Xây dựng quy trình định lượng Cytomegalovirus (CMV) trong máu, nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR

hạm Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. Cô TS Trần Thanh Thủy, trưởng bộ môn Vi sinh vật, khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HỒ CHÍ MINH đã luôn tạo mọi thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cô PGS. TS Cao Minh Nga, giảng viên chính bộ môn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, phó trưởng khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Dược đã tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Cử nhân Hồ Thị Thanh Thủy- PGĐ công ty cổ phần công nghệ Việt Á, cử nhân Nguyễn Văn Hưng- trưởng phòng dịch vụ & KCS, cùng tập thể cán bộ, công nhân viên các phòng của công ty đã tận tình giúp đỡ tôi về thực nghiệm của đề tài để tôi hoàn thành kết quả luận văn này. ThS- BS Phùng Như Toàn- Trưởng phòng tham vấn tiền sản, Th.S Bs Lê Minh Hoài An- Trưởng khoa Xét nghiệm, Bs Lê Nguyễn Bảo Trân-trưởng P.A8- phòng xét nghiệm dịch vụ, KTV Tôn Nữ Thu Trang cùng tập thể nhân viên phòng xét nghiệm bệnh viện Từ Dũ đã tạo mọi thuận lợi và cung cấp cho tôi số liệu và mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, máu) nhiễm CMV . Dược sĩ Nguyễn Thanh Tòng- Trưởng khoa Xét nghiệm Trung tâm y khoa Medic, BS Nguyễn Bảo Toàn-phòng Sinh học phân tử và KTV Đặng Đình Triển, phòng xét nghiệm kháng thể trung tâm y khoa Medic đã cung cấp cho tôi số liệu và mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV, HSV. Tập thể các bạn lớp cao học K18 – khoa Sinh, trường Đại học Sư Phạm TP HCM đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khóa học và làm luận văn. Xin chân thành cảm ơn. Đặng Hồng Cúc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT - BLAST: Basic local alignment tool - CMV: Cytomegalovirus - COBAS: COBAS AMPLICOR™ CMV MONITOR - CSF: Cerebrospinal fluid: dịch não tủy. - Da: Dalton, đơn vị đo khối lượng phân tử protein. - DNA: Deoxyribonucleic acid - dNTP: Deoxynucleoside triphosphate - dNTP: deoxynucleotie triphosphate - dUTP: deoxy Uracil triphosphate. - EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid. - gB: glycoproteinB - GE: genome-equivalent - IDT: Intergrated DNA Technologies - IE: immediate early: sớm tức thì - LC-PCR: LightCycler® polymerase chain reaction - PBL: Peripheral blood leucocytes: bạch cầu máu ngoại biên - PMNLs: polymorphonuclear leucocytes: bạch cầu đa nhân - Pol: polymerase. - PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder: rối loạn tăng sinh tế bào lympho sau ghép. - qPCR: quantitative polymerase chain reaction: PCR định lượng - UL: unique long - UNG: Uracyl – N – glycosylase - WB: whole blood: máu toàn phần. MỞ ĐẦU Nhiễm Cytomegalovirus (CMV) là loại nhiễm virus thường gặp trong cộng đồng, chiếm tỉ lệ từ 60% đến 99% người lớn trên toàn thế giới [51], nhưng hiếm khi gây ra triệu chứng lâm sàng, vì vậy chẩn đoán nhiễm CMV ít khi được quan tâm. CMV là tác nhân sinh bệnh nhiễm trùng cơ hội và nguy cơ bệnh CMV tùy thuộc sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Nhiễm CMV sẽ tái kích hoạt khi bệnh nhân có hệ thống miễn dịch suy yếu, và là tác nhân gây bệnh nặng, thậm chí gây tử vong cho những người sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, cũng như những người cấy ghép nội tạng, và đặc biệt những người nhiễm virus HIV. CMV còn là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bẩm sinh thường gặp ở thai phụ- nhiễm trùng ToRCH (Toxoplasmase, Rubella, CMV, Herpes simplex virus), gây nguy hại cho thai nhi: 0,5%-2,5% trẻ sơ sinh mắc bệnh CMV bị vàng da, lách to, giảm tiểu cầu, suy thai, nhỏ đầu, viêm võng mạc, CMV có thể để lại di chứng khốc liệt lúc mới sinh[11], [12], [13], [24], [72]. Ngoài ra, một nghiên cứu mới tại Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) xuất bản trong số ra ngày 15 tháng 5 năm 2009, cho thấy lần đầu tiên CMV, là một nguyên nhân gây ra huyết áp cao, khi kết hợp với yếu tố nguy cơ khác đối với bệnh tim, CMV có thể gây ra xơ vữa, hoặc xơ cứng động mạch [51]. Do đó, chẩn đoán sớm nhiễm CMV để đánh giá chính xác tình trạng của bệnh nhân là rất cần thiết. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chẩn đoán nhiễm CMV như tìm kháng thể IgG-CMV, IgM-CMV, nuôi cấy virus, tìm tế bào nội mô....đều cho kết quả khả quan. Đặc biệt, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, người ta cũng đã sử dụng PCR định tính CMV nhưng phương pháp này khó phân biệt nhiễm tiềm tàng (nhiễm CMV không biểu hiện triệu chứng) hay nhiễm họat động (nhiễm CMV biểu hiện triệu chứng). Jiska Jebbink, và cộng sự [42] đã chỉ ra rằng nếu số lượng CMV khoảng 10.000 genomes virus /ml mẫu máu là báo trước nhiễm CMV có nguy cơ cao phát triển thành bệnh CMV. Ngoài ra còn một số công trình khác cũng chỉ ra mối tương quan giữa số lượng virus trong mẫu thử và bệnh CMV (bảng 1). Bảng 1: Minh họa các kết quả định lượng CMV tương quan bệnh CMV Tài liệu tham khảo PP định lượng Mẫu thử Số lượng gen virus/ml mẫu thử Biểu hiện triệu chứng Không biểu hiện triệu chứng Jayne C.Fos [41] năm 1995 PCR (gB) Nước tiểu 106,5 x Jayne C.Fos [41] năm1995 PCR (gB) Nước tiểu 105,2 x Lazzarotto[47] năm 2000 qcPCR (IE1) Dịch ối 105 x Gouarin [45] năm 2002 Real-Time qPCR (UL83) Dịch ối 2,8x105 x Marianne Leruez- Ville [49] năm 2003 Real-Time qPCR (UL123) Mẫu máu 3,5 log10 x Marianne Leruez- Ville [49] năm 2003 Real-Time qPCR (UL123) Mẫu máu 4,2log10 x Boppana [23] năm 2005 Real-Time qPCR (gB) Mẫu máu 1x104 x Ravit Arav-Boger [66] năm 2007 Real-Time qPCR (US17) Dịch ối 2,8x105 x Ravit AravBoger [66] năm 2007 Real-Time qPCR (US17) Dịch ối 8x103 x Vì vậy, việc định lượng CMV sẽ giúp các bác sĩ tiên lượng và có liệu pháp chữa trị sớm. Phát hiện kháng nguyên pp65 trong máu cũng giúp cho việc định lượng CMV hữu hiệu, nhanh, nhưng cũng còn nhiều nhược điểm. Trong thời gian gần đây, từ 1993 đến nay phương pháp Real-Time PCR được sử dụng nhiều ở nước ngoài [18], [26], [27] ,[28], [32], [33], [42], [46], [53], [56], [59], [70] định lượng CMV nhanh, chính xác , độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã giúp cho sự tiên lượng những bệnh nhân nhiễm CMV có nguy cơ phát triển thành bệnh CMV để kịp thời chữa trị, đồng thời còn giúp cho việc theo dõi kiểm tra hiệu lực liệu pháp chữa trị. Tại Việt Nam cho đến nay, ở miền Nam Việt Nam, một vài nơi như công ty cổ phần công nghệ Việt Á, công ty khoa Thương, công ty Nam Khoa, bệnh viện Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh, bệnh viện Chợ Rẫy có kit thử định lượng CMV từ máu bệnh nhân bằng Real-Time PCR, chưa thấy công trình nào xây dựng kỹ thuật định lượng CMV từ nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Xây dựng quy trình định lượng CMV trong máu và nước tiểu bằng phương pháp Real-Time PCR”. Giới hạn đề tài: Hiện nay, có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-Time PCR với độ nhạy tương đương như Molecular beacon, chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi, probe lai, probe thủy giải (TaqMan probe). Đề tài chọn kiểu phản ứng dùng TaqMan probe, vừa đơn giản, vừa có tính đặc hiệu cao. Nhiệm vụ đề tài : - Thiết kế primers, TaqMan probe đặc hiệu định lượng CMV. - Khảo sát các điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real-Time PCR và xây dựng quy trình định lượng CMV trong máu và trong nước tiểu. - Ứng dụng quy trình chẩn đoán trên một số bệnh phẩm. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: - Những mẫu bệnh phẩm nhiễm CMV tại các phòng xét nghiệm của BV Từ Dũ, trung tâm y khoa Medic, công ty cổ phần công nghệ Việt Á. Đề tài được thực hiện tại phòng kỹ thuật của bộ môn Vi sinh, khoa Y, trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và công ty cổ phần công nghệ Việt Á. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về CMV CMV còn gọi là virus đại bào, là do tế bào bị nhiễm CMV sẽ có kích thước khổng lồ, đặc biệt bên trong nhân và bào tương lại xuất hiện nhiều thể vùi có hình mắt cú đặc trưng (hình 1.1). Hình 1.1: Tế bào bị nhiễm CMV (bên trái), và thể vùi “mắt cú” (bên phải). “Nguồn: www,pathguy,com/lectures/infect,htm” 1.1.1. Lược sử nghiên cứu về CMV [14], [50], [51], [72] - Từ năm 1881, Ribbert là người đầu tiên mô tả những tế bào kích thước khổng lồ mang thể vùi hiện diện trong thận của một em bé tử vong do giang mai. Năm 1907, phòng thí nghiệm của Ribbert tiếp tục phát hiện các thể vùi của 4 trong 30 tuyến mang tai của những đứa trẻ từ 2 tháng đến hai tuổi. Nhưng ông sai lầm khi cho rằng nguyên nhân là do động vật nguyên sinh (có tên là Entamoeba mortinatalium). Vào năm 1920, Goodpasture và Talbert là những người đầu tiên cho rằng tề bào bị phình to có thể là do hậu quả của nhiễm virus, và Goodpasture đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalia” là để chỉ sự phồng to của tế bào bị nhiễm. Vào 1956, Smith và Rowe phân lập được CMV từ tuyến dưới hàm hoặc tuyến amidan của em bé, và CMV được gọi là: “virus của tuyến nước bọt”, hay là “virus gây bệnh thể vùi của tuyến nước bọt”. - Đến năm 1960, Weller và cộng sự đề nghị sử dụng thuật ngữ “Cytomegalovirus” bởi vì thuật ngữ “bệnh virus của tuyến nước bọt-CID (Cytomegalic inclusion disease)” khó sử dụng và sai lầm, do tuyến nước bọt chỉ là một trong nhiều vị trí bị nhiễm, Klemola và Kaarrianinen đã mô tả bệnh tăng bạch cầu đơn nhân do CMV(1965), cùng năm ấy người ta phát hiện CMV ở một bệnh nhân được ghép thận. Trong hai thập niên 1970 và 1980, sinh học phân tử của CMV được tiếp tục các nhà khoa học nghiên cứu và khám phá. 1.1.2. Phân loại CMV ở người  CMV ở người là Human Cytomegalovirus (HCMV) là thành viên của giống Herpesvirus và thuộc họ Herpesviridae, chi Betaherpesvirinae. Nhân là sợi đôi DNA. Có 8 loài virus Herpes ở người được chia làm 3 phân họ (bảng 1.1). Bảng 1.1: 8 loài virus Herpes gây bệnh ở người Phân họ TT VIRUS Bệnh liên quan Alpha- herpesvirinae 1 HSV-1 Mụn rộp ở môi 2 HSV-2 Mụn rộp ở bộ phận sinh dục, gây ung thư cổ tử cung. 3 VARICELLA-ZOSTER VIRUS (VZV) hoặc (HHV3) Bệnh thủy đậu Beta- herpesvirinae 4 EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV_HHV4) Bệnh tăng tế bào đơn nhân, Burkitt lymphoma, ung thư dạng carcinoma vùng mũi hầu, bệnh tăng sinh tế bào lympho sau ghép (PLTD). Phân họ TT VIRUS Bệnh liên quan Beta- 5 CMV (HHV-5) Bệnh CMV herpesvirinae 6 HHV-6 Bệnh ban đào(roseola), bệnh não ghép (Transplant- encephalopathy), bệnh xơ cứng rải rác. Gamma- herpesvirinae 7 HHV-7 Bệnh ban đào (roseola) 8 HHV-8 Kaposi sarcoma, lymphoma đáy các xoang cơ thể, bệnh sarcoid. 1.2. Tình hình nhiễm CMV [3], [6], [11], [12], [13], [14], [16], [20], [23], [24], [29],[31], [50], [51], [52], [60], [71], [72] CMV là virus có mặt ở khắp nơi và thường gây nhiễm cho nhiều loài sinh vật khác nhau, nhưng cũng là tác nhân sinh bệnh thường gặp ở người. CMV gây bệnh cho người đã được ghi nhận từ thời cổ đại. Người ta tìm thấy dấu vết của nhiễm CMV trong các bộ lạc Da Đỏ cổ đại ở Nam Mỹ (ngày nay thuộc lãnh thổ Brazin). Tỷ lệ nhiễm CMV tùy thuộc vào vị trí địa lý, tình trạng kinh tế xã hội, yếu tố nuôi dưỡng và giáo dục, tỉ lệ nhiễm CMV trung bình trên thế giới là khoảng 40%. Ở Mỹ, từ 50% đến 80% số người lớn trên 40 tuổi đều nhiễm CMV, phụ nữ ở lứa tuổi sinh đẻ tỉ lệ nhiễm CMV là 60-65%, 0,7-4% phụ nữ mang thai nhiễm CMV nguyên phát, nhiễm sang thai nhi là 30- 40%, trong 40% nhiễm bẩm sinh có 10% xuất hiện triệu chứng bệnh CMV, 5-15% trong số 90% còn lại sau một vài năm có biểu hiện di chứng muộn của CMV như khiếm khuyết nghe, nhìn và chậm phát triển tinh thần. CMV gây nhiễm ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên lứa tuổi thiếu niên là là độ tuổi thường bị nhiễm nguyên phát, và tỉ lệ nhiễm CMV tăng dần theo lứa tuổi. Theo thống kê ở Hoa kỳ với tuổi từ 6-11 tuổi là 36,3%, lớn hơn hoặc bằng 6 tuổi tỉ lệ nhiễm là 58,9%, từ 80 tuổi trở lên tỉ lệ nhiễm là 90,8%. Nhiễm CMV còn khác nhau ở các chủng tộc: 51,2% ở Tây Ban Nha không phải người da trắng, 75,8% ở Tây Ban Nha không phải người da đen, và 81,7% ở người Mỹ gốc Mexico. Mỗi năm tại Hoa Kỳ khoảng 340.000 người không phải gốc Tây Ban Nha da trắng, 130.000 người không phải gốc Tây Ban Nha da đen, và 50.000 phụ nữ Mỹ gốc Mexico bị nhiễm CMV nguyên phát. Đối với bệnh nhân AIDS, hơn 40% bị nhiễm CMV, những người cấy ghép nội tạng, nếu không có sự can thiệp kháng virus thì sẽ biểu hiện triệu chứng nhiễm CMV: 39-41% ở những người ghép tim, phổi; 9-35% ở những người ghép tim; 22-29% ở những người ghép gan và tụy; 8-32% ở những người ghép thận; 50% ở những người ghép thận và tụy; 22% ghép đoạn ruột. Ở miền Nam Việt Nam từ 16 ca ghép thận đầu tiên ở Chợ Rẫy [3] ghi nhận được số liệu ở bảng 1.2. Bảng 1.2: Tần suất nhiễm CMV ở 16 ca ghép thận Huyết thanh dương tính Người cho thận Người nhận thận IgG-CMV 12/16 13/16 IgM-CMV 3/16 2/16 Thống kê nhiễm CMV từ năm 2008 đến tháng 04/2010: + Ở bệnh viện Từ Dũ tỉ lệ mẫu xét nghiệm có kháng thể IgG-CMV là 94,26% (6013/6379), kháng thể IgM-CMV là 3,76% (240/6379). + Ở trung tâm y khoa Medic 88,59% (4896/5526) người xét nghiêm có kháng thể IgG- CMV, kháng thể IgM-CMV là 9,89% (547/5526). Xét nghiệm DNA-CMV từ 2009 đến tháng 04/2010 kết quả dương tính 30,61% ca xét nghiệm (30/98). Giá xét nghiệm một mẫu máu định lượng CMV bằng kit Roche là 750.000đ Việt Nam. 1.3. Cấu tạo của CMV [6], [14], [51] * CMV (hoặc HCMV) cũng có những đặc điểm cấu trúc đặc trưng của họ virus Herpes. Hạt virion của một HCMV từ trong ra (hình 1.2) gồm: Một bộ gen (genome) là phần lõi (core) của virus, một capsid (khoảng 162 capsomers), một chất nền (tegument) chứa enzymes, màng bọc ngoài (envelope hay membrane) và glycoprotein. Hình 1.2: Một virion của HCMV (Human Cytomegalovirus) “Nguồn :www,abbottdiagnostics,com/science, www,who,int/publications ” 1.3.1. Bộ gen CMV (hình 1.3, 1.4) là một phân tử DNA sợi đôi mạch thẳng, dài 64 nm, được chia làm hai cấu phần “duy nhất” (unique), cấu phần duy nhất dài UL (unique long), và cấu phần duy nhất ngắn US (unique short). Ở hai đầu vùng trình tự duy nhất là các vùng trình tự lặp lại đầu cuối TR (terminalrepeat sequence) và vùng trình tự đảo ngược IR (inverted repeat sequence). Vùng UL của bộ gen virus là vùng mang các gen mã hóa cho các protein quan trọng cần thiết cho sự xâm nhập và sao chép của virus như UL55 mã hóa cho glycoprtein B trên màng bọc ngoài, UL123 mã hóa cho protein IE, bộ gen của CMV còn có những vùng xác định tương đồng với một số vùng trên DNA người [6]. Đây là bộ gen có kích thước lớn nhất trong họ virus Herpesviridae, xấp xỉ 230- 240Kb (hình 1.3). Có khoảng 31% - 75% Guanin+ Cytocine. Với bộ gen > 240.000bp, có tiềm năng mã hoá protein cho hơn 200 khung đọc mở (opening reading frames) và có khả năng tổng hợp khoảng 100 protein của virus. Hiện nay, mới xác định được một vài protein từ bộ gen virus. Có những đoạn gen mã hoá quan trọng cần cho sự sao chép của virus, nhưng cũng có đoạn gen không thiết yếu, nhưng lại sản sinh ra yếu tố lây truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Hình 1.3: Minh họa bộ gen của một số loài Herpesvirus “Nguồn: uk/335/HHV5,html” Hình1.4: Mô tả cấu trúc chi tiết bộ gen của CMV. “Nguồn:” Ghi chú: Những mũi tên màu xanh lá cây chú thích trước khung đọc mở của HCMV có khả năng mã hóa một polypeptide, mũi tên màu đỏ chỉ định khung đọc mở không mã hóa một polypeptide. 