Xây dựng quy trình xác định vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia Coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2011 Tác giả Lưu Thị Hải Yến Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... ii LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành luận văn này, ngồi sự cố gắng của bản thân, phải kể tới sự giúp đỡ về vật chất và tinh thần của các thầy, cơ giáo, gia đình và bạn bè của tơi. Trước hết, tơi xin được bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới TS. ðỗ Ngọc Thúy – người đã trực tiếp hướng dẫn tơi hồn thành luận văn này. Tơi cũng xin được cảm ơn TS. Nguyễn Bá Hiên, các thầy cơ giáo trong bộ mơn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tơi hồn thành luận văn này. Tơi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Cù Hữu Phú, các cán bộ nghiên cứu cơng tác tại bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tơi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, gia đình và bạn bè tơi là một sự cổ vũ to lớn, là động lực để tơi hồn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2011 Tác giả Lưu Thị Hải Yến Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU A/E Attaching and Effacing (Bám dính và xâm nhập) BHI Brain Heart Infusion BPW Buffer Peptone Water cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic Acid E. coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cơ quan thực phẩm và dược phẩm Mỹ) HC Hemorrhagic colitis (Viêm ruột xuất huyết) HUS Hemolytic uremic syndrome (Hội chứng huyết niệu) LB Luria Bertani MR Methyl Red m-TSB modified Trypticase Soy Broth NB Nutrient Broth PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure (Ban xuất huyết giảm tiểu cầu) VK Vi khuẩn VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an tồn thực phẩm VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO World Health Organisation (Tổ chức y tế thế giới) Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... iv DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1. Trình tự mồi dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae..........................36 2.2. Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1, VT2 và eae................................................................................37 2.3. Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1, VT2 và eae ............................................................................................................37 2.4a. Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương.............................................................................................38 2.4b. Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn đối chứng âm...39 3.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR đơn và đa mồi để phát hiện một số gen độc lực của VTEC ..............................................................................45 3.2. Kết quả xác định mơi trường thích hợp nuơi cấy vi khuẩn để chiết tách DNA cho phản ứng PCR...........................................................................47 3.3a. Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức để phát hiện các chủng vi khuẩn đối chứng dương .......................................................................................48 3.3b. Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức với các chủng vi khuẩn đối chứng âm ..................................................................................................49 3.4. Kết quả đếm số hai chủng vi khuẩn đối chứng dương trên một số mơi trường nuơi cấy.........................................................................................51 3.5. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR trên mơi trường nuơi cấy.........................................................................................52 3.6. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR trong mẫu thịt sạch ....................................................................................................55 3.7. Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập được ................................60 3.8. Kết quả kiểm tra các đặc tính của vi khuẩn E. coli phân lập được..............61 3.9. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ các mẫu thịt ..........................................63 3.10. Khả năng sản sinh độc tố VT của các chủng VTEC phân lập được..........69 3.11. Kết quả xác định serotyp của các chủng VTEC phân lập được ................70 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... v DANH MỤC BIỂU, HÌNH Hình 1.1: Cơ chế tác động của độc tố VT .........................................................16 Hình 3.1: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm sau quá trình điện di ............................................................48 Hình 3.2: Kết quả đếm số chủng FD636 trên thạch máu...................................51 Hình 3.3: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các nồng độ pha lỗng khác nhau từ mơi trường LB đã nuơi cấy chủng FD636 ....................................54 Hình 3.5: Xử lý mẫu tại phịng thí nghiệm .......................................................60 Hình 3.6: Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường MacConkey ....................62 Hình 3.7: Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường thạch máu .......................62 Hình 3.8: Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường EMB ..............................62 Hình 3.9: Tính chất mọc của E. coli trên mơi trường CT-SMAC......................62 Hình 3.10: Khả năng lên men sinh hơi một số loại đường của E. coli...............62 Hình 3.11: Khả năng sinh Indol của E. coli ......................................................62 Hình 3.12: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu thịt sau quá trình điện di64 Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ các mẫu thịt.............................64 Hình 3.13: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của một số mẫu thịt sau quá trình điện di ...............................................................66 Hình 3.14: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu phân và mẫu lau .............67 thân thịt sau quá trình điện di ...........................................................................67 Hình 3.15: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của mẫu phân sau quá trình điện di .........................................................................67 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... vi MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN ...............................................................................................i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU........................................ iii DANH MỤC BẢNG .........................................................................................iv DANH MỤC BIỂU, HÌNH ...............................................................................iv MỤC LỤC ........................................................................................................vi MỞ ðẦU...........................................................................................................1 PHẦN I - TỔNG QUAN ..................................................................................3 1.1. Lịch sử nghiên cứu .....................................................................................3 1.2. Phân loại E. coli..........................................................................................6 1.3. ðặc tính của vi khuẩn E. coli ......................................................................7 1.4. Verocytogenic Escherichia coli (VTEC) ..................................................12 PHẦN II - ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................34 2.1. ðối tượng, địa điểm nghiên cứu................................................................34 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................34 2.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu..........................................................34 2.4. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................35 PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................44 3.1. Thiết lập và chuẩn hĩa phương pháp PCR ...........................................44 3.1.1. Lựa chọn giữa PCR đơn và PCR phức..............................................44 3.1.2. Lựa chọn mơi trường nuơi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu ....46 3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng với các chủng đối chứng.......................47 3.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR dùng để xác định VTEC ................................................................................49 3.2.1. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR dùng để xác định VTEC trong mơi trường nhân tạo ...................................50 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... vii 3.2.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch ..............................................55 3.3. Quy trình xác định sự cĩ mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt57 3. 4. Kết quả phân lập vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt ........................58 3.4.1. Kết quả áp dụng quy trình trong phân lập và xác định vi khuẩn VTEC cĩ trong các mẫu thịt thu thập từ các chợ và lị mổ.........................59 3.4.2. Kết quả giám định các chủng vi khuẩn VTEC phân lập được ..........68 PHẦN IV - KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ.........................................................71 4.1. Kết luận....................................................................................................71 4.2. ðề nghị.....................................................................................................71 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................73 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 1 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm cĩ khoảng 2 tỷ người bị ngộ độc thực phẩm (ðậu Ngọc Hào, 2011). Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) cĩ khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đĩ phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu cơng nghiệp, bếp ăn của học sinh. Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011). Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm (VSATTP). VSATTP cĩ vai trị rất quan trọng đối với cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng mơi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia. Trong những thập kỷ gần đây, ơ nhiễm vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc nhĩm Verotoxygenic Escherichia coli (VTEC) sản sinh độc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm đã trở thành đề tài nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn này gây ra ở người (Bergamini, 2007). Tuy nhiên, tại Việt Nam, cĩ rất ít cơng trình nghiên cứu tương tự. ðộc tố VT cĩ hai nhĩm chính là VT1 và VT2 với nhiều biến thể khác nhau (Gyles và Fairbrother, 2004). ðộc tố này gây ra các loại bệnh như viêm ruột xuất huyết (HC – Hemorrhagic colitis), hội chứng huyết niệu (HUS – Haemolytic uremic syndrome), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP – Thrombotic Thrombocytopanic purpura), viêm đường niệu (Urinary tract Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 2 infections), viêm màng não (meningitis) (XU Jian-Guo và cs, 1999; Lake và Cressey, 2002). Vi khuẩn này cĩ thể lây nhiễm qua nhiều đường khác nhau, như sử dụng thực phẩm, rau xanh, nước uống bị nhiễm vi khuẩn, tiếp xúc trực tiếp với động vật mang trùng, … (Võ Thành Thìn và cs, 2008). Việc xây dựng được một quy trình chuẩn để xác định vi khuẩn VTEC phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm tại Việt Nam, nhằm xác định nhanh và chính xác thịt tươi bị nhiễm vi khuẩn VTEC sẽ là nền tảng quan trọng trong chẩn đốn và điều trị các trường hợp ngộ độc thực phẩm cũng như cho các nghiên cứu tiếp theo. Vì vậy, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình xác định vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)”. Nghiên cứu này cho phép xác định nhanh và chính xác tiêu chuẩn vi sinh đối với vi khuẩn VTEC trong thực phẩm, loại bỏ hoặc tiêu hủy kịp thời thực phẩm cĩ nhiễm mầm bệnh này hoặc xác định nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm do VTEC. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng được một quy trình thích hợp cĩ thể dùng để xác định chính xác thịt bị nhiễm vi khuẩn VTEC. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 3 PHẦN I TỔNG QUAN 1.1. Lịch sử nghiên cứu Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người ðức Theodore Escherich đã lần đầu tiên mơ tả một lồi vi khuẩn phân lập được từ phân của một bệnh nhi. Ơng đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. coli. Từ đĩ đến nay, E. coli được xác định là lồi vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật (Vũ Khắc Hùng, 2004). E. coli là lồi chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae. Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn, trong vi trường thường đứng riêng hoặc thành đơi, cho phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, cĩ thể di động nhờ lơng roi (flagella) hoặc khơng di động. Hầu hết các chủng đều lên men đường Lactose, một số lên men chậm và một số khơng sinh hơi. Thơng thường, E. coli cĩ phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges-Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. E. coli là vi khuẩn thường thấy trong đường tiêu hĩa của người và động vật; từ đĩ E. coli được thải vào nước, đất và đồng cỏ, khơng chỉ nhiễm lan trong đàn mà cĩ thể nhiễm vào một số sản phẩm nơng nghiệp như rau, củ,... Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và Beavan) (1989) gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, sau này được gọi là nhĩm O111, thuộc lớp EPEC. Từ đĩ, những nhĩm E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. Các vi khuẩn E. coli gây bệnh cĩ độc lực rất khác nhau và cĩ khả năng gây ra một số bệnh nghiêm trọng. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 4 Một số chủng sản sinh độc tố tế bào gây phá hủy tế bào Vero và Hela, tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra. Những độc tố này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc Shiga- like toxin. Trong báo cáo này, chúng tơi sử dụng tên gọi thống nhất là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn cĩ khả năng sản sinh độc tố này được gọi là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC. Trong những năm gần đây, các chủng E. coli gây tiêu chảy được chia thành ít nhất 5 nhĩm. ðĩ là E. coli gây độc ruột (ETEC – Enterotoxigenic E. coli) – sản sinh độc tố ruột nhưng khơng xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột (EIEC – Entero invasive E. coli) cĩ khả năng xâm nhập tế bào biểu mơ ruột, E. coli gây bệnh tích ruột (EPEC – Enteropathogenic E. coli) cĩ khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết (EaggEC – Enteroaggregative E. coli) cĩ khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ nhờ một cơ quan giống lơng nhung và khuyếch tán vào trong biểu mơ ruột. Nhĩm cuối cùng cĩ tên là E. coli cĩ khả năng sản sinh độc tố VT (VTEC – Verotoxigenic Escherichia coli) gây bệnh viêm ruột xuất huyết (HC – Haemorrhagic colitis), huyết niệu (HUS – Haemolytic ureamic syndrome) và ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP – Thrombotic thrombocytopenic purpura) ở người. Trước đây, VTEC là một phân nhĩm của EPEC vì chúng cũng cĩ khả năng gây bệnh tích A/E ở biểu mơ ruột của động vật cảm thụ, nhưng khi phát hiện một số chủng của VTEC cĩ khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhĩm riêng là VTEC. E. coli O157:H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993), Canada (Waters và cs, 1994), Anh (Thomas và cs, 1996) và Nhật Bản (Bettelheim, 1997). Vi khuẩn này được xác định là một trong các tác nhân Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 5 gây ngộ độc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ độc thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (HUS) (Phạm Thị Tâm và cs, 2009, trích dẫn theo Griffin, 1995). Vụ dịch đầu tiên được báo cáo vào năm 1982, E. coli O157:H7 được xác định là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ. Trong một thập kỷ sau đĩ, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm. Vụ dịch lớn nhất được báo cáo xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7-8/1996, với 9578 ca bệnh được ghi nhận và 11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS. Vụ dịch lớn thứ hai xảy ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đĩ 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP. Mặc dù, serotyp O157:H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhĩm VTEC, một số serotyp khác của nhĩm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người. Hơn nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau. Cĩ hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O cĩ khả năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP. Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thơng thường (Wachsmuth, 1994). Ví dụ, ở ðức, VTEC là tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy thứ hai ở trẻ em sau Salmonella, ở Úc, đứng thứ ba sau Salmonella và Campylobacter. VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần như khơng cĩ triệu chứng gì, cĩ hoặc khơng cĩ triệu chứng đau bụng nhẹ, đến những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP. ðối tượng thường bị nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già. Ở những người trưởng thành và trung niên, các triệu chứng cĩ thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng khơng xuất huyết. Hiện tượng này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn. Ở động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bị, chúng cũng cĩ thể gây bệnh phù đầu ở lợn (ðỗ Ngọc Thúy, 2004). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 6 Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157:H7, cĩ liên quan tới việc ăn thịt bị chưa nấu chín kỹ, một số thực phẩm tương tự hoặc sữa tươi. Phương thức lây truyền chủ yếu của VTEC là qua thực phẩm. Vật nuơi, đặc biệt trâu bị, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin và cs, 1993). Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng cĩ thể truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia súc khác qua tay người giết mổ và dụng cụ lị mổ. Hiện nay, người ta vẫn chưa khẳng định được liệu tất cả các chủng VTEC phân lập được từ động vật cĩ gây bệnh cho người hay khơng. Tiêu chuẩn Việt Nam quy định: vi khuẩn này khơng được phép cĩ mặt trong 1g các loại thực phẩm như thịt hộp, rau quả muối, nước uống, sữa và các sản phẩm từ sữa. Ở Việt Nam, cĩ rất ít thơng tin về VTEC ở những động vật mang trùng, thân thịt sau khi giết mổ và thực phẩm. Hơn nữa, thực tế hiện nay khơng cĩ 1 bộ kit phát hiện VTEC nào trên thị trường, ngoại trừ nhĩm O157. Do đĩ, các phương pháp phát hiện nhanh VTEC ở Việt Nam cần phải được phát triển để xác định được vai trị của vi khuẩn này ở động vật mang trùng cũng như các sản phẩm từ động vật. 1.2. Phân loại E. coli E. coli cĩ thể được chia thành các nhĩm dựa trên bệnh lý mà chúng gây ra, vị trí các kháng nguyên, định typ phage, thơng tin về plasmid và khả năng sản sinh yếu tố dung huyết. Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học thường được sử dụng nhất và cĩ hiệu quả khi phân loại E. coli (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan, 1997). Năm 1944, Kauffman là người đầu tiên đưa ra phương pháp phân loại vi khuẩn E. coli dựa trên đặc điểm huyết thanh học, và với một số cải tiến, phương pháp này vẫn được áp dụng cho tới ngày nay. Theo đĩ, vi khuẩn E. coli được phân loại dựa theo các kháng nguyên bề mặt, gồm cĩ kháng nguyên Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 7 thân O (Somatic), kháng nguyên lơng H (Flagellar) và kháng nguyên giáp mơ K (Capsular) (Lior, 1994). Mặc dù E. coli được phân loại dựa trên 3 loại kháng nguyên này nhưng kháng nguyên O và H thường được sử dụng nhiều hơn. Do đĩ, thuật ngữ serotyp chỉ được sử dụng khi hai kháng nguyên này đã được xác định. Khi chỉ cĩ kháng nguyên O được xác định, các vi khuẩn E. coli được xếp thành nhĩm kháng nguyên O (serogroup O). Hiện nay, nhĩm E. coli dựa trên kháng nguyên O đã được xác định được đánh số từ O1 đến O173 (trừ 7 nhĩm đã bị loại : O31, O47, O67, O72, O93, O94, O122). Cũng đã cĩ 103 kháng nguyên K và 56 kháng nguyên H được xác định. 1.3. ðặc tính của vi khuẩn E. coli 1.3.1. ðặc tính hình thái E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu trịn, cĩ kích thước 2 – 3 x 0,6 µm. Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ, đơi khi xếp 2 – 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Vi khuẩn khơng cĩ giáp mơ, khơng sinh nha bào và khơng bắt màu với các thuốc nhuộm axit. Vi khuẩn cĩ lơng và cĩ khả năng di động (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001). Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, một số chủng vi khuẩn nhất định cĩ mang cấu trúc fimbriae hay cịn gọi là yếu tố bám dính. 1.3.2. ðặc tính nuơi cấy E. coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này là 370C, pH thích hợp là 7,4, nhưng vi khuẩn cũng cĩ thể phát triển được ở mơi trường cĩ pH từ 5,5 – 8,0 (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001). Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các mơi trường nuơi cấy thơng thường, một số chủng cĩ thể phát triển được ở mơi trường tổng hợp đơn giản. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 8 - Mơi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc trịn, ướt, bĩng láng khơng trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2-3 mm. Nuơi lâu, khuẩn lạc cĩ màu nâu nhạt và mọc rộng ra, cĩ thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M. - Mơi trường nước thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, mơi trường đục đều cĩ lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đơi khi cĩ màu xám nhạt, canh trùng cĩ mùi phân thối. - Mơi trường MacConkey: Khuẩn lạc cĩ màu hồng cánh sen, trịn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, khơng làm chuyển màu mơi trường. - Mơi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền khơng gọn, màu xám nhạt, một số chủng cĩ khả năng gây dung huyết. - Mơi trường Simmon citrate: Khuẩn lạc khơng màu trên nền xanh lục - Mơi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ - Mơi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím đen - Mơi trường SS: Khuẩn lạc cĩ màu đỏ 1.3.3. ðặc tính sinh hĩa - ðặc tính lên men và sinh hơi các loại đường: Vi khuẩn E. coli cĩ khả năng lên men và sinh hơi một số loại đường như: Glucose, Fructose, Galactose, Lactose, Manitol, Levulose, Xylose; lên men khơng chắc chắn với các loại đường như: Dulcitol, Saccarose, Salixin. Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi nhanh đường Lactose, cịn vi khuẩn Salmonella spp. khơng cĩ đặc tính này. ðây chính là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E. coli và Salmonella. - Các đặc tính khác: + Làm đơng vĩn sữa sau 24 – 72 giờ nuơi cấy ở 370C + Khơng làm tan chảy gelatin Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 9 + Các phản ứng khác: Indol, Catalase, MR dương tính; Citrat, Oxidase, VP, Urease, H2S âm tính. Vi khuẩn E. coli cĩ khả năng khử nitrat thành nitrit, khử cacboxyl trong mơi trường lysine decacboxylase. 1.3.4. Sức đề kháng Vi khuẩn E. coli cĩ sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút, đun sơi ở 1000C thì chết ngay. Các chất sát trùng như axit phenic 3%, HgCl2 0,5%, formol 1-2% cĩ thể tiêu diệt vi khuẩn nhanh trong 5 phút. Trong phân, chất độn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời, vi khuẩn cĩ thể tồn tại trên 2 tháng. Vi khuẩn E. coli cĩ khả năng đề kháng với sự sấy khơ và hun khĩi. Những chủng E. coli trong phân cĩ xu hướng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở mơi trường bên ngồi. Ở mơi trường bên ngồi, các chủng E. coli gây bệnh cĩ thể tồn tại đến 4 tháng (Gross W. G., 1994). 1.3.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F. Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đã xác định được 166 loại kháng nguyên O, 103 loại kháng nguyên K, 56 loại kháng nguyên H và một số quyết định kháng nguyên F (Fairbrother và cs, 1992; Carter và cs, 1995). 1.3.5.1. Kháng nguyên O ( Somatic antigen) Kháng nguyên O là yếu tố thể xoma của phospholipid – polysaccharide gĩp phần tạo nên màng ngồi lipopolysaccharide của vi khuẩn, rất độc, chỉ cần 1/20 mg kháng nguyên O cũng đủ để giết chết chuột nhắt trắng sau 24 giờ. Kháng nguyên O cĩ khả năng chịu được nhiệt độ, các chất cồn và axit HCl 1N. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 10 Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide của kháng nguyên O gồm 2 phần: phần polysaccharide nằm ngồi cĩ nhĩm hydro mang chức năng tạo ra tính đặc trưng về serotyp, và phần polysaccharide ở bên trong khơng cĩ nhĩm hydro, cĩ chức năng phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc. Khi làm mất dần từng đơn vị đường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Thành phần lipit trong kháng nguyên cĩ tác dụng quyết định độc tính của vi khuẩn E. coli. Kháng nguyên O khơng phải là một kháng nguyên đơn (single antigen) mà gồm một số thành phần và thường được gọi là nhĩm kháng nguyên O. Các nhĩm kháng nguyên O khác nhau cĩ thể cĩ một vài thành phần kháng nguyên chung, và do đĩ cĩ thể gây phản ứng chéo giữa các nhĩm. Phản ứng chéo với các vi khuẩn khác cũng đã được ghi nhận như với Shigella, Salmonella và Citrobacter (Winkle và cs, 1972). 1.3.5.2. Kháng nguyên H (Flagella antigen) Các kháng nguyên H dựa trên các dạng khác nhau của lơng roi - protein của cơ quan di chuyển. Việc xác định kháng nguyên H chỉ phù hợp khi khả năng di động của vi khuẩn được thể hiện tốt qua một hoặc vài lần cấy chuyển trên mơi trường bán cố thể. Hầu hết các kháng nguyên H đều cĩ tính đặc hiệu cao, ít hoặc khơng cĩ phản ứng chéo. Các chủng khơng di động được ký hiệu là NM (Non motile) hoặc H-. Kháng nguyên H là kháng nguyên cĩ bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O; kém chịu nhiệt, bị phá hủy trong cồn 50% và các enzyme tiêu hĩa protein, khơng bị tác động khi xử lý bằng formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết. Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bơng. Do vậy, vi khuẩn cĩ Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 11 khả năng di động, khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành khơng di động. Kháng nguyên H khơng cĩ độc lực và cũng khơng cĩ ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch. 1.3.5.3. Kháng nguyên K (Capsular antigen) Thơng thường, kháng nguyên K sử dụng để định typ E. coli khơng gây ngưng kết với kháng huyết thanh O tương ứng. Việc xác định kháng nguyên K dựa trên đặc điểm hĩa học của kháng nguyên vỏ lipopolysaccharide. Cĩ 3 nhĩm kháng nguyên K đã được xác định là L, A và B; chúng khác nhau về đặc tính kháng nguyên và khả năng kết hợp với kháng thể khi ở nhiệt độ khác nhau. Kháng nguyên K nhĩm B và L vơ hoạt sau khi đun ở 1000C trong 1 giờ, trong khi nhĩm A sau 1 giờ nhưng ở 1210C. Khả năng kết hợp với kháng thể của nhĩm B khơng bị mất đi sau khi đun ở 1210 trong 1 giờ, trong khi nhĩm L thì bị mất sau khi ở 1000C trong 1 giờ. Việc xác định kháng nguyên K cĩ thể tiến hành bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính hoặc trong ống nghiệm. Nhưng hiện nay, kháng nguyên K ít được sử dụng, mà thường sử dụng kháng nguyên O:H. Một số nhà nghiên cứu cho rằng kháng nguyên K khơng cĩ ý nghĩa về độc lực (Pourbakhsh và cs, 1997; McPeake và cs, 2005). Tuy nhiên, cũng đã cĩ cơng trình nghiên cứu._. chứng minh kháng nguyên K cĩ ý nghĩa về độc lực vì chúng tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phịng vệ của vật chủ. Kháng nguyên K cĩ tác dụng chống lại sự thực bào, gồm cả kháng bổ thể trong huyết thanh. Nĩi chung, các nghiên cứu đều thống nhất về kháng nguyên K cĩ hai chức năng sau: + Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết kháng nguyên O của vi khuẩn Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 12 + Tạo ra hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào cũng như các yếu tố phịng vệ khác của vật chủ. 1.3.5.4. Kháng nguyên F (Fimbriae antigen) Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều cĩ khả năng sản sinh ra một hoặc nhiều loại kháng nguyên bám dính. Các chủng khơng gây bệnh thì khơng cĩ kháng nguyên bám dính (Carter và cs, 1995). Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn E. coli cĩ thể bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mơ ruột và lớp màng nhày, chống lại khả năng đào thải vi khuẩn do nhu động ruột. Kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli chính là các cấu trúc pili (hay cịn gọi là Fimbriae) cĩ cấu trúc giống sợi lơng, ngắn, thẳng, xuất phát từ một đĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn. Fimbriae cĩ bản chất là protein, bao phủ trên bề mặt ngồi của tế bào vi khuẩn với số lượng từ 10 – 400/tế bào vi khuẩn. Trước khi cấu trúc hĩa học của chúng được biết đến, các kháng nguyên này được gọi là kháng nguyên K như K88 và K99. Tuy nhiên, ngày nay, chúng được gọi là những lơng roi bám dính F4 và F5. 1.4. Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) Trong số E. coli cĩ khả năng gây tiêu chảy, VTEC được xem là một nhĩm quan trọng gây tiêu chảy cĩ lẫn máu ở người (Levent Akkaya và cs, 2006). 1.4.1. Danh pháp Mặc dù đã được xác định là các chủng E. coli cĩ khả năng sản sinh độc tố VT hoặc Shiga-like toxin và được phân loại là nhĩm VTEC, nhưng danh pháp quốc tế của nhĩm vi khuẩn này vẫn chưa được thống nhất. SLTEC (Shiga-like toxin-producing Escherichia coli) và STEC (Shiga toxin- producing Escherichia coli) là những tên gọi khác của VTEC. 1.4.2. ðộc lực Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 13 Nhìn chung, ngoại độc tố VT được coi là yếu tố độc lực của VTEC. Tuy nhiên, sự cĩ mặt của riêng độc tố VT cĩ thể khơng đủ gây ra bệnh, những yếu tố được cho là độc lực khác cĩ thể đĩng một vai trị nào đĩ. Người ta cho rằng một số yếu tố cĩ liên quan đến khả năng bám dính của VTEC với tế bào biểu mơ ruột, gây nên bệnh tích A/E. Trong những yếu tố này cĩ plasmid 60- Mda, mã hĩa cho lơng roi bám dính – một loại protein màng ngồi (OMP – Outer membrane protein), cĩ trọng lượng phân tử 94 kDa, cĩ yếu tố intimin do gen eae quy định tổng hợp. Trong số các yếu tố này, mới chỉ cĩ VT được xác định rõ vai trị trong quá trình gây bệnh của VTEC. 1.4.2.1. ðộc tố Verotoxin (VT) Konowalchuk và cs (1977) đã cĩ một cơng trình nghiên cứu về độc tố gây độc tế bào (cytotoxin) của E. coli. Các tác giả đặt tên độc tố này là VT (Verotoxin). Vero là tế bào thận khỉ xanh châu Phi (Cercopithecus aethiops), thường được dùng trong phịng thí nghiệm, đặc biệt trong các nghiên cứu về virus học. Theo Konowalchuk, cĩ hai loại độc tố VT: VT1 và VT2. ðộc tố VT1 giống độc tố của Shigella dysenteriae typ 1 về mọi phương diện, kể cả miễn dịch học. Trong điều kiện in vitro, cĩ thể dùng kháng độc tố Shiga để trung hịa VT1. Vì thế, VT1 cịn được gọi là độc tố giống độc tố Shiga (Shiga- like-toxin). ðộc tố VT2 khơng cĩ liên quan gì về miễn dịch học với độc tố của Shigella dysenteriae typ 1, nhưng cũng cĩ khả năng gây độc tế bào như VT1. Konowalchuk nhận thấy rằng một số chủng EPEC cĩ khả năng tổng hợp độc tố VT1 và/hoặc VT2, vì những chủng này gây độc và làm biến dạng tế bào Vero đơn lớp. Tuy nhiên, phát hiện này chưa được chú ý đến khi một vụ dịch do E. coli O157:H7 xảy ra ở Mỹ, và vi khuẩn này cĩ khả năng sản sinh VT. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 14 Trong một nghiên cứu độc lập khác, năm 1982, O’Brien và cs phát hiện một loại độc tố do E. coli O26 sản sinh, gây độc cho tế bào Hela và bị trung hịa bởi kháng huyết thanh kháng độc tố Shiga. ðộc tố này được O’Brien và cs gọi là độc tố giống độc tố Shiga (Shiga – like toxin, viết tắt là SLT). Nhĩm tác giả nhận thấy độc tố này giống độc tố E. coli O157:H7 sản sinh. Do đĩ, cả hai tên gọi SLT và VT đều chỉ một loại độc tố. Tại hội nghị châu Á về bệnh tiêu chảy tại Bangkok năm 1985, các nhà vi khuẩn học Sri Lanka khi trình bày kết quả nghiên cứu về các chủng EPEC cĩ nhận định rằng: Các chủng E. coli cĩ độc tố VT thường gây bệnh ở gia súc (trâu, bị), nhưng khơng cĩ vai trị gì quan trọng trong bệnh tiêu chảy ở người, ít nhất là ở vùng nhiệt đới ðơng Nam Á. Trình tự nucleotit của gen chịu trách nhiệm sản sinh VT1 và trình tự axit amin đã được xác định và so sánh với gen sản sinh độc tố Shiga. Mặt khác, VT2 và các biến thể của nĩ cĩ những đặc điểm khác biệt với VT1. Mức độ tương đồng của trình tự nucleotit và axit amin của VT2 và VT1 khoảng 55 – 60%. Các loại VT2 hiện nay đã xác định được gồm cĩ VT2, VT2vha (VT2va), VT2vhb (VT2vb), VT2vp1 (VT2e) và VT2vp2. Schmidt và cs (1994) đã mơ tả gen tương tự VT2 ở Citrobacter freundii, được gọi là C. freundii slt-IIcA và slt-IIcB. Những gen này cũng đã phân lập được từ Enterobacter cloacae – vi khuẩn cĩ liên quan đến bệnh HUS ở người. Nhĩm tác giả này cũng đã báo cáo VT2 từ C. freundii khơng ổn định do độc tố mất hoạt tính, đồng nghĩa với việc mất gen VT trong quá trình cấy chuyển. Các gen giống VT1 cũng đã được phân lập từ Aeromonas spp. từ bệnh nhân bị tiêu chảy và từ mơi trường, cĩ khả năng gây độc đối với tế bào Vero. Cấu trúc chung và cơ chế tác động của các độc tố VT giống với độc tố Shiga. Mỗi độc tố cĩ cấu trúc gồm tiểu phần A – B, 1 tiểu phần A (khoảng 33 kDa) và 5 tiểu phần B (khoảng 7,5 kDa). Tiểu phần A cĩ hoạt tính của một enzyme, tác động ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào, gồm cĩ dung Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 15 giải protein và phá hủy liên kết disulfide. Tiểu phần B mang vị trí tiếp xúc của phân tử độc tố với một receptor glycolipid trên màng tế bào. Stein và cs (1992) đã xác định cấu trúc tinh thể của tiểu phần B của VT1 và nhận thấy nĩ giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố LT được sản sinh bởi hầu hết các chủng E. coli. VT là protein khơng chịu nhiệt, nhưng khả năng chịu nhiệt của các loại VT khác nhau là khác nhau. VT2e là kém chịu nhiệt nhất, mất hoạt tính hồn tồn khi ở 650C trong 30 phút. VT2d cĩ khả năng chịu nhiệt cao nhất, khơng mất hoạt tính khi ở 750C trong 60 phút. VT1 và VT2 là những độc tố cĩ khả năng chịu nhiệt trung bình. Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), của VT2e là Globotetraosylceramide (Gb4). Gb3 là phức hợp trên màng tế bào nội mạc quản cầu thận. Cấu trúc và số lượng những receptor đặc hiệu ở những lồi và mơ khác nhau tạo nên sự khác nhau về độ mẫn cảm của tế bào, mơ hoặc cơ quan đối với độc tố. Tuy nhiên, nguyên nhân chính gây phá hủy thận trong bệnh tiêu chảy cĩ liên quan đến HUS vẫn chưa được làm rõ. Vì ái lực của VT1 đối với Gb3 lớn hơn so với VT2, người ta cho rằng VT1 gắn với tế bào biểu mơ ruột và gây phá hủy các tế bào này cũng như hệ thống mạch quản ở ruột, trong khi đĩ, VT2 cĩ ái lực nhỏ hơn với Gb3 do đĩ khả năng vào được hệ thống tuần hồn lớn hơn, theo máu đến các cơ quan, cĩ thể gây HUS hoặc TTP. Khi độc tố được gắn với receptor, tiểu phần A sẽ xâm nhập vào trong tế bào theo cơ chế ẩm bào, gây dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide, từ đĩ ức chế việc tổng hợp yếu tố kéo dài chuỗi gắn với ribosome của phân tử RNA vận chuyển. Do đĩ, về cơ bản, sự kéo dài chuỗi peptit bị ngừng lại, ức chế sự tổng hợp protein, dẫn tới giết chết tế bào đích. Các nghiên cứu dịch tễ học trong thời gian gần đây tại Mỹ và Anh đều đã cho thấy việc nhiễm VTEC cĩ thể sản sinh cả hai loại độc tố VT1 và VT2 hoặc chỉ VT2 gây ra các tình trạng bệnh phức tạp hơn so với khi nhiễm các chủng chỉ sản sinh VT1. Tesh và cs (1993) đã so sánh khả năng gây độc của Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 16 những độc tố này trên chuột. Họ phát hiện VT2 cĩ liều LD50 thấp hơn gần 400 lần so với VT1. Hơn nữa, VT2 bền hơn với nhiệt độ và pH. Hoạt tính sinh học và khả năng gây độc thơng thường của tất cả các độc tố VT (trừ khả năng gây độc tế bào Vero) đều gây chết chuột và gây độc với tế bào ruột thỏ. ðộc tính của VT đã được thí nghiệm trong điều kiện in vitro bằng phương pháp nhân nhanh tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người. Phương pháp sử dụng tế bào Vero để đo khả năng gây độc bằng cách tính tốn số lượng tế bào bị diệt, rời ra khỏi lớp tế bào đơn lớp. Một liều gây độc 50% tế bào địi hỏi khoảng 1 pg độc tố, gần tương đương như giá trị CD50 của VT1 và VT2 đối với tế bào Hela. Hình 1.1: Cơ chế tác động của độc tố VT Khả năng gây độc của từng loại VT cũng khác nhau. Takeda (1995) đã thống kê hoạt tính sinh học của các loại VT như sau: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 17 ðộc tố CD50 (pg) LD50 (ng) Shiga 1,0 27 VT1 1,0 30 VT2 0,75 1 VT2vh 6 2,7 VT2vp 1 6 22 VT2vp 2 20 55 Ghi chú : CD50 (đơn vị tính): Liều gây độc 50% tế bào Vero LD50 (đơn vị tính): Liều gây chết 50% chuột thí nghiệm 1.4.2.2. Gen eae (giúp bám dính và xâm nhập) Gen eae là một đặc tính quan trọng của nhĩm EPEC. Gen này đĩng vai trị quan trọng trong việc gắn tế bào vi khuẩn vào màng tế bào ruột, và gây nên bệnh tích đặc trưng A/E (Attaching and Effacing – bám dính và xâm nhập). Một số vi khuẩn thuộc nhĩm EHEC cũng gây ra bệnh tích này do chúng cĩ thể cĩ gen eae. Vị trí gắn của các tế bào vi khuẩn dẫn tới sự phá hủy các lơng rung và hệ xương của tế bào chủ. Beebakhee và cs (1992) đã giải trình tự gen eae của serotyp O157:H7 và thấy cĩ sự tương đồng với gen này của nhĩm EPEC. Các tác giả cũng khẳng định sự tương đồng tới 50% với gen eae của Yersinia pseudotuberculosis. Tương tự, Yu và Kaper (1992) cho rằng gen eae cĩ thể mã hĩa cho một protein ngồi màng cĩ trọng lượng phân tử 94 kDa (OMP). Tuy nhiên, Dytoc và cs (1993) khẳng định gen eae khác so với gen mã hĩa cho OMP (sử dụng phương pháp giải trình tự peptit và miễn dịch học). Các tác giả quan tâm đến các yếu tố khác đã xác định được độc tính hơn là gen eae và plasmid 60 – Mda, như CL8 – 57JB, Cl8 – 106JB - là những protein bị bất hoạt nếu cĩ sự đột biến của gen TnphoA. Dytoc và cs (1993) đã cĩ báo cáo về sự khác nhau của khả năng bám dính giữa serotyp O113:H21 (khơng cĩ gen eae) và O157:H7. Allerberger và cs (1996) cũng đã phân lập Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 18 được 2 chủng VTEC khơng thuộc nhĩm O157:H7 và khơng mang gen eae từ những trẻ em bị tiêu chảy xuất huyết. Các tác giả cho rằng chúng cĩ thể mang yếu tố bám dính khác mà chưa được xác định rõ. Một nghiên cứu về khả năng gây tiêu chảy của E. coli O157:H7 sử dụng lợn con làm động vật gây nhiễm đã được Donnenberg và cs tiến hành năm 1993. Các tác giả cho rằng một sự đột biến của gen eae ở chủng vi khuẩn này cĩ thể hạn chế khả năng bám dính của vi khuẩn. Hơn nữa, khi gen eae ở các vi khuẩn thuộc nhĩm EPEC hoặc EHEC được bộc lộ, khả năng bám dính sẽ được phục hồi. McKee và O’Brien (1996) đã xác định được yếu tố intimin – sản phẩm của gen eae. Intimin là một protein ngồi màng, cĩ trọng lượng phân tử 97 kDa, đĩng vai trị quan trọng trong quá trình bám dính của E. coli O157:H7. Kết luận này được khẳng định bằng phân tích cấu trúc – chức năng của gen eae và bằng phương pháp chặn sự bám dính của vi khuẩn vào tế bào HEp-2 sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu của intimin. Louie và cs (1994) đã tiến hành nghiên cứu gen eae ở VTEC phân lập từ trâu bị bị tiêu chảy nặng và từ người bị HUS hoặc HC và đã kết luận rằng 82% VTEC phân lập từ người và 59% phân lập từ trâu bị cĩ mang gen eae. Mainil và cs (1993) nhận thấy 75% các chủng E. coli phân lập từ trâu bị bị tiêu chảy cĩ mang gen eae là VTEC. Sandhu và cs (1996) nghiên cứu về gen eae ở các chủng VTEC phân lập được từ trâu bị khỏe mạnh, kết quả cho thấy 35,2% số chủng VTEC cĩ gen này và hầu hết đều thuộc các nhĩm kháng nguyên O chính. Kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở nghiên cứu của Wieler và cs (1996). Cấu trúc gen eae ở E. coli O157 được nghiên cứu bằng phương pháp lai mẫu dị DNA. Kết quả cho thấy tất cả các chủng VTEC O157 đều cĩ phản ứng bắt cặp với mẫu dị gen eae. Tuy nhiên, trong 129 E. coli O157 khơng sản sinh VT, 10 chủng vẫn cĩ phản ứng với mẫu dị gen eae. Beutin và cs (1994) đã nghiên cứu các yếu tố độc lực của các chủng VTEC Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 19 phân lập được từ người. Trong 54 chủng, 94% cĩ gen eae. Tuy nhiên, Schmidt và cs (1994) cho rằng khơng nên sử dụng mồi eae mà sử dụng mồi VT để xác định VTEC. Kết quả của nhĩm tác giả này chỉ ra 2 trong 6 VTEC khơng phản ứng với mồi eae, 3 trong 7 chủng E. coli cĩ gen eae khơng phản ứng với mồi VT. Các chủng VTEC phân lập được từ phân người và thực phẩm cĩ nguồn gốc động vật ở Úc cũng cĩ gen eae và kết quả này đã được cơng bố trong nghiên cứu của Paton và cs (1996). VTEC chủng O111:H- và O157:H- phân lập được từ bệnh nhân bị HUS và HC cũng dương tính với eae, nhưng chủng O91, O123 và O128 phân lập được từ bệnh nhân HC cho kết quả âm tính với eae. Kết quả trên cho thấy vai trị của gen eae trong cơ chế gây bệnh của vi khuẩn vẫn chưa được khẳng định một cách chắc chắn và cần thêm nhiều nghiên cứu nữa về yếu tố này. 1.4.2.3. Plasmid 60 – Megadalton Karch và cs (1987) là nhĩm tác giả đầu tiên quan sát và nghiên cứu về plasmid 60 – Megadalton (Mda) ở E. coli O157:H7 phân lập được từ bệnh nhân bị HC và HUS. Yếu tố độc lực này là một lơng bám dính giúp vi khuẩn gắn với tế bào ruột Henle 407. Mặc dù được phát hiện từ 13 trong 14 chủng E. coli O157:H7 phân lập được nhưng vai trị của yếu tố này trong quá trình gây bệnh chưa được làm rõ khi thí nghiệm với lợn con gây nhiễm. Do đĩ, mặc dù cĩ mặt ở các chủng E. coli O157:H7, vai trị gây độc của yếu tố này vẫn chưa được kết luận đầy đủ. 1.4.2.4. ðộc tố gây xuất huyết ruột (Enterohaemolysin) Một vài chủng cĩ khả năng gây dung huyết đã được xác định trong các nhĩm E. coli khác nhau. Gây