Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotics

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng Quan Về Probiotics : 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics: Từ cổ xưa, mặc dù chưa nhận thức được sự tồn tại của vi sinh vật, nhưng loài người đã biết khá nhiều về các tác dụng của chúng. Trong sản xuất và đời sống, họ đã tích lũy được nhiều kinh nghiệm và các biện pháp lợi dụng các vi sinh vật có ích và phòng tránh các vi sinh vật có hại. Việc lên men lactic (muối dưa) để bảo quản thực phẩm được thực hiện vào khoảng năm 3500 trước Công Nguyên. Ngoài ra, việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không phải là mới. Hàng nghìn năm trước, rất lâu trước khi có thuốc kháng sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men. Bằng chứng về quá trình sản xuất sữa lên men được ghi trong kinh thánh (“Book of Genesis”). Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là khoảng 2500 năm trước Công Nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (sữa lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt (Chopra và Doiphode, 2002). Các nhà khoa học đầu tiên, như Hippocrates được xem là người sáng lập ra nền y học hiện đại và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng và thuốc của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày. Năm 1857, các vi khuẩn lên men lactic (LAB) lần đầu tiên được phát hiện bởi Louis Pasteur (Nguyễn Lân Dũng, 2005). Năm 1878, báo cáo của Lister về việc cô lập vi khuẩn lactic từ sữa ôi, và sau đó các vi khuẩn này cũng được cô lập từ đường ruột. Vào thế kỷ 20, trong thời gian là giáo sư tại viên Pasteur ở Paris, nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff đã tiến hành nghiên cứu những tác động có lợi của LAB đối với sức khỏe của con người và động vật. Ông cho rằng sự lão hóa của con người là do sự thối rửa của các protein và và các chất gây độc từ vi sinh vật bên trong ruột. Ông quan sát thấy những người dân ở Châu Âu, như người Bulgari và người Nga, họ có cuộc sống thọ và khỏe mạnh. Đó là kết quả của việc họ đã tiêu thụ lượng lớn sữa lên men. Ông kết luận việc tiêu thụ các sản phẩm lên men từ trực khuẩn (Lactobacillus) sẽ có ảnh hưởng tích cực đến hệ vi khuẩn đường ruột do acid lactic và hợp chất sinh ra có tác dụng hạn chế sự thối rửa và ngăn chặn các hoạt động của vi khuẩn gây hại trong ruột (A. Mercenier et all, 2002). Điều này khiến cho Metchnikoff đã khuyên trong sách của ông rằng uống đồ uống chứa các lợi khuẩn sống như vi khuẩn lactic sẽ ngăn cản lão hóa (E. Metchnikoff, 1907). Trong bài thảo luận " Việc kéo dài cuộc sống " (The prolongation of life), Metchnikoff đã tuyên bố "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật hữu ích” (Metchnikoff, 1907) và theo ông, những chủng vi khuẩn có thể hoặc không gây hại cho con người nhưng trái lại rất nhiều trong số đó có một vai trò quan trọng đối với sức khỏe của chúng ta. Theo lý thuyết trên, Năm 1908, Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra khái niệm “probiotic”. Trong một vài năm trước, bài thảo luận cuả Metchnikoff, Pastuer và Joubert, khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã kết luận sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Cùng thời gian đó, Henry Tissier đã phân lập được Bifidobacteria, một chủng thuộc nhóm vi khuẩn lactic, từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ, ban đầu có tên thông thường là Bacillus bifidus, sau đó được xếp vào giống Bifidobacterium và nghiên cứu nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi và Shimamura, 1993). Tissier tin rằng Bifidobacteria trong cơ thể trẻ sẽ thay thế các vi khuẩn gây thối rữa và bệnh tật. Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào giả thuyết ảnh hưởng lớn của Bifidobacteria tới số trẻ em này (O ' Sullivan et al., 1992). Lý thuyết của ông được khẳng định bởi quan sát lâm sàng trẻ nuôi bằng sữa mẹ so với trẻ được nuôi bằng sữa hộp (Rasic và Kurmann, 1983). Trong suốt giai đoạn bùng phát của bệnh do vi khuẩn Shigella vào năm 1917, giáo sư người Đức Alfred Nissle đã phân lập được một chủng thuộc Escherichia coli từ phân của một người lính không bị nhiễm bệnh ( Med Klin, 1918). Lúc bấy giờ vẫn chưa có thuốc kháng sinh, Nissle đã sử dụng chủng Escherichia coli Nissle 1917 để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột cấp tính do Salmonella và Shigella Năm 1920, Rettger chứng minh rằng chủng Bulgarian bacillus của Metchnikoff ( sau đổi thành Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) không thể sống trong đường ruột của con người (Cheplin và Rettger, 1920) và hiện tượng hư hỏng của các thực phẩm lên men đã gây ra những tranh cãi về lý thuyết của Metchnikoff trong giai đoạn này. Sau khi Metchnikoff mất (1916), các nghiên cứu tập trung ở Mỹ. nhiều lý luận cho rằng vi khuẩn từ ruột có rất nhiều khả năng tạo ra các tác động có ích bên trong ruột, và vào năm 1935 một số chủng thuộc Lactobacillus acidophilus được tìm thấy có ảnh hưởng tốt khi được cấy vào ruột. Nhiều thử nghiệm được tiến hành với các chủng này và kết quả thu được đã thúc đẩy việc áp dụng trong điều trị táo bón mãn tính. Đến nay, việc nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống vẫn được tiếp tục. Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ qua là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này cũng như về bảo đảm sự sống sót của các vi khuẩn này khi ở trong vùng dạ dày-ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001; Tri I. Wirjantoro et al, 2008; Nagendra P. Shah et al, 1997 ). Rõ ràng nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotics đã được thành lập Các kiến thức có được về probiotics thông qua nhiều nghiên cứu đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa. Từ các quan sát từ sớm của Eli Metchnikoff và các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotics với sản phẩm sữa lên men đã tiếp tục cho đến tận hiện đại. Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại. 2.1.2. Định nghĩa về Probiotics Từ “probiotics” (pro-bios) có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Năm 1908, Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra khái niệm “probiotic”. Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật (Gomes và Malcata, 1999). Sau đó, Parker đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó. Vì vậy, khái niệm “probiotics” “được Parker đề nghị là “những sinh vật và các chất góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” (Parker et al, 1974) Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller, ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó” (Fuller, 1989). Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” ( Havenaar và Huis in't Veld, 1992). Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một hệ sinh thái vi sinh vật ở người trưởng thành ( Tannock, 1990 ); mặc dù phương pháp trị liệu kháng sinh, bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này, nhưng trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự hiệu chỉnh ( Tannock, 1983 ). Vi khuẩn probiotic được tiêu thụ với số lượng lớn cũng không đủ để trở thành chủng chiếm ưu thế trong ruột và có thể hiếm khi được phát hiện trong mẫu ruột hoặc phân sau một hay hai tuần sau sự tiêu hóa. Do đó, quan trọng là chúng ta phải hiểu trên thực tế ảnh hưởng của probiotic có thể được đem lại bởi các sự kết hợp và cơ cấu hoạt động ít thân thiết hơn và tạm thời hơn so với hệ vi sinh vật của người (Sanders, 1999). Vì vậy, định nghĩa về probiotics hiện tại chỉ còn là “vi sinh vật sống mà đi ngang qua vùng ruột và làm lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng”. ( Tannock et al., 2000 ) Hiện nay theo định nghĩa của FAO/WHO (2001) : “Probiotics là những vi thể sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi bổ sức khoẻ cho người tiếp nhận”. Tóm lại, Probiotic là những vi sinh vật sống hữu dụng được đưa trực tiếp vào trong thực phẩm. Khi vào đường tiêu hóa chúng không bị giết bởi diều kiện môi trường và enzyme trong cơ thể mà chúng có khả năng tồn tại, phát triển trong ống tiêu hóa. Chúng không gây hại cho cơ thể vật chủ, trái lại chúng còn ức chế vi sinh vật có hại, tiết ra enzyme tiêu hóa các chất dinh dưỡng mà cơ thể vật chủ không tiêu hóa được để