Xác định vai trò gây bệnh viêm phổi – màng phổi ở lợn của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và thử nghiệm vacxin phòng bệnh

ng thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày … tháng 9 năm 2008 Tác giả Vũ Ngọc Quý Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn: - PGS.TS. Cù Hữu Phú, người hướng dẫn khoa học trực tiếp đã giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. - TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; khoa Sau đại học-Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. - Cán bộ nghiên cứu công tác tại Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y - Sự giúp đỡ nhiệt tình của lãnh đạo Công ty Giống Chăn nuôi Thái Bình, Hải Phòng, Hà Tây và các bạn đồng nghiệp đặc biệt là gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Hà Nội, Ngày … tháng 9 năm 2008 Tác giả Vũ Ngọc Quý Mục lục Lời cam đoan i Lời cám ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu v Danh mục bảng vi Danh mục biểu, hình vii danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu AGID: Agargel Immuno Diffuse A. pleuropneumoniae: Actinobacillus pleuropneumoniae B. bronchiseptica: Bordetella bronchiseptica BHI: Brain Heart Infusion CAMP: Christie – Atkinson – Munch – Peterson CFT: Complement Fixation Test cs: cộng sự DNA: Deoxyribonucleic Acid EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ELISA: Enzyme – linked Immunosorbant assay H. parasuis: Haemophilus parasuis H. pleuropneumoniae: Haemophilus pleuropneumoniae IHA: Indirect Haemagglutination test LPS: LypoPolysaccarit M. hyopneumoniae: Mycoplasma hyopneumoniae MR: Methyl red NAD: Nicotinamide Adenine DinucleotideOIE: Organisation for International EpidemicPBS: Phosphat buffer solution PCR: Polymerase Chain Reaction P. multocida: Pasteurella multocida PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TSA: Tryptic Soy Agar vk: vi khuẩn VP: Voges - Prokauer Danh mục bảng STT Tên bảng Trang 2.1 Trình tự các cặp mồi dùng để xác định type giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida 36 3.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm 39 3.2 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Actinobacillus và Pasteurella ở đường hô hấp của lợn theo địa phương 40 3.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Actinobacillus và Pasteurella từ dịch ngoáy họng và phổi của lợn 43 3.4 Kết quả phân lập vi khuẩn đường hô hấp của lợn theo các lứa tuổi 45 3.5 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được 46 3.6. Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn phân lập được 46 3.7 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập được 46 3.8 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được 46 3.9 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae và P. multocida phân lập được 46 3.10 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin. 46 3.11 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột bạch 46 3.12 Kết quả thử hiệu lực vacxin trên lợn 46 3.13 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm vacxin 46 Danh mục biểu, hình Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Actinobacillus và Pasteurella ở đường hô hấp của lợn theo địa phương 41 Biểu đồ 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Actinobacillus và Pasteurella từ dịch ngoáy họng và phổi của lợn 43 ảnh 3.1 Bệnh tích phổi lợn bị viêm phổi - màng phổi 45 ảnh 3.2 Khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella phân lập được trên môi trường thạch máu 46 ảnh 3.3 Hình thái vi khuẩn Pasteurella phân lập được (1500 x) 46 ảnh 3.4 Khuẩn lạc của vi khuẩn Actinobacillus phân lập được trên môi trường thạch máu 46 ảnh 3.5 Hình thái vi khuẩn Actinobacillus phân lập được (1500 x) 46 ảnh 3.6 Phản ứng lên men đường của vi khuẩn Actinobacillus phân lập được 46 ảnh 3.7 Phản ứng lên men đường của vi khuẩn Pasteurella phân lập được 46 ảnh 3.8 Kết quả của phản ứng PCR định type vi khuẩn P. multocida 46 Mở ĐầU Hiện nay chăn nuôi gia súc nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng vẫn chiếm một vị trí quan trọng trong ngành nông nghiệp nước ta, đặc biệt là những tỉnh thuộc đồng bằng Bắc bộ. Bởi vì đa số dân số nước ta sống ở nông thôn và nguồn sống dựa cả vào nông nghiệp, trong đó chủ yếu là trồng lúa và chăn nuôi lợn. Thịt lợn là nguồn thực phẩm chính trong bữa ăn hàng ngày của mọi người dân chúng ta, sản phẩm thịt lợn phần lớn là để đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần dành cho xuất khẩu, lợn cũng là nguồn cung cấp phân hữu cơ cho thâm canh tăng năng suất cây trồng. Trong những năm gần đây, ngành thú y đã có một số thành tựu mới góp phần phòng chống dịch bệnh, bảo vệ đàn lợn. Tuy nhiên, từng lúc từng nơi khi mà điều kiện sinh thái không thuận lợi, một số dịch bệnh vẫn xảy ra gây những thiệt hại đáng kể cho đàn