xuất huyết ruột là một đặc điểm điển hình của nhĩm EHEC. Schmidt và cs (1994, 1995) cho biết hiện tượng xuất huyết ruột là kết quả của sự cĩ mặt của một loại protein – đĩ là protein gây xuất huyết Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 20 ruột EHEC (EHEC Hly – EHEC haemolysin protein). EHEC – Hly được mã hĩa bởi một plasmid lớn, liên quan tới dung huyết kiểu alpha. Schmidt và cs (1995) cũng đã xây dựng phương pháp PCR để xác định EHEC – hlyA. Khoảng 90% VTEC cĩ khả năng sản sinh độc tố này. Hầu hết các chủng VTEC gây xuất huyết ruột (98,4%) phân lập được từ động vật đều cĩ trình tự DNA đặc hiệu cho plasmid mã hĩa độc tố xuất huyết ruột. Cĩ thể dùng thạch máu cừu cĩ bổ sung canxi (WSBA-Ca: Wash sheep blood agar with Calcium) để xác định yếu tố này. Sau 4 giờ nuơi cấy, nếu quan sát thấy hiện tượng dung huyết là dung huyết kiểu alpha; cịn nếu để qua đêm mới quan sát thấy hiện tượng dung huyết thì chỉ chứng tỏ sự cĩ mặt của độc tố xuất huyết ruột. Do cĩ sự liên quan chặt chẽ giữa sự sản sinh VT và độc tố gây xuất huyết ruột nên sự biểu hiện của độc tố này là một đặc điểm tốt cho việc xác định nhanh và đơn giản các chủng VTEC. Sự tồn tại của EHEC – Hly ở EHEC là một đặc điểm quan trọng vì nĩ cĩ ở mọi chủng O157 phân lập được từ bệnh nhân HUS và từ mọi chủng VTEC phân lập được từ trẻ em bị HC. 1.4.3. Vai trị của VTEC khơng thuộc nhĩm O157 Mặc dù các triệu chứng của các bệnh nghiêm trọng ở người như HC và HUS hầu hết đều liên quan đến các chủng O157 (Beutin và cs, 1994), nhưng vẫn cĩ một số trường hợp bệnh lẻ tẻ do các chủng khơng thuộc nhĩm O157 gây ra. Cĩ hơn 30 nhĩm kháng nguyên O hoặc 100 serotyp O:H khác nhau được cho là cĩ liên quan tới một số ca bệnh HUS và HC ở người. ðĩ là các nhĩm O1, O2, O4, O5, O6, O18, O22, O23, O25, O26, O38, O39, O45, O48, O50, O55, O73, O75, O82, O84, O91, O100, O103, O104, O111, O113, O114, O115, O117, O118, O119, O121, O125, O126, O128ab, O132, O145, O146, O153, O163, O165, O166 và một số chủng chưa được định typ khác. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 21 Các VTEC khác khơng thuộc nhĩm O157 nên được chú ý hơn ở một số quốc gia. Ví dụ nguyên nhân thường gặp của HUS là các chủng khơng thuộc nhĩm O157 như O104:H2 ở Pháp, O111:H- ở Úc. Trước đây, đã cĩ một sự nhầm lẫn khi cho rằng chỉ những chủng E. coli O157 khơng lên men sorbitol mới thuộc nhĩm EHEC, do đĩ đã cĩ rất nhiều chủng EHEC quan trọng bị bỏ qua. Cĩ rất nhiều chủng EHEC phân lập được từ các trẻ em bị HUS như O6:H31, O26:H11, O91:H10, O98:H-, O111:H-, O111:H12, O146:H8, O157:H-,… (Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan, 1997). Cũng đã cĩ một số báo cáo về các vụ dịch do VTEC khơng thuộc nhĩm O157 gây ra. Năm 1992, ở Italia, O111:H- đã gây ra nhiều ca bệnh HUS. Ở Úc, báo cáo ca bệnh HUS đầu tiên do VTEC gây ra là vào năm 1987. Kiểm tra mẫu phân, các bác sỹ đã phân lập được chủng E. coli O111:H2. Năm 1990, Pryor và cs phân lập được O111 từ các bệnh nhân bị HUS, mà trong đĩ khơng sử dụng phương pháp phân lập các chủng O157 khơng lên men sorbitol. Năm 1996, ở Úc, Paton và cs kết luận chủng O111:H- là nguyên nhân gây ra một vụ dịch HUS ở Adelaide, Nam Úc, liên quan tới việc sử dụng sốt lên men. Các chủng vi khuẩn này đã gây chết một người, 23 trẻ em phải nhập viện và 18 trẻ em bị HUS. Chủng vi khuẩn này đã được phân lập từ mẫu phân của 18 trong số 23 bệnh nhân và từ 4 trong 5 mẫu sốt. Do đĩ, chủng O111 trở thành nguyên nhân gây HC và HUS chủ yếu ở Úc. Ở ðức, chủng O111:H- là chủng khơng thuộc nhĩm O157 thường gặp nhất liên quan tới HUS ở trẻ em. Cĩ một số chủng E. coli khơng thuộc nhĩm O157, khơng lên men đường sorbitol, là nguyên nhân gây HUS, như O104:H21 ở Montana (Mỹ). Ở ðức, từ 1988 – 1989, từ 91% bệnh nhân HUS đã phân lập được E. coli O157. Tuy nhiên, năm 1994, một số chủng khác phân lập được thường xuyên hơn chủng O157. ðiều này đưa ra một gợi ý về sự dịch chuyển về dịch tễ học Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 22 hướng về các chủng khác hơn là O157 và cĩ thể xảy ra ở các quốc gia khác nhau. Ở Úc, tỷ lệ phân lập O157 và các chủng khác ở trẻ em là tương đương nhau. Các chủng O157:H- lên men sorbitol cũng đã được phân lập từ 21 bệnh nhân HUS ở ðức năm 1988. Ngồi ra, kiểu gen và kiểu hình của chúng giống với các chủng O157:H7 lên men sorbitol. Ở Canada, VTEC O26:H11 là chủng phổ biến thứ hai sau O157:H7. Serotyp này thường gặp ở trâu bị, bê bị tiêu chảy và đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới, nhưng khơng nhiều ở Nhật Bản, Anh, Argentina. Ở người, VTEC O26:H11 gây một vài trường hợp bệnh riêng lẻ và một số ca bệnh tiêu chảy, HC và HUS (Laiking và cs, 2005). Nhiều chủng khơng thuộc nhĩm O157 cĩ nhiều yếu tố độc lực như sản sinh độc tố VT, gen eae, plasmid EHEC và độc tố gây xuất huyết ruột, do vậy, chúng được xếp vào nhĩm EHEC. Tuy nhiên, nhiều vi khuẩn thuộc nhĩm EHEC thiếu một hoặc nhiều yếu tố độc lực nhưng vẫn gây HUS và HC. Liều gây nhiễm của các chủng khơng thuộc nhĩm O157 cũng tương đương với chủng thuộc nhĩm O157. Cĩ thể chỉ với một số lượng rất nhỏ, dưới 10 vi khuẩn cũng cĩ thể gây ra những bệnh trầm trọng ở người mẫn cảm. Do đĩ, các chủng VTEC khơng thuộc nhĩm O157 gây bệnh HUS và HC ở người cũng cần được chú ý như VTEC O157. 1.4.4. VTEC ở động vật Carlton (2004) cho rằng tỷ lệ VTEC ở động vật dao động khoảng 6% - 100%. Các nghiên cứu đều cho thấy hầu hết các đàn gia súc đều cĩ O157 cũng như các VTEC khác nhưng hiện cĩ ít thơng tin về các yếu tố ảnh hưởng tới sự thải VTEC ra ngồi mơi trường của động vật. 1.4.4.1. VTEC O157 ở động vật Thơng thường, E. coli O157 cĩ thể được tìm thấy trong đường tiêu hĩa của một số lồi như trâu bị, cừu, gia cầm, trong đĩ trâu bị đĩng vai trị là nguồn tàng trữ chính (Levent Akkaya và cs, 2006). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 23 Trên thế giới, đặc biệt ở Mỹ, đã cĩ nhiều nghiên cứu về E. coli O157:H7 ở vật nuơi, thường trên trâu bị. Hancock và cs (1994) thấy rằng chỉ cĩ 10 trong 3570 (0,28%) mẫu phân bị sữa và 10 trong 1412 (0,71%) mẫu phân bị thịt cĩ chứa E. coli O157:H7. Zhao và cs (1995) đã tiến hành xác định sự tồn tại của E. coli O157:H7 trên bê ở các đàn bị sữa. Nhĩm nghiên cứu đã sử dụng các đàn bị trước đĩ đã phân lập được E. coli O157:H7 làm đàn thí nghiệm, ở các đàn này tỷ lệ dương tính với vi khuẩn cao hơn so với đàn đối chứng (50% và 22%). Tương tự, tỷ lệ phân lập phụ thuộc vào lứa tuổi của động vật. Tuy nhiên, khơng cĩ sự khác nhau về lứa tuổi giữa đàn đối chứng và đàn thí nghiệm. Bê sau cai sữa 4 tháng thường bài thải E. coli O157:H7 theo phân, với tỷ lệ phân lập từ các mẫu phân ở đàn thí nghiệm là 5,3% và 4,9% ở đàn đối chứng. E. coli O157:H7 phân lập được từ những bê trong độ tuổi từ 24 giờ sau khi sinh đến cai sữa là 1,5% ở đàn đối chứng và 2,9% ở đàn thí nghiệm. Một nghiên cứu bệnh chứng của Garber và cs (1995) cũng cho kết quả tương tự. Họ nhận thấy E. coli O157:H7 phân lập được ở các bê nuơi lấy sữa thường là những bê sau cai sữa (4,8%) hơn là trước cai sữa (1,4%). Trong một nghiên cứu khác, Faith và cs (1996) đưa ra kết luận tỷ lệ E. coli O157:H7 ở đàn bị sữa là 7% và ở các động vật khác là 1,8%. Hơn nữa, các tác giả này cũng kết luận rằng: bị cái tơ và trâu là nguồn tàng trữ E. coli O157:H7 quan trọng giống như bê. Ở Anh, Mechie và cs (1997) nghiên cứu tỷ lệ E. coli O157:H7 ở một đàn bị sữa đã dương tính với vi khuẩn này trước đĩ trong một thời gian khoảng 15 tháng. Tỷ lệ vi khuẩn này là 0% vào mùa đơng và đạt cao nhất là 14% ở bị đang tiết sữa, 40% ở bị cạn sữa, 56% ở bê và 68% ở bị cái tơ vào đầu mùa hè. Kết quả tương tự cũng thu được khi nghiên cứu trên cừu và trên bị thịt. Kudva và cs (1997) thấy tỷ lệ E. coli O157:H7 ở cừu trong khoảng từ 0% (vào mùa đơng) đến 30% (vào mùa hè). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 24 Các kết quả trên cho thấy tỷ lệ E. coli O157:H7 ở bị và cừu cĩ ý nghĩa quan trọng và phụ thuộc vào mùa trong năm. E. coli O157:H7 khơng gây bệnh cho bê từ 3 tuần tuổi trở lên. Tính gây bệnh của vi khuẩn cĩ liên quan đến tuổi, bê ở giai đoạn dưới 36 giờ sau khi sinh bị gây nhiễm E. coli O157:H7 ở giai đoạn 18 giờ sau khi sinh thấy cĩ biểu hiện tiêu chảy, viêm ruột, cĩ bệnh tích A/E ở cả ruột non và ruột già. Khơng cĩ bằng chứng cho thấy E. coli O157:H7 khơng gây bệnh ở bê đã cai sữa. Một số thí nghiệm khác cho thấy E. coli O157:H7 khơng gây bệnh cho bê. Vi khuẩn khơng phát triển ở niêm mạc đường tiêu hĩa, nhưng cĩ thể tồn tại trong chất chứa dạ cỏ và kết tràng, cĩ thể phát hiện theo từng đợt trong phân trong một thời gian dài. Rasmussen và cs (1993) nhận thấy chất chứa dạ cỏ đặc biệt ở những trâu bị lớn nhanh là một nguồn chứa E. coli O157:H7. Hơn nữa, vi khuẩn này cĩ khả năng tồn tại một thời gian ngồi đường tiêu hĩa cĩ thể là một nguyên nhân gây ra các vụ dịch liên quan đến sử dụng rau được bĩn phân trâu bị. Tương tự, các hoạt động sống của động vật và việc sử dụng chung nước uống, thức ăn trong chuồng cũng cĩ thể cĩ tác động làm lây lan vi khuẩn trong đàn. Nước uống bị nhiễm vi khuẩn cịn là một nguồn tàng trữ và lan truyền E. coli O157:H7. Khi nghiên cứu về E. coli O157:H7 trên thịt gà ở Thổ Nhĩ Kỳ, Levent Akkaya và cs (2006) cho rằng vi khuẩn này cĩ trong đường ruột của gà và được thải ra ngồi theo phân trong vài tháng. Sau đĩ, từ những gà này, E. coli O157:H7 cĩ thể nhiễm chéo sang các gà hoặc thịt gà trong quá trình vận chuyển và/hoặc quá trình giết mổ; bằng chứng là tỷ lệ dương tính 1,05% trong số 190 mẫu thịt gà được kiểm tra trong nghiên cứu. Việc phân lập được E. coli O157:H7 trên thịt gà cho thấy gà nĩi riêng và gia cầm nĩi chung cĩ thể là Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 25 một nguồn tàng trữ khác, dễ dàng lây nhiễm sang người nếu khơng cĩ các biện pháp kiểm sốt nghiêm ngặt. 1.4.4.2. VTEC khơng thuộc nhĩm O157 ở động vật Cĩ nhiều nghiên cứu về VTEC ở động vật đã được tiến hành. Cray và cs (1996) đưa ra tỷ lệ 5,9% của 1305 chủng E. coli phân lập được từ phân của bị cái tơ là VTEC. Ở ðức, Beutin và cs (1993) đã nghiên cứu về VTEC ở 7 lồi khác nhau. VTEC phân lập được từ cừu (66,6%) cao hơn từ dê (56,1%) và trâu bị (21,1%), thấp hơn nữa là ở lợn (7,5%), mèo (13,8%) và chĩ (4,8%). Khơng phân lập được chủng nào từ gà. Ở Tây Ban Nha, phân lập được VTEC từ 35% bị khỏe mạnh và 37% bê khỏe mạnh. Ở Canada, VTEC thường phân lập được ở bê nuơi lấy sữa (24,7%) hơn là từ bị sữa trưởng thành (9,5%). Ở Italia, VTEC phân lập được từ 18,3% bê nuơi lấy sữa và 7,8% lợn. Một nghiên cứu về tỷ lệ VTEC từ các chủng E. coli phân lập được từ vật nuơi bị bệnh ở Mỹ chỉ ra rằng 2,8% các chủng E. coli phân lập từ bị, 6,1% từ cừu, 4% từ lợn là VTEC. Ở Tây Ban Nha, VTEC thường phân lập được từ bê bị tiêu chảy (20,5%). Nghiên cứu này cũng cho biết các chủng khác khơng thuộc nhĩm O157 cĩ tỷ lệ phân lập trội hơn ở cả trâu bị bị tiêu chảy và khỏe mạnh. Hơn nữa, trong 126 chủng VTEC phân lập được cĩ 27 nhĩm kháng nguyên O khác nhau đã được xác định; trong khi đĩ con số này ở ðức là 16 nhĩm (trong 28 chủng). Tuy nhiên, ở Mỹ, Cray và cs (1996) chỉ thấy 18 nhĩm kháng nguyên O khác nhau trong 77 chủng VTEC phân lập từ phân bị cái tơ. 60% các chủng VTEC khơng thuộc nhĩm O157 phân lập từ trâu bị cĩ khả năng gây bệnh cho người, đặc biệt các bệnh nặng như HC và HUS. Montenegro và cs (1990) cho rằng tỷ lệ này chỉ khoảng 40% trong khi Blanco và cs cho rằng tỷ lệ này thay đổi từ 45% vào năm 1994 đến 60% năm 1997. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 26 Beutin và cs (1993) thấy rằng 60% VTEC phân lập từ 7 lồi vật nuơi khỏe mạnh cĩ khả năng gây bệnh cho người. Hiện nay, VTEC O26 thường phân lập được từ trâu bị và cĩ các đặc tính giống với các chủng phân lập được ở người (Wieler và cs, 1996), mặc dù, vẫn chưa cĩ bằng chứng cụ thể rằng các chủng O26 cĩ nguồn gốc từ trâu bị gây bệnh cho người (Jenkins và cs, 2003). Nhĩm vi khuẩn này đã được cảnh báo là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở người và được cho cĩ liên quan tới một vụ dịch lớn ở Ireland (McMaster và cs, 2001). Một nghiên cứu về các yếu tố độc lực của VTEC trên động vật cho thấy 57% VTEC cĩ gen VT1, 28% cĩ gen VT2 và 15% cĩ cả 2 gen. Blanco và cs (1996) cho rằng 10% số VTEC phân lập được cĩ mang gen gây bệnh tích A/E. 1.4.5. VTEC trong thực phẩm Cĩ nhiều vụ dịch do VTEC đã xảy ra ở một số quốc gia, trong đĩ nguyên nhân chính là do sử dụng thực phẩm bị ơ nhiễm, chủ yếu là các thực phẩm cĩ nguồn gốc từ bị. Sử dụng bánh hamburger nhân thịt bị là nguyên nhân chính gây ra các vụ dịch ở Anh, Mỹ và Canada, ngồi ra, cịn cĩ một vài vụ dịch liên quan đến sữa và các sản phẩm từ sữa, như sữa tươi, sữa chua, nước táo chưa tiệt trùng. EHEC đã được khẳng định là nguyên nhân gây bệnh trong một vụ dịch cĩ liên quan đến nước uống. Các vụ dịch thường xảy ra ở những nơi cơng cộng, trung tâm chăm sĩc sức khỏe, trường học,... Chế biến thực phẩm khơng đúng cách như nhiệt độ nấu thức ăn chưa đảm bảo, nhiễm từ các dụng cụ sử dụng chế biến thực phẩm tươi và thực phẩm đã nấu chín là những cách thức phổ biến gây ra các vụ dịch. Sự cĩ mặt của VTEC trong thực phẩm đã được khẳng định ở nhiều quốc gia. Ở Mỹ, chủng O157:H7 phân lập được từ 3,7% mẫu thịt bị xay, 1,5% mẫu thịt gia cầm, 1,5% mẫu thịt lợn và 2% mẫu thịt cừu. Ở Ai Cập, E. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 27 coli O157:H7 cĩ trong 6% mẫu thịt bị, 4% thịt gà, 4% thịt cừu và 6% mẫu sữa. Ở Mỹ, Willshaw và cs (1993) phát hiện 17% mẫu thịt bị tươi cĩ VTEC. VTEC cũng được phân lập ở Canada từ thịt bị (10,4%) và thịt lợn (3,8%). Samadpour và cs (1994) sử dụng mồi của gen VT để xác định sự cĩ mặt của VTEC trong các thực phẩm bán trên thị trường ở Seattle, Washington. Kết quả là 23% mẫu thịt bị, 18% mẫu thịt lợn, 48% mẫu thịt cừu, 12% mẫu thịt gà, 7% thịt gà tây, 10% cá, 5% sứa cĩ kết quả dương tính, tuy nhiên, chỉ thu được VTEC từ 12 (23,5%) mẫu cĩ phản ứng dương tính với gen VT. Mặt khác, liều gây nhiễm của VTEC O157 rất thấp. Bolton và cs (1996) báo cáo rằng từ liều rất thấp như 0,3 đến 2300 CFU/g đã phân lập được từ các mẫu thực phẩm cĩ liên quan tới các ca tiêu chảy ở người. Chỉ cần 1 VTEC trong 10 g nước sốt lên men cũng cĩ thể gây HUS. Liều gây nhiễm thấp là một lợi thế vì chủng vi khuẩn này cĩ thể tồn tại trong mơi trường axit. Benjamin và Datta (1995) đã cho thấy E. coli O157:H7 tồn tại trong mơi trường axit, pH 3,0 và 2,5 trong ít nhất 5 giờ ở 370C. Khả năng kháng axit của vi khuẩn này giống Shigella flexneri, Buchanan và Edelson (1996) cũ._.t mổ được cơ quan thú y thẩm định các điều kiện vệ sinh thú y – Bùi Thị Phương Hịa, 2008). Tình trạng này dẫn tới nguy cơ lây lan dịch bệnh và ơ nhiễm mơi trường nghiêm trọng. Hình 3.13: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của một số mẫu thịt sau quá trình điện di Ghi chú: Hàng trên: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 3, 4, 5, 6, 9, 11: Chủng phân lập (âm tính). Giếng 7, 8, 10, 12, 13, 14 và 15: Chủng phân lập (VT1). Hàng dưới: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 10, 11, 12, 14: Chủng phân lập (âm tính). Giếng 4, 6: Chủng phân lập (VT1/VT2). Giếng 3, 5, 7, 8, 9, 13 và 15: Chủng phân lập (VT1). Do điều kiện thực tế, chúng tơi chỉ tiến hành thu thập được 30 mẫu tại lị mổ lợn (gồm 15 mẫu phân và 15 mẫu lau thân thịt). Kết quả phân tích bằng phản ứng PCR cho thấy: khơng cĩ mẫu lau thân thịt nào dương tính với 1 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 67 trong 3 gen độc lực kiểm tra, chỉ cĩ 2 mẫu phân cho kết quả dương tính với gen VT1. Khi kiểm tra từng khuẩn lạc riêng biệt ở 2 mẫu này, chúng tơi phân lập được 3 chủng VTEC. Hình 3.14: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu phân và mẫu lau thân thịt sau quá trình điện di Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15: mẫu âm tính. Giếng 3, 6: mẫu phân dương tính(VT1). Hình 3.15: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của mẫu phân sau quá trình điện di M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 1 2 3 4 5 6 7 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 68 Ghi chú: M: 100 bp marker. Giếng 1: FD635 (VT1/VT2/eae). Giếng 2, 5, 7: âm tính. Giếng 3, 4, 6: mẫu dương tính (VT1). 3.4.2. Kết quả giám định các chủng vi khuẩn VTEC phân lập được 3.4.2.1. Kết quả xác định các loại độc tố VT của các chủng VTEC phân lập được Bằng kỹ thuật PCR, trong 41 chủng VTEC phân lập được, đa số đều cĩ mang gen VT1 (hơn 70%), chỉ cĩ một số ít chủng mang gen VT2, cĩ 2 chủng phân lập được từ thịt bị cĩ cả hai gen độc tố VT1 và VT2, chiếm tỷ lệ 25%. ðặc biệt, khơng chủng nào trong số các chủng VTEC phân lập được cĩ gen eae (bảng 3.10). Kết quả này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam, cho rằng tỷ lệ cĩ gen eae ở các chủng VTEC khơng thuộc nhĩm O157 là rất thấp. Nguyễn Bình Minh (2004) khi nghiên cứu về VTEC ở Việt Nam đã phân lập được 9 chủng từ 400 bệnh nhân bị tiêu chảy và 42 bị thịt. Kết quả cho thấy khơng chủng nào cĩ gen eae. Mohammad A. Islam và cs (2008) thu thập mẫu phân trực tiếp từ trực tràng của trâu, bị và dê ngay sau khi giết mổ ở Bangladesh. Tất cả các chủng VTEC khơng thuộc nhĩm O157 phân lập được đều khơng cĩ gen eae. Ngồi ra, cịn một số nghiên cứu khác cũng báo cáo kết quả tỷ lệ mang gen eae của các chủng VTEC thấp hoặc khơng cĩ, như Peiris và cs (2001), Irino và cs (2005). Thực tế cho thấy: các chủng phân lập được ở nghiên cứu này chưa thể hiện khả năng gây bệnh một cách rõ ràng, do chúng khơng cĩ một gen độc lực quan trọng (eae). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 69 Bảng 3.10: Khả năng sản sinh độc tố VT của các chủng VTEC phân lập được Khả năng sản sinh độc tố VT Nguồn gốc phân lập Số chủng xét nghiệm VT1 VT2 VT1 + VT2 Thịt bị 8 6 (75%) 0 (0%) 2 (25%) Thịt lợn 18 13 (72,22%) 5 (27,78%) 0 (0%) Thịt gà 12 10 (83,33%) 2 (16,67%) 0 (0%) Phân 3 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 3.4.2.2. Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn phân lập được với 9 nhĩm huyết thanh O đa giá (gồm 50 loại huyết thanh O đơn giá) được trình bày ở bảng 3.11. Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của 41 chủng VTEC phân lập được cho thấy các chủng VTEC thuộc về 14 nhĩm kháng nguyên O khác nhau, nhưng khơng cĩ chủng nào được xác định là thuộc nhĩm O157, O111 hay O26 - là 3 trong số các serotyp đã được xác định là thường gây ra các vụ ngộ độc và một số các chứng bệnh khác trên người như HC, HUS và TTP do ăn phải thực phẩm bị ơ nhiễm. Các kết quả nuơi cấy và giám định đặc tính sinh hĩa của 41 chủng vi khuẩn VTEC, đặc biệt là trên mơi trường CT-SMAC cũng đã một lần nữa khẳng định các kết quả này là hồn tồn phù hợp. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý ở đây là 2 loại serotyp O8 và O103 đều đã được phát hiện thấy ở một tỷ lệ nhất định trong số các chủng cĩ nguồn gốc từ thịt lợn và thịt bị. Chúng thuộc trong số 8 loại serotyp thường gây tiêu chảy xuất huyết ở bị và cĩ khả năng lây sang người, đặc biệt O8 là nhĩm vi khuẩn cĩ khả năng gây tiêu chảy khơng xuất huyết và HUS ở người. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 70 Bảng 3.11: Kết quả xác định serotyp của các chủng VTEC phân lập được Nguồn gốc chủng VTEC Kết quả ðịa điểm lấy mẫu Loại mẫu xét nghiệm Số chủng phân lập được Serotyp Số chủng dương tính Tỷ lệ (%) O1 2 11,1 O8 4 22,2 O18 2 11,1 O103 2 11,1 O143 2 11,1 O148 1 5,6 O159 1 5,6 O166 2 11,1 Thịt lợn 18 KXð 2 11,1 O8 6 75,0 Thịt bị 8 O125 2 25,0 O1 2 16,7 O15 3 25,0 O28ae 2 16,7 O152 2 16,7 O158 1 8,3 Chợ Thịt gà 12 O169 2 16,7 Lị mổ Phân lợn 3 O103 3 100,0 Ghi chú - KXð: Khơng xác định với 9 nhĩm huyết thanh đa giá Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 71 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ kết quả của nghiên cứu, chúng tơi rút ra một số kết luận như sau: 4.1.1. Phương pháp PCR phức với 3 loại cặp mồi (VT1, VT2 và eae) với các điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hĩa trong nghiên cứu này cĩ thể được áp dụng để xác định vi khuẩn VTEC, phản ứng cĩ độ đặc hiệu 100% và độ nhạy 2,3 – 6,6 x 104 vi khuẩn/ml 4.1.2. ðã xây dựng được một quy trình xác định vi khuẩn VTEC trong thịt. Quy trình này cĩ thể dễ dàng áp dụng trong các phịng thí nghiệm vi trùng để xác định mức độ vệ sinh an tồn của thịt tươi 4.1.3. Kết quả áp dụng thử nghiệm quy trình đã được xây dựng với 100 mẫu thịt tại chợ và 30 mẫu tại lị mổ cho tỷ lệ dương tính với vi khuẩn VTEC lần lượt là 32% và 6,7%. 4.1.4. Trong 41 chủng VTEC phân lập được, đa số đều cĩ gen VT1 (hơn 70%), chỉ cĩ một số ít chủng cĩ gen VT2, cĩ 2 chủng phân lập được từ thịt bị cĩ cả hai gen độc tố VT1 và VT2, chiếm tỷ lệ 25%. ðặc biệt, khơng chủng nào trong số các chủng VTEC phân lập được cĩ gen eae. 4.1.5. Kết quả xác định serotyp kháng nguyên O của 41 chủng VTEC phân lập được cho thấy các chủng VTEC thuộc về 14 nhĩm kháng nguyên O khác nhau, nhưng khơng cĩ chủng nào thuộc nhĩm O157, O111 hay O26. Nhĩm O8 và O103 đều đã được phát hiện thấy ở một tỷ lệ nhất định trong số các chủng cĩ nguồn gốc từ thịt lợn và thịt bị. 4.2. ðề nghị 4.2.1. Áp dụng thử nghiệm quy trình với các mẫu phân và mơi trường tại các trại chăn nuơi để xác định mức độ lưu hành của vi khuẩn thuộc nhĩm VTEC Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 72 và khả năng lây nhiễm của chúng sang các vật nuơi và thực phẩm dùng làm thức ăn cho con người. 