Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiệm khả năng chuyển gen gus vào cây thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. & de Vries)

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr­êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ----------eêf---------- §ç TIÕN PH¸T X¢Y DùNG QUY TR×NH T¸I SINH Vµ THö NGHIÖM KH¶ N¡NG CHUYÓN GEN GUS VµO C¢Y TH¤NG NHùA (PINUS MERKUSII JUNGH. & DE VRIES) LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh : Di truyÒn vµ chän gièng c©y trång M· sè : 60.62.05 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: ts. §INH THÞ PHßNG Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Đỗ Tiến Phát LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn cao học, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình từ nhiều cá nhân và cơ quan: Trước tiên cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đinh Thị Phòng, Viện Công nghệ sinh học, người đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc đến GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, định hướng, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện và hoàn thiện luận văn. Xin gửi tới các thầy cô và cán bộ Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội lời cảm ơn chân thành và sâu sắc, những người đã giảng dạy kiến thức, truyền đạt kinh nghiệm và dành những điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn những chia sẻ, định hướng, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học. Cuối cùng, tôi muốn gửi đến những người thân yêu trong gia đình, bè bạn một tình cảm sâu nặng và lòng biết ơn sâu sắc, những người đã luôn ở bên tôi, chia sẻ động viên, ủng hộ và dành mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Đỗ Tiến Phát MỤC LỤC STT Nội dung Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic AS Acetosyrigone BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair Cry Crystal gene = gen mã hóa protein tinh thể độc có tác dụng diệt côn trùng CV Coefficient of variation = sai số thí nghiệm CXN Cùng xâm nhập GA3 Gibberellic acid gus β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase Hyg Hygromycin phosphotransferase IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid LB Luria Bertani LSD Least significant difference = độ lệch chuẩn M16 Môi trường muối cơ bản theo Pullman và cộng sự (2003) MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density PPT Phosphinothricin SEV Split-end vector SP Môi trường muối cơ bản theo Smith (1996) SRT Sâu róm thông str/spc Streptomycine/spectinomycine phosphotransferase gene T-DNA Transfer –DNA = đoạn ADN được chuyển Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Vir Virulence Region = vùng gây độc WP Môi trường muối cơ bản theo Mc Cown và Llyod (1981) X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản tới khả năng sinh trưởng của cây in vitro 28 4.2. Ảnh hưởng của BAP tới việc tạo đa chồi từ phôi hạt chín 30 4.3. Thời gian cảm ứng và hiệu quả tạo đa chồi từ phôi hạt chín 32 4.4. Ảnh hưởng của BAP tới hiệu quả tái sinh đa chồi từ cây mầm 35 4.5. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng nhân nhanh cây thông in vitro 38 4.6. Nồng độ NAA và hiệu quả tạo rễ 40 4.7. Nồng độ IBA và hiệu quả tạo rễ 42 4.8. Ảnh hưởng của NAA-IBA tới hiệu quả tạo rễ 44 4.9. Ảnh hưởng của giá thể tới hiệu quả ra cây cây thông nhựa 46 4.10. Ảnh hưởng chất chọn lọc tới khả năng sống sót của cây thông nhựa 49 4.11. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới hiệu quả chuyển gen qua phôi hạt chín nguyên vẹn 52 4.12. Ảnh hưởng tuổi mẫu tới hiệu quả chuyển gen qua cây mầm 54 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Sơ đồ khái quát quá trình tái sinh in vitro cây thông nhựa từ hai nguyên liệu là phôi hạt chín và cây mầm 23 4.1. Cây thông nhựa sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 29 4.2. Cụm chồi thành từ phôi hạt chín 31 4.3. Các dạng chồi thành ở thời gian cảm ứng khác nhau 33 4.4. Đa chồi thành từ mẫu cây mầm 36 4.5. Cụm chồi cây thông nhựa hình thành trên môi trường nhân nhanh 38 4.6. Rễ cây thông nhựa thành trên môi trường bổ sung NAA 41 4.7. Rễ cây thông nhựa thành trên môi trường bổ sung IBA 42 4.8. Rễ cây thông nhựa thành trên môi trường bổ sung NAA - IBA 44 4.9. Cây thông nhựa sinh trưởng trên các giá thể khác nhau 47 4.10. Mẫu Thông nhựa sống sót trên môi trường bổ sung PPT 51 4.11. Mẫu Thông nhựa sống sót trên môi trường bổ sung hygromycine 51 4.12. Biểu hiện của gen gus trên phôi hạt chín 53 4.13. Biểu hiện gen gus trên mẫu cây mầm 55 1. MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Các loài thông thuộc chi Pinus là đối tượng cây lâm nghiệp được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như Hoa Kỳ, Canada, Chile, New Zealand, Úc, Nam Phi, Tây Ban Nha,…[42], [48], [72]. Ở nước ta, cây thông đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây rừng. Diện tích trồng thông chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng diện tích rừng trồng ở nước ta. Đây là loại cây có khả năng sinh trưởng trên điều kiện đất đai thoái hóa, nghèo dinh dưỡng và trong điều kiện lập địa xấu [42]. Ngoài tác dụng phủ xanh đất trống đồi trọc, phục hồi cảnh quan, chắn gió, làm sạch môi trường, thông còn cung cấp gỗ và nhựa phục vụ cho công nghiệp. Hai thành phần chính của nhựa thông là tinh dầu thông (turpetine) và tùng hương (colophony) được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sơn, mỹ phẩm, hóa chất tẩy rửa… Trong số các loài thông đang được trồng ở nước ta, Thông nhựa (Pinus Merkusii Jungh. & de Vries) là loài có giá trị kinh tế cao và được trồng với diện tích lớn nhất [63]. Một trong những trở ngại lớn cho công tác trồng rừng thông là sâu róm. Các biện pháp kỹ thuật canh tác, sinh học đã được áp dụng trong phòng chống sâu róm nhưng kết quả rất hạn chế. Biện pháp hóa học được sử dụng khi dịch bùng phát mạnh song rất khó thực hiện bởi chiều cao của cây và sức sinh sản nhanh của sâu hại. Ngoài ra, nó còn tiềm ẩn các nguy cơ về môi trường sinh thái. Tuy nhiên, việc tạo giống cây thông kháng sâu bằng phương pháp truyền thống hầu như không có hiệu quả. Công nghệ gen là một trong những giải pháp tạo ra những bước đột phá về năng suất, chất lượng cũng như tính chống chịu với điều kiện bất lợi. Cho đến nay, đã có nhiều công bố thành công về chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ở một số loài thông như Pinus taeda, Pinus roxburghii, Pinus omorika và Pinus radiata [42], [61]. . Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens có nhiều ưu việt hơn phương pháp bắn gen hay vi tiêm. Tuy nhiên, hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumefaciens phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn vật liệu dùng để nuôi cấy, thời gian cảm ứng, khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, nồng độ chất chọn lọc, khả năng tái sinh cây sau biến nạp gen, ... Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiệm khả năng chuyển gen gus vào cây thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. & de Vries)” 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích Xây dựng, hoàn thiện quy trình tái sinh và chuyển gen vào cây thông nhựa làm cơ sở để tiến hành chuyển gen kháng sâu vào loài thông này nhằm tạo ra được giống thông có khả năng chống chịu cao với sâu róm. 1.2.2. Yêu cầu - Xây dựng quy trình tái sinh cây thông nhựa (Pinus merkusii) thông qua đa chồi phục vụ việc chuyển gen. - Xác định được ngưỡng nồng độ chất chọn lọc và thử nghiệm chuyển gen gus vào cây thông nhựa. 1.3. Ý nghĩa khoa học của của đề tài Đây là nghiên cứu đầu tiên ở nước ta về nuôi cấy in vitro và chuyển gen trên đối tượng loài thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. & de Vries). Quy trình tái sinh đa chồi đã xây dựng được trong đề tài là quy trình tái sinh in vitro hoàn chỉnh đầu tiên ở Việt Nam đối với cây thông nói chung và Thông nhựa nói riêng. Kết quả của đề tài là cơ sở quan trọng trong chiến lược chọn tạo giống thông chống chịu cao với sâu róm. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây Thông nhựa 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và phân bố Thông nhựa (Pinus merkusii) là loài cây nhiệt đới thuộc chi Pinus, họ Thông (Pinaceae) và nằm trong bộ Thông (Coniferales) ngành hạt trần (Gynospermae) [24] Thông nhựa là loài thông bản địa ở Đông Nam Á và là một trong số các loài thông thuần chất nhiệt đới trên thế giới. Loài này xuất hiện tự nhiên ở phía Đông Nam châu Á (Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia, Indonesia và Philippin). Vùng phân bố của loài này trải dài từ khoảng từ 23o vĩ Bắc tới 2o Nam, Thông nhựa cũng tìm thấy ở đảo Hải Nam Trung Quốc. Diện tích rừng Thông nhựa lớn nhất được phát hiện ở phía Tây Bắc Thái Lan, vùng Đông Nam Myanmar và phía Bắc đảo Sumatra. Thông nhựa thích nghi chủ yếu ở độ cao từ 30 mét đến trên 1800 mét so với mực nước biển. Thông nhựa phát triển được trên nhiều loại đất lập địa và phổ khí hậu từ vùng ôn đới đến nhiệt đới gió mùa trong điều kiện lượng mưa hàng năm thay đổi từ 3800 mm (ở vùng Zambales - Philippin) xuống 1000 mm -1200mm (ở một số vùng lục địa châu Á) và có thể thích nghi với cả điều kiện nhiệt độ thay đổi trong khoảng từ 19-280C. Tái sinh tự nhiên tốt, đặc biệt ở những vùng mà khí hậu thích hợp (để Thông nhựa ra hoa vào tháng 5-6 và hạt chín vào khoảng tháng 9 - 10 năm sau). Trong 5 năm đầu, Thông nhựa phát triển chậm, những năm tiếp theo cây sinh trưởng phát triển nhanh [63]. 2.1.2 Đặc điểm sinh học Cây gỗ lớn, tán hình trứng, phân cành thấp, vỏ cây màu xám nâu, thường nứt dọc sâu. Trong thân có nhiều nhựa, nhựa thơm hắc. Lá hình kim, có hai lá mọc cụm trên một đấu cành nhắn, lá có chiều dài 20 - 25 cm, có màu xanh đậm. Cành ngắn đính lá thường dài 1-1,5 cm, đính vòng xoắn ốc vào cành lớn. Nón đơn tính cùng gốc, nón cái chín trong hai năm. Nón thường hình trứng cân đối, có kích thước thường là: chiều cao 4 - 5 cm, chiều rộng 3 - 4 cm, cuống nón thường thẳng và dài 1,5 cm. Lá bắc kém phát triển, lá noãn thường hóa gỗ khi chín. Mặt vảy hình thoi, có hai gờ ngang dọc nổi rõ, rốn vảy lõm. Mỗi vảy có hai hạt, hạt có cánh [24], [63]. 2.1.3 Giá trị kinh tế và sử dụng của cây thông nhựa Dác gỗ và lõi gỗ phân chia rõ ràng, dác gỗ màu vàng còn phần lõi có màu nâu đỏ. Gỗ nặng, trọng lượng vào khoảng 0,64 - 0,80 g/cm3. Gỗ thông được sử dụng trong xây dựng, sản xuất diêm, giấy, đồ gia dụng, giàn hầm khai thác, đóng tàu... Thông nhựa là loài cây có khả năng cung cấp một trữ lượng nhựa lớn và ổn định. Nhựa có thể thu hoạch từ những cây thông nhựa khoảng 15 năm tuổi, lượng nhựa thu được mỗi năm từ 4 - 6,5 kg, thời gian thu hoạch nhựa kéo dài từ 40 - 50 năm. Nhựa thông với thành phần chính là tinh dầu thông (turpentine) và tùng hương (colophany) là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Khi chế biến nhựa thông sẽ thu được khoảng 70% tùng hương và 20% tinh dầu thông, 10% còn lại là nước và một số tạp chất khác. Dầu thông được dùng trong công nghiệp hóa chất, dược liệu, mỹ phẩm, trong việc chế tạo các loại sơn, long não tổng hợp, cellulose và tổng hợp nhiều loại chất thơm quí... Tùng hương được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp: giấy, cao su, xà phòng, diêm và thuộc da... Giá trị kinh tế mà nhựa thông đem lại vào khoảng 600 USD/tấn tùng hương và 650 USD/tấn tinh dầu thông. 2.1.4 Tình hình sản xuất cây thông nhựa Hiện nay, trên thế giới, người ta đã sử dụng 30 loài thông để khai thác nhựa ở qui mô công nghiệp. Trong đó, cây thông nhựa có một vị thế khá quan trọng và tập trung chủ yếu ở Đông Nam châu Á. Diện tích trồng Thông nhựa lớn nhất tập trung ở Indonesia, Thái Lan và Việt Nam. Vào cuối thập niên 80 của thế kỷ 20, Indonesia ước tính có khoảng 100.000 ha Thông nhựa tập trung ở chủ yếu ở Java và khoảng 1000 ha ở Zambia [63]. Ở Việt Nam, các loài thông được trồng chủ yếu là Thông nhựa (Pinus merkusii), Thông đuôi ngựa (Pinus massoniana), Thông 3 lá (Pinus kasyia), Thông 5 lá (Pinus excelsa), Thông 5 lá dẹt (Pinus krem). Trong các loài thông này chỉ có Thông nhựa, Thông đuôi ngựa và Thông 3 lá là chiếm chủ yếu và cho khai thác nhựa. Với đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây thông, một loài cây chịu hạn có thể sống và phát triển trên những lập địa xấu, khô hạn. Do đó trong chương trình trồng rừng 327 trước đây và chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng hiện nay, cây thông được chọn là cây trồng chính quan trọng cần được ưu tiên phát triển. Trong ba loài thông đang được sử dụng để khai thác nhựa ở nước ta thì Thông nhựa là loài cây cho nhiều nhựa nhất và đang được trồng rộng rãi [25]. Vào cuối năm 1999, Việt Nam ước tính có khoảng 218.056 ha rừng thông, với các loài khác nhau như P. merkusii, P. massoniana và P. kasyia, trong đó diện tích Thông nhựa (Pinus merkusii) khoảng 100.000 ha. Thông nhựa là loài cây rất quan trọng ở những vùng đồi trọc tập trung ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam như: Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Lạng Sơn, Quảng Ninh… với tác dụng chống sói mòn rửa trôi, cung cấp nhựa và nguyên liệu gỗ. Hiện nay, một số vùng gây trồng Thông nhựa chính của cả nước như Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Thanh Hoá, Nghệ An và Hà Tĩnh đã thành lập 20 ha vườn giống bằng cây ghép có nguồn gốc từ 185 cây trội. Đây là các cá thể được chọn lọc với ưu điểm sinh trưởng nhanh và hàm lượng nhựa thực tế vượt so với trị số bình quân của lâm phần (tương đương 200-300%). Tập đoàn cây giống này có ý nghĩa quan trọng trong kế hoạch trồng rừng trước mắt cũng như chương trình cải thiện giống lâu dài đối với loài thông này [28], [63]. 2.2 Sâu róm hại thông 2.2.1 Sâu róm thông Những nghiên cứu gần đây cho thấy dưới tên gọi “sâu róm thông” (SRT) có tới 3 loài khác nhau: sâu róm thông đuôi ngựa (Dendrolimus punctatus Walker), sâu róm thông 3 lá (Dendrolimus kikuchii Misumura), hai loài này thuộc họ Lasiocampidae, bộ cánh vảy Lepidoptera; ngoài ra còn loài sâu róm 4 chùm lông (Dasychira axantha colienette), thuộc họ Lymantriidae, bộ cánh vảy Lepidoptera. Loài Dendrolimus punctatus Walker có phân bố rộng từ miền Bắc đến miền Trung nước ta và gây thiệt hại nhiều nhất cho các khu rừng thông ở độ tuổi 8-15 năm. Loài Dasychira axantha colienette xuất hiện ở Quảng Ninh và Sơn La nhưng chủ yếu gây hại ở Hoành Bồ, Quảng Ninh trên rừng Thông đuôi ngựa và Thông nhựa. Loài Dendrolimus kikuchii Misumura đã được phát hiện tại vùng cao nguyên Trung bộ, chủ yếu gây hại trên rừng Thông 3 lá, hầu như chưa phát dịch lớn ngoại trừ trường hợp gây hại cục bộ trên 18 ha rừng thông 10 tuổi lại A Lưới (Thừa Thiên Huế) vào năm 1987 [9]. Tuy nhiên, sâu róm Thông đuôi ngựa (Dendrolimus punctatus Walker) là đối tượng gây hại chủ yếu và phổ biến ở nước ta và gây hại đặc biệt trên cây thông nhựa. 2.2.2 Thiệt hại do sâu róm thông gây ra Trên thế giới: Sâu róm thông từng gây ra những đại dịch, hủy hoại những cánh rừng thông trên thế giới. Năm 1998, Australia và Scotlent đã gặp rất nhiều khó khăn