1.3.2. Bộ khung nucleocapsid (hình 1.5) - Bảo vệ bộ gen của virus. - Bộ khung capsid có hình dáng một hình đa diện 20 mặt, được cấu tạo bởi các non- phosphorylated proteins, ví dụ: p70, khung capsid có đường kính khoảng 116nm và gồm 162 capsomers. - Mỗi capsomere có đường kính khoảng 15nm, dài 20nm, có rãnh trung tâm có d=3nm. Trên bề mặt capsomere có nhiều cấu trúc nhô ra ngoài một cách đối xứng và hình dáng tua tủa như những nan hoa. Những cấu trúc này được cho là tác dụng nối kết các capsomere với nhau Hình 1.5: Capsid của herpes virus “nguồn: Linda Stannard” 1.3.3. Tegument (hình 1.6) chất nền (matrix) lấp đầy khoảng trống giữa các nucleocapsid và vỏ bọc bên ngoài (envelope), có bản chất chính là phosphorylate proteins. Trong đó glycoprotein pp65, là glycoprotein quan trọng và chiếm tỷ lệ khá lớn. Các kháng thể phản ứng với protein này cho thấy có hoạt động trung hòa virus mạnh khi có hiện diện của bổ thể và phản ứng mạnh với bề mặt của tế bào bị nhiễm. Đáp ứng kháng thể của người đối với glycoprotein pp65 chưa được nghiên cứu. Xét nghiệm tìm kháng nguyên glycoprotein pp65 trong máu là một phương pháp để phát hiện CMV và nó đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán hiện nay. Hình1.6: Chất nền matrix, và màng bọc ngoài “Nguồn: ” 1.3.4. Màng bọc ngoài của virus (envelope) (hình 1.6) - Là lớp lipit kép gồm lipoprotein và có ít nhất 33 protein cấu trúc, một vài protein cấu trúc là glycoprotein (glycosylate). - Những phân tử glycoprotein này nằm trên bề mặt và có những phần lồi ra ngoài. Phần lồi ra ngoài giúp cho virus gắn vào các thụ thể khi nó xâm nhập vào tế bào đích của túc chủ và là mục tiêu cho các kháng thể trung hoà virus. Các glycoprotein này sẽ quyết định các dòng CMV khác nhau. Các glycoprotein được biết rõ nhất trong lớp vỏ ngoài này là gp 116, gp58, gp86. glycoprotein envelope chất nền nucleocapsid - Một phát hiện cho thấy glycoprotein của vỏ bọc virus có vai trò tạo ra đáp ứng miễn dịch của cơ thể, nhưng một số khác góp phần làm giảm đáp ứng miễn dịch tế bào của túc chủ bằng cách giới hạn sự trình diện kháng nguyên của virus. 1.4. Đặc điểm của virus [9] 1.4.1. Tính bền vững CMV là virus không bền vững, dễ bị bất hoạt bởi các yếu tố như : dung môi lipit, pH<5, CMV chỉ tồn tại một giờ ở nhiệt độ 370C, 30 phút ở 500C hay 5 phút dưới tia cực tím. Bị mất khả năng gây nhiễm ở -200C - 370C, CMV có thể tồn tại ở môi trường tự nhiên bên ngoài trong nhiều giờ, có thể bảo quản CMV ở 40C trong nhiều ngày mà không mất khả năng gây nhiễm. Bảo quản CMV ở nhiệt độ -700C trong nhiều tháng không làm mất khả năng gây nhiễm. Ở nhiệt độ - 1900C, bảo quản CMV vô thời hạn. 1.4.2. Đặc tính gây bệnh của CMV (bảng 1.3) [14] - CMV là virus được giới hạn theo loài, có nghĩa là virus CMV ở người chỉ có thể nhân lên trong cơ thể con người, hay những tế bào có nguồn gốc từ con người. Trên cơ thể sống, CMV có thể gây nhiễm cho nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào nội mô, tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào biểu mô, nguyên bào sợi……CMV là virus gây bệnh cho tế bào, có nghĩa là tế bào bị nhiễm cuối cùng sẽ bị phá hủy, - CMV sống tiềm ẩn trong các dịch sinh học và các mô khác nhau của cơ thể như: nước bọt, nước tiểu, tinh dịch, sữa mẹ, phân, máu, chất tiết âm đạo và cổ tử cung, trong bạch cầu đa nhân trung tính, lympho bào T, tế bào nội mô mạch máu, biểu mô ở thận, CMV ở trạng thái thụ động, không tăng trưởng. Khi có điều kiện thuận lợi hoặc khi đáp ứng miễn dịch của cơ thể bị suy giảm virus có khả năng tái hoạt. - CMV có khả năng liên kết chặt chẽ với tế bào, do đó virus có thể lây truyền từ người này sang người khác khi tiếp xúc dịch thể nhiễm CMV, khi virus lan truyền khắp cơ thể, có nghĩa là nhiều tế bào của các cơ quan khác nhau cùng bị nhiễm. Kết quả của việc virus liên kết tế bào là hệ thống miễn dịch của cơ thể bị mất hiệu lực một cách tương đối trong việc kiểm soát virus. - CMV có khả năng gây ung thư mạnh, bằng chứng rõ nhất là sinh bệnh học của bệnh tăng sinh lympho bào sau ghép (PTLD: post transplant lymphoproliferative disease) kèm với virus Epstein-Barr. Bảng 1.3: Sơ đồ hậu quả do CMV gây ra BỆNH CMV Hậu quả gián tiếp Hậu quả trực tiếp - Là tác nhân gây ức chế miễn dịch - Hội chứng virus - Tăng nguy cơ nhiễm trùng cơ hội. - Ảnh hưởng tạng ghép - Tăng nguy cơ nhiễm nấm. - Sinh ung thư - Gây thải ghép cấp và mạn. - Giảm chất lượng sống, tăng chi phí điều trị 1.5. Quá trình xâm nhập của CMV vào tế bào [6], [14], [51], [72] 1.5.1. Đường lây truyền  Lây truyền CMV có thể xảy ra từ người này sang người khác, thông qua các sự tiếp xúc với dịch thể nhiễm CMV (nước tiểu, nước bọt, sữa mẹ, máu, nước mắt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo v,v…) chẳng hạn như hôn, quan hệ tình dục, và dính nước bọt hay nước tiểu nhiễm CMV trên tay rồi sau đó chạm vào mắt của mình, hoặc bên trong miệng, mũi…).  CMV cũng có thể truyền qua tử cung, nhau thai, hay những mô, cơ quan ghép mà người cho bị nhiễm CMV.  Bạch cầu và tế bào CD 13+ là nơi tập trung chủ yếu của CMV. Do đó, virus cũng có thể lây nhiễm khi truyền máu. 1.5.2. Quá trình xâm nhập (hình 1.7) - Virus vào tế bào túc chủ bằng cách kết hợp và hoà lẫn vỏ của virus với màng tế bào của túc chủ hay qua hiện tượng thực bào. - Khi virus xâm nhập vào tế bào đích, sẽ có sự tham gia của tất cả các cấu trúc của virus như những phức hợp glycoprotein và các phân tử ở màng tế bào túc chủ như heparan sulphat, proteoglycan, và một loại membrane-bound protein có trọng lượng phân tử là 30-34 kD. Tác động đầu tiên của HCMV đối với tế bào túc chủ là sự hút bám: Liên kết với sulphat heparan của tế bào túc chủ qua tương tác cacbonhydrat, chủ yếu là gpUL100(gM), nhưng cũng có thể là gpUL55(gB), sau đó gắn với HLA bề mặt tế bào, tương đồng HLA(gpUL18), tương tác qua microglobulin B2 và gắn với thụ thể tế bào 32-34kD (có thể là gpUL55). - Sau khi hút bám, virus bắt đầu di chuyển xuyên qua màng tế bào. Sau đó, một loại những phản ứng sinh lý tiếp theo xảy ra trong vòng vài phút, dẫn đến hiện tượng thủy phân phosphatidylinositol(4,5)-biphosphate và kích thích quá trình chuyển hoá của axit arachidonic. Axit này sau đó được biến đổi thành prostalandin H2. Những hoá chất trung gian này được cho hoạt hoá yếu tố sao chép, yếu tố nhân kappa-B. Ngoài ra những thụ thể đôi G protein đôi cũng hoạt hoá phospholipase C, dẫn đến việc tạo ra những chất truyền tin thứ cấp inositol triphosphate và diacylglycerol. Đến lượt những chất này tiếp tục hoạt hoá giải phóng canxi từ lưới nội chất và protein kinase C. Từ đây, sự tổng hợp virus bắt đầu. Những tiểu thể của virus được tạo ra và sau đó được tập hợp lại trong nhân. Vỏ bọc của virus được tạo ra bằng cách nhô ra khỏi màng nhân bên trong của tế bào chủ. Từ đó, những tiểu thể này đi qua màng