4.2.2. Tiếp tục tiến hành thí nghiệm trên các loại mẫu để xác định được tỷ lệ VTEC trong thịt cũng như ở các động vật cung cấp thực phẩm, đồng thời xác định được nguồn gốc của VTEC ở Việt Nam. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. ðậu Ngọc Hào (2011), “An tồn sản phẩm chăn nuơi từ sản xuất tới tiêu dùng”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Tập XVIII (1), tr. 84 – 88. 2. Bùi Thị Phương Hịa (2008), “ Thực trạng cơng tác vệ sinh an tồn thực phẩm trong ngành chăn nuơi thú y và giải pháp khắc phục”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XV (2), tr. 93 – 99. 3. Nguyễn Bình Minh (2004), “Kỹ thuật PCR đa mồi xác định các loại Escherichia coli gây bệnh”, Tạp chí Y học Việt Nam, số 7, Tổng hội y dược học Việt Nam, tr. 1 - 4. 4. Phạm Thị Tâm, Phạm Cơng Hoạt, Trần Thị Hạnh, Tơ Long Thành và Lê Văn Nhương (2009), “Nghiên cứu chế tạo và lựa chọn kháng nguyên của vi khuẩn E. coli O157:H7 phục vụ thiết lập phản ứng ELISA”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Tập XVI (5), tr.11 – 15. 5. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội. 6. Võ Thành Thìn, Nguyễn Thị Ánh Hưng, ðặng Văn Tuấn và Ngơ ðăng Nghĩa (2008), “Tỷ lệ nhiễm và phân tích độc tố Shiga của vi khuẩn E. coli phân lập từ thịt bị tại TP Nha Trang”, Tạp chí khoa học và kỹ thuật thú y, tập XV (3), tr. 26 – 31. 7. Phương Thuận (2011), “Hơn 6000 người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm”, nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham-moi-nam.htm 8. Lê Thị Tuyết Trinh (2007), Phát triển và hồn thiện hệ thống PCR đa mồi xác định trực tiếp các Escherichia coli gây tiêu chảy từ phân, Luận văn thạc sỹ y học, ðại học Y Hà Nội, Hà Nội. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 74 9. Trần Trí Tuệ (2001), Gĩp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đốn Escherichia coli gây tiêu chảy, Luận văn Thạc sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội. TIẾNG ANH 10. Acheson D. W. K., Keusch G. T., Lightowlers M. and Donohue-Rolfe A. (1990), “Enzyme linked immunosorbent assay for Shiga toxin and Shiga- like toxin II using P1 glycoprotein from hydatid cysts”, Journal of Infectious Diseases, 161, p. 134 – 137. 11. Alfredo Caprioli, Silvia Bonardia, Emilio Maggia, Gisella Pizzina and Stefano Morabitob (2001), “Faecal carriage of Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 and carcass contamination in cattle at slaughter in northern Italy”, International Journal of Food Microbiology, Vol. 6, Issues 1 – 2, p. 47 – 53. 12. Allerberger F., Rossboth D., Dierich M. P., Aleksic S., Schmidt H. and Karch H. (1996), “Prevalence and clinical manifestations of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli infections in Australian children”, European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Disease, 15(7), p. 545 – 550. 13. Beebakhee G., Louie M., de Azavedo J. and Brunton J. (1992), “Cloning and nucleotide sequence of the eae gene homologue from enterohemorrhagic Escherichia coli serotyp O157:H7”, FEMS Microbiology Letters, 91, p. 63 – 68. 14. Begum D., M. P. Jackson (1995), “Direct detection of Shiga-like toxin- producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction”, Mol. Cell probes, 9, p. 259 – 264. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 75 15. Benjamin M. M. and Datta A. R. (1995), “Acid tolerance of enterohemorrhagic Escherichia coli”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p. 1669 – 1672. 16. Bergamini A.M.M (2007), “Prevalence and characteristics of Shiga toxin- producing Escherichia coli (STEC) strains in ground beef in Sao Paulo, Brazil”, Brazilian Journal of Microbiology, p. 1517 – 8382. 17. Bettelheim K. A. (1997), “Escherichia coli O157 outbreak in Japan: lesson for Australia”, Australian Veterinary Journal, 75 (2), p. 108. 18. Beutin L., Geier D., Steinruck H., Zimmermann S. and Scheuts F. (1993), “Prevalence and some properties of Verotoxin (Shiga-like toxin)- producing Escherichia coli in seven different species of healthy dosmetic animals”, Journal of Clinical Microbiology, 31 (9), p. 2483 – 2488. 19. Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S. and Gleier K. (1994), “Virulence factors and phenotypical traits of verotoxigenic strains of Escherichia coli isolated from human patients in Germany”, Medical Microbiology and Immunology, 183, p. 13 – 21. 20. Bolton F. J., Crozier L. and Williamson J. K. (1996), “Isolation of Escherichia coli from raw meat products”, Letters in Applied Microbiology, 23, p. 317 – 321. 21. Buchanan R. L. and Edelson S. G. (1996), “Culturing enterohemorrhagic Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple means of evaluating the acid tolerance of stationery-phase cells”, Applied and Environmental Microbiology, 62 (11), p. 4009 – 4013. 22. Carter G. R., Chengappa M. M. and Rober T. S. A. W. (1995), Essentials of veterinary Microbiology, Williams and Wikkins, Rose tree corporate Center building 21400 North providence Rd, Suite 5025 Media PA 19063-2043, A waverly Company. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 76 23. Carlton L. Gyles (2004), Pathogenesis, epidemiology, and control of VTEC infection in the cattle industry, 23rd World Buiatrics Congress, Quebec city, Canada. 24. Cray W. C., Thomas L. A., Schneider R. A. and Moon H. W. (1996), “Virulence attributes of Escherichia coli from dairy heifer feces”, Veterinary Microbiology, 53 (3-4), p. 467 – 474. 25. Donnenberg M. S., Tzipori S., Mc Kee M. L., O’Brien A. D., Alroy J. and Kaper J. B. (1993), “The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model”, Journal of Clinical Investigation, 92, p. 1418 – 1424. 26. Doyle M. P. and Padhye V. V. (1989), “Escherichia coli”, Foodborn bacterial pathogens, Marcel Dekker, Inc., New York, p. 235 – 281. 27. Dytoc M., Soni R., Cockerill III F., de Azacedo J., Louie M., Brunton J. and Sherman P. (1993), “Multiple determinants of Verotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 attachment-effacement”, Infection and Immunity, Vol. 61 No. 8, p. 3382 – 3391. 28. Fairbrother J. M., Bestchinger H. U., Nielsen O. N. and Pohlenz J. F. (1992), Escherichia coli infections diseases of swine, 7th edition, Wolfe publishing Ltd., Australian, p. 489 – 497. 29. Faith N. G., Shere J. A., Brosch R., Arnold K. W., Ansay S. E., Lee M. S., Luchansky J. B. and Kaspar C. W. (1996), “Prevalence and clonal nature of Escherichia coli O157:H7 on dairy farms in Wisconsin”, Appiled and Environmental Microbiology, 62 (5), p. 1519 – 1525. 30. Gannon V. P. J., R. K. King, E. J. Thomas (1992), “Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction”, Appl. Environ. Microbiol, 58, p. 3809 – 3815. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 77 31. Garber L. P., Wells S. J., Hancock D. D., Doyle M. P., Tuttle J., Shere J. A. and Zhao T. (1995), “Risk factors for fecal shedding of Escherichia coli O157:H7 in dairy calves”, Journal of American Veterinary Medicine Association, 207 (1), p. 46 – 49. 32. Gross W. G. (1994), Disease due to Escherichia coli in poultry. In Escherichia coli in Dosmetic animals and human, Edited by C. L. Gyles, Wallingford, England: CAB International, p. 237 – 259. 33. Gyles C.L and Fairbrother J.M (2004), Escherichia coli. In: Pathogens of bacterial infection in animal, Editor: Gyles C.L, Prescott J.F, Songer J.G and Thoen C.O. Blackwill publishing, p. 193 – 214. 34. Hancock D. D., Besser T. E., Kinsel M. L., Tarr P. I., Rice D. H. and Paros M. G. (1994), “The prevalence of Escherichia coli O157:H7 in dairy and beef cattle in Washington state”, Epidemiology and Infection, 113, p. 199 – 207. 35. Hanna Evelina Sidjabat-Tambunan (1997), Verocytotoxin producing Escherichia coli in food-producing animals, The degree of master of veterinary science, The University of Queensland, Australia. 36. Helge Karch and Thomas Meyer (1989), “Single primer pair for amplifying segments of distinct Shiga-like-toxin genes by polymerase chain reaction”, Journal of clinical microbiology, Vol. 27, No. 12, p. 2751 – 2757. 37. Vũ Khắc Hùng (2004), Escherichia coli – prevalence and comparison of virulence factors in strains isolated from pigs with diarrhea in Slovak Republic, The degree of Doctor, Slovak Republic. 38. Irino K., Kato M.A.M.F., Vaz T.M.I., Ramos I.I., Souza M.A.C., Cruz A.S., Gomes T.A.T., Vieira M.A.M. and Guth B.E.C. (2005), “Serotyps and virulence markers of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 78 isolated from dairy cattle in Sao Paulo state, Brazil”, Veterinary Microbiology, 105, p. 29 – 36. 39. Jenkins C., G. A. Willshaw, J. Evans, T. Cheasty, H. Chart, D.J. Shaw, G. Dougan, G. Frankel and H.R. Smith (2003), “Subtyping of virulence genes in verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) other than serogroup O157 associated with disease in the United Kingdom”, Journal of Medical Microbiology, 52, p. 941 – 947. 40. Jorge Blanco, Azucena Mora, Miguel Blanco, Jesus E Blanco, Ghizlane Dahbi, Cecilia Lopez, Paula Justel, Maria Pilar Alonso, Aurora Echeita, Maria Isabel Bernardez and Enrique A Gonzalez (2007), “Serotyps, virulence genes and intimin typs os Shiga toxin (verocytotoxin)- producing Escherichia coli isolates from minced beef in Lugo (Spain) from 1995 through 2003”, BMC Microbiology, 7:13, p. 1 – 9. 41. Karch H., Heesemann J., Laufs R., O’Brien A. D., Tacket C. O. and Levine M. M. (1987), “A plasmid of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 is required for expression of a new fimbrial antigen and for adhesion to epithelial cells”, Infection and Immunity, 55 (2), p. 455 – 461. 42. Konowalchuk J., Speirs J. I. and Stavric S. (1977), “Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli”, Infection and Immunity, 18 (3), p. 775 – 779. 43. Kudva I. T., Hatfield P. G. and Hovde C. J. (1997), “Characterization of Escherichia coli O157:H7 and other shiga toxin-producing E. coli serotyps isolated from sheep”, Journal of Clinical Microbiology, 35 (4), p. 892 – 899. 44. Lai King Ng., Matthew W. Gilmoiur, Tyler Cote, Jamie Munro, Linda Chui, John Wylie, Judith Issac-Renton, Greg Horsman, Dobryan M. Tracz and Ashleigh Andrysiak (2005), “Multilocus sequence typing of Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 79 Escherichia coli O26:H11 isolates carrying stx in Canada does not identify genetic diversity”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 43, No. 10, p. 5319 – 5323. 