Xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong huyết tương

cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS. Phạm Thị Thanh Hà đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trìmh học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trường, trân trọng cám ơn các thầy giáo, cô giáo Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác của trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy tận tình và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Ban lãnh đạo Viện dinh dưỡng, phòng Vật lý đo lường-viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trung tâm kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm- Viện dinh dưỡng nơi tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên nơi tôi công tác đã quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian qua. Cuối cùng xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ tôi tận tình để có kết quả ngày hôm nay. Dương Hải Thuận Học viên cao học khóa 11 chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mục lục Lời cảm ơn. Mục lục. Danh mục các từ viết tắt. Danh mục các bảng. Danh mục các hình. Trang Đặt vấn đề 1 Chương 1: Tổng quan 3 1.1. Vài nét về azithromycin 3 1.2. Một số phương pháp định lượng AZI trong dịch sinh học. 5 1.3. Nguyên tắc chung về phương pháp phân tích bằng HPLC 7 1.3.1. Phân tích định tính. 7 1.3.2. Phân tích định lượng: 8 1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. 9 1.5. Vài nét về LC-MS. 10 Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu. 13 2.2. Hoá chất và thiết bị 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 14 2.3.1. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang 15 2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 15 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. 15 2.3.2.2. Xử lý mẫu 16 2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lượng AZI. 16 2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết 18 2.3.3. Định lượng thăm dò AZI trong HT người uống AZI 18 2.3.4. Phân tích số liệu thực nghiệm 18 Chương 3: Kết quả 19 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 19 3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. 21 3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lượng AZI 21 3.2.2. Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang 22 3.2.3. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định. 24 3.3. Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ để định lượng AZI trong HT. 30 3.3.1. Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội 30 3.3.2. Xác định điều kiện khối phổ. 32 3.3.3. Xác định chương trình sắc ký. 33 3.3.4. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích. 36 3.3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc. 36 3.3.4.2. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống. 37 3.3.4.3. Xác định khoảng nồng độ tuyến tính. 38 3.3.4.4. Xác định LOD và LOQ 40 3.3.4.5. Độ đúng 40 3.3.4.6. Độ chính xác 41 3.4. Xác định hiệu suất chiết 42 3.5. Định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện. 43 Chương 4. Bàn luận. 45 4.1. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI. 45 4.1.1.Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang. 45 4.1.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 46 4.2. Về kết quả định lượng thăm dò AZI trong HT người tình nguyện. 48 Kết luận và kiến nghị 49 Kết luận 49 Kiến nghị 51 Tài liệu tham khảo Phụ lục BẢNG CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APCI : Ion húa học ở ỏp xuất thường (Atmospheric pressure chemical ionization) AZI : Azithromycin CLA : Clarithromycin Cmax : Nồng độ thuốc tối đa ESI Ion húa bằng phun điện tử (Electronsray Ionization) FMOC-Cl 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chlorid HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HT : Huyết tương IS : Nội chuẩn (Internal standard) LC-MS : Sắc ký lỏng ghộp khối phổ (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) LOD : Giới hạn phỏt hiện (Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MS : Khối phổ (Mass Spectrometry) PĐ : Pha động PA : Tinh khiết phõn tớch (Pure for Analysis) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) ROXI : Roxithromycin SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) S/N : Tớn hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise) TB : Trung bỡnh TƯ : Trung ương UV : Tử ngoại (Ultra Violet) VN : Việt Nam DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC 6 2.1 Danh mục hóa chất- thuốc thử-chất chuẩn 13 3.1 Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa 22 3.2 Kết quả khảo sỏt tớnh phự hợp của hệ thống HPLC. 27 3.3 Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tớch pic và nồng độ AZI 28 3.4 Kết quả khảo sỏt tớnh phự hợp của hệ thống LC-MS 38 3.5 Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tớch pic và nồng độ AZI trong HT 39 3.6 Kết quả xỏc định độ đỳng của phương phõn tớch 41 3.7 Kết quả xỏc định độ lặp trong ngày của phộp phõn tớch 42 3.8 Kết quả xỏc định hiệu suất chiết 43 3.9 Kết quả định lượng thăm dũ AZI trong HT người tỡnh nguyện 43 DANH MỤC CÁC HèNH TRONG LUẬN VĂN Hỡnh Nội dung Trang 3.1 Sơ đồ quy trình chiết AZI trong HT 20 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang 23 3.