lưới Golgi và bắt đầu gây bệnh bằng cách phân tách, ly giải tạo glycoprotein B (gB), gB là sản phẩm gen UL55 của CMV và là glycoprotein vỏ của HCMV là nổi bật nhất. Hình 1.7: Chu trình sao chép của HCMV « Nguồn:www,nature,com/,,,/n8/fig_tab/nm0800_863_F1,html » Pha 1: Vỏ ngoài của HCMV nhờ glycoprotein gB và gH của virus gắn lên thụ thể tế bào túc chủ như NFk-B và SP1. Pha 2 : Capsid của vi rút vào tế bào và phóng thích DNA virus, protein và mRNA của virus tổng hợp trong bào tương, còn DNA virus vào trong nhân tế bào. Pha 3: Trong nhân, DNA của virus và gen tế bào được sao chép lại. Pha 4: DNA virus và protein của virus được đóng gói lại thành hạt virion, qua màng tế bào hình thành màng bao ngoài và lây nhiễm sang tế bào bên cạnh. Như vậy : - Chu trình phát triển của HCMV tương đối chậm, sự tổng hợp DNA virus bắt đầu trong nhân là 16-24 giờ sau khi nhiễm, không có virus nào phóng thích trong khoảng thời gian 72-96 giờ. Hiện chưa rõ vị trí nhiễm đầu tiên cũng như sự xâm nhập của virus vào dòng máu. - Khi virus vào máu, DNA của nó tìm thấy trong tế bào đơn nhân, lympho bào và bạch cầu đa nhân trung tính. Trong bạch cầu đa nhân virus không nhân lên, nhưng nó sẽ là nguồn gieo rắc virus đi khắp nơi. - Sau khi nhiễm, virus HCMV theo đường máu đi khắp nơi trong cơ thể và đến các cơ quan khác nhau như thận, gan, lách, não, võng mạc, thực quản, tai trong, phổi và đại tràng, cũng như nước tiểu và tuyến nước bọt. 1.6. Sự né tránh miễn dịch của CMV [6], [14]. Sự tương tác giữa đáp ứng miễn dịch của túc chủ và quá trình sao chép của virus quyết định khả năng gây bệnh khi nhiễm CMV, CMV có đặc tính sống âm ỉ và kéo dài. Trong giai đoạn sống tiềm ẩn virus không nhân lên trong tế bào túc chủ. Đối với nhiễm CMV mạn tính và ngay cả nhiễm CMV hoạt động thể yên lặng, cũng không có virus đang hoạt hóa. Sự tiềm ẩn virus trong tế bào đơn nhân là mối nguy hiểm bởi vì đó là nơi ẩn náu kín đáo của virus và từ đây chúng theo hệ tuần hoàn phát tán khắp cơ thể, đồng thời, tế bào đơn nhân còn duy trì virus khi nó biệt hoá thành đại thực bào. Ngoài ra, người ta còn thấy CMV có khả năng tạo ra cơ chế né tránh đáp ứng bảo vệ của cơ thể, vì vậy nhiễm CMV cũng đưa đên bội nhiễm các loại nhiễm trùng cơ hội khác như Pneumocystis carini, Aspergillus fumigatus, Candida albicans hay các loại vi khuẩn, virus khác. Đặc biệt là các virus trong họ Herpes, viêm phổi và nhiễm nấm thường xảy ra sau khi nhiễm CMV. Sự đảo ngược huyết thanh HHV-6 sau khi ghép gan có thể được xem là yếu tố báo trước cho bệnh CMV, HHV-6, bản thân nó rất hiếm gây triệu chứng lâm sàng trầm trọng, trừ khi đồng nhiễm CMV. Nếu tìm thấy DNA của HHV-6 và CMV trong nước tiểu hoặc trong huyết thanh thì đây là yếu tố chắc chắn dự đoán trước bệnh CMV sẽ xảy ra [65]. CMV còn tạo thêm một số cơ chế gây cản trở sự bảo vệ của cơ thể chủ. Một trong các cơ chế đó là giảm điều hoà sự biểu lộ các phân tử lớp I của phức hợp chủ yếu hoà hợp mô (MHC) làm cản trở sự nhận biết của các tế bào lympho T độc. Các protein của CMV người còn ức chế vận chuyển các kháng nguyên được xử lý, giữ lại các phân tử lớp I của MHC trong lưới nội nguyên sinh và tái sinh để trả lại cho bào tương các chuỗi nặng của lớp I MHC. Thiếu các phân tử lớp I MHC đáng lẽ các tế bào nhiễm CMV sẽ bị các tế bào diệt tự nhiên (NK) tiêu hủy nhưng các tế bào nhiễm CMV lại biểu lộ phân tử gpUL 18 tưong ứng với các phân tử lớp I MHC. Hơn nữa CMV còn có một kháng nguyên gpUL 40 có khả năng tăng điều hoà phân tử HLA-E thuộc lớp I không kinh điển MHC. Phân tử HLA-E ức chế tác động của tế vào NK bằng cách gắn kết với receotor lectintip C trên tế bào NK. Sau cùng CMV sản xuất một phân tử tương tự IL-10, có khả năng ức chế tổng hợp cytokin và làm mất vai trò trình diện và đồng đáp ứng miễn dịch của đại thực bào . 1.7. Những dấu hiệu nhận biết và triệu chứng bệnh CMV 1.7.1. Đặc điểm cơ bản của bệnh CMV gây ra là những thể vùi khổng lồ hình “mắt cú” trong nhân tế bào bị nhiễm (hình 1.1). 1.7.2. Triệu chứng lâm sàng 1.7.2.1. Với nhiễm CMV bẩm sinh - Trẻ sơ sinh của những người mẹ nhiễm CMV nguyên phát thường dễ đưa đến diễn tiến bệnh CMV nặng. - Trẻ sơ sinh của những bà mẹ nhiễm CMV tái hoạt hóa thường có tiên lượng tốt hơn do người mẹ đã có kháng thể trung hòa virus. Những biểu hiện trầm trọng nhất của nhiễm CMV bẩm sinh là bệnh thể vùi tế bào khổng lồ (cytomegalic inclusion disease) với một số triệu chứng phổ biến nhất bao gồm những phát hiện lâm sàng xuất huyết đốm (71%), vàng da (67%), nhỏ đầu (53%), và kích thước nhỏ với tuổi thai (50%). Bất thường trong phòng thí nghiệm thường bao gồm tăng biribulin huyết (81%), tăng mức độ của các enzym tế bào gan (83%), giảm tiểu cầu (77%), và tăng mức độ đạm CSF (77%) [71]. Nhiều đứa trẻ biến chứng nặng có thể tử vong ngay khi sinh hoặc phải nuôi trong lồng kính cách ly. Những trẻ em nhiễm trùng không có triệu chứng có thể xuất hiện các bất thường về thính giác, thị giác, phát triển tâm thần và vận động trong nhiều năm về sau. - Đặc biệt, viêm não do CMV thường gặp trong nhiễm CMV bẩm sinh. Trên mô não bị nhiễm CMV sẽ thấy có hiện tượng viêm cấp với những tế bào khổng lồ mang thể vùi phân bố trong mô dưới màng não thất và dưới màng mềm kèm theo hiện tượng hoại tử không đều rải rác trong não. Thương tổn do CMV thường khu khu trú ở não thất, não thất sinh tư và nhũng thương tổn này có thể hoá vôi. 1.7.2.2. Với nhiễm CMV mắc phải ở trẻ em - Nhiễm chu sinh và sau khi sinh - Nhiễm CMV trong thời kỳ này là do hít phải dịch tiết của cổ tử cung bị nhiễm CMV, do bú sữa mẹ hoặc có thể do truyền máu. - Nhiễm CMV thời kỳ này đặc biệt nguy hiểm vì là nhiễm nguyên phát. Nếu không có kháng thể bảo vệ trong sữa mẹ thì trẻ có nguy cơ bị nhiễm CMV trầm trọng. Thông thường ban đầu không xuất hiện gì, nhưng một thời gian sau , các triệu chứng thính giác hay những bất thường khác của não mới bắt đầu xuất hiện. - 17-41% trẻ sơ sinh bị nhiễm CMV bẩm sinh có biểu hiện viêm màng mạch võng mạc [70]. 1.7.2.3. Biểu hiện lâm sàng ở những bệnh nhân ghép tạng [3], [14]. Hội chứng nhiễm CMV trên lâm sàng xuất hiện từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 16, cao điểm vào tuần thứ 4 đến tuần thứ 6. CMV thường kèm với tình trạng xáo trộn hệ thống miễn dịch nặng. Nguyên nhân là do giảm tỷ lệ tế bào giúp đỡ đối với tế bào ức chế và có thể gián tiếp đưa đến gia tăng tình trạng nhiễm trùng cơ hội và gây ra thải ghép. Nhiễm CMV còn tạo kháng thể kháng tế bào nội mô mà có thể đưa đến nguy cơ thải ghép cấp và thải ghép mạn. Triệu chứng sốt kéo dài 3-4 tuần là dấu hiệu nguy nhất của hội chứng CMV. Triệu chứng sốt kèm theo những dấu hiệu và triệu chứng của bệnh xâm lấn. Viêm phổi, tổn thương ống tiêu hoá, viêm túi mật, viêm thực quản, viêm gan, viêm võng mạc cũng có thể xày ra. Trong các bênh nhân ghép tạng hậu quả của bệnh CMV là giống nhau: Viêm tụy xuất hiện ở người nhận tụy, viêm phổi -xuất hiện ở những người ghép phổi hoặc ghép tim -phổi, viêm gan ở những người nhận gan ghép. Bệnh nhân ghép thận có tổn thương viêm vi cầu thận thể hình liềm và hoại tử với thể vùi bên trong vi cầu…, nhiễm CMV vẫn còn là một biến chứng có ý nghĩa sau ghép tế bào nguồn tuỷ xương. Tóm lại tạng được ghép là nơi thường dễ bị nhiễm CMV nhất. Mối liên hệ nhân quả giữa CMV và tổn thương tạng ghép vẫn còn là suy đoán và nhiều nghiên cứu cần được chứng minh cho mối liên hệ này. 1.7.2.4. Đối với bệnh nhân AIDS Nhiễm CMV gây ra nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu hoá hoặc hệ thần kinh trung ương [9]. Nhiễm CMV xảy ra 21-44% bệnh nhân AIDS- nhất là bệnh nhân có tế bào lympho CD4 + dưới 100 tế bào/mm3 [71], tỉ lệ viêm võng mạc trên bênh nhân AIDS có nhiễm CMV là 85%. 