tạo ra các acid hữu cơ hạ pH ruột già, chống lại sự lên men thối, nhờ thế mà bảo vệ tốt đường tiêu hóa, cải thiện sự tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng của sinh vật chủ. 2.1.3. Probiotic, prebiotic và synbiotic. Từ lý thuyết về probiotic , dẫn đến những khái niệm về prebiotic và synbiotic. Prebiotic được định nghĩa và đặt tên đầu tiên bởi Marcel Roberfroid (1995) (Gibson GR, Roberfroid MB. 1995). Prebiotic là hợp chất trong thức ăn không được tiêu hóa ở đoạn trên ống tiêu hóa do cơ thể vật chủ không có Enzyme tương thích, nhưng sau khi đi xuyên qua dạ dày, ruột non xuống ruột già, chúng lại kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn hữu ích phát triển, làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột ( Lactobacilli hoặc Bifidobacteria) theo hướng có lợi cho vật chủ. Sau đó khái niệm này đã được sửa đổi như sau “Prebiotic là những thành phần lên men một cách có chọn lọc , cho phép diễn ra một số thay đổi cụ thể cả về thành phần và hoạt động của hệ vi sinh vật bên trong đường tiêu hóa, mà những vi sinh vật này mang lại lợi ích cho vật chủ ” (Roberfroid, 2007). Prebiotic có vai trò gián tiếp đối với sức khỏe con người. Prebiotic được so sánh với các thực phẩm chức năng. Prebiotic bao gồm các hợp chất carbohydrates và cả non-carbohydrates, phổ biến nhất là các dạng chất xơ hòa tan (soluble fiber) có trong các loại thực phẩm thô (dietary fiber). Thêm vào đó, sau khi xem xét lại các prebiotic năm 2007, Roberfroid chỉ ra rằng có 2 loại fructo-oligosaccharides (FOS) cụ thể bổ sung đầy đủ cho khái niệm của ông, đó là oligofructose và inulin (Roberfroid,2007) và cho biết có thể đưa ra một số chất khác làm prebiotic. Nhiều chuyên gia tiến hành phân biệt các galactooligosaccharides (GOS) là prebiotic thật sự. GOS là một chất có nguồn gốc từ động vật được sản xuất bằng cách chiết xuất đường sữa từ các sản phẩm sữa hoặc sử dụng các enzyme để phân hủy chúng. Các tiêu chí cơ bản của một prebiotic: Không bị tiêu hóa Thủy phân và lên men bởi các vi khuẩn đường ruột Kích thích có chọn lọc một hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định. Mang lại những lợi ích về sức khỏe cho vật chủ. Synbiotic là hỗn hợp probiotic và prebiotic có tác dụng cải thiện khả năng sống và chiếm ngự trong đường ruột của các probiotic, sử dụng synbiotic cho nhiều hiệu quả tốt hơn là chỉ sử dụng probiotic hay prebiotic đơn thuần. Bảng 2.1: Ví dụ về thành phần của prebiotic (Gibson, Roberfroid. 2008) Thành phần Inulin - các polimer của fructose (fructan) và fructo-oligosaccharides (FOS) Oligosaccharides đậu nành Lactulose Lactosucrose Rafinose và stachyose Galacto-oligosaccharides (GOS) Trans-galacto-oligosaccharides Galactosylsucrose Isomalto-oligosaccharides và malto-oligosaccharides Palatinose Gluco-oligosaccharides Xylooligosaccharides Chitinoligosaccharides 2.1.4. Thành phần vi sinh của probiotics (Avrelija. 2010) Probiotics được biết dến là các vi sinh vật sống thuộc vào hệ vi sinh có trong tự nhiên, ít hoặc không có khả năng gây bệnh và có vai trò quan trọng đối với sức khỏe của vật chủ. Probiotics bao gồm một số loài thuộc Lactobacillus như Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus reuteri, bifidobacteria và một số chủng nhất định thuộc Lactobacillus casei, nhóm các vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia coli Nissle 1917, ngoài ra còn có các chủng Enterococci, đăc biệt là Enterococcus faecium SF68. Một số nấm men cũng được xem là probiotics như Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae. Chúng được sử dụng trong các thực phẩm probiotic nhất là các sản phẩm sữa lên men hoặc dược phẩm. Một số chủng mới được xem là probiotic đã và đang được chú ý như Lactobacillus plantarum (gồm các loài PCS20, PCS22, PCS25 và PCS26)được phân lập từ Slovenian cheese (Nam Tư). Những loài này mang lại lợi ích lớn đối với sức khỏe cũng như khả năng miễn dịch và kháng khuẩn cao cho con người. Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) Lactobacillus Gram (+) Bifidobacterium Other lactic acid Bacteria Gram (+) Non-lactic acid bacteria - L. acidophilus - L. amylovorus - L. casei - L. cripatus - L. delbrueckii subsp.Bulgaricus - L. gallinarum - L. gasseri - L. johnsonii - L. paracasei - L. plantarum - L. reuteri - L. rhamnosus - B. adolescentis - B. animalis - B. bifidum - B. breve - B. infantis - B. lactis - B. longum - Enterococcus faecalis - Enterococcus faecium - Lactococcus lactis - Leuconostoc mesenteroides - Pediococcus acidolactici - Streptococcus thermophilus - Sporolactobacillus inulinus - Bacillus cereus var. Toyoi - Escherichia coli Nissle 1917 - Propionibacterium freudenreichii - Saccharomyces cerevisiae - Saccheromyces boulardii 2.1.5. Cơ chế hoạt động và lợi ích của probiotics. (Salminen et al.) Các thí nghiệm về lợi ích của probiotic đã đưa ra một loạt các khả năng mang lại lợi ích khi sử dụng probiotics. International Life Sciences Institute (ILSI) đã đánh giá và phân loại chức năng của probiotics đối với con người vào 4 lĩnh vực ứng dụng khác nhau : (1) trao đổi chất, (2) viêm ruột mãn tính và rối loạn chức năng, (3) nhiễm trùng và (4) dị ứng. Mật độ cần thiết của một probiotic để đạt được một hiệu ứng lâm sàng thường là ≥106 CFU/ml dịch ruột non và ≥ 108 CFU/g phân trong ruột già. Liều lượng điều trị bằng probiotic có thể cao hơn từ 10 đến 100 lần. Trong tiêu chảy điều trị liều lượng cao thì cho hiệu quả hơn. Đối với các bệnh mãn tính (dị ứng, viêm hoặc các bệnh thuộc miễn dịch) thì tác động của probiotic phị thuộc vào tương tác giữa hệ miễn dịch đường ruột với hệ vi sinh vật tương ứng và thời gian điều trị. (Avrelija. 2010). Lưu ý rằng đối với những lợi ích mang tính tiềm năng, nghiên cứu bị giới hạn và chỉ cho kết quả sơ bộ, các tác động được mô tả chỉ thuộc về chủng được kiểm tra, không được quy cho bất kì dòng khác của cùng một loài và không phải là tác động chung cho toàn bộ các chủng probiotics (Gilliland và Walker, 1990). Để có thể mang lại những lợi ích cho vật chủ, trước tiên chủng probiotics phải có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa nghĩa là chịu được acid, dịch tiêu hóa dạ dày, tồn tại và phát triển được trong điều kiện có muối mật và không gây bệnh cho vật chủ. 2.1.5.1. Tác động kháng khuẩn của probiotics. Probiotics có họat tính đối kháng chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Helicobacter pylori…làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh đồng thời tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt những vi khuẩn cạnh tranh. Vi khuẩn probiotic tạo ra nhiều chất ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, gồm có các acid hữu cơ, H2O2 và đăc biệt là bacteriocin. Những hợp chất này không chỉ làm giảm sô lượng sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic. Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase. Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong. Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng của tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết. Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng. Bacteriocin class I (đại diện: nisin của Lactococcus lactis) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, đo đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám đựơc vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh/lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin) – protein không bền nhiệt, tác động trực tíêp lên vách tế bào đích (hình 2.1) (Riley và Chavan, 2007 ), (Cotter et al., 2005). Hình 2.1: Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin (Cotter et al., 2005). 2.1.5.2.Tác động của probiotics trên biểu mô ruột Một khả năng cần thiết nữa của probiotic nữa là khả năng kết bám trên biểu mô ruột do vị trí họat động của probiotics là trên bề mặt biểu mô ruột. Muốn vậy chúng phải sống sót khi đi qua dạ dày. Chúng kết bám vào biểu mô ruột với số lượng lớn và đa dạng góp phần tạo nên hệ vi sinh đường ruột lành mạnh và nhờ đó mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô. Bám dính cạnh tranh vị trí và nguồn dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh Tổng hợp các hợp chất kháng và giảm số lượng vi sinh vật có hại trên bề mặt ruột. Cảm ứng huy động tế bào miễn dịch và họat hóa đáp ứng miễn dịch thích hợp và đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy. Giảm viêm đường tiêu hóa và sự lây nhiễm vi khuẩn như giảm viêm loét đại tràng (Whorwell et al., 2006), ( Niedzielin et al., 2001), (Kerr, Martha, 2003). LAB được cho là hỗ trơn trong việc điều trị nhiễm Helicobacter pylori, một trong những nguyên nhân gây viêm loét dạ dày.