khi mùa giáng sinh đến do sâu róm thông phá hoại các khu rừng thông, các cây thông trang trí ở các vùng trồng thông rộng lớn. Cũng trong thời gian này, dịch sâu róm đã xuất hiện ở phía Nam Canada, một số nước châu Âu, Chile và Tây Bắc Mỹ. Năm 2001, hơn 30% rừng thông đang tuổi thu hoạch của Chile bị sâu róm tấn công, thiệt hại ước tính khảng 3 triệu đô la [56]. Những năm gần đây sâu róm thông cũng xuất hiện và gây hại lớn cho các cánh rừng thông của Trung Quốc, Đài Loan và một số quốc gia Nam Á. Sâu róm thông được coi là loài sâu gây hại nghiêm trọng nhất và gây tổn thất nặng về kinh tế đối với rừng phía Nam Trung Quốc. Năm 1998, ở khu vực này, diện tích thông bị sâu róm tàn phá là 3 triệu ha và ước tính mất đi 5 triệu m3 gỗ mỗi năm [62]. Việt Nam: Sau khi gây ra những trận dịch lớn tại miền Bắc vào những thập niên 1960-1970, sâu róm thông có xu hướng dịch chuyển trung tâm phát dịch vào khu vực phía Nam điển hình là Bắc Trung Bộ và gây ra những trận dịch lớn ở Thanh Hoá, Hà Tĩnh, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế. Đây là khu vực thường có khí hậu khô nóng, đất nghèo dinh dưỡng, rừng có độ tuổi non và tập trung trên diện tích lớn. Theo thống kê hàng năm, diện tích rừng thông bị hại ở nước ta do sâu róm thông gây ra lên tới 8.000-15.000ha. Năm 2003 sâu róm thông đe dọa quét sạch diện tích rừng thông ở Nghệ An, Hà Tĩnh và một số tỉnh khác ở miền Bắc. Từ năm 2005 trở lại đây, sâu róm thông lại có xu hướng phát triển mạnh trở lại và hình thành những “đại dịch sâu róm thông” đe doạ tới rừng thông của tất cả các vùng trong cả nước. Năm 2005-2006, Nghệ An có tới hơn 3.976 trên 6.000 ha rừng khối các lâm trường bị nhiễm sâu róm thông. Trong đó, diện tích nhiễm nhẹ trên 2.874 ha, nhiễm trung bình 887 ha, nhiễm nặng 215 ha, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng nhựa [18], [10]. Cũng trong năm 2006, gần 100 ha rừng thông có giá trị kinh tế cao thuộc Ban quản lý rừng phòng hộ Cẩm Xuyên (Hà Tĩnh) bị sâu róm tàn phá nặng nề. Tại thanh Hóa, trong ba tháng đầu năm 2006, sâu róm tàn phá gần 10.000 ha rừng thông của tỉnh, mật độ sâu trung bình 50-70 con/m2, có nơi mật độ lên tới 150 con/m2, làm rừng thông bị trơ trụi lá, giảm tỉ lệ nhựa, có nguy cơ chết hàng loạt [3]. Năm 2007, ở Kom Tum dịch "sâu róm thông" đã bùng phát dữ dội tại địa bàn 2 tiểu khu 337 và 338 thuộc xã Đăk Hring (huyện Đăk Hà), hàng nghìn ha rừng thông bị đe doạ với mật độ sâu róm từ 120-150 con/cây. Ở Bắc Kạn, 985 ha rừng thông tại huyện Ngân Sơn xuất hiện sâu róm với mật rất cao, cá biệt có nơi lên đến trên 1000 con/cây [27]. Năm 2008, dịch sâu róm thông đã xuất hiện ở Lạng Sơn, với tổng diện tích trên 2.000 ha với mật độ trung bình từ 200-300 con/cây, có nơi mật độ lên tới 400-600 con/cây [2]. Từ đầu năm 2009 đến nay, dịch sâu róm phát sinh và phát triển với tốc độ nhanh chóng, đã phá hoại tới 2.800 ha rừng thông thuộc Lâm trường Quảng Trạch. Trong số này có khoảng 15 ha đã bị ăn trụi lá, trơ cành, khoảng 150 ha khác đang bị tàn phá mạnh với mật độ hàng trăm con sâu/cây [8]. Sâu róm thông gây ra thiệt hại to lớn về mặt kinh tế và sinh thái lâm nghiệp. Sâu ăn trụi lá thông, cây không phát triển, sản lượng nhựa suy giảm thậm chí mất trắng. Năm 2006, Hà Tĩnh có 1500 ha rừng thông bị gây hại, làm mất 800-1000 tấn nhựa, ước tính thiệt hại lên tới 12 tỷ đồng. Ngoài ra nó cũng gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng tới cuộc sống sinh hoạt của người dân. Sâu bu bám vào cành cây, nhà cửa, công sở gây xáo trộn sinh hoạt, cuộc sống và sức khỏe của người dân. Sâu róm thông đang là nỗi hiểm hoạ đối với những cánh rừng trong thời gian gần đây. Rất nhiều biện pháp được áp dụng để phòng ngừa và tiêu diệt sâu róm thông nhưng hiệu quả không cao. Phương pháp sử dụng thuốc hóa học được xem như giải pháp tình thế hữu hiệu để dập dịch tuy nhiên gặp phải trở ngại bởi chiều cao của tán cây, địa hình các vùng rừng hiểm trở và tác hại xấu mà nó để lại với môi trường sinh thái và sức khỏe con người. Việc chọn tạo các giống thông có khả năng chống chịu hay kháng sâu róm là một yêu cầu cấp bách và là hướng đi triển vọng với sự hỗ trợ của Công nghệ sinh học. 2.3 Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng 2.3.1 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong tạo giống cây trồng Mặc dù phôi thai từ đầu thế kỷ 20, khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật vào chọn giống và nhân giống cây trồng chỉ rõ nét vào khoảng 30 năm gần đây thông qua việc phát hiện tính toàn năng của tế bào và hàng loạt các ứng dụng như: - Tạo cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn để tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối nhằm rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả trong chu trình lai tạo. - Khả năng nuôi cấy protoplast và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. - Kỹ thuật loại trừ virus bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. - Sử dụng các chồi nách, các thể chồi vào nhân giống vô tính với tốc độ nhanh, độ đồng đều cao ở một số cây trồng quan trọng. - Ứng dụng nuôi cấy mô, cứu phôi nhằm khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa. - Bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây in vitro. Đồng thời có thể tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà vẫn giữ nguyên được tính toàn năng của tế bào. - Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật dẫn tới những biến đổi trong bộ máy di truyền và hình thành các đặc tính biểu hiện ra bên ngoài. Nói cách khác đó là khả năng ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy mô trong chuyển gen vào thực vật. Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật dễ nhận thấy là trong lĩnh vực nhân giống và phục tráng giống cây trồng. Ngay từ những năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loại địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và tiếp tục nuôi cấy sẽ thu được các protocorm mới. Các protocorm được đặt trong những điều kiện nhất định sẽ phát triển thành các cây địa lan hoàn chỉnh. Ngoài ra ông cũng phát hiện ra các tế bào ở đỉnh sinh trưởng của thực vật chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus, do đó với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục tráng tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều đối tượng cây trồng khác. Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật được Nozenran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách trên đối tượng cây nho và cây khoai tây. Kỹ thuật nuôi cấy mô cũng được áp dụng trong việc nhân giống với quy mô thương mại trên các đối tượng cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, khoai tây, thuốc lá, cây có múi… và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được ứng dụng mạnh mẽ vào công tác tuyển chọn giống, nhân giống, gây tạo biến dị và chọn dòng. Ngoài ra nó cũng được áp dụng trong việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu về lý luận di truyền của thực vật bậc cao [21]. Ở nước ta, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại nhiều thành tựu to lớn. Rất nhiều quy trình nhân nhanh đã được xây dựng với các đối tượng cây trồng quan trọng như mía, dứa, chuối, khoai tây, một số loài hoa cũng như nhiều đối tượng cây lâm nghiệp như bạch đàn, keo… [12], [1], [14], [20]. Các quy trình này giờ đây đã trở nên thông dụng và phổ cập tới tận các trung tâm và nhiều phòng nuôi cấy mô tại các địa phương. Trong lĩnh vực phục tráng giống sạch bệnh, chúng ta cũng đã có những kết quả quan trọng trên các đối tượng như khoai lang, khoai tây…Việc chọn tạo giống lúa mới thông qua biến dị soma đối với giống lúa DR1, DR2 ... đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp [16]. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là mắt xích quan trọng không thể thiếu được của công nghệ gen, đặc biệt là chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens [15], [5], [26], [7]. 2.3.2 Tái sinh in vitro ở cây thông Không giống như những đối tượng cây rừng khác, việc tái sinh in vitro bằng cách tạo đa chồi hay tái sinh thông qua mô sẹo và phôi soma trên cây thông gặp rất nhiều khó khăn. Nguyên nhân chủ yếu do tính chất ngủ nghỉ sâu của hạt cũng như khả năng sinh trưởng rất chậm của loại cây này trong điều kiện in vitro. Mặc dù vậy, một vài quả tái sinh phôi soma trên cây thông được công bố khá sớm, cách đây khoảng 20 năm. Sau đó, hàng loạt các nghiên cứu về cấu trúc phân tử, tế bào, điều kiện vật lý, các loại môi trường …được thực hiện để xây dựng một quy trình tái sinh thông qua phôi soma với hiệu suất cao [35]. Từ những cải tiến về môi trường nuôi cấy và sử dụng các chất điều hòa áp suất thẩm thấu như ABA, PEG… giúp cho đường hướng tái sinh phôi soma gặp nhiều thuận lợi với hàng loạt các công bố về tái sinh và chuyển gen [35], [64]. Thời gian gần đây, việc sử dụng phôi hạt non giúp nâng cao tỷ lệ tái sinh mô sẹo và khắc phục những khó khăn ở một số loài thông cũng đã được công bố. Tuy nhiên, phương pháp tái sinh thông qua phôi soma còn nhiều tồn tại bao gồm tỷ lệ mô sẹo biệt hóa tạo phôi thấp, khả năng phôi soma phát triển thành cây hoàn chỉnh không cao và chỉ thành công trên một vài loài nhất định [31], [57]. Do vậy, trong vài năm trở lại đây, nghiên cứu tái sinh in vitro thông qua đa chồi từ phôi hạt chín, hạt chưa chín cũng đã được nghiên cứu để tạo giống thông chuyển gen. Rất nhiều gen khác nhau được chuyển nạp thành công vào cây thông khi áp dụng phương pháp này như gen gus, bar, cry…[34], [43], [69]. Đây là đường hướng quan trọng đối với một số loài thông gặp khó khăn trong tái sinh thông qua mô sẹo và phôi soma. Mặc dù cậy, cho đến nay trên đối tượng Thông nhựa (Pinus merkusii), một loài thông bản địa của khu vực Đông Nam Châu Á, việc nghiên cứu tái sinh và chuyển gen vẫn còn hạn chế, chưa có những thành công cụ thể. 2.3.3 Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens Cho đến nay có khá nhiều phương pháp đã được sử dụng để tạo cây trồng chuyển gen. Dựa vào cách thức đưa gen vào tế bào thực vật mà có các phương pháp như chuyển gen trực tiếp và gián tiếp. Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật chuyển gen với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý để đưa vào tế bào thực vật một hay nhiều gen quan tâm. Chuyển gen trực tiếp bao gồm các phương pháp vi tiêm, polyethylen glycol (PEG), phương pháp dung hợp tế bào trần, phương pháp xung điện và phương pháp bắn gen. Tuy nhiên chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp được sử dụng rộng rãi với ưu điểm dễ thực hiện và hiệu quả chuyển nạp gen cao. 2.3.3.1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai vi khuẩn gây bệnh cho thực vật đã được biết đến và nghiên cứu từ lâu. Tuy nhiên, sau những khám phá về khả năng xâm nhiễm và chuyển một đoạn ADN của Ti-plasmid nhập vào bộ gen của cây bị bệnh, chúng mới được sử dụng như một vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô tế bào thực vật. 2.3.3.2 Các hệ thống vector dùng để chuyển gen Hệ vector cùng xâm nhập (CXN) Hệ thống vector CXN gồm hai plasmid riêng rẽ: Ti-plasmid của Agrobacterium và vector trung gian trong E. coli. Hai vector này có vùng tương đồng và có thể tái tổ hợp tạo thành plasmid lớn hơn sau khi có sự tiếp hợp giữa Agrobacterium và E. coli. Gen định chuyển vào thực vật được tách dòng và thao tác trên E. coli, sau khi tái tổ hợp với Ti-plasmid trong Agrobacterium thì nằm giữa hai vùng lặp lại của T-ADN. Riêng E. coli plasmid không có điều kiện sao mã để giữ trong Agrobacerium và nó không được giữ lại nếu không có các bước tái tổ hợp. Một trong những hệ thống vector cùng xâm nhập cho hiệu quả chuyển nạp cao là hệ thống vector có đầu chẻ (split-end vector) ký hiệu SEV. Hiện nay, một plasmid loại SEV thường dùng là pMON200 và plasmid của Agrobacterium tương ứng là pTiB6S3SE [22]. Hệ vector nhị thể (Binary vector) Ti-plasmid là một đoạn phân tử ADN mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử bằng 3-5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Sử dụng Agrobacterium chuyển gen gặp khó khăn do Ti-plasmid của Agrobacterium lớn (200kb). Ti-plasmid chứa các gen khối u gây bất lợi cho thực vật, cản trở quá trình tái sinh bình thường ở thực vật [32]. Các enzyme giới hạn có thể cắt ADN của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau. Trong khi công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới hạn. Mặt khác, khi chuyển các Ti-plasmid này vào E.coli, sẽ không có khả năng tái bản trong E.coli. Chính vì vậy phải tạo nên các plasmid cải biến. Do đó, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể: gồm 2 plasmid cùng tồn tại trong Agrobacterium sau tiếp hợp: một plasmid khép kín (vector chuyển gen) và Ti-plasmid (vector bổ trợ - helper Ti-plasmid). Plasmid khép kín đặc trưng bao gồm 1 hoặc cả 2 vùng (phải và trái) lặp lại của T-ADN, vùng có thể sao mã và khởi động trong nhiều chủ thể và gen chỉ thị chọn lọc làm cho plasmid có thể hoạt động trong E.coli và Agrobacterium. Vector bổ trợ có các gen vir, gen khởi đầu phiên mã của Agrobacterium (Ori A), không có các vùng T-ADN. Sau khi tiếp hợp, 2 plasmid cùng tồn tại một áp lực chọn lọc trong Agrobacterium. Khi Agrobacterium nhiễm vào cây bị thương các gen vir của vector bổ trợ tương tác với vùng phải của Ti-plasmid khép kín theo chiều trans để chuyển T-ADN vào genome thực vật [22]. 2.3.3.3 Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình chuyển gen - Vùng T-ADN: là đoạn ADN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen của cây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gen có thể biểu hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [13], [23]. - Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gen. Vùng Vir có vai trò kích thích việc biến nạp của T-ADN. Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có tác dụng làm tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gen [37], [44]. - Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong quá trình biến nạp T- ADN, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ thể giúp tạo ra exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời gắn vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt gens) … Ngoài ra những gen khác như mia A đóng vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [44]. Tóm tắt cơ chế chuyển gen của A.tumefaciens: Khi nhận được các phân tử tín hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất phenolic (cacbolic acid), Acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid, đường đơn hoặc các tín hiệu khác như pH axit (pH5 - 5,5), đói phosphat và opine, làm dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật (AS, OH-AS được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy tế bào thuốc lá - giống như những sản phẩm của chuyển hoá phenyl propanoid - một khâu chủ yếu trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin và các chất thơm. Những chất này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiệ._.n stress và bị thương, ta gọi là hợp chất dẫn dụ). Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào thực vật và Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành bó gắn lên bề mặt tế bào thực vật. Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá các gen vùng vir. Sự thể hiện gen vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng gồm các sản phẩm của virA và virG. Chính các sản phẩm protein của các gen vir đã làm nhiệm vụ chế biến T-ADN. Một số bằng chứng chứng tỏ T-ADN được vận chuyển tới nhân tế bào thực vật và gắn hoá trị vào genome thực vật, sau đó, T-ADN được phiên mã nhờ ARN polymerase II [36], [38]. Cho đến nay, phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium được ứng dụng rộng rãi và mang lại nhiều thành quả to lớn [13]. Ước tính sơ bộ gần 80% cây trồng chuyển gen thương mại hóa được tạo ra thông qua chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium như thuốc lá, cà chua, đậu tương, bông, cam quýt… Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây 1 lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng chuyển gen ở cây một lá mầm. Thành công trên cây lúa đã làm cho phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium trở nên hấp dẫn, phổ biến và hiệu quả với nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobaterium đang được áp dụng trên một số đối tượng cây trồng lâm nghiệp và mang lại những kết quả khả quan [4], [5]. Nguyên liệu để tiến hành chuyển gen thông qua Agrobacterium rất đa dạng, có thể là đoạn thân, mảnh lá, khối mô sẹo, phôi hạt… Tuy nhiên, cũng giống như phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen đó là đòi hỏi có một hệ thống tái sinh và chọn lọc hiệu quả. Trước khi tiến hành chuyển gen vào đối tượng nào đó công việc đầu tiên và quan trọng là xây dựng một quy trình tái sinh in vitro hoàn chỉnh. 2.4 Phương pháp sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen 2.4.1 Sàng lọc cây chuyển gen bằng chất chọn lọc Sàng lọc sau khi chuyển gen bằng chất chọn lọc đặc hiệu được xem là bước đi đầu tiên và đặc biệt quan trọng để xác định được tế bào mang gen chuyển đồng thời giúp làm giảm được công sức cho các phân tích tiếp theo. Muốn vậy cần thiết phải lập được môi trường chọn lọc thích hợp nhằm loại bớt các tế bào không mang gen chuyển, đồng thời giữ lại được hầu hết các tế bào có mang gen chuyển [22]. Để chọn lọc các tế bào mang gen biến nạp, trong vector biến nạp thường phải chứa các gen chọn lọc như: nptII – kháng kanamycine, hyg – kháng hygroycine, str/spc – kháng streptomycine và spectinomycine, bar – kháng thuốc trừ cỏ PPT (phosphinothricin)…Các các loại vector này đã được ứng dụng và mang lại thành công trong việc chọn lọc các tế bào mang gen chuyển ở nhiều đối tượng cây trồng như cây bông vải, cây hông, cây thuốc lá, lúa…[15], [5], [26], [7]. Hiện nay, với mục tiêu an toàn sinh học, an toàn thực phẩm và thân thiện với môi trường, người ta đã đưa vào vector chuyển gen các gen chỉ thị chọn lọc ít độc hơn như pmi mã hóa cho enzyme phosphomanso isomerase, hệ thống chọn lọc sử dụng đường mannose. Hệ thống chọn lọc này đã mang lại thành công trên các đối tượng như táo, cam quýt, lúa …[28], [30], [37], [50]. Tuy nhiên đến nay trên đối tượng cây thông vẫn chưa có kết quả nào được công bố. Để sử dụng được các chất chọn lọc như kháng sinh, thuốc diệt cỏ hay đường trong hệ thống chọn lọc tế bào chuyển gen cần xác định được ngưỡng nồng độ chọn lọc thích hợp với từng loại tế bào, mô hay loài cây. Các thí nghiệm này cần tiến hành trước khi thực hiện chuyển gen vào một đối tượng cây trồng nào đó. Theo Brukhin và cộng sự [33], để công tác chọn lọc có hiệu quả đồng thời không tiêu diệt cả các tế bào mang gen chuyển thì môi trường chọn lọc cần thiết lập một ngưỡng nồng độ thấp nhất có thể loại bỏ được khoảng 90% các cá thể không mang gen chuyển. 2.4.2 Phân tích cây chuyển gen gus bằng nhuộm hoá mô tế bào Hệ thống dung hợp gen gus (Escherichia coli - β - D - glucuronidase gene) được khám phá bởi Jefferson [49]. Nó được xem như một công cụ hữu hiệu trong việc đánh giá hoạt động của gen trong cây chuyển gen và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực biến nạp gen ở thực vật [22]. Gen gus (uidA) là một gen chỉ thị lý tưởng với những đặc điểm sau: Sản phẩm của nó là độc nhất và không độc với tế bào vật chủ, các enzyme chỉ thị của nó có tính ổn định cao, các phương pháp phân tích sản phẩm của gen này đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy và đặc thù, có khả năng kết hợp với các polypeptide bên ngoài mà vẫn giữ được hoạt tính enzyme. Cơ chế biểu hiện của gen gus: gen gus mã hóa cho enzyme β-glucuronidase. Enzyme này là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải cơ chất X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết và rất bền vững. Trong tự nhiên β - glucuronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gen gus là gen chỉ thị rất hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật [50]. Để thuận lợi hơn cho việc sử dụng gen chỉ thị gus ở thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa uidA. Do vậy, trong các bước biểu hiện gen gus tạm thời ở mô thực vật tránh được hiện tượng dương tính giả. Khi còn ở trong vi khuẩn Agrobacterium, gen gus nằm trong vùng intron của vector chuyển gen nên không được phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm enzyme và không có phản ứng tạo màu đặc trưng khi nhuộm trong cơ chất X-Gluc. Chỉ khi được chuyển vào tế bào thực vật, thông qua bộ máy di tuyền của tế bào thực vật gen gus mới được phiên mã, dịch mã để tạo ra sản phẩm tham gia vào phân giải cơ chất và tạo phản ứng màu đặc trưng. Để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen trước khi tiến hành chuyển các gen đích mong muốn, nguời ta thường sử dụng gen chỉ thị gus. Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen. 2.4.3 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử 2.4.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu, được sử dụng cho mục đích nhân nhanh một số lượng không hạn chế nguyên bản của một đoạn ADN nhất định. PCR là một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay để kiểm tra đánh giá kết quả chuyển gen ở mức độ phân tử. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, sử dụng ADN khuôn và các hóa chất như Taq – polymerase, các nucleotide, các cặp primer đặc hiệu. Ưu điểm của kỹ thuật này là nhanh nhạy và đặc biệt là không cần dùng đồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn bộc lộ một số hạn chế đáng kể như: mức độ ngoại nhiễm cao, giới hạn kích thước của trình tự cần khuyếch đại, sai sót trong quá trình tổng hợp bởi Taq – polymerase…Vì vậy, đây được xem là bước đầu tiên trong đánh giá sự có mặt của gen chuyển vào cây ở mức độ phân tử [22]. 2.4.3.2 Kỹ thuật lai Southern (Southern blotting) Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) nói chung và lai Southern nói riêng dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò ADN (ARN) với các phân tử ADN (ARN, protein) được lưu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học đặc trưng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lưu giữ như màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhưng vẫn duy trì được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác [11]. 