45. Lake R. and Cresscy A.H (2002), Rick profile: Shiga toxin-producing Escherichia coli in red meat and meat products, Institute of Environment Science & Research Limited Christchurch Scienve Centre, New Zealand. 46. Levent Akkaya, Halil Ibrahim Atabay, Beytullah Kenar and Mustafa Alisarli (2006), “Prevalence of verotoxigenic Escherichia coli O157:H7 on chicken carcasses sold in Turkey”, Bull Vet Inst Pulawy, 50, p. 513 – 516. 47. Lior H. (1994), “Classification of Escherichia coli”, In: Gyles C. L. (ed.) Escherichia coli in domestic animals and humans, CAB International, Wallingford, p. 31 – 72. 48. Louie M., de Azavedo J., Clarke R., Borczyk A., Lior H., Richter M. and Brunton J. (1994), “Sequence heterogeneity of the eae gene and detection of verotoxin-producing Escherichia coli using serotyp-specific primers”, Epidemiology and Infection, 112, p. 449 – 461. 49. MacDonald K. L. and Osterholm M. T. (1993), “The emergence of Escherichia coli O157:H7 infection in the United States”, Journal of American Medical Association, 269 (17), p. 2264 – 2266. 50. Mainil J. G., Jacquemin E. R., Kaeckenbeeck A. E. and Pohl P. H. (1993), “Association between the effacing (eae) gene and the Shiga-like toxin-encoding genes in Escherichia coli isolates from cattle”, American Journal of Veterinary Research, 54 (7), p. 1064 – 1067. 51. Matar G. M., Abdo D., Khneisser I., Youssef M., Zouheiry H., Abdelnour G. and Harakeh H. S. (2002), “The multiplex PCR based detection and Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 80 genotyping of diarrhoeagenic Escherichia coli in diarrhoeal stools”,Ann Trop Med Parasitol, 96 (3), p. 317 - 324. 52. McKee M. L. and O’Brien A. D. (1996), “Truncated enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 Intimin (EaeA) fusion proteins promote adherence of EHEC strains to HEp-2 cells”, Infection and Immunity, 64 (6), p. 2225 – 2233. 53. McMaster C., Roch E.A., Willshaw G.A., Doherty A., Kinnear W. and Cheasty (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli serotype O26:H11 outbreak in an Irish Creche”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 20(6), p. 430 - 432. 54. McPaeke S. J. W., Smyth J. A. and Ball H. J. (2005), “Characterisation of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds”, Veterinary Microbiology, 110, p. 245 – 253. 55. Mechie S. C., Chapman P. A. and Siddons C. A. (1997), “A fifteen month study of Escherichia coli O157:H7 in dairy herd”, Epidemiology and Infection, 118, p. 17 – 25. 56. Meng J., Zhao S., Doyle M. P., Mitchell S. E. and Kresovich S. (1996), “Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157:H7”, International Journal of Food Microbiology, 32, p. 103 – 113. 57. Meng J., Zhao S., Doyle M. P., Mitchell S. E. and Kresovich S. (1997), “A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing Escherichia coli O157:H7”, Letters in Applied Microbiology, 24, p. 172 – 176. 58. Mohammad A. Islam, Abdus S. Mondol, Enne de Boer, Rijkelt R. Beumer, Marcel H. Zwietering, Kaisar A. Talukder and Annet E. Heuvelink (2008), “Prevalence and Genetic Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates from Slaughtered Animals in Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 81 Bangladesh”, Applied and environmental microbiology, Vol. 74, No. 17, p. 5414–5421. 59. Montenegro M. A., Bulte M., Trumpf T., Aleksic S., Reuter G., Bulling E. and Helmuth R. (1990), “Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (6), p. 1417 – 1421. 60. Paton A. W., J. C. Paton, P. N. Goldwater, P. A. Manning (1993), “Direct detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in primary fecal cultures using the polymerase chain reaction”, J. Clin. Microbiol, 31, p. 3063 – 3067. 61. Paton J. C. and A. W. Paton (1998), “Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections”, Clin. Microbiol. Rev., 11, p. 450 – 479. 62. Paton J. C. and A. W. Paton (2002), “Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1, stx2, eae, ehxA and saa”, Journal of clinical microbiology, Vol. 40, No. 1, p. 271 – 274. 63. Paton A. W., Ratcliff R. M., Doyle R. M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J. A. and Paton J. C. (1996), “Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic-uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin-producing Escherichia coli”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (7), p. 1622 – 1627. 64. P. Alexa, L. Konstantinova, Z. Sramkova-Zajacova (2011), “Faecal shedding of verotoxigenic Escherichia coli in cattle in the Czech Republic”, Veterinarni Medicina, 56 (4), p. 149 – 155. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 82 65. Peiris J.S.M., P.H.M. Leung, W.C. Yam and W.W.S. Ng. (2001), “The prevalence and characterization of verotoxin-producing Escherichia coli isolated from cattle and pigs in an abattoir in Hong Kong”, Epidemiol. Infect., 126, p. 173 – 179. 66. Pourbakhsh S., Dho-Moulin M., Bree A., Desautels C., Martineau-Doize B. and Fairbrother J. M. (1997), “Localization of the in vivo expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally inoculated with pathogenic Escherichia coli”, Microbiol. Pathog., 22, p. 331 – 341. 67. Pryor W., Hodson E., McIntyre P. and Bettelheim K. A. (1990), “Toxigenic Escherichia coli in haemolytic ureamic syndrome” , The Medical Journal of Australia, 152, p. 221 – 222. 68. Rasmussen M. A., Cray W. C. Jr., Casey T. A. and Whipp S. C. (1993), “Rumen contents as a reservoir of enterohemorrhagic Escherichia coli”, FEMS Microbiology Letters, 114, p. 79 – 84. 69. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B. and Erlich H. A. (1987), “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, p. 487 – 491. 70. Samadpour M., Onerth J. E., Liston J., Tran N. Nguyen D., Whittam T. S., Wilson R. A. and Tarr P. I. (1994), “Occurrence of Shiga-like toxin producing Escherichia coli in retail fresh seafood, beef, lamb, pork and poultry from grocery stores in Seattle, Washington”, Applied and Environmental Microbiology, 60 (3), p. 1038 – 1040. 71. Sandhu K. S., Clarke R. C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H. and Gyles C. L. (1996), Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario. Epidemiology and Infection, 116, p. 1 -7. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 83 72. Schmidt H., Rusmann H., Schwarzkoft A., Aleksic S., Heesemann J. and Karch H. (1994), “Prevalence of attaching and effacing Escherichia coli in stool samples from patients and controls”, Zentrablatt fur Bakteriologie, 281 (2), p. 201 – 213. 73. Schmidt H., Beutin L. and Karch H. (1995), “Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933”, Infection and Immunity, 63 (3), p. 1055 – 1061. 74. Stein P. E, Boodhoo A., Tyrrell G. J., Brunton J. L. and Read R. J. (1992), “cvCrystal structure of the cell-binding B oligomer of verotoxin-1 from E. coli”, Nature (London), 355, p. 748 – 750. 75. Takeda Y. (1995), “Shiga and Shiga-like (Vero) toxins”, Bacterial toxins and virulence factors in disease (Edited by: Moss J., Iglewski B., Vaughan M. and Tu A. T..), Marcel Dekker Inc., p. 313 – 326. 76. Tesh V. L., Burris J. A., Owens J. W., Gordon V. M., Wadolkowski E. A., O’Brien A. D. and Samuel J. E. (1993), “Comparison of the relative toxicities of Shiga-like toxins typ I and typ II for mice”, Infection and Immunity, 61, p. 3392 – 3402. 77. Thomas A., Cheasty T., Frost J. A., Chart H., Smith H. R. and Rowe B. (1996), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli, particularly serogroup O157, associated with human infections in England and Wales: 1992 – 4”, Epidemiology and Infection, 117, p. 1 – 10. 78. ðỗ Ngọc Thúy (2004), The significance of Enterotoxigenic E. coli as a cause of pre-weaning piglet diarrhoea in North VietNam, The degree of Doctor of philosophy, The University of Queensland, Australia. 79. Tozzi A. E., Niccolini A., Caprioli A., Luzzi I., Montini G., Zacchello G., Gianviti A., Principato F. and Rizzoni G. (1994), “A community outbreak of haemolytic-uraemic syndrome in children occurring in a large area of Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 84 Northern Italy over a period of several months”, Epidemiology and Infection, 113, p. 209 – 219. 80. Wachsmuth (1994), “Summary: public health, epidemiology, food safety, laboratory diagnosis”, Recent advances in Verocytotoxin-producing Escherichia coli infection, Karmali M. A. and Goglio A. G. (eds.), Elsevier, Amsterdam, p. 3 -6. 81. Waters J. R., Sharp J. C. M. and Dev V. J. (1994), “Infection caused by Escherichia coli O157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland: a five year review, 1987 – 1991”, Clinical Infectious Disease, 19, p. 834 – 843. 82. Wieler L. H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A. and Baljer G. (1996), “Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from bovines association of adhesion with carriage of eae and other genes”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (12), p. 2980 – 2984. 83. Willshaw G. A., Smith H. R., Roberts D., Thirlwell J., Cheasty T. and Rowe B. (1993), “Examination of raw beef products for the presence of verocytotoxin producing Escherichia coli, particularly those of serogroup O157”, Journal of Applied Bacteriology, 75, p. 420 – 426. 84. Willshaw G.A., Cheasty T., Smith H.R., O'Brien S.J. and Adak G.K. (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O157 and other VTEC from human infections in England and Wales: 1995-1998”, J Med Microbiol, 50 (2), p. 135 – 142. 85. Winkle S. M., Refai M. and Rhode R. (1972), “On the antigenic relationship of Vibrio cholera to Enterobacteriaceae”, Annales de L’institut Pastuer, 123, p. 775 – 781. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ...................................... 85 86. Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun and Jing Hual-Qi (1999), “Escherichia coli O157:H7 and Shiga like-toxin-producing Escherichia coli in China”, World Journal of Gastroenterology, ISSN 1007-9327. 87. Yu J. and Kapper J. B. (1992), “Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Molecular biology, 6 (3), p. 411 – 417. 88. Zhao T., Doyle M. P., Shere J. and Garber L. (1995), “Prevalence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of a dairy herds”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p. 1290 – 1293. ._.