lợn, đặc biệt là lợn con trước và sau cai sữa vì lợn ở giai đoạn này vừa thay đổi điều kiện sinh lý vừa dần thích nghi với điều kiện sống mới nên rất dễ mắc bệnh. Có rất nhiều các loại bệnh khác nhau ở lợn, trong đó phải kể đến các bệnh về đường hô hấp như: Ho thở truyền nhiễm, viêm phổi, viêm phế quản, viêm teo mũi truyền nhiễm,… Đây là những bệnh đáng quan tâm nhất trong giai đoạn hiện nay của ngành chăn nuôi lợn. Trong chăn nuôi lợn nói chung, các bệnh về đường hô hấp thường không gây tỷ lệ chết lợn cao như các bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng,...nhưng chúng gây tổn thất nặng nề về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi, gây thiệt hại cho nền kinh tế quốc dân. Lợn thường mắc bệnh hô hấp, đặc biệt đối với lợn chăn nuôi tập trung và bệnh lại xuất hiện quanh năm. Lợn mắc bệnh bị còi cọc, chậm lớn, tiêu tốn thức ăn nhiều nhưng tăng trọng kém và chi phí điều trị lớn. ở đường hô hấp trên của lợn ở các lứa tuổi thường có một số loại vi khuẩn cư trú thường trực như các vi khuẩn: Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Haemophillus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Streptococcus suis… Khi sức đề kháng của cơ thể gia súc giảm xuống do điều kiện nuôi dưỡng, vệ sinh, chăm sóc kém, các vi khuẩn này sẽ nhân lên nhanh chóng về số lượng và tăng cường độc lực phát thành bệnh và gây thiệt hại lớn cho đàn lợn. Vì vậy để góp phần giải quyết những yêu cầu thực tế của sản xuất, giúp người chăn nuôi có biện pháp phòng trừ bệnh đường hô hấp có cơ sở khoa học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định vai trò gây bệnh viêm phổi – màng phổi ở lợn của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và thử nghiệm vacxin phòng bệnh” Mục đích của đề tài Xác định tỷ lệ nhiễm một số loại vi khuẩn cư trú tại đường hô hấp trên của lợn các lứa tuổi khỏe mạnh và nghi mắc bệnh đường hô hấp. Xác định độc lực của vi khuẩn đường hô hấp phân lập được để đưa ra những đánh giá về vai trò gây bệnh hô hấp của một số vi khuẩn này. Chế tạo và thử nghiệm Autovacxin sử dụng phòng bệnh đường hô hấp cho lợn. 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn 1.1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida Năm 1836 có thể được coi là cột mốc lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng (Pasteurellosis) của con người. Đây chính là năm mà Maillet là người đầu tiên mô tả về bệnh tụ huyết trùng ở gà, sau đó Bollinger đã phát hiện bệnh này ở bò vào năm 1878. Nhưng đến năm 1880, Louis Pasteur mới là người đầu tiên nuôi cấy và phân lập được mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng gà. Sau đó, Gaffky (1881) phân lập được mầm bệnh trên thỏ và Kitt (1885) phân lập được mầm bệnh ở bò. Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh tụ huyết trùng ở lợn. Năm 1887, Trevisan đã đề nghị đặt tên vi khuẩn này là Pasteurella để ghi nhớ công lao của Louis Pasteur. Tất cả các loại Pasteurella gây bệnh bại huyết, xuất huyết cho các loài gia súc, gia cầm đều thuộc một giống duy nhất có những đặc tính cơ bản giống nhau về mặt hình thái, nuôi cấy,… nhưng chỉ khác nhau ở tính thích nghi gây bệnh ở các loài vật chủ (Theo Nguyễn Như Thanh, 2001 [9]). Theo phân loại của Bergey (1994) [14] thì Pasteurella multocida nằm trong bộ Eubacteriales thuộc họ Pasteurellaceae, thuộc giống Pasteurella và thuộc loài P. multocida. 1.1.1.1. Đặc tính hình thái và tính chất nuôi cấy P. multocida là loại cầu trực khuẩn nhỏ, hình trứng hoặc bầu dục, kích thước 0,25 - 0,4x0,4 - 1,5 mm. Vi khuẩn bắt màu gram (-), không có lông, không di động, không hình thành nha bào. Trong cơ thể gia súc mắc bệnh, P. multocida khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn. Vì thế người ta gọi Pasteurella là vi khuẩn lưỡng cực. Nguyên nhân này là do nguyên sinh chất dung dải dồn về hai đầu. Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái. P. multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 13 - 380C, tốt nhất là 370C, pH thích hợp từ 7,2 - 7,4. Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, khi môi trường được bổ sung thêm máu hay huyết thanh thì vi khuẩn phát triển tốt. Khuẩn lạc của vi khuẩn P. multocida không gây dung huyết trên môi trường thạch máu, vi khuẩn không mọc trên môi trường MacConkey. Vi khuẩn có khả năng lên men đường Glucose, Saccarose, Succrose, Mannitol, Xylose, không lên men Lactose, Maltose, Arabinose, Salixin. Phản ứng Indol, Catalase, Oxydase dương tính. Phản ứng Urease, VP, MR âm tính và không làm tan chảy gelatin. 1.1.1.2. Sức đề kháng P. multocida có sức đề kháng yếu, nó dễ dàng bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường: Vi khuẩn bị diệt sau khi đun ở 580C/20 phút, 800C/10 phút, 1000C trong vài giây, ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày. Axit phenic 5% diệt vi khuẩn trong 1 phút, nước vôi 1% trong 3 - 5 phút. Trong đất ẩm có nhiều Nitrat và thiếu ánh sáng vi khuẩn có thể sinh sản và sống khá lâu. Trong chuồng nuôi súc vật, trên đồng cỏ, trong đất vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm (Nguyễn Như Thanh, 2001 [9]). 