2.4.3.3 Kỹ thuật lai Northern (Northern blotting) Lai Northern là phương pháp xác định kích thước và số lượng các phân tử mARN trong ARN tổng số hoặc poly(A)+ARN. Để làm việc này, trước hết ARN tách đoạn bằng điện di trên gel agarose biến tính sau đó được thấm truyền lên màng celulose, nitro-cellulose hoặc lên kính hay lên màng nilon. Về nguyên tắc, lai Northern cũng tương tự như lai Southern. Điều khác biệt là trong lai Northern, ARN được thấm truyền sau đó lai với ADN hoặc ARN đánh dấu còn ở lai Southern ADN được thấm truyền và sau đó được lai với ADN đánh dấu. Kỹ thuật này nhằm đánh giá hoạt động sao chép của gen chuyển khi được được gắn vào genome của cây chủ [22]. 2.4.3.4 Kỹ thuật lai Western (Western blotting) Kỹ thuật lai Western là kỹ thuật lai protein-protein. Protein mẫu sau khi được phân tách bằng điện di trên gel acrylamide sẽ được chuyển sang cố định trên một chất giá thể cũng bằng điện di. Chất giá thể thường sử dụng là các loại màng khác nhau như màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM), nylon... Protein đã cố định trên màng sẽ được phát hiện bằng phản ứng miễn dịch kép. Kỹ thuật lai Western là bước quan trọng nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển khi được đưa vào cây ở mức độ protein và thể hiện tính trạng [65]. 2.5 Một số thành tựu về chuyển gen trên đối tượng cây lâm nghiệp So với cây trồng nông nghiệp, việc chuyển gen trên đối tượng cây lâm nghiệp mới chỉ thu được những kết quả khiêm tốn và còn nhiều hạn chế. Hai trở ngại lớn nhất trong chuyển gen đối với cây lâm nghiệp là việc tái sinh đối với cây thân gỗ gặp nhiều khó khăn (cây sinh trưởng chậm; chu kỳ tái sinh in vitro dài), việc đánh giá mức độ biểu hiện và sự bền vững của gen chuyển cần nhiều thời gian bởi chu kỳ sinh trưởng và phát triển của các thế hệ cây lâu năm [66]. Tuy vậy, cho tới nay có khá nhiều công bố thành công về nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro và chuyển gen trên nhiều đối tượng cây lâm nghiệp: dương, keo, bạch đàn, xoan, thông… [29], [34], [42]. Những nghiên cứu về công nghệ sinh học trong lâm nghiệp đã được tiến hành trên 80 quốc gia [41], trong đó châu Âu chiếm 39%, châu Á 24% và 23% thuộc về Bắc Mỹ, còn lại là châu Đại Dương, châu Phi, Nam Mỹ. Theo báo cáo của FAO [41] có 6 loại cây rừng được tập trung nghiên cứu là thông (20%), bạch đàn (11%), Picea (9%), dương (9%), Quercus (7%) và keo (6%). Các gen được nghiên cứu và áp dụng chủ yếu là gen kháng sâu (cryIA/a, b, c), gen tăng cường chất lượng gỗ, giảm hàm lượng lignin (F5H-Ferulate-5-hydroxylase; C4H-cinnamate 4-hydroxylase), gen kích thích sinh trưởng (gen Xycloglucanases, gen CEL1) và gen chịu mặn ( mtlD, nha1). Cho tới nay, trên thế giới có khoảng 210 thử nghiệm đồng ruộng cây lâm nghiệp biến đổi gen ở các đối tượng cây dương, thông, Sau sau, keo và bạch đàn. Tính trạng kháng sâu trên cây thông và cây dương đã được thử nghiệm ở bốn quốc gia Argentina, Canada, Trung Quốc và Mỹ. Theo các báo cáo, đến nay duy nhất chỉ Trung Quốc có cây dương chuyển gen kháng sâu đã được thương mại hóa với diện tích khoảng 300-500 ha, bên cạnh đó cây thông cũng đang được thử nghiệm . Ở nước ta trong những năm gần đây, đối tượng cây lâm nghiệp cũng đã được quan tâm đầu tư nghiên cứu và mang lại những thành công đáng kể trên cả hai phương diện nhân nhanh - chuyển gen. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng nhằm nhân nhanh một số giống cây lâm nghiệp với mức độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và chất lượng cây giống đảm bảo. Rất nhiều quy trình nhân nhanh hiệu quả được áp dụng rộng rãi trong sản xuất trên nhiều đối tượng cây lâm nghiệp như bạch đàn, keo, hông [17], [12]. Các nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng cây lâm nghiệp còn hạn chế tuy nhiên đã có những thành tựu khả quan trên một số đối tượng quan trọng như hông, keo, xoan… [4], [5]. Việc chuyển và biểu hiện thành công một số gen chỉ thị như gen kháng thuốc trừ cỏ bar, gen gus là cơ sở quan trọng để tiến hành chuyển các gen mong muốn vào các đối tượng cây rừng quan trọng này. Với nhiều lợi ích về kinh tế cũng như sinh thái, cây thông là một trong những đối tượng cây lâm nghiệp quan trọng nhất và được xếp vào nhóm 6 cây trồng rừng quan trọng được tập trung nghiên cứu trên toàn thế giới. Tuy nhiên, ở nhóm cây có quả hình nón nói chung và cây thông nói riêng, kết quả chuyển gen mới chỉ được công bố cách đây khoảng 10 năm [64], [68] và giới hạn ở một vài loài nhất định [39], [45], [51], [53], [71]. Có rất nhiều phương pháp chuyển gen được áp dụng và đã thu được thành công trên nhiều đối tượng cây trồng. Tuy nhiên với cây thông, hai phương pháp chuyển gen được áp dụng chủ yếu: Phương pháp biến nạp trực tiếp sử dụng súng bắn gen và phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen trực tiếp sử dụng súng bắn gen đã được một số tác giả áp dụng với những thành công trên một số loài thông khác nhau. Năm 2004, Lining [55] và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá về kích thước hạt vàng dùng trong chuyển gen và tái sinh thành công cây thông thuộc loài Picea mariana mang gen chỉ thị gus. Lin và cộng sự [54] sử dụng phôi hạt chín của loài thông Larix gmelinii L. làm nguyên liệu chuyển gen đồng thời tái sinh thành công cây thông mang gen chỉ thị gus. Cũng với phương pháp này, Tuija và cộng sự [73] đã thu được cây thông mang gen gus thuộc loài Pinus sylvestris L. Một gen chọn lọc khác là gen kháng thuốc trừ cỏ cũng đã được chuyển thành công vào cây thông loài Pinus radiata [29]. Không chỉ dừng lại ở những gen chỉ thị, Tang và cộng sự [68] đã thành công trong việc chuyển gen và tái sinh cây thông loài Pinus radiata mang gen kháng sâu CryIAc. Mặc dù đã có khá nhiều kết quả được công bố khi sử dụng phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen, nhưng hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trên các loài thông có khả năng tái sinh thông qua phôi soma. Đường hướng tái sinh thông qua đa chồi vẫn chưa thu được thành công với phương pháp này. Ngoài ra, một trở ngại lớn trong việc ứng dụng phương pháp chuyển gen này đó là yêu cầu về trang thiết bị và công nghệ, đồng thời chi phí thực hiện cao. So với phương pháp trên, phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được áp dụng phổ biến hơn trong chuyển gen vào cây thông. Nguyên liệu sử dụng để chuyển gen khá phong phú như: phôi hạt chín, phôi non, chồi ngọn… phạm vi ứng dụng là hầu hết các loài thông khác nhau. Những thành công trong chuyển gen thông qua Agrobacterium được công bố trên cả hai đường hướng tái sinh thông qua phôi soma và tái sinh thông qua đa chồi [43], [47]. Việc chuyển và tái sinh thông qua đa chồi có ý nghĩa quan trọng vì không phải bất cứ loài thông nào cũng có khả năng tái sinh qua con đường mô sẹo và phôi soma. Cho đến nay, rất nhiều nghiên cứu chuyển gen sử dụng A. tumefaciens và tái sinh phôi soma đã thành công với các gen chỉ thị như gus, bar, pptII trên nhiều loài thông khác nhau Pinus patula, Pinus radiata D., Pinus taeda, Picea abies…[34], [45], [60], [71], [75]. Jean và cộng sự [48] cũng đã chuyển thành công gen chỉ thị gus vào loài thông Pinus taeda bằng việc sử dụng đỉnh chồi và tái sinh thông qua đa chồi. Từ những thành công trên các tác giả tập trung vào chuyển các gen hữu ích như gen kháng sâu, tăng khả năng sinh trưởng ... Nhìn chung, kết quả tạo cây thông chuyển gen chủ yếu thành công trên một số ít loài, phần lớn chúng có hiệu suất tái sinh cao thông qua phôi soma điển hình là Pinus radiata và Pinus taeda. Hiện nay, Trung Quốc là nước đầu tiên đưa cây thông chuyển gen vào khảo nghiệm đồng ruộng và tiến hành đánh giá tiến tới áp dụng rộng rãi. Mặc dù vậy, trên thế giới vẫn chưa có một công bố nào về chuyển gen trên cây thông nhựa Pinus merkursii. Ở Việt Nam, không giống các đối tượng cây rừng khác như bạch đàn, keo hay xoan, những nghiên cứu trên cây thông mới chỉ là bước đầu và mang tính chất thăm dò. Một số kết quả đã công bố dừng lại ở việc khảo sát nhân nhanh cây thông trong điều kiện in vitro và chưa có được một quy trình tái sinh hoàn chỉnh [17], [12], [6]. Thông nhựa là loài thông phổ biến ở nước ta và là đối tượng bị thiệt hại nặng nhất bởi sâu róm nên được chọn làm đối tượng chuyển gen. Khó khăn khi nghiên cứu với Thông nhựa vì đây là loài thông bản địa ở khu vực Đông Nam châu Á, ít được tiếp cận. Do vậy, xây dựng quy trình tái sinh in vitro và thử nghiệm khả năng chuyển gen ở cây thông nhựa là bước đi đầu tiên và rất quan trọng để tiến hành chuyển gen kháng sâu vào loại cây này. 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 Vật liệu thực vật Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là hạt chín của gia đình Thông nhựa có mã số 54. Đây là gia đình Thông nhựa được lựa chọn với các ưu điểm sinh trưởng nhanh, sản lượng nhựa cao…do Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. Mặt khác, trong các thí nghiệm khảo sát khả năng nuôi cấy in vitro của 6 gia đình Thông nhựa trội của Nguyễn Thị Tâm [19] thì gia đình số 54 có phản ứng nuôi cấy tốt nhất nên được chúng tôi lựa chọn tiếp cho các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen. 3.1.2 Chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector dùng trong chuyển gen Chủng A. tumefaciens EHA1300 mang vector chuyển gen pPTN289 có kích thước khoảng 11,7kb. Vector pPTN 289 mang gen chỉ thị gus intron và gen bar do Đại học Nebraska-Mỹ cung cấp, cấu trúc vector pPTN289 được thể hiện ở phụ lục 2. 3.1.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 3.1.3.1 Hóa chất Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen bao gồm: MS , WP, SM, M16 và LB. Thành phần môi trường như trong phụ lục 1. Các kháng sinh, chất điều tiết sinh trưởng được dùng trong thí nghiệm tái sinh và chuyển gen như: NAA, BAP, GA3, Acetosyringone (AS), X-Gluc (5-bromo-chloro-3-indolyl-b-D-glucuronide), PPT, kanamycine, cefotacime, hygromycine… được cung cấp bởi các hãng: New England Biolabs (Anh), Amerham Pharmacia Biotech (Thuỵ Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan). 3.1.3.2 Thiết bị Bàn nuôi cấy vô trùng, nồi khử trùng, máy đo pH, máy đo OD, kính hiển vi soi nổi, tủ ổn nhiệt, tủ nuôi lắc, máy siêu âm, ... và các thiết bị máy móc khác do các hãng của Pháp, Thụy Sĩ, Đức, Nhật ... sản xuất. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Xây dựng và tối ưu quy trình tái sinh in vitro cây thông nhựa 3.2.1.1 Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro từ phôi hạt chín thông nhựa Hạt chín được tách bỏ lớp vỏ gỗ, khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng, khử trùng bằng Javen 60% bổ sung Tween 20 trong 15 phút, rửa lại nhiều lần bằng nước cất khử trùng, thấm khô hạt bằng giấy thấm khử trùng. Sử dụng panh, dao, kéo vô trùng tách phôi hạt khỏi nội nhũ làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.1.2 Xác định môi trường nuôi cấy in vitro cây thông nhựa Cây thông nhựa in vitro có chiều cao 1 cm được cấy trên bốn loại môi trường cơ bản MS, WP, SM, M16 (môi trường cơ bản đều được bổ sung 30g/l sucrose, 8,5g/l agar và pH = 5,8). Sau 4 tuần, các cây thông được cấy chuyển sang môi trường mới. Các chỉ tiêu: Tỷ lệ cây sống, chiều cao trung bình cây, chất lượng cây in vitro được xác định và đánh giá sau 2 lần cấy chuyển. 3.2.1.3 Tạo đa chồi thông qua phôi hạt chín Phôi hạt chín được đặt trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi bao gồm M16 bổ sung 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA + 1 g/l Casein + 50 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Sau thời gian cảm ứng, phôi hạt được đặt lên môi trường tạo đa chồi (PN1-PN5): M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8 và chất điều tiết sinh trưởng BAP với các nồng độ từ 5-13 mg/l. Các cụm chồi phát triển đầy đủ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi: M16 bổ sung 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tính, pH = 5,8. 3.2.1.4 Tạo đa chồi từ cây mầm cây Phôi hạt chín được đặt lên môi trường nảy mầm phôi: M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tính, pH =5,8. Phôi được nảy mầm trong điều kiện tối hoàn toàn. Sau 15-20 ngày, cây mầm được sử dụng làm nguyên liệu tái sinh. Dùng panh, dao vô trùng cắt phần đỉnh mầm với chiều dài 0,7 cm, sau đó bổ đôi đỉnh sinh trưởng theo chiều dọc tạo thành hai mảnh mẫu. Các mảnh mẫu được đặt trên môi trường tạo đa chồi (SR1-SR6): M16 bổ sung BAP từ 0,5 - 8 mg/l + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Các cụm chồi phát triển đầy đủ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi: M16 bổ sung 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tính, pH = 5,8. 3.2.1.5 Nhân nhanh cây in vitro Chồi ngọn với chiều dài 0,5 cm được cắt từ cây thông nhựa in vitro và các đoạn thân cây in vitro có chiều dài 0,7 cm được cấy lên môi trường nhân chồi (M1-M5) bao gồm: M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 9 g/l agar và BAP nồng độ từ 5 - 11 mg/l, ba tuần cấy chuyển một lần. Sau 2 tháng, cụm chồi đã nhân được chuyển sang môi trường kéo dài chồi và tách các chồi đơn để tạo cây hoàn chỉnh. 3.2.1.6 Tạo rễ in vitro, ra cây và chăm sóc cây Cây in vitro có kích thước từ 1,5-2 cm được cấy lên môi trường tạo rễ SR: M16 + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar; bổ sung các nồng độ khác nhau của NAA , IBA và các tổ hợp giữa IBA – NAA. Các cây in vitro có bộ rễ hoàn chỉnh được đưa ra trồng trong các loại giá thể khác nhau với sự tổ hợp của đất, cát sỏi, trấu hun, cát đen. Cây thông nhựa sống sót trên giá thể, xuất hiện lá mới được đưa ra các chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới. Tái sinh qua cây mầm Khử trùng tách phôi hạt Phôi nảy mầm Cảm ứng tạo đa chồi Tạo đa chồi Kéo dài chồi Tạo rễ cây in vitro Ra cây Tái sinh qua phôi hạt chín nguyên vẹn Hạt chín Thông nhựa Hình 2.1. Sơ đồ khái quát quá trình tái sinh in vitro cây thông nhựa từ hai nguyên liệu là phôi hạt chín và cây mầm 3.2.2 Chuyển gen chỉ thị gus vào phôi hạt chín và cây mầm thông qua A. tumefaciens 3.2.2.1 Xác định nồng độ chất chọn lọc dùng cho thí nghiệm chuyển gen Nguyên liệu sử dụng trong thí nghiệm xác định ngưỡng chọn lọc là cây mầm. Sau hai tuần nảy mầm, phần ngọn của cây có chiều dài 0,5 cm được bổ dọc và đặt lên môi trường tạo đa chồi. Sau 2 tuần nuôi cấy, lựa chọn các mảnh mẫu có chất lượng tốt, đồng đều và cấy lên môi trường có bổ sung nồng độ khác nhau của kanamycine, hygromycine, PPT, thời gian cấy chuyển một tháng 1 lần. Sau hai tháng chọn lọc tiến hành thống kê các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu tạo đa chồi… 3.2.2.2 Tạo nguyên liệu để chuyển gen Nguyên liệu là phôi hạt chín: Sau khi khử trùng, phôi hạt được tách khỏi nội nhũ và đặt trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi gồm có các muối cơ bản của M16 bổ sung 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA + 1 g/l casein + 50 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Sau hai ngày trên môi trường cảm ứng, phôi hạt được lấy khỏi môi trường và ngâm trong dung dịch ½ M16 trước khi tiến hành siêu âm và nhiễm khuẩn. Nguyên liệu là cây mầm: Phôi hạt chín được đặt lên môi trường nảy mầm phôi: M16 bổ sung 30 g/l sucrose + 0,2 mg/l GA3 + 9 g/l agar + 1,5 g/l than hoạt tính, pH = 5,8. Phôi được nảy mầm trong điều kiện tối hoàn toàn. Sau các khoảng thời gian khác nhau, cây mầm được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen. Dùng panh, dao vô trùng cắt phần đỉnh mầm với chiều dài 0,7 cm sau đó bổ đôi đỉnh sinh trưởng theo chiều dọc tạo thành hai mảnh mẫu. Mẫu được ngâm trong dung dịch ½ M16 trước khi nhiễm khuẩn. 