1.8. Phòng ngừa và điều trị 1.8.1. Phòng ngừa Ngày nay các thầy thuốc lâm sàng đều quan tâm và chú trọng đến việc phòng ngừa nhiễm CMV bởi vì nếu để bệnh CMV bùng phát thì điều trị khó khăn, dự hậu xấu. Hiện nay c._.ó một số tiêu chuẩn để phòng ngừa nhiễm CMV được chấp nhận. - Tránh lây nhiễm. - Tạo miễn dịch chủ động: sử dụng vaccin Towne sẽ tạo miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. Vaccin không ngăn ngừa bệnh CMV hoàn toàn nhưng có khả năng làm giảm mức độ trầm trọng của nhiễm nguyên phát. - Dự phòng miễn dịch thụ động với immunoglobulin: chỉ làm giảm nguy cơ mắc bệnh chứ không ngăn được nhiễm CMV. Hiệu quả dự phòng bằng immunoglobulin có thể bị giới hạn do độ chuẩn của kháng thể không đủ. 1.8.2. Điều trị Các thuốc thường dùng là Acyclovir, Ganciclovir, Penciclovir, Valacyclovir. Tuy nhiên, Ganciclovir có hiệu quả gấp 10 lần Acyclovir trong chống CMV và virus Epstein-Barr, nó có hiệu quả như Acyclovir trong chống herpes và thủy đậu. Cidofovir có tác dụng chống một số chủng CMV kháng Ganciclovir, Fomivirsen tác dụng chống lại chủng CMV kháng Cidofovir, Foscarnet và Ganciclovir. Phân lập kháng Fomivirsen có thể nhạy cảm với Cidofovir, Foscarnet, và/hoặc Ganciclovir. Về cơ chế: Acyclovir, Cidofovir, Famciclovir, Ganciclovir, Penciclovir và Valacyclovir có tác dụng ức chế polymerase DNA của virus, Acyclovir, Cidofovir và Valacyclovir tác động lên phần cuối của chuỗi DNA. Foscarnet không cần phospho hóa trước trước khi ức chế polymerase và sao chép đảo ngược DNA của virus. 1.9. Một số phương pháp chẩn đoán [6], [14]. 1.9.1. Huyết thanh chẩn đoán tìm kháng thể kháng CMV Bao gồm các xét nghiệm tìm kháng thể kháng CMV trong máu của bệnh nhân là IgM-CMV, IgG-CMV. Xét nghiệm miễn dịch men (enzym immuno assay) phát hiện kháng thể IgG, IgM đặc hiệu giúp xác định tình trạng nhiễm CMV. Phương pháp sử dụng chủ yếu là ELISA. 1.9.2. Giải phẫu bệnh Tế bào bị nhiễm CMV sẽ to ra và đặc biệt xuất hiện thể vùi với kích thước lớn nằm trong nhân. Thể vùi có tính ái kiềm hoặc ái toan khi nhuộm bằng hematoxylin hoặc nhuộm eosin. Bao quanh thể vùi là một vòng sáng tạo thành hình ảnh giống như viên đạn chì (buckshot) hoặc mắt cú (owls eye). Kỹ thuật nhuộm miễn dịch: sử dụng cho những mẫu sinh thiết từ gan ghép, độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao từ 84-97% [62]. 1.9.3. Các tế bào nội mô khổng lồ (Cytomegalic endothelial cell - CEC) Các tế bào được xác định bằng cách ly tâm phần tế bào đơn nhân của bạch cầu trên lam thủy tinh sau khi nhuộm đặc hiệu tế bào nội mô. Đối với người nhận tạng, CEC không thấy trong những trường hợp được điều trị dự phòng hoặc điều trị trước. Trong tương lai, xét nghiệm này trong lĩnh vực ghép tạng sẽ được áp dụng rộng rãi. 1.9.4. Phân lập virus Là phương pháp thông thường và cổ điển nhất cho kết quả lâu (1-2 tuần), 1.9.5. Xét nghiệm tìm kháng nguyên trong máu (antigenemia assay) Là phương pháp tiến bộ đáng kể trong chẩn đoán nhiễm CMV ở những người được ghép tạng. Các tế bào nhiễm CMV được xác định bằng các kháng thể đơn dòng kháng lại các protein đặc hiệu của virus (ví dụ pp65). Đây là kỹ thuật đặc hiệu, độ nhạy cao và thông dụng nhất trong việc xác định nhiễm virus trong máu. 1.9.6. Kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization- ISH) Lai tại chỗ là lai phân tử mà trong đó một axit nucleic chuỗi đơn đã biết được gắn với chất phóng xạ hoặc huỳnh quang. Đem phân tử này đặt vào các tế bào hay mảnh mô đã được chuẩn bị và quá trình tác dụng (lai) sẽ xảy ra tại chỗ để tạo thành nhiều phân tử chuỗi kép. Nghiên cứu ISH có thể sử dụng khi kết quả chẩn đoán mô- bệnh học còn nghi ngờ. Ứng dụng này dùng trong chẩn đoán viêm phổi, viêm gan, viêm dạ dày ruột do CMV. Kỹ thuật thực hiện còn cồng kềnh. 1.9.7. Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) xác định DNA của virus PCR (polymerase chain reaction – phản ứng trùng hợp chuỗi): năm 1985, Kary B, Mullis cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp PCR. Đây là một kĩ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kĩ thuật tạo dòng DNA in vitro. Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong lĩnh vực sinh học. PCR cho phép chẩn đoán nhanh nhiễm CMV, nhưng nếu kết quả dương tính cũng không cho ta xác định được là virus mới nhiễm hay là nhiễm tiềm ẩn. Real-Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dùng để định lượng có thể xác định chính xác số lượng của CMV trong cơ thể, thậm chí ở những vị trí đặc hiệu. Kỹ thuật PCR có thể phát hiện được CMV-DNA trong bạch cầu ở máu ngoại vi và toàn bộ máu cũng như CMV-RNA trong bạch cầu. Mặc dù CMV kết hợp với tế bào, CMV-DNA cũng có thể được phát hiện trong các dịch tự do của cơ thể. Định lượng PCR là một phương pháp tốt nhất trong việc chẩn đoán CMV hiện nay. 1.10. Khái niệm về Real-Time PCR [1], [2], [4], [7], [10], [15], [22], [57], [64], [68]. 1.10.1. Khái niệm: Real-Time PCR không những định tính mà còn định lượng, Real-Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dùng để định lượng một lượng nguyên liệu ban đầu nhỏ. 1.10.2. Nguyên tắc: Real-Time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuyếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đó là ý nghĩa cụm từ “Real time” – thời gian thực. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang (fluorescent dye) báo hiệu sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang, Real-Time PCR dùng để định lượng được gọi là PCR định lượng (qPCR). Tín hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh sản phẩm khuyếch đại trong mỗi chu kỳ. 1.10.3. Ưu điểm  Ưu điểm chính của Real-Time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng.  Dữ liệu Real-Time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện.  Việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngọai nhiễm và lọai bỏ những thao tác sau phản ứng. 1.10.4. Phân loại: Hiện nay có bốn phương pháp định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ probe có gắn chất phát huỳnh quang [2]. 1.10.4.1. Molecular beacon: loại probe này có cấu trúc dạng vòng và cuống. Phần cấu trúc dạng vòng sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, còn phần cấu trúc dạng cuống được tạo thành từ các base nằm ở hai đầu mút của probe bắt cặp bổ sung với nhau nhờ liên kết hydro. Một đầu probe sẽ được gắn một chất hóa học phát huỳnh quang, đầu kia được gắn một chất hóa học khác có nhiệm vụ ˝dập tắt˝ (quencher) Molecular beacon có tính đặc hiệu rất cao. Việc thiết kế probe dạng beacon rất khó và quan trọng (hình 1.8). Hình1.8: Quá trình phát tín hiệu huỳnh quang của Molecular beacon 1.10.4.2. Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi: chất nhuộm này gắn với mọi phân tử DNA mạch đôi và chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi gắn vào chúng. Hai chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I và Ethidium bromide. Nhược điểm của phương pháp này phản ứng sẽ cho kết quả định lượng không chính xác nếu có sản phẩm ký sinh (hình 1.9). Hình1.9 : Cơ chế phát huỳnh quang của chất nhuộm SYBR Green I 1.10.4.3. Probe đôi (Hybridization probe): phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một probe sẽ gắn chất cho huỳnh quang (fluorescein donor) ở đầu 3’ phát ánh sáng xanh, một probe sẽ gắn chất nhận huỳnh quang (fluorescein accepter) ở đầu 5’và luôn chặn ở đầu 3’ DNA sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này. Ưu điểm của phương pháp này là việc thiết kế probe tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon (hình 1.10). Chất phát huỳnh quang Quencher Phát tín hiệu huỳnh quang Hình1.10 : Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang của probe đôi. 1.10.4.3. Probe thủy giải (Hydrolysis probe): còn được gọi là TaqMan probe, probe này được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (Quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher. Trong phản ứng PCR, probe này sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của primer đến tiếp xúc với probe, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’–3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của probe và thay bằng nucleotide mới, lúc đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi probe và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt. TaqMan probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện (hình 1.11). Hình1.11 : Phương pháp TaqMan probe 1.10.5. Một số thuật ngữ khác 1.10.5.1. Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle-Ct) [2] Là khái niệm trung tâm của kỹ thuật Real–Time PCR. Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này là dựa vào một đường cong chuẩn (standar curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã biết trước nồng độ DNA. Chu kỳ ngưỡng của một mẫu là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang mẫu vượt lên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận. Tín hiệu huỳnh quang nền do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR, nhưng đối với phản ứng Real–Time PCR sử dụng TaqMan probe, thì chính quencher sẽ tạo tín hiệu nền cho phản ứng. Các mẫu có nồng độ DNA ban đầu lớn sẽ có Ct nhỏ và ngược lại [1] (hình 1.12). Hình1.12: Mô tả chu kỳ ngưỡng 1.10.5.2. Đường cong chuẩn (Standar curve) [1], [2], [46]. Là đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn. Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn (trên biểu đồ chuẩn trục tung là chu kỳ ngưỡng, còn trục hoành là số lượng bản DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn). Các thiết bị phản ứng Real-Time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn biết trước nồng độ. Phương trình hồi quy và giá trị r sẽ được trình bày phía trên đồ thị. Qua đó, chúng ta đọc được hiệu quả khuyếch đại và đường chuẩn tuyến tính R2. Một phản ứng PCR định lượng tối ưu sẽ có hiệu quả khuyếch đại (E) cao 90-105% và đường chuẩn tuyến tính R2>0,980. Hình 1.13:. Kết quả các mẫu chuẩn từ 101-106 copies Hình1.14: Mô tả đường cong chuẩn [46]. Ghi chú: hình 1.14 cho ta R2 (Correlation Coefficient)=1, hiệu quả khuyếch đại (PCR Efficiency) E=96,2%. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mẫu bệnh phẩm Mẫu máu, mẫu nước tiểu của những người nghi ngờ nhiễm CMV đã được xác định dương tính bằng phương pháp tìm kháng thề IgG, IgM ở bệnh viện Từ Dũ, trung tâm y khoa Medic, và xác định bằng PCR tại Công ty cổ phần công nghệ Việt Á. Mẫu HSV1, HSV2 cung cấp từ trung tâm y khoa Medic đươc khẳng định dương tính bằng phương pháp miễn dịch kháng thể. Mẫu huyết thanh khẳng định có chứa HBV, HCV, HPV, EBV, MTB được xác định dương tính bằng Real-Time PCR ở công ty cổ phần công nghệ Việt Á. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Các thiết bị dụng cụ [2] Gồm các thiết bị cơ bản (xem phụ lục): - Ống eppendorf 0,2ml, 1,5ml - Pipetman1000l, 200l, 100l, 10l và các đầu tip tương ứng - Ống nghiệm, ống hút, becher, đĩa petri, giá đỡ ống nghiệm. - Máy ủ nhiệt, máy ly tâm siêu tốc, máy Real-Time PCR, máy vortex, máy vi tính các phần mềm chuyên dụng để thiết kế và đánh giá primer, thiết kế phản ứng PCR, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, tủ hút khí độc, bàn đèn tử ngọai… Vật liệu tiêu hao: găng tay không phấn, đầu tip có phin lọc…. 2.2.2. Hóa chất [2] 2.2.2.1. Hóa chất dùng tách chiết DNA + Proteinase K + Dung dịch 1: triozol (phenol 38%, guanidium thyocinate 0,8M, glycerol5%), chỉnh pH=8. + Dung dịch 2: chloroform. + Dung dịch 3: izopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa. + Dung dịch 4: ethanol 70%. + Dung dịch 5:dung dịchTE 1X (tris 0,1M-EDTA 0,001M). 2.2.2.2. Hóa chất dùng trong Real-Time PCR + DNA-CMV được tách chiết bằng phenol chloroform + Primer (mồi) xuôi, primer ngược, TaqMan probe đã được công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế. + PCR master mix (Pha PCR mix cho Real-Time PCR dùng TaqMan probe): Thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 µl bao gồm: 1. PCR buffer 1X- 2. 1,5 unit Taq DNA polymerase có họat tính 5’-3’ exonuclease 3. dNTP=400µM/L/ mỗi loại dATP, dGTP, dCTP và dTTP 4. 10-25pm primer xuôi, primer ngược 5. 2-5pm TaqMan probe 6. 3-5mM MgCl2 7. Thêm dUTP, hoặc UNG giảm khả năng ngoai nhiễm 2.3. Phương pháp [1], [4], [8], [10], [15], [22], [57], [64], [68]. 2.3.1. Thiết kế hệ primers (mồi) và TaqMan probe Trong đề tài này chúng tôi thực hiện phương pháp Real-Time PCR kiểu phản ứng sử dụng TaqMan probe. Các bước để phát triển một phản ứng TaqMan probe là 1. Thiết kế primers và TaqMan probe. 2. Đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hóa phản ứng. Để thiết kế hệ primers và probe có nhiều phần mềm dùng để thiết kế và chúng tôi sử dụng các phần mềm sau:  Clustal X 2.0  Annhyb 4.922 năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ)  Phần mềm trực tuyến BLAST ( NCBI) ww.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/  Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ) www.scitool.,id.,com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/ Một phản ứng Real-Time PCR thành công đòi hỏi sản phẩm phải được khuyếch đại (trình tự đích) đặc hiệu và hiệu quả. Thiết kế primer phù hợp với trình tự đích là rất quan trọng, vì vậy, việc chọn trình tự đích (sản phẩm khuyếch đại) cần tiến hành trước. 2.3.1.1. Chọn sản phẩm khuyếch đại A- Nguyên tắc: - Sản phẩm khuyếch đại từ 75-200bp. Trình tự càng ngắn thì hiệu quả khuyếch đại càng cao. Tuy nhiên chúng phải dài hơn 75 bp để có thể dễ dàng phân biệt với các trình tự primer- dimer có thể đựơc tạo ra. - Cần tránh cấu trúc thứ cấp ở nhiệt độ bắt cặp hay không, (kiểm tra bằng cách sử dụng chương trình mfold: applications/ mfold/, hoặc xem tập san Bio- Rad 2593). - Tránh một base đơn được lặp lại hơn 4 lần liên tục trên khuôn DNA - Duy trì hàm lượng G, C ở 50-60%. * Sản phẩm khuyếch đại được chọn là một đoạn trình tự gen UL123 (CMV), mã hóa protein 72KDa B- Cách tiến hành - Đầu tiên tải tất cả trình tự nucleotide của gen UL 123(CMV) từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information) trên internet www,ncbi,nlm,gov và lưu lại trong unitled-notepad. - Sau đó so hàng (alignment) các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX 2.0. ClustalX là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng nhiều trình tự DNA hay trình tự protein. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm nổi bật những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng.  