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang 24 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng 25 3.5 Sắc ký đồ mẫu có AZI 25 3.6 Sắc ký đồ mẫu có CLA 26 3.7 Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA 26 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic và nồng độ AZI 28 3.9 Sắc ký đồ AZI 0,5 mg/ml và CLA 5mg/ml 29 3.10 Phổ khối AZI 30 3.11 Phổ khối CLA 31 3.12 Phổ khối ROXI 31 3.13 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5mm) 34 3.14 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5mm) 34 3.15 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy chạy chế độ dẳng dòng 0,5ml/phút hệ dung môi acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4) 35 3.16 Các sắc ký đồ thể hiện sự chon lọc của phương pháp. 37 3.17 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic(AZI/ROXI) và nồng độ AZI trong HT 39 3.18 Sắc ký đồ mẫu HT xác định LOQ 40 3.19 Các sắc ký đồ định lượng AZI trong HT 2 người tình nguyện T1 và T2 44 Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dược phẩm, lĩnh vực phân tích và đảm bảo chất lượng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh, gắn bó chặt chẽ với nhau và có quan hệ tương hỗ để cùng nhau phát triển. Vào những năm 60 của thế kỷ 20, vấn đề sinh khả dụng của thuốc được đề cập tới và nhanh chóng trở thành vấn đề được hầu hết các hãng dược phẩm lớn quan tâm và phát triển. Nó trở thành một động lực thúc đẩy các nhà bào chế tìm ra công thức thuốc tốt nhất, an toàn nhất cho một loại hoạt chất Từ cuối năm 2003, Viện Kiểm nghiệm đã triển khai một mô hình thử nghiệm để đánh giá tương đương sinh học của thuốc nhằm xây dựng nên một qui chế cho đánh giá tương đương sinh học [7]. Những quy chế này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học và dược động học của thuốc, góp phần quản lý chặt chẽ, nâng cao chất lượng thuốc sản xuất trong nước. Chúng ta đã có một số nghiên cứu về lĩnh vực này [1], [3], [7]. Tuy nhiên, con người được đào tạo về lĩnh vực phân tích sinh học này rất ít do đó để triển khai và phát triển nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc không những phải đầu tư vào trang thiết bị mà còn phải chú trọng vào đào tạo con người. Phương pháp phân tích để định lượng thuốc và chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học đóng vai trò quyết định trong đánh giá và diễn giải các số liệu nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học và dược động học của thuốc. Để làm được điều này, các phương pháp phân tích sinh học dựa trên kỹ thuật hóa lý và sinh học hiện đại được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong đó có phương pháp HPLC được sử dụng rất phổ biến. Các phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước để đảm bảo kết quả thu được là chính xác, đáng tin cậy. Qui định một qui trình và các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích sinh học đã được thảo luận ở rất nhiều hội nghị quốc tế lớn về công nghiệp dược phẩm. Trong thực tế chúng tôi nhận thấy thuốc của Việt Nam sản xuất không thua kém về sinh khả dụng so với chế phẩm nổi tiếng cùng loại của nước ngoài (các chế phẩm nghiên cứu đều có tương đương sinh học với chế phẩm đối chiếu) nhưng giá thành chênh lệch nhau gấp 10 lần thậm chí 30 – 40 lần. Về giá bán cũng đúng với trường hợp chế phẩm azithromycin, trong khi viên Azithrin 250 của Pfizer giá khoảng 80.000 – 90.000 đ/ viên, viên Usmax 250 của Dong In Dang Pharmaco (Hàn Quốc) giá khoảng 34.000 đ/ viên, ... thì viên Azithromycin 250 của Traphaco hoặc Azimax 250 của Imexpharm giá chỉ khoảng 3.000 đ/ viên. Do đó, đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của chế phẩm chứa Azithromycin nói riêng và các thuốc của Việt Nam sản xuất nói chung là một việc làm hết sức cần thiết nhằm mục đích phục vụ người bệnh những thuốc có chất lượng cao, giá cả hợp lý phù hợp với điều kiện kinh tế người Việt Nam, đồng thời thúc đẩy nhà sản xuất không ngừng nâng cao chất lượng để sản phẩm của mình có tính cạnh tranh cao. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi chọn đề tài "Xây dựng phương pháp định lượng arithromycin trong huyết tương" Mục tiêu của đề tài: - Xây dựng phương pháp định lượng AZI trong HT. - Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng để khẳng định phương pháp có thể áp dụng định lượng AZI trong HT phục vụ cho nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học. Chương 1: Tổng quan Vài nét về azithromycin(AZI). *Công thức cấu tạo của AZI [6]. Công thức phân tử C38H72N2O12. Khối lượng phân tử: 748,98. Tên khoa học là:10-dihydro-10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA. Trong cấu trúc của AZI không có dây nối đôi liên hợp và các nhóm mang màu nên nó hấp thụ UV kém, đây chính là điều khó khăn để định lượng AZI trong dịch sinh học. * Tính chất [4], [6]. AZI là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid, ở dạng bột màu trắng đến màu trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng. Thực tế không tan trong nước, rất dễ tan trong methanol, aceton, ethanol, diethyl ether, cloroform và dung dịch acid hydrocloric loãng. Dung dịch 0,2% trong hỗn hợp methanol – nước (1 : 1) có pH là 9,0– 11,0. Năng suất quay cực là - 45o tới – 49o (dung dịch 1% trong ethanol) . * Dược động học [4]. Hấp thu: AZI hấp thu nhanh và sinh khả dụng đường uống khoảng 40%. Đặc biệt thuốc đạt nồng độ trong tế bào cao hơn so với trong HT vỡ vậy dựng điều trị vi khuẩn nội bào tốt. Thức ăn làm giảm hấp thu thuốc. Phõn bố: Phõn bố rộng khắp trong cơ thể, chủ yếu vào cỏc mụ như phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt và đại thực bào..., cao hơn trong mỏu nhiều lần, tuy nhiờn nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp. Chuyển hoỏ: Một lượng nhỏ AZI bị khử methyl trong gan, và được đào thải qua mật ở dạng khụng biến đổi và một phần ở dạng chuyển hoỏ. Thải trừ: Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vũng 72 giờ dưới dạng khụng biến đổi. *Cơ chế và tác dụng dược lý [4]. AZI tỏc động bằng cỏch gắn kết vào tiểu đơn vị 50S của ribosom và qua đú ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn. AZI cú phổ khỏng khuẩn rộng và sau khi uống, nồng độ đỉnh trong HT đạt được sau 2-3 giờ. AZI là một kháng sinh mới có hoạt phổ rộng, có tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram(+) (như Streptococcus, Pneumococcus, Staphilococcus aureus…) và gram(-) (như Haemophilus influenzae, Neissria gonorrhoeae…). Có tác dụng vừa phải trên các vi khuẩn Escherichia coly, Samonella enteritis, Samonella typhi, Klebsiella. * Tác dụng không mong muốn [4]. - AZI được dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp. Hay gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10%) với các triệu chứng như buồn nôn, đau bụng, co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy, nhưng thường nhẹ và ít xẩy ra hơn so với erythromycin. - ảnh hưởng thính giác: sử dụng lâu dài ở liều cao AZI có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số người bệnh. * Chỉ định [4]. AZI được chỉ định dùng trong các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm với thuốc như nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới (viêm phổi, viêm phế quản, các nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa), đường hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng và viêm amidan), nhiễm khuẩn đường sinh dục chưa biến chứng do Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae không đa kháng. * Liều dùng và cách dùng [4]. - Dùng 1 lần mỗi ngày, uống trước bữa ăn 1 giờ hoặc sau khi ăn 2 giờ. - Người lớn: ngày đầu uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa với liều đơn 250mg/ngày. - Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ uống ngày đầu là 10mg/kg thể trọng, và 4 ngày tiếp theo là 5mg/kg thể trọng mỗi ngày uống một lần. * Dạng bào chế [5]. - Viên nang AZI dihydrat tương đương AZI 250mg và 500mg. - Bột pha hỗn dịch uống AZI dihydrat tương đương 200mg AZI/ 5ml, lọ bột đông khô pha tiêm 500mg. - Viên nén và viên nén bao phim tương đương AZI 125mg, 250mg và 500mg; viên nén phân tán tương đương AZI 100mg. 1.2. Một số phương pháp định lượng AZI trong dịch sinh học. Theo tài liệu khoa học của nước ngoài có thể định lượng AZI trong dịch sinh học bằng những phương pháp sau: *Các nghiên cứu sử dụng sắc ký Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC T/ liệu Mẫu thử Cột sắc ký Điều kiện sắc ký [12] HT người Acquity UPLC TM BHE C18 ( 50 x 2,1 mm; 1,7mm Waters) - Dung môi chiết: Diethyl ether - Pha động: MeCN- NH4CH3COO 0,05M - Chuẩn nội: ROXI - Tốc độ dòng: 0,35ml/phút - Detector: MS - Đường chuẩn: 1-1000ng/ml - LOQ: 1ng/ml [18] Huyết thanh người Al2O3 - Pha động: Na3PO4 0,02M : MeCN(1:3) pH=10. - Tốc độ dòng: 1,5ml/phút - Detector: điện hóa. - Đường chuẩn: 10ng/ml – 1000ng/ml [13] HT người Symmetry C18 (250 x 2,1mm; 3mm) - Pha động: MeCN- NH4CH3COO 0,05M. - Chuẩn nội: CLA - Tốc độ dòng: 0,5ml/phút - Detector : MS - Đường chuẩn 2,5-2000ng/ml [10] Huyết thanh người Phenyl C18 (250 x 2,1mm; 5mm) - Dung môi chiết: Hexan - Pha động: MeOH- Na3PO40,05M (71:29); pH=5,9 - Chuẩn nội: CLA - Tốc độ dòng: 2,5ml/phút - Detector huỳnh quang. - Chất dẫn xuất huỳnh quang: FMOC-Cl. - Đường chuẩn: 1-500ng/ml [14] Huyết thanh người Chromegabond alkylphenyl 5mm -Pha động: MeCN-MeOH-NH4COOCH3-NaHClO3 (53:10:22:23) - Detector: điện hóa. -LOQ: 90ng/ml [16] HT người Waters C8 (100 x 4,6mm ; 3,5 mm) - Dung môi chiết: Tert-butyl metyl ether - Pha động: MeCN- đệm phosphat (36,5:63,5) pH=7,40 - Tốc độ dòng: 1,2ml/phút - Detector : điện hóa [17] HT người Spheri-5 cyano (100x4,6mm; 5mm) Norwark USA - Dung môi chiết: Ethyl acetat-hexan(1:1) - Pha động: MeCN-MeOH-Đệm phosphat 0,04M pH=6,9 (52:9:39) - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector: điện hóa. - Đường chuẩn: 40-800ng/ml [15] HT người Zorbax SB CN (150x4,6mm; 5mm) - Dung môi chiết: Tert-butyl methyl ether - Pha động:Na2HPO450mM-NaH2PO450mM -MeCN-MeOH pH 6,5-7,5 - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector : điện hóa - Đường chuẩn: 25-1000ng/ml *Các phương pháp khác - Phương pháp Cực phổ, mẫu thử là dịch sinh học [20]. - Phương pháp vi sinh: Xử lý mẫu: pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4o C , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch nổi ở trên cô ở 55oC đến thể tích ban đầu của mẫu. Định lượng trong môi trường thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến 1mg/L[11]. 1.3. Nguyên tắc chung về phương pháp phân tích bằng HPLC [2]. Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha động và pha tĩnh khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. 1.3.1. Phân tích định tính. Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định. Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu. Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào. 1.3.2. Phân tích định lượng: Để có thể định lượng được thì yêu cầu giữa đáp ứng phân tích (chiều cao, diện tích pic) phải có tương quan với nồng độ chất thử. Hi = k1.Ci Si= k2.Ci Hi; Si là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i Ci là nồng độ chất i k1; k2 là các hằng số thực nghiệm. *Phương pháp đường chuẩn: - Phương pháp ngoại chuẩn: Lập đường chuẩn với chuẩn đối chiếu ở ngoài mẫu phân tích. - Phương pháp thêm đường chuẩn: Lập đường chuẩn với chuẩn đối chiếu trên nền mẫu phân tích. - Phương pháp nội chuẩn: Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, người ta thường dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu phân tích và mẫu chuẩn đối chiếu. Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn. Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích nhưng được tách hoàn toàn, có tính chất tương tự như chất cần phân tích nhưng không gây ảnh hưởng lên tín hiệu của chất cần phân tích. Tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic của chất phân tích và chất chuẩn nội trong dung dich chuẩn đối chiếu là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn. *Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một thành phần trong mẫu phân tích được xác định bằng tỷ số (tính bằng phần trăm) của diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu( trừ pic dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện). Hai yêu cầu cần đáp ứng khi sử dụng phương pháp này: - Tất cả các thành phần trong mẫu phân tích cần được rửa giải, xuất hiện trân sắc ký đồ. - Detector của thiết bị có đáp ứng như nhau đối với tất cả các thành phần có mặt trong mẫu. Do hai yêu cầu trên rất khó được đáp ứng đầy đủ nên kết quả thường không tin cậy. Để tăng độ tin cậy người ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối với từng thành phần của mẫu. 1.4. Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang. Quang phổ huỳnh quang ngoài việc áp dụng để định tính, định lượng các chất trên máy đo quang phổ huỳnh quang thì nó còn được dùng để chế tạo bộ phận phát hiện của máy HPLC. Detector huỳnh quang đóng vai trò như một máy huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát hiện về phân tích định tính và định lượng các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký. Detector huỳnh quang có độ chọn lọc và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV. HPLC-detector huỳnh quang có thể phát hiện tới 10-12g. Do có độ nhạy cao nên detector huỳnh quang được sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi trường, giám định pháp y, định lượng hoạt chất trong dịch sinh học... Tùy theo các chất cần định lượng có khả năng phát quang hay không mà tiến hành định lượng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả năng phát quang của nó. Người ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trước khi đến detector huỳnh quang. Việc tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trước hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua cột sắc ký. Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử trước khi qua cột thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất trước cột. Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử sau khi đã đi ra khỏi cột, thì được gọi là tạo dẫn xuất sau cột. 1.5. Vài nét về LC-MS. LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích. - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cho phép phân tích hỗn hợp các chất khó bay hơi như các thuốc bảo vệ thực vật, các thuốc chữa bệnh,... các độc tố, các phân tử protein có phân tử lượng lớn từ vài ngàn đến hàng trăm ngàn đơn vị dalton... [8]. - Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện được sử dụng rất hữu hiệu phân tích dược phẩm cả định tính và định lượng, ví dụ các thuốc có trong các mẫu sinh học phức tạp như HT, huyết thanh, nước tiểu... [8]. *Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ: Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hay nguyên tử của mẫu. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị áp suất thấp, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 đến 10-6 Pa. Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến detector thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. *Các bộ phận của máy phân tích khối phổ: - Bộ nạp mẫu: Có đường kết nối với đầu ra của máy sắc ký lỏng. - Bộ nguồn ion hóa: Nhiệm vụ ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu. Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hiện nay thường sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI) Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI. ESI có vai trò chuyển ion từ pha lỏng sang pha khí. Kỹ thuật này được mô tả như sau: Các phân tử dung môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ được đưa vào một ống mao quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy chất khảo sát). Dưới tác động của điện thế cao có sự tạo thành những hạt nhỏ mang điện. Sau khi qua ống mao quản dưới tác động của luồng khí nitơ nóng các phân tử dung môi từ từ bay hơi, các hạt mang điện tích nhỏ dần. Sau đó các ion dương hay âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài [21]. - Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. - Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. -Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện được khuyếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lượng... * Một số kỹ thuật LC-MS - Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan) Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ đưa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta có một sắc đồ toàn ion (Total Ion Chromatogram). Kỹ thuật này có độ nhiễu đường nền rất lớn nên độ nhạy kém [9]. - Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM) Đây là kỹ thuật ngay từ đầu chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian. Lúc này sắc đồ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa ion đó. Kỹ thuật này có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó làm tăng độ nhạy (tăng tỷ lệ tín hiệu /nhiễu đường nền). Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp [9]. - Kỹ thuật MS/MS Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó sẽ được phân tích tiếp bằng cách tạo ra mảnh ion nhỏ hơn đặc trưng cho ion trước đó, được phân tích MS lần 2. Nếu tiếp tục chọn ion và bẻ gãy ion ta có kỹ thuật MSn (n là số lần bẻ gẫy ion) [21] Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 2.1.Đối tượng nghiên cứu Để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích AZI trong HT người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau: - Mẫu trắng: là HT người của viện Huyết học và truyền máu trung ương. - Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm AZI với nồng độ xác định. - Mẫu thử: là HT người có sử dụng AZI. 2.2. Hoá chất và thiết bị * Hoá chất : Bảng 2.1: Danh mục hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn Tên chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn Hàmlượng Hóa chất thuốc thử Diethyl ether Merck - Đức P.A 99,5% Acetonitril Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,9% Methanol Baker - Mỹ HPLC nhà sản xuất 99,8% Natri carbonat Vel - Bỉ P.A Acid boric Vel - Bỉ P.A Kali clorid Vel - Bỉ P.A Amoni acetat Vel - Bỉ P.A FMOC-Cl Aldrich-Mỹ P.A Chất chuẩn Azithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,27% Roxithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,73% Clarithromycin Viện kiểm nghiệm TƯ - VN 97,82% Chế phẩm HT người Viện huyết học và truyền máu TƯ -VN Viên nén Zithromax Pfizer-USA 250mg * Thiết bị - dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 10A-VP - Detector huỳnh quang. - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max. - Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45μm), bộ lọc mẫu (màng lọc 0,2μm) - Máy lắc siêu âm (Brasonic - Mỹ). - Cân phân tích (Sartorius - Đức) - Máy đo pH (Metrohm - Thụy Sĩ). - Máy ly tâm (Jouan - Pháp) - Máy siêu li tâm (Sartorius - Đức) - Tủ lạnh sâu (Frigo - Đan Mạch). - Máy lọc nước siêu sạch (Elga -Anh). - Máy lắc (Labinco - Hà Lan). - Nồi cách thủy. - ống nghiệm lấy máu chứa EDTA, - ống nghiệm teflon dung tích 30ml. - Bình định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Định lượng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phương pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao. Sau khi tìm hiểu sâu về đối tượng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn hai phương án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với detector huỳnh quang và LC-MS. 2.3.1. Khảo sát quy trình định lượng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang. *Chuẩn bị dung dịch: - Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml trong methanol - Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 mg/ml - Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml - Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4 * Khảo sát điều kiện chạy sắc ký. Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh quang (bước sóng kích thích, bước sóng phát xạ) * Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang. - Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70oC, cách 10oC - Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10 phút. * Đánh giá một số thông số kỹ thuật của phương pháp. - Tính chọn lọc. - Tính phù hợp của hệ thống sắc ký. - Khoảng tuyến tính. - Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). 2.3.2. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng AZI trong HT bằng LC-MS. 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. Để giảm các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích và tăng độ chính sác chúng tôi chọn phương pháp nội chuẩn. Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến hành khảo sát chọn làm chuẩn nội. - Pha dung dịch chuẩn gốc AZI: cân chính xác chất chuẩn AZI, hòa tan trong methanol để được dung dịch gốc. Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,2- 20mg/ml trong methanol. 2.3.2.2. Sử lý mẫu Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phương pháp chiết lỏng - lỏng. 2.3.2.3. Khảo sát điều kiện để định lượng AZI. Tiến hành chạy thử trên từng mẫu AZI, chuẩn nội (IS) và hỗn hợp AZI và IS trong dung môi pha động để: * Khảo sát điều kiện khối phổ. - Kỹ thuật MS một lần: phân tích toàn thang để xác định ion phân tử. - Kỹ thuật SIM sử dụng ion phân tử để định lượng. * Khảo sát điều kiện sắc ký. - Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của AZI và IS trên các cột: Thermo C18 (50 x 2,1mm; 5mm) và Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm). - Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ đẳng dòng hay gradient. - Tốc độ dòng: thay đổi lưu lượng pha động từ 0,2 – 0,6ml/phút để xác định được tốc độ phù hợp cho thời gian lưu tối ưu. - Tiêm mẫu tự động 25ml 2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích * Tính chọn lọc Chuẩn bị mẫu: - HT trắng. - HT có AZI. - HT có IS. - HT có AZI và IS. Xử lý mẫu và tiến hành phân tích * Tính phù hợp của hệ thống sắc ký Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động. Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, tỷ số diện tích pic. * Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng độ AZI từ 0,02 - 2 mg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích. *LOD và LOQ LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3). LOQ là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác phù hợp. LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng. Trong phương pháp sắc ký độ nhiễu của đường nền có thể thay cho tín hiệu của mẫu trắng. Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp dần và tiến hành phân tích. * Độ đúng Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha. *Độ chính xác. Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý như trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sác ký, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ. 2.3.2.5. Xác định hiệu suất chiết Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ k._.