( Hamilton-Miller, 2003) Hỗ trợ tiêu hóa cho ruột, cải thiện khả năng hấp thụ lacrose và hoạt động của các enzyme khác (Sanders,2000), các khoáng chất (Famularo,2005) và các vitamin : B, K… Giảm cholesterol, giảm huyết áp máu nhờ vào một loại peptide ức chế tên gọi là ACE tạo ra trong quá trình lên men của LAB (Famularo,2005) Kháng đột biến và kháng ung thư nhờ sự tương tác của các tế bào này với các tác nhân gây đột biến và ung thư (Mattila et al., 2002). Probiotic có thể kết dính, bao bọc, hoặc kéo đi những yếu tố gây ung thư; kiềm chế sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh có liên quan từ đó hạn chế các yếu tố tiền ung thư trong đường ruột . 2.1.5.3.Tác động lên hệ miễn dịch của probiotics. Mặc dù cơ chế vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên LAB được cho là có một số hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch. LAB có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng các phương tiện của sự ức chế cạnh tranh, Probiotics đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003).tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA – kháng thể chính trong chất nhày cơ thể, hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ T lympho (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002), kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (mặc dù chưa có cơ chế cụ thể) (O'Toole và Cooney, 2008). Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh rằng probiotics có thể làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp (Hatakka et al. 2001) và sâu răng ở trẻ em (Näse et al. 2001). Một nghiên cứu năm 2010 cho rằng những lợi ích của liệu pháp probiotic là ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi dùng kháng sinh. Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong khi probiotics lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm mới (ScienceDaily).  2.1.5.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột. Hình 2.2 : Cơ chế tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột bao gồm : (1) Cạnh tranh về các thành dinh dưỡng, (2) tác động dựa vào các chuyển hóa sinh học như tạo ra các chất gây ức chế trong quá trình lên men, (3) tạo ra các chất sinh trưởng cho các vi khuẩn khác như Exopolysaccharide (EPS) và các vitamins, (4) tạo đối kháng trực tiếp bằng các bacteriocins, (5) cạnh tranh vị trí bám dính trên biểu mô ruột, (6) tạo hàng rào bảo vệ, (7) giảm viêm nhiễm, (8) kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (O'Toole và Cooney, 2008). (IEC (epithelial cells): tế bào biểu mô, DC (dendritic cells): tế bào đuôi gai hoặc tế bào nhánh, T: tế bào T). Probiotics điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Ở những phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn probiotic khác nhau. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này đúng cho tất cả các loại probiotics. Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh : Nguyên nhân là do kháng sinh làm mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột và khi đó Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca tăng lên nhanh chóng và giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh. kết quả cho thấy chủng S. bolardii, S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006). Tính hiệu quả của phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng probiotic được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến 50% mức độ của bệnh. Các loại thực phẩm bổ sung LAB, được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp , và giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002). Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột. Probiotics có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột. Bảng 2.3: Sự chiếm ngụ của vi sinh trong đường tiêu hóa của người (Simon và Gorbach, 1982). Dạ dày : 101 – 103 CFU/ ml Lactobacilli Streptococci Helicobacter pylory Nấm men ( như Candida albicans ) Ruột non : 104 – 108 CFU/ml Lactobacillii Enterobacteriaceae Streptococci Bacteroides Bifidobacteria Fusobacteria Ruột già : 1010 – 1012 CFU/g Chủ yếu là các vi khuẩn kị khí bắt buộc và không sinh bào tử Bacteroides 30% Bifidobacteria 25% Streptococci Fusobacteria Enterobacteriaceae Clostridia (phần lớn là vi khuẩn kị khí) Veillonella Lactobacillii Proteus Staphylococci Pseudomonas Nấm men ( như Candida albicans ) Protozoa ( như Blastocystis, Chilomastix, Endolimax, Entamoeba speices, Trichomonoashominis) 2.1.6. Hạn chế của probiotic : Trong một số trường hợp cụ thể (như ngững người đang mắc bệnh trầm trọng) chúng có thể có gây hại. Trong một thử nghiệm điều trị lâm sàng được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu về viêm tụy Hà Lan (Dutch Pancreatitis Study Group), việc tiêu thụ một hỗn hợp của 6 vi khuẩn probiotic làm tăng tỷ lệ tử vong của bệnh nhân với dự đoán viêm tuỵ cấp nghiêm trọng (Besselink et al. 2008). Trong một thử nghiệm lâm sàng được tiến hành tại Đại học Tây Úc, nhằm thể hiện tính hiệu quả của chế phẩm sinh học trong việc giảm bệnh dị ứng ở trẻ em, Tiến sĩ Susan Prescott và các đồng nghiệp của cô đã cho 178 trẻ em hấp thu hoặc một probiotic hoặc giả dược trong giai đoạn 6 tháng tuổi. Những trẻ có được các vi khuẩn tốt có nhiều khả năng phát triển một sự nhạy cảm dễ bị dị ứng (Susan Prescott et al. 2008). Một số bệnh viện đã báo cáo về nhiễm trùng lactobacillus trong máu, một bệnh có khả năng gây tử vong, do tiêu thụ probiotics bởi những người bị suy giảm hệ thống miễn dịch hoặc những người đang bị bệnh nặng (Susan Prescott et al. 2008), (Daily Mail, 29-1-2008) Không có công bố nào cho thấy bổ sung probiotic có thể thay thế hệ vi sinh vật tự nhiên của cơ thể khi chúng bị tiêu diệt hoàn toàn, các mức vi khuẩn bị biến mất trong ngày khi lượng vi khuẩn bổ sung bị ngưng ( 2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB). (Owen R. Fennema et al. 2004) 2.2.1 Khái niệm. Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự thống nhất về hình thái , đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, acid lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987). Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), do được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. Theo bản phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que, trong đó các giống sau đây là chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một nhóm vi khuẩn Gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic Việc phân loại vi khuẩn acid lactic vào chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được axit hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. Hình 2.3 : Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004) Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau. - Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an toàn với con người. 2.2.2. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc.Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và acid. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2÷3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8÷4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5÷6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25÷350C, ưa nhiệt là 40÷450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 60÷800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau, quả, sữa, thịt,…). 2.2.3. Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu. Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. 2.2.3.1 Giống Lactobacillus: Phân loại khoa học: Bảng 2.4 : Phân loại khoa học giống Lactobacillus Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bacilli Bộ : Lactobacillales HHọ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như : L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus … Hình 2.4 : Lactobacillus species [87] Đặc điểm: (Beijerinck, 1901) Tế bào có dạng hình que thường dài và thon, không di động, Gram +, hiếm._.