3.2.2.3 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trường LB đặc (bổ sung 50 mg/l kanamycine, 25 mg/l chloramphenicol, 100 mg/l spectinomycin, 100 mg/l streptomycin), nuôi trong tủ ổn nhiệt 28oC trong thời gian 48 giờ. Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn đã cấy vạch và cấy vào môi trường LB lỏng bổ sung các loại kháng sinh như nuôi đặc. Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút, nhiệt độ 28oC và điều kiện tối hoàn toàn. Sau 12-14 giờ, dịch khuẩn được hòa loãng 3 lần và tiếp tục nuôi phục hồi với thời gian 2-4 giờ. Sau đó, dịch khuẩn được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút, thời gian 10 phút. Sinh khối tế bào được hòa loãng trong dung dịch ½ M16 về mật độ huyền phù vi khuẩn đạt OD660nm 0,75 - 1,0, sau đó bổ sung acetosyringone (AS) ở nồng độ 100 μM trước khi biến nạp. 3.2.2.4 Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy Nhiễm khuẩn vào phôi hạt chín: Mẫu phôi chuẩn bị ngâm trong ½ M16 được tạo thương tổn bằng cách ngâm trong bể siêu âm (Bransonics 1210) với các mức thời gian 20-90 giây. Sau khi siêu âm, loại bỏ phần dung dịch và ngâm mẫu trong huyền phù vi khuẩn (đã chuẩn bị ở phần trên) trong thời gian 30 phút. Sau khi nhiễm khuẩn, mẫu phôi được thấm khô và cấy lên môi trường cảm ứng tạo đa chồi M16 bổ sung 1 mg/l BAP + 2 mg/l NAA + 1 g/l casein + 50 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8, đồng nuôi cấy ba ngày trong điều kiện tối hoàn toàn. Nhiễm khuẩn vào mẫu cây mầm: mẫu cây mầm đã được chuẩn bị ngâm trong ½ M16 được vớt ra và ngâm trong huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn mẫu vật được thấm khô và cấy lên môi trường M16 bổ sung 7 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar, pH = 5,8. Mẫu được đồng nuôi cấy với vi khuẩn trong điều kiện tối hoàn toàn với thời gian 3 ngày. 3.2.2.5 Diệt khuẩn, chọn lọc và tái sinh cây Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lấy ra rửa sạch bằng nước cất khử trùng, lắc trong nước cất bổ sung 500 mg/l cefotaxime trong thời gian 10 phút, thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy mẫu lên môi trường tạo đa chồi. - Với nguyên liệu là phôi hạt chín: M16 bổ sung 9 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 500 mg/l cefotaxime + 6 mg/l PPT. - Với nguyên liệu là cây mầm: M16 bổ sung 6 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar + 500 mg/l cefotaxime + 6 mg/l PPT Thời gian cấy chuyển 2 tuần 1 lần. Sau 2 tháng chọn lọc, các cụm chồi sống sót và phát triển được chuyển sang môi trường kéo dài chồi. Chồi đơn có chiều dài 1,5 cm – 2 cm được tách ra và cấy lên môi trường tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh. 3.2.2.6 Phân tích biểu hiện gen gus bằng nhuộm hoá mô tế bào Một số mẫu vật ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình tái sinh chồi sau khi chuyển gen được lấy ra, rửa sạch vi khuẩn, thấm khô làm nguyên liệu kiểm tra biểu hiện của gen chỉ thị gus bằng phản ứng nhuộm màu. Mẫu vật được ngâm trong dung dịch X-Gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4, pH = 7,0, 10 mM K3[Fe(CN)6], 10 mM K4[Fe(CN)6], 10 mM Na2EDTA, 0,1% (v/v) Triton-100, 1,5 mM X-glucuronide) và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 37oC, thời gian ủ từ 24 - 48 giờ. Sau thời gian ủ, mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục tố. Sau khi loại bỏ hoàn toàn chất diệp lục, mẫu cấy được đưa lên kính hiển vi soi nổi, quan sát, tính toán và chụp ảnh mức độ biểu hiện màu. 3.2.3 Địa điểm thực hiện, phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; Các bình thí nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng 2000 lux, chu kỳ 16 giờ sáng 8 giờ tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi cấy điều chỉnh ở mức 26 ± 2oC. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán bằng phần mềm Excel và xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê IRRISTAT 4.0 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng quy trình tái sinh cây thông nhựa thông qua đa chồi 4.1.1 Xác định môi trường thích hợp cho nuôi cấy in vitro cây thông nhựa Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, việc xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy phù hợp cho mỗi bộ phận của cây và cho mỗi loài cây được xem như điều kiện tiên quyết quyết định cho bất cứ mục đích nghiên cứu nào. Tuy nhiên, chúng có một số yêu cầu chung như nguồn Các bon dưới dạng đường, muối của các nguyên tố đa lượng ( N, P, Ka, Ca) và vi lượng (MG, Fe, Mn, Co…). Ngoài ra cần một số chất vô cơ đặc biệt như vitamin (B1, B6, axit nicotinic …) và các chất điều hòa sinh trưởng. Với các loại cây khác nhau, nhà nghiên cứu cần lựa chọn môi trường cơ bản phù hợp nhằm thúc đẩy khả năng sinh trưởng của cây trong điều kiện in vitro. Cho đến nay, nuôi cấy in vitro đối với cây thân gỗ luôn gây khó khăn cho các nhà nghiên cứu, đặc biệt đối với loại cây thân gỗ có chứa nhiều chất phenol, turpentine, colophany... và Thông nhựa thuộc đối tượng này. Do vậy, việc chọn tạo được môi trường thích hợp để tăng nhanh khả năng sinh trưởng và kéo dài chồi trong nuôi cấy in vitro mang một ý nghĩa quan trọng. Hầu hết các kết quả nuôi cấy in vitro với một số loại cây lâm nghiệp và cây thân gỗ ở nước ta mới chỉ thử nghiệm hai loại môi trường là MS và WP [12], [5]. Trong các công bố gần đây về tái sinh và chuyển gen đối với cây thông, các tác giả đã thông báo một vài môi trường phù hợp cho một số loài nhất định (Pinus taeda, Pinus ayacahuite …) [64], [67]. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi sử dụng bốn loại môi trường cơ bản MS, WP, SP và M16 [58], [59], [64], [69] (phụ lục 1) để xác định được môi trường thích hợp cho tái sinh và chuyển gen đối với cây thông nhựa (Pinus merkusii). Nguyên liệu được sử dụng là các chồi đơn của cây thông nhựa nuôi cấy in vitro. Khả năng sinh trưởng của cây được đánh giá thông qua tốc độ tăng trưởng chiều cao, thời gian xuất hiện đợt lá mới và chất lượng cây con được nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thành phần môi trường cơ bản khác nhau có ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy. Với việc tăng cường thành phần và hàm lượng một số muối đa lượng đặc biệt là nhóm muối chứa nitơ giúp đẩy nhanh tốc độ sinh trưởng của cây thông nhựa khi được nuôi cấy trên môi trường M16. Trong bốn loại môi trường thử nghiệm, môi trường M16 tỏ ra phù hợp với cây thông nhựa, thể hiện qua tốc độ tăng chiều cao trung bình lớn (nhất 2,7 cm) sau 10 tuần nuôi cấy, các môi trường còn lại dao động từ 1,1- 1,5 cm, môi trường SP tỏ ra kém hiệu quả khi nuôi cấy cây thông nhựa (1,1 cm). Bảng 4.1. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản tới khả năng sinh trưởng của cây in vitro Môi trường Ngày xuất hiện đợt lá mới Chiều cao trung bình (cm)/10 tuần Chất lượng cây con M16 22 2,7 a +++ WP 30 1,5 b +++ SP 37 1,1 b + MS 34 1,2 b ++ LSD (0,05) 0,6 CV % 4,4 Ghi chú: (+++) Thân, lá phát triển tốt; (++) Thân phát triển chậm, lá mảnh kéo dài chậm; (+) Thân không phát triển, lá chuyển vàng Thời gian xuất hiện đợt lá mới và chất lượng cây thông nhựa in vitro một lần nữa cho thấy sự phù hợp của môi trường M16. Quan sát của chúng tôi thấy, trên môi trường M16, cây con có ._.