1.1.1.3. Giáp mô và yếu tố độc lực của vi khuẩn P. multocida * Giáp mô: Phần lớn các chủng P. multocida đều có giáp mô. Đó là một lớp vỏ nhày hay dịch nhày bao bọc ngoài thành tế bào. Giáp mô vừa có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác động có hại của môi trường, vừa là nơi dự trữ các chất dinh dưỡng của vi khuẩn. Giáp mô là yếu tố độc lực của vi khuẩn. Theo Carter (1952) [18], đa số các trường hợp vi khuẩn P. multocida phân lập từ động vật mắc bệnh cấp tính sẽ thấy có giáp mô và có độc lực. Khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vi khuẩn sẽ mất và vi khuẩn không còn độc lực. Nhưng nếu cấy những vi khuẩn đã mất giáp mô trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền qua động vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và thể hiện độc lực. Ông cũng đã chia P. multocida thành 5 serotype kháng nguyên giáp mô khác nhau là serotype A, B, D, E và F. Bain (1982) [13] cho rằng thành phần của giáp mô có chứa axit hyaluronic và gắn một lớp polysaccarit. Lớp polysaccarit giáp mô là yếu tố quyết định bề mặt quan trọng không chỉ đối với P. multocida mà còn đối với một số vi khuẩn gây bệnh khác. Theo Manninger (1991) [39], độc lực của P. multocida rất phức tạp và không ổn định, nó tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh. Những chủng vi khuẩn P. multocida có giáp mô thì có độc lực, không có giáp mô thì không có độc lực. Khả năng xâm nhập vào ký chủ và sự phát triển trong ký chủ của vi khuẩn là nhờ sự có mặt của giáp mô. Vi khuẩn khi mất khả năng tái tạo giáp mô sẽ không còn độc lực. Tác giả còn thấy rằng nhiều chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được có giáp mô rõ nhưng độc lực lại thấp vì độc lực của vi khuẩn có thể phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng. Kháng nguyên giáp mô là nhân tố rất quan trọng trong yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida, đặc biệt là serotype A. Giáp mô giúp vi khuẩn tránh được sự thực bào trong quá trình đại thực bào ở phổi. Một số tác giả đã thông báo rằng P. multocida bị hấp thu trong quá trình đại thực bào tại phổi lợn xảy ra rất chậm, thậm chí có sự hiện diện của Opsonin, như kết quả nghiên cứu của Fuentes và Pijoan (1986)[27]. * Độc tố của vi khuẩn: Một trong những tính chất quan trọng của P. multocida gây nên quá trình bệnh lý là khả năng sản sinh nội độc tố. Thành phần chính của nội độc tố là Lipopolysaccarit. Chế phẩm tinh khiết của nội độc tố có tính chịu nhiệt, nhưng sẽ bị giảm độc dưới tác dụng của Phenol ở 220C, hoặc khi xử lý bằng dung dịch Trichloracetic 4% trong 1 giờ ở 370C. Lipopolysaccarit có thể gây viêm, sốt và sinh ra đáp ứng miễn dịch chống vi trùng ở các mức độ khác nhau. Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận P. multocida còn sản sinh ra một loại độc tố khác, đó là một loại protein có hằng số lắng 2,99x103 (trong dung dịch đệm phosphat). 1.1.1.4. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida P. multocida có kháng nguyên rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Cho đến nay đã xác định được kháng nguyên của P. multocida có 2 loại chính là kháng nguyên giáp mô (K) và kháng nguyên thân (O). - Kháng nguyên giáp mô (K) có hai thành phần α và β. Chúng được cấu tạo từ protein và polysaccarit, ngoài ra còn một số ít các Lipopolysaccarit. Kháng nguyên K của vi khuẩn P. multocida còn có khả năng gắn với thụ thể của tế bào hồng cầu. P. multocida có 5 serotype kháng nguyên giáp mô là A, B, D, E và F (Theo Carter, 1987 [21]). Trong đó, các serotype A, B và D thường gây bệnh cho lợn. Tại Triều Tiên trong 80 chủng P. multocida phân lập từ 450 phổi lợn bệnh thấy có 96,3% thuộc type A, 3,9% thuộc type D (Ahn and Kim, 1994 [12]). Tại Nhật Bản trong 116 chủng P. multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh tích nhục hoá, áp xe và viêm màng phổi thấy có 81,9% thuộc type A, 18,1% thuộc type D, đặc biệt type D chỉ thấy ở phổi lợn có áp xe (Iwamatsu and Sawada, 1988 [31]). Theo Verma (1988) [59] type B thường gặp ở Đông Nam á, Trung Quốc, ấn Độ. - Kháng nguyên thân (O) là các kháng nguyên thành tế bào vi khuẩn, chỉ được bộc lộ khi kháng nguyên giáp mô (K) đã tách ra. Kháng nguyên (O) là một phức hợp hóa học: Protein - Lipit - Polysaccarit. Kháng nguyên thân (O) của P. multocida được chia thành 16 loại, ký hiệu từ 1 - 16 (Theo phân loại của Heddleston, 1972 [29]). 