Cách sử dụng chương trình ClustalX2.0 Để nhập dữ liệu cho chương trình ClustalX, thực hiện các bước sau:  Mở chương trình ClustalX trên Desktop  Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode  Từ Menu File, chọn Load Sequences  Trong hộp Open, chọn tập tin chứa các trình tự cần so sánh, nhấn nút Open. Hình 2.1: Nhập trình tự cho chương trình ClustalX Sau khi chọn open ta được bảng gióng cột. Hình 2.2: Kích hoạt open sắp gióng cột trong chương trình ClustalX Để thực hiện sắp gióng cột các trình tự nhập vào, chúng ta chọn Do complete alignment trong menu Alignment. Xác định vị trí cho file lưu rồi nhấn nút OK. Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí nucleotide hay amino acid giống nhau sẽ được thể hiện cùng một màu sắc, mỗi loại một màu, và được đánh dấu *. Ta có thể biết được độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương đồng về màu sắc và chọn đoạn tương đồng cao làm trình tự đích. Hình 2.3: Thể hiện kết quả sắp gióng cột trong chương trình ClustalX 2.3.1.2. Thiết kế hệ primers và TaqMan probe  Thiết kế primer: đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò làm primer cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế primer phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Nguyên tắc thiết kế primer: - Hàm lương GC từ 50-60%. - Nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 50-65 0C. Giá trị Tm được tính bằng phương pháp lân cận gần nhất với giá trị của 50mM nồng độ muối và 300nM nồng độ oligonucleotide. - Tránh cấu trúc thứ cấp. - Tránh lặp lại base G, C hơn 3 lần. - Thiết kế base G và C ở đầu và cuối primer. Thành phần 5 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ không nên có hơn 2G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR. - Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp ở đầu 3’( tránh tạo ra primer-dimer). - Kiểm tra sự đặc hiệu bằng những công cụ như Basic Local Alignment Search Tool (  Thiết kế TaqMan probe: Nguyên tắc thiết kế TaqMan probe: - TaqMan probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn primer 5-100C (vì ở giai đọan 600C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của TaqMan probe, TaqMan probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi primer mới bắt cặp) . - Ngắn hơn 30 nucleotide và không có base lọai G ở đầu 5’ bởi vì nó có thể hấp thụ tín hiệu hùynh quang ngay cả khi TaqMan probe bị cắt đứt. - Trình tự TaqMan probe cần có hàm lượng GC từ 30-80% và TaqMan probe phải có nhiều base C hơn base G. - Vị trí bắt cặp ở đầu 5’ của TaqMan probe nhưng không kéo dài đầu 3’ của primer, cách vị trí 3’ của primer bắt cặp trên cùng sợi đích khoảng 2-5 base. - Quan trọng là lựa chọn chất phát và chất hấp thụ hùynh quang . Đề tài chọn kiểu phản ứng singleplex, cho nên probe sẽ chọn chất FAM (6- carboxyfluorescin) làm chất phát huỳnh quang, và TAMRA (6-carboxytetra-methylrhodamine) làm chất hấp thụ huỳnh quang vì giá thành thấp, có sẵn, hiệu quả tốt và tín hiệu có thể phát ra bởi bất kỳ thiết bị nào hiện có.  Cách tiến hành thiết kế hệ primers và TaqMan probe  Cách sử dụng phần mềm ClustalX Sau khi chạy ClustalX các đoạn gene UL123 tải về, so sánh trình tự và xác định vùng bảo tồn (vùng có các trình tự tương đồng của tất cả các đoạn gene), và dựa vào các cặp primer và TaqMan probe đã được công bố trên các bài báo uy tín quốc tế [26], [42], [48], [56], [58], [69] để chọn primer và TaqMan probe, chạy ClustalX các đoạn gene UL123 với từng primer xuôi, primer ngược và TaqMan probe, đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên.  Mở chương trình ClustalX đã gióng cột.  Vào file/ append sequenses/ trong hộp append khai báo file primer/open. Hình 2.4: Minh họa cách gióng cột primer trong ClustalX  Ta được: Hình 2.5: Primer được nối vào cột ClustalX  Tiếp tục vào menu alignment/ Do complete alignment/ khai báo địa chỉ lưu/OK ta được kết quả sắp gióng cột primer xuôi, primer ngược, và TaqMan probe (mẫu dò) (hình 3.1, hình 3.2, hình 3.3).  Cách sử dụng phần mềm Blast Sau bước đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên, ta phân tích và đánh giá hệ primers, probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self–dimer, hetero– dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Annhyb4-922, Oligo Analyzer 3,0 của IDT ( analyzer/oligocal,asp). Vào  Chọn nucleotide blast  Trong vùng : Choose Search Set, dòng database : chọn nucleotide colletion  Trong vùng : Program Selection, chọn Optimize for Somewhat similar sequences (blastn).  Coppy cấu trúc primer vào vùng Enter Query Sequence, và click nút blast, kết quả tương đồng giữa primer và probe giúp ta xác định độ đặc hiệu của primer và probe được thiết kế so với gen CMV.  Cách sử dụng phần mềm Annhyb 4.942 AnnHyb 4.942 (Annealing and Hybridization) là phần mềm miễn phí dùng để phân tích trình tự nucleotide với các đặc trưng như chuyển đổi qua lại giữa các định dạng trình tự, dịch mã, phân tích bảng đồ cắt giới hạn, tìm motif, khung đọc mở. Mở phần mềm Annhyb 4.942  Vào Menu Oligo, chọn New Oligo  Phần Name: Nhập tên đoạn Oligo vào  Note: Chọn màu đoạn primer, hoặc TaqMan probe  Seq, 5’: Nhập trình tự primer hoặc TaqMan probe vào  Ta vào Menu Oligo, chọn Align Oligo with Sequences. Ta có kết quả Align của primer và trình tự.  Cách sử dụng Oligo Analyzer 3.0 của IDT  Vào  Vùng : Sequence nhập trình tự mối và probe theo chiều 5’- 3’,  Để kiểm tra cấu trúc thứ cấp nào thì ta chọn vùng đó, sau đó click nút submit  Để kiểm tra đặc tính ta chọn analyze. Từ đó chọn cặp primers, TaqMan probe tốt nhất để chạy phản ứng Real - Time PCR. Gởi công ty IDT (Intergrated DNA Technologies) của Mỹ thiết kế. 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA –CMV Có thể tách chiết DNA-CMV từ nhiều dịch sinh học khác nhau như máu, nước tiểu, hoặc dịch sinh học khác. Và cũng có nhiều phương pháp khác khau để tách chiết DNA như phương pháp BOOM, CTAB, hoặc phenol-chloroform. Mỗi phương pháp sẽ có một nguyên tắc riêng, nhưng nguyên tắc chung là: 1. Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein để giải phóng DNA. 2. Xử lý bằng nhiệt để phá hủy hoàn toàn protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân. 3. Tách DNA ra khỏi đệm tách và bào quản DNA ở 4 đến 200C. Riêng đề tài này chúng tôi chọn phương pháp tách chiết bằng phenol chloroform [2]. Nguyên tắc: mẫu bệnh phẩm khi trộn với dung dịch phenol /chloroform /Izoamyl alcohol(P/C/I=25:24:1) thì các protein trong mẫu sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform, các vón cục sẽ bị tách ra và tập trung trong lớp phân cách giữa nước và P/C/I (Chloroform thường đi kèm với phenol có tác dụng bổ sung và làm mất hoàn toàn dấu vết của phenol, Chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol). Pha nước chứa DNA sẽ được lấy ra và làm kết tủa trong izopropanol có bổ sung chất trợ tủa (chất trợ tủa có tác dụng bắt các phân tử DNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR). Khi thực hiện với sự có mặt của chất trợ tủa, quá trình tủa có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng với thời gian ngắn (10 phút). Trong điều kiện không có chất trợ tủa, quá trình tủa phải thực hiện ở - 200C trong ít nhất 1 giờ. DNA sau khi được tủa sẽ rửa lại 1 lần với ethanol 70% và cuối cùng được bảo quản trong TE1X (T: Tris có vai trò ổn định pH và E: EDTA bắt các ion Mg2+ làm cho DNase không hoạt động). 2.3.2.1. Quy trình xử lý nước tiểu và tách chiết DNA trong nước tiểu [17], [18], [19], [25], [26], [34],[35], [37], [40], [43], [44], [61]. Phương pháp này sử dụng proteinase K để thủy giải toàn bộ proteine có trong mẫu nước tiểu. Bước 1: Lấy 6 ml nước tiểu cho vào fancol 15ml, ly tâm tốc độ 4000v/p trong 30phút Bước 2: Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn và cho vào 200µl TE1X (0,1M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA- pH=8,0) +0,1% SDS và 40µg proteinase K, ủ ở 370C trong 3 giờ, tốt nhất là ủ qua đêm. Sau đó có thể đun nóng mẫu ở 1000C trong vài phút để bất hoạt proteinase K còn lại. Mẫu thử lúc này có thể sẵn sàng để tách chiết DNA. Bước 3: Lấy 200 µl mẫu tiến hành tách chiết DNA bằng tủa phenol : cloroform: isoamylalcool (25:24:1) giống quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh. 2.3.2.2. Quy trình tách chiết DNA trong máu hoặc huyết thanh, nước tiểu (hình 2.6): Bước 1: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu. Bước 2: Cho 200l mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900l dung dịch 1 (triozol), vortex 30s, để yên 10 phút, thêm vào 200l dung dịch 2 (chloroform), trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng /phút trong 10 phút. Bước 3: Thu 600l dung dịch nổi có chứa DNA (chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600l dung dịch 3 (izopropanol) (trộn đều dd3 trước khi sử dụng). Trộn đều dịch trong tube, để yên trong tủ lạnh 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 4: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh ( tránh loại bỏ luôn phần cặn), cho từ từ 900l dung dịch 4 (ethanol) vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 5: Thu cặn màu xanh, để khô ở 600C trong 10-15 phút, cho 50l dung dịch 5 (TE 1X) vào và đặt phản ứng. Bước 6: Nếu chưa đặt phản ứng phải bảo quản mẫu ở -200C. Mẫu QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA/RNA Vào eppendorf chứa 900 µl dung dịch 1 Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút Hút 200 µl µl mẫu (Mẫu bệnh lao hút 100 µl) Vortex Trộn đều Thêm vào 200 µl dung dịch 2 Hút 600 µl dung dịch nổ i vào eppendorf có sẵn 600 µl dung dịch 3 Làm lạnh 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút Để yên 10 phút Đổ dung dịch nổi Thu cặn màu xanh Thêm vào 900 µl dung dịch 4 Ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút Đổ dung dịch nổi thu cặn màu xanh Thấm vào giấy cho ráo Sấy khô ở 60 oC Cho vào 50 µl dung dịch TE 1X Mẫu lao cho vào 100 µl dung dịch TE 1X Bảo quản lạnh -20 oC Mẫu RNA cho vào 50 µl dung dịch DEPC Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA trong huyết thanh (xem thêm phụ lục) 2. 3.3. Phương pháp Real-Time PCR Phản ứng Real-Time PCR sử dụng TaqMan probe được thiết lập với 5 µl DNA-CMV với 20 µl master mix pha từ iTaq DNA Polymerase (Bio-Rad), phản ứng Real-Time PCR sử dụng PCR Amp/Cycle Graph với FAM-490. Chương trình luân nhiệt được tiến hành như sau: 1 Chu kỳ 95,0ºC 15 phút 40 Chu kỳ 95,0ºC 15 giây 57,0ºC 1 phút 72,0ºC 20 giây Việc phân tích kết quả sau phản ứng luân nhiệt được thực hiện với phần mềm iCycler (Bio- rad) theo đúng hướng dẫn sử dụng. 2.3.4. Phương pháp khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-Time PCR [1], [15]. 2.3.4.1. Khảo sát nhiệt độ lai: Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR. Nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp primer sử dụng dễ tạo nên các sản phẩm ký sinh không mong muốn trong phản ứng, còn nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của primer vào DNA bản mẫu, do đó hiệu quả nhân bản sẽ không cao. Công thức tính nhiệt độ lai: 1. Công thức chính xác với primer dài không quá 20nu: Tm= [4(G+C)+2(A+T)] 0C. Đây là công thức Wallace chung nhất hay được sử dụng, xác định gốc phân tử lai oligonucleotide, được thực hiện trong 1M NaCl, ở nồng độ muối thấp. 2. Công thức này dùng cho primer có độ dài 14-70nu: Tms={81,5+16,6(log10[J +]+0,41(%G+C)-(600/l)}0C [J+] là nồng độ phân tử của cation hóa trị đơn và l= độ dài oligonucleotide, (%G+C) là giá trị thực chứ không phải giá trị phân số (ví dụ: (%G+C)=90% là 90 chứ không phải 0,90). 3. Công thức này dùng cho primer có độ dài 20-35nu: Tmp={22+1,46[2(G+C)+(A+T)] 0C Nhiệt độ primer tính theo lý thuyết là nhiệt độ tham khảo, nhiệt độ bắt cặp thực sự có thể cao hơn 3-120C so với nhiệt tính toán. Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai của từng cặp primers trên một gradient nhiệt độ, khảo sát ở các giếng khác nhau trong khoảng 55-650C, và đọc kết quả so sánh. 2.3.4.2. Khảo sát nồng độ MgCl2+ [4], [15] Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg 2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm-melting temperature) của DNA mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg 2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ Mg 2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polymerase, hiệu suất thu sản phẩm thấp hoặc không có sản phẩm, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu (primer sai vị trí). Nhìn chung, nồng độ MgCl 2 có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài Mg 2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm như AMSO, DMSO, formamide được thêm vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 với một dãy nồng độ từ 2-5 mM. 2.3.4.3. Khảo sát nồng độ primer và TaqMan probe [1] * Thăm dò nồng độ primer Lượng primer đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp. Nếu nồng độ primer quá thấp thì primer sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ primer quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ primer không được cao quá, vì các phân tử Mg 2+ bị cặp hết làm giảm hoạt tính enzym, thể tích mẫu không vượt quá 1/10 thể tích. Trên 200M, thì phải tối ưu lại Mg, tránh sử dụng đệm EDTA vì EDTA bắt kẹp Mg2+. Nồng độ primer thường 0,2M là đủ cho các primer tương tự, cũng có thể sử dụng đến 3M, nhưng tỷ lệ giữa primer và khuôn cao có thể cho kết quả khuyếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân primer. Nồng độ primer trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nồng độ primer thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM. * Thăm dò nồng độ TaqMan probe để có cường độ huỳnh quang là cao nhất, không phải hàm lượng TaqMan cao là cho cường độ phát huỳnh quang cao, ngược lại sẽ làm các phân tử TaqMan probe quá gần nhau nên huỳnh quang phát ra từ đầu reporter của TaqMan probe được thủy giải sẽ bị các quencher của các TaqMan probe khác hấp phụ. Thông thường từ 2-5pm cho mỗi thể tích phản ứng. Vì vậy, chúng tôi chọn phổ nồng độ TaqMan probe từ 100nM-500nM. 2.3.5. Phương pháp khảo sát độ nhạy và khả năng nhân bản chọn lọc của primer và TaqMan probe. 2.3.5.1. Khảo sát độ nhạy Bất kỳ phương pháp nào, các đối tượng mục tiêu cũng chỉ có thể được phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu. Một phương pháp tốt khi nó có thể phát hiện được đối tượng quan tâm ở nồng độ càng thấp càng tốt. Do đó, đây là một chỉ tiêu quan trọng dùng để đánh giá mức độ hiệu quả của phương pháp. Trong nghiên cứu này, để xác định độ nhạy của primer, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu (đã biết trước nồng độ) thành nhiều nồng độ khác nhau. Ở mỗi nồng độ chúng tôi tiến hành khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được khảo sát từ các thí nghiệm trên. Từ đó chúng tôi sẽ xác định nồng độ thấp nhất mà phương pháp vẫn cho kết quả rõ ràng và chính xác. 2.3.5.2. Khảo ._.