1.1.1.5. Đường xâm nhập và cơ chế gây bệnh Vi khuẩn P. multocida có thể xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua các vết thương trên da. Theo Biberstein (1990) [15], vi khuẩn Pasteurella có thể truyền lây bằng mọi đường nhưng quan trọng nhất là bằng đường không khí, ngoài ra còn bằng đường tiêu hóa, sinh dục, qua các vết cắn của động vật. Sự truyền lây bệnh bởi ngoại ký sinh trùng và truyền lây qua ruồi cũng có thể xảy ra trong những ổ dịch nghiêm trọng, đặc biệt là ở bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết của động vật có vú và gia cầm. ở điều kiện bình thường vẫn có một tỷ lệ nhất định vi khuẩn cư trú ở niêm mạc đường hô hấp trên của nhiều lợn khỏe mạnh và không gây bệnh. Tuy nhiên, khi sức đề kháng của cơ thể lợn bị giảm sút do điều kiện ngoại cảnh tác động thì những vi khuẩn này sẽ nhanh chóng tăng cường về số lượng, độc lực, xâm nhập sâu vào bên trong đường hô hấp đến phổi và gây bệnh. 1.1.2. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P. multocida gây ra Vi khuẩn P. multocida có thể là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát gây ra bệnh viêm phổi ở lợn, bệnh có thể gây chết lợn hoặc làm giảm khả năng tăng trọng của lợn do vậy gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi. Theo Pijoan (1989) [50], việc nhiễm P. multocida ở phổi lợn thường thấy ở giai đoạn cuối của dịch viêm phổi địa phương hay hội chứng ho thở truyền nhiễm do M. hyopneumoniae khởi phát hoặc ở những bệnh ghép. 1.1.2.1. Đặc điểm dịch tễ Vi khuẩn P. multocida được phát hiện thấy trong tất cả các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, có thể tồn tại trong niêm mạc mũi và hầu họng của những lợn khoẻ mạnh bình thường. Bệnh viêm phổi do P. multocida xuất hiện rộng khắp trên thế giới nhưng bệnh hay xảy ra và gây thiệt hại ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới như: ấn Độ, Pakistan, Iran, Irắc, Thái Lan, Philippin, Indonesia, Lào, Campuchia, Triều Tiên và Việt Nam, ở tất cả các điều kiện khí hậu và điều kiện chăn nuôi. Vì vi khuẩn P. multocida thường cư trú ở đường hô hấp trên của lợn ở hầu hết các lứa tuổi, ở cả lợn khỏe mạnh nên rất khó tiêu diệt. Vi khuẩn P. multocida gây bệnh thường kết hợp với những tác nhân khác như vi khuẩn M. hyopneumoniae, A. pleuropneumoniae, H. parasuis, B. bronchiseptica,... làm cho quá trình viêm phổi càng nặng thêm. Nielsen (1988) [45] cho rằng sự lây nhiễm P. multocida có thể xảy ra qua đường không khí hoặc qua đường tiếp xúc trực tiếp giữa các lợn với nhau. Nhiều công trình nghiên cứu cho biết nguồn lây nhiễm vi khuẩn từ môi trường bên ngoài bao gồm chuột và những loài gặm nhấm khác, đôi khi gà và phân gà cũng được coi là nguồn lây nhiễm. Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [8], quá trình lây nhiễm P. multocida là qua tiếp xúc với gia súc bị bệnh, nung bệnh, mang trùng hay tiếp xúc với chất thải của vật bệnh. 1.1.2.2. Triệu chứng Triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra rất khác nhau tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn gây bệnh, thường xuất hiện 3 thể: - Thể cấp tính: Thể này thông thường do hầu hết các chủng P. multocida thuộc serotype B gây ra. Những con vật mắc bệnh thường có biểu hiện khó thở, hóp bụng vào để thở, gõ vào bụng có âm đục “bịch, bịch”, sốt cao nhiệt độ lên tới 41 - 420C, tỷ lệ chết cao (5 - 40%). ở những con vật chết và hấp hối có thể thấy những vết đổi màu tím ở vùng bụng có thể là do sốc nội độc tố. - Thể á cấp tính: ở thể này, hiện tượng ho và thở thể bụng thường thấy ở những lợn lớn. Ho ở những lợn ở lứa tuổi này thường được coi là tiêu chuẩn xác định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Triệu chứng lâm sàng của bệnh ở thể này giống như viêm màng phổi do A. pleuropneumoniae gây ra, nhưng những đặc điểm phân biệt chính là bệnh viêm phổi do P. multocida hiếm khi gây ra chết đột ngột, hơn nữa lợn mắc bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra có thể tồn tại một thời gian dài. - Thể mãn tính: Đây là thể đặc trưng thường thấy của bệnh, lợn bệnh thỉnh thoảng xuất hiện ho, sốt nhẹ hoặc không. Những lợn bị bệnh thường ở giai đoạn lớn (10 - 16 tuần tuổi). 1.1.2.3. Bệnh tích Bệnh tích do P. multocida gây ra chủ yếu ở phần xoang ngực và thường đi kèm với bệnh tích của M. hyopneumoniae. Bệnh tích đặc trưng của bệnh này xuất hiện ở thuỳ đỉnh và mặt trong của phổi, cùng với có bọt khí trong khí quản. Có sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng tổ chức phổi bị tổn thương và vùng tổ chức phổi bình thường. Phần bị ảnh hưởng của phổi có sự biến đổi màu sắc từ màu đỏ sang màu xám xanh phụ thuộc vào giai đoạn của bệnh. Các trường hợp bệnh nặng có thể xuất hiện viêm màng phổi và áp xe ở các mức độ khác nhau. Trong các trường hợp này thường thấy màng phổi dính chặt vào thành xoang ngực và màng phổi có vùng mờ đục, khô. Đây chính là bệnh tích chủ yếu để phân biệt bệnh viêm phổi do Pasteurella với viêm phổi do Actinobacillus, trong đó thường thấy mủ chảy ra có màu vàng và dính cùng với rất nhiều sợi fibrin (Pijoan, 1989 [49]). Một đặc điểm nữa là ở thuỳ phụ có dịch rỉ viêm của phế quản. Mức độ nghiêm trọng của viêm phế quản là do sự tăng sản của tế bào nội mô và sự có mặt rất nhiều các tế bào bạch cầu trung tính trong mủ nhầy (chất tiết nhầy có mủ) ở phế quản và trong phế nang. Bệnh tích này là không đặc trưng cho sự nhiễm khuẩn P. multocida mà nó phổ biến cho mọi trường hợp viêm phổi do nhiễm khuẩn. Dấu hiệu bệnh này cũng thể hiện mối liên quan giữa bệnh viêm phế quản do Pasteurella với bệnh viêm cầu thận, cũng do Pasteurella (Buttenschon, 1991 [17]). Tác giả này cũng kết luận rằng hai bệnh này có liên quan với nhau bởi quá trình vi khuẩn phát tán từ những bệnh tích ở phổi. 1.1.2.4. Chẩn đoán Việc chẩn đoán đúng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra là hết sức cần thiết, do đó cần tiến hành đồng thời nhiều phương pháp như: Dịch tễ học, chẩn đoán lâm sàng, giải phẫu bệnh lý và đặc biệt là dựa trên kết quả xét nghiệm vi khuẩn học trong phòng thí nghiệm. Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn tương đối dễ nuôi cấy, phân lập trong phòng thí nghiệm. Những mẫu bệnh phẩm tốt nhất để phân lập vi khuẩn bao gồm: Dịch khí quản và tổ chức phổi được lấy ở vùng ranh giới giữa tổ chức bị tổn thương và tổ chức bình thường. Những mẫu dịch ngoáy mũi, ngoáy họng bằng tăm bông cũng được xem là mẫu tốt cho việc phân lập P. multocida, những mẫu này nên được giữ trong môi trường vận chuyển phù hợp. Mẫu bệnh phẩm phải được đưa đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt, tránh bị tạp nhiễm và tất cả các mẫu phải được bảo quản lạnh (4 – 80C) cho đến khi phân lập, nuôi cấy vi khuẩn. Bên cạnh đó còn có thể sử dụng các phương pháp khác như: Phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch trên gel thạch AGID (Agargel Immuno Diffuse) để xác định kháng nguyên thân (O) từ vi khuẩn phân lập được với kháng huyết thanh chuẩn, phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính để định loại kháng nguyên giáp mô (K), phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để xác định kháng nguyên giáp mô, phản ứng ELISA, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction),... Việc xác định chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được thuộc serotype nào là hết sức cần thiết để có thể xác định được thể bệnh mà chúng gây ra, từ đó có biện pháp phòng trị bệnh phù hợp. Gần đây, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra ở vật nuôi, trong đó có P. multocida và đã được OIE chuẩn hóa thành quy trình chung, có thể áp dụng ở các phòng thí nghiệm để định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida. 1.1.2.5. Phòng bệnh Cần tiến hành đồng thời nhiều biện pháp để phòng các bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra nói riêng như: Giữ vệ sinh chuồng trại, chuồng nuôi thông thoáng, hợp lý, quản lý chăm sóc tốt, nhất là thức ăn, nước uống cho lợn phải đầy đủ. Bên cạnh đó cần sử dụng vacxin để phòng bệnh viêm phổi do P. multocida gây ra cho lợn. Hiện nay, ở nước ta đã có một số loại vacxin vô hoạt dùng cho việc phòng bệnh viêm phổi do P. multocida. Tại Viện Thú y quốc gia, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú và cs đã và đang nghiên cứu thử nghiệm loại vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh đường hô hấp cho lợn do một số loại vi khuẩn đường hô hấp gây ra trong đó có vi khuẩn P. multocida. 1.1.2.6. Điều trị Việc nghiên cứu điều trị bệnh do P. multocida bằng thuốc kháng sinh đã được quan tâm từ lâu. Theo Trần Đình Từ và cs (1992) [11], P. multocida phân lập từ gia cầm ở vùng Thừa Thiên Huế mẫn cảm với Chloramphenicol (vòng vô khuẩn 31,31mm) sau đến Streptomycin (25,84 mm), Gentamycin (24,28 mm), Tetramycin (24,14 mm) nhưng đề kháng với Ampicilin, Erythromycin. Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bình (1996) [1], P. multocida phân lập từ gia cầm ở Long An mẫn cảm với các loại kháng sinh: Spectinomycin 100%, Flumequin 100%, Nitrofuratonin 98%, Colistin 90%... và thấy rằng phần lớn những kháng sinh mới nhập vào thị trường Việt Nam đều có tác dụng mạnh với P. multocida. Salmon và cs (1995) [54] đã làm phản ứng kiểm tra các chủng vi khuẩn phân lập từ một số quốc gia và đã nhận thấy các loại Cephalosporin và Enrofloxacin có tác động tốt nhất và các loại Erythromycin, Sulfamethazine và Lincomycin có tác động kém trong phòng thí nghiệm. Kháng sinh rất đa dạng và sự kết hợp giữa các loại kháng sinh đã được sử dụng thường xuyên. Tuy nhiên việc điều trị bằng kháng sinh ngày càng khó khăn hoặc không thành công, điều này là do tính kháng thuốc rộng rãi của vi khuẩn P. multocida. Một số thuốc kháng sinh đã được dùng có hiệu quả cho điều trị P. multocida: Lincomycin-spectinomycin, một số Cephalosporin và nhiều Quinolon: Enrofloxacin và Danofloxacin. Trong đó Ceftiofur đã được một số tác giả chứng minh là kháng sinh tốt để chống lại vi khuẩn P. multocida. Tuy nhiên, để điều trị có hiệu quả bệnh đường hô hấp do vi khuẩn P. multocida gây ra phải dựa trên kết quả kháng sinh đồ vì vi khuẩn rất dễ kháng thuốc và thường kết hợp gây bệnh với một số loại vi khuẩn đường hô hấp khác như Mycoplasma, Actinobacillus,... 1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae và bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn 1.2.1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay H. pleuropneumoniae, đã được chứng minh là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn. 1.2.1.1. Đặc tính hình thái và tính chất nuôi cấy Vi khuẩn A. pleuropneumoniae là loại cầu trực khuẩn nhỏ, gram (-), kích thước 0,3 - 0,5x0,6 - 1,4 mm, không di động, không sinh nha bào và có hình thành giáp mô. Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy vi khuẩn có lông hay còn gọi là pili có kích thước 0,5 - 2x60 - 450 nm. A. pleuropneumoniae là một vi khuẩn khó tính, khó nuôi cấy. Chủ yếu sinh trưởng trong môi trường được bổ sung 5% huyết thanh ngựa, và trong điều kiện có 5 - 10% CO2. Vi khuẩn không mọc trên môi trường thạch máu thông thường trừ khi thạch máu được bổ sung NAD và chúng mọc xung quanh các khuẩn lạc của tụ cầu do Staphylococcus aureus trong quá trình phát triển trên thạch máu đã phá huỷ hồng cầu có trong máu và sản sinh ra chất NAD. Do đó cần cấy vài đường tụ cầu kèm trên đĩa thạch máu khi phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae trên môi trường này. Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc 0,5 – 1 mm sau 24h nuôi cấy trên thạch máu có cấy kèm tụ cầu và hình thành vùng dung huyết b, nhất là khi sử dụng máu cừu (Kilian và cs, 1978 [37]) và người ta thấy hiện tượng này liên quan tới sự có mặt ba chất làm tan tế bào: Apx I; Apx II; Apx III (Frey và cs, 1993 [26]; Jensen và cs, 1986 [36]). A. pleuropneumoniae có thể phân biệt được với H. parasuis bởi sự xuất hiện dung huyết xung quanh đường cấy tụ cầu trên thạch máu, vì vi khuẩn Haemophilus khi nuôi cấy trên thạch máu không gây ra hiện tượng dung huyết. Nhưng với Haemophilus sp. (nhóm phụ) cần có NAD như Haemophilus sp. nhóm C (Rapp và cs, 1985 [53]) nay đã được xếp vào nhóm Actinobacillus như A. minor, A. porcinus và A. indolicus (Moeller và cs, 1996 [41]). Trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn đòi hỏi yếu tố V để phát triển, nó phát triển tốt trên môi trường thạch Chocolate nhưng vi khuẩn không mọc trên môi trường MacConkey. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có khả năng lên men các loại đường: Xylose, Ribose, Glucose, Fructose, Maltose,...và không lên men: Trehalose, Arabinose, Lactose, Raffinose, Mannitol,... Phản ứng sinh Indol, Oxidase, Catalase, Urease, CAMP Test dương tính. 1.2.1.2. Sức đề kháng A. pleuropneumoniae có sức đề kháng kém. Vi khuẩn chỉ tồn tại trong môi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên khi được bảo vệ bởi chất nhầy hoặc các chất hữu cơ khác thì vi khuẩn có thể sống sót trong vài ngày. Trong nước sạch ở nhiệt độ 40C, vi khuẩn có thể sống được 30 ngày, nhiều giờ trong khí dung và có thể tồn tại được trong 4 ngày ở mô phổi và chất thải ở nhiệt độ phòng. Nó bị diệt nhanh chóng ở điều kiện khô và các chất sát trùng thông thường (Eastaugh, 2001 [2]). 1.2.1.3. Phân loại A. pleuropneumoniae là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi. Có thể chia thành 2 biotype dựa trên nhu cầu sử dụng NAD của vi khuẩn (Pohl và cs, 1983 [51]). Biotype 1 của vi khuẩn khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo phụ thuộc vào NAD, biotype 2 không phụ thuộc vào NAD nhưng cần có các pyridine nucleotide đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotide để tổng hợp NAD cần thiết cho sự phát triển của chúng. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2. Đến nay, trong biotype 1, đã tìm thấy được 12 serotype, chúng được phân loại theo type huyết thanh từ 1 - 12 (riêng serotype 5 được chia làm 5A và 5B). Trong biotype 2, serotype 2, 4, 7, 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1. Gần đây biotype 2 có serotype 13, 14 được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1. 1.2.1.4. Cấu trúc kháng nguyên và các yếu tố độc lực Hiện nay đã xác định được một số thành phần cấu trúc và các loại protein của A. pleuropneumoniae. Một số trong các thành phần này liên quan tới quá trình sinh bệnh và người ta đã xác định được cấu trúc của nhiều thành phần, đã giải mã được trật tự gen và những yếu tố này có vai trò quan trọng trong sinh bệnh, chẩn đoán và phòng bệnh. * Lớp vỏ vi khuẩn: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các Polysaccarit. Đây là thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và gây hiệu ứng cho serotype đặc hiệu (Ward and Inzana, 1997 [60]). Cấu trúc và thành phần hóa học của lớp vỏ của 12 serotype đã được xác minh (Perry và cs, 1990 [47]). Lớp vỏ này mang điện tích âm. ở các serotype 2, 3, 6, 7, 8, 9 và 11, điện tích âm phụ thuộc vào gốc phosphat, ở serotype 5A, 5B, điện tích âm phụ thuộc vào yếu tố liên kết diestephosphat, ở serotype 1, 4, 12 phụ thuộc liên kết phosphat (Perry và cs, 1990 [47]; Dubreuil và cs, 2000 [25]). Lớp vỏ này không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có ý nghĩa chẩn đoán và dịch tễ (Inzana, 1991 [32]). Những chủng A. pleuropneumoniae tự nhiên có độc lực cao hơn những chủng khác. Sự khác nhau về độc lực liên quan đến cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và nội độc tố tạo nên (Dubreuil và cs, 2000 [25]). Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy những chủng có độc lực thì có kích thước lớn hơn và có lớp vỏ bám dính hơn trong khi những chủng ít độc thì nhỏ hơn và chỉ có lớp vỏ mỏng (Steffens và cs, 1990 [56]; Inzana, 1991 [32]). Jacques (1987) [35] cũng xác định sự đa dạng trong cấu trúc vỏ khi phân tích lớp vỏ ở các serotype 1 - 10 dưới kính hiển vi điện tử và cho thấy lớp vỏ dày khoảng 80 – 90 mm đến 210 – 230 mm tùy từng serotype. Chính điều này đã giải thích cho sự khác nhau về độc lực giữa các serotype. Lớp vỏ giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi sự đề kháng của động vật như hoạt động thực bào và hoạt động bổ thể. Những thể đột biến không có vỏ sẽ bị tiêu diệt ngay sau kh._.i có mặt kháng thể trong khi những chủng có vỏ thì không (Ward và Inzana, 1997 [60]). * Độc tố của vi khuẩn: Đa số các chủng A. pleuropneumoniae đều tạo ra 1 hoặc nhiều hơn 1 độc tố phân hủy hồng cầu. ở A. pleuropneumoniae độc tố này gọi là độc tố Apx được xác định là Apx I, Apx II, Apx III (Frey và cs, 1993 [26]) và Apx IV (Cho và Chae, 2001 [22]). Người ta tin chắc chắn về vai trò của Apx trong quá trình gây bệnh của A. pleuropneumoniae. Mỗi độc tố này khác nhau do hoạt động phân giải hồng cầu gây độc tế bào (Frey và cs, 1993 [26]). - Apx I có khả năng gây dung huyết mạnh, gây độc mạnh cho tế bào, có trọng lượng phân tử 105 - 110 kDa, có ở các chủng thuộc serotype 1, 5, 9, 10 và 11 và được mã hoá bởi nhóm gen Apx bao gồm Apx IC, Apx IIA, Apx IB và Apx ID cho gen hoạt hoá, cấu trúc và 2 gen bài xuất. - Apx II gây dung huyết yếu, khả năng gây độc tế bào cũng yếu, có trọng lượng phân tử 103 - 105 kDa, có ở các chủng trên trừ serotype 10. - Apx III là độc tố không gây dung huyết nhưng có khả năng gây độc tế bào mạnh, có trọng lượng phân tử 120 kDa, thấy ở các chủng thuộc serotype 2, 3, 4, 6 và 8. Gần đây, người ta đã phân loại thêm Apx IV, song chỉ được thấy trong môi trường cơ thể, không tìm thấy trong môi trường thí nghiệm. Tất cả 12 serotype A. pleuropneumoniae đều mang gen Apx IV (Cho và Chae, 2001 [22]). Vai trò độc lực của Apx đã được chứng minh gây ra những triệu chứng của bệnh và những tổn thương đặc trưng trên lợn. * Lipopolysaccarit: Lipopolysaccarit (LPS) là thành phần chính của lớp màng ngoài vi khuẩn, và được cho là nguyên nhân gây tổn thương mô. Những tổn thương do LPS tinh chế không gây xuất huyết, không gây hoại tử khác với tổn thương đặc trưng của viêm phổi - màng phổi. Song LPS chắc chắn kết hợp với độc tố Apx làm tăng độc lực và tăng tính mãnh liệt cho độc tố Apx. LPS có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô và lớp màng nhầy khí quản của lợn (Perry và cs, 1990 [47]). Bám dính là hoạt động ban đầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn và có thể là đặc tính gây bệnh, là nguyên nhân gây ra bệnh. Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng phần LPS của A. pleuropneumoniae có vai trò trong sự phát triển tổn thương hay gây chết lợn khi bị nhiễm vi khuẩn này. Tuy nhiên cơ chế gây bệnh khác có thể tham gia trong quá trình sinh bệnh khi sự tổn thương vẫn phát triển sau khi lợn bị phơi nhiễm với vi khuẩn sống, có hiệu giá huyết thanh cao với lipit A và phần carbohydrat của phân tử LPS. 1.2.2. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra Vi khuẩn A. pleuropneumoniae là một tác nhân gây bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn. Đây là một bệnh truyền nhiễm quan trọng ở đường hô hấp của lợn và xảy ra ở hầu hết các nước có nền công nghiệp chăn nuôi tiên tiến, nhất là với hình thức chăn nuôi lợn tập trung. Bệnh đã gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi vì ngoài việc gây chết lợn, còn làm giảm tăng trọng, giảm năng suất, làm con vật gầy yếu và tốn kém cho chi phí thuốc men. Pattison và cs (1957) [46] là những người đầu tiên nghiên cứu về bệnh này và thông báo đã phân lập được loại vi khuẩn giống Haemophilus từ phổi lợn có bệnh tích viêm phổi. Năm 1978, Kilian và cs [37] đã đặt tên vi khuẩn này là Haemophilus pleuropneumoniae. H. pleuropneumoniae sau được xếp vào họ Actinobacillus và đặt tên là A. pleuropneumoniae bởi sự xác định có sự tương đồng ADN giữa H. pleuropneumoniae và A. ligrieressi (Pohl và cs, 1983 [51]). 1.2.2.1. Đặc điểm dịch tễ học Bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm của lợn do A. pleuropneumoniae gây ra đã xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới. Tại Việt Nam trong những năm gần đây, A. pleuropneumoniae đã được phân lập và được đánh giá là một vi khuẩn gây nên một bệnh hô hấp khá quan trọng ở tất cả các trại lợn siêu nạc quy mô lớn. Bệnh viêm phổi truyền nhiễm của lợn có phân bố rộng rãi. Nó ngày càng trở nên quan trọng do việc chăn nuôi lợn ngày một phát triển. Bệnh có mặt và lan truyền ở hầu hết các nước châu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nam Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và úc. Mặc dù chỉ một vài serotype thịnh hành ở một số nước nhất định như: Serotype 2 ở Thụy Điển, Đức và Thụy Sĩ; serotype 1 và 5 ở Mỹ và Canada nhưng cũng có thể thấy một số serotype ở cùng một nước. Một số serotype (serovar) được coi là ít độc (ví dụ serovar 3 có độc lực rất thấp) và về dịch tễ chúng không quan trọng ở một số nước nhất định nhưng lại có thể gây nên dịch ở một số nước khác (Desrosiers và cs, 1984 [24]; Brandreth và Smith, 1985 [16]). Chính vì vậy việc xuất nhập khẩu động vật có ý nghĩa quan trọng trong việc truyền lây bệnh. A. pleuropneumoniae là vi khuẩn cư trú ở đường hô hấp trên của lợn. Trong những trường hợp nhiễm trùng quá cấp và cấp tính, không chỉ thấy vi khuẩn ở phổi và ở máu, mà còn ở chất tiết đường mũi. Các trường hợp sống sót sau nhiễm khuẩn cấp tính trở thành lợn lành mang trùng, tác nhân gây bệnh thường thấy ở những vùng hoại tử ở phổi, amidan và mũi. Thời gian ủ bệnh có thể khác nhau, người ta thấy rằng lợn tiếp xúc với số lượng lớn vi khuẩn có thể bị chết sau một vài giờ hoặc vài ngày. Sự nhiễm trùng ở mức độ thấp có thể dẫn tới thể bệnh ẩn trên lâm sàng. Tất cả các lứa tuổi đều bị cảm nhiễm. Trong trường hợp cấp tính của bệnh thì tỷ lệ chết thường cao. Tỷ lệ chết cũng phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sự lưu hành bệnh trong môi trường. Bệnh nặng hơn và tỷ lệ tử vong cao hơn nếu nhiễm kế phát các bệnh khác như bệnh Aujeszky’s hoặc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS). Sự lan truyền bệnh giữa các đàn thường xảy ra qua việc đưa động vật mới vào đàn. Sự vận chuyển và trộn đàn làm tăng số lượng lợn mắc bệnh viêm phổi - màng phổi. Các yếu tố khác như mật độ đàn quá đông, điều kiện khí hậu thay đổi đột ngột nhất là khi có sự thay đổi nhiệt độ, độ ẩm không khí cao và thông khí kém làm sự phát triển và lan truyền bệnh nhanh có ảnh hưởng lớn đến số lượng lợn mắc bệnh và chết. Do đó không ngạc nhiên khi thấy tỷ lệ các đợt bùng phát cao nhất ở lợn đang lớn và lợn chuẩn bị được giết thịt, chủ yếu vào các mùa có thời tiết xấu. Các đàn có số lượng lớn, trộn đàn nhiều thường có nguy cơ mắc bệnh cao hơn các đàn nhỏ, nuôi riêng rẽ. 1.2.2.2. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng có nhiều mức phụ thuộc vào tuổi của gia súc, tình trạng miễn dịch, điều kiện môi trường và mức độ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh. Biểu hiện lâm sàng của bệnh có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính. - Thể quá cấp tính: Một hoặc nhiều lợn cai sữa cùng một chuồng hoặc khác chuồng trở nên ốm nặng, sốt tới 41,50C, đờ đẫn và không muốn ăn, nôn mửa và ỉa chảy, con vật bị bệnh nằm trên nền chuồng, không có dấu hiệu thở rõ ràng, mạch đập tăng lên rất sớm và trụy tim mạch. Da trên mũi, tai, chân và sau cùng là toàn bộ cơ thể trở nên tím tái ở giai đoạn cuối và chết. Thời gian ngắn trước khi chết thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, gia súc ở tư thế ngồi để thở, nhiệt độ ở hậu môn giảm nhanh. Ngay trước khi chết thường có chảy nhiều dịch bọt nhuốm máu ở mồm và lỗ mũi. Tử vong xảy ra 24 - 36 giờ sau khi xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng. Một số trường hợp con vật chết đột ngột không có biểu hiện lâm sàng. Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian diễn biến của bệnh ít nhất là 3 giờ từ khi bị nhiễm trùng cho đến chết. ở lợn sơ sinh bệnh xảy ra như nhiễm trùng huyết dẫn tới hậu quả tử vong. - Thể cấp tính: Nhiều lợn ở 1 chuồng hoặc ở những chuồng khác nhau cùng mắc. Lợn sốt cao từ 40,50C - 410C, da đỏ, con vật mệt mỏi, không muốn dậy, không ăn uống. Các dấu hiệu hô hấp nặng với khó thở, ho, và đôi khi thở bằng mồm trở nên rõ. Thường xuất hiện trụy tim mạch, với xung huyết ở các đầu tứ chi. Toàn thân suy sụp trong vòng 24 giờ đầu. Bệnh diễn biến khác nhau ở từng con vật, phụ thuộc mức độ tổn thương phổi và thời điểm bắt đầu điều trị. - Thể mãn tính: Xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính mất đi. Không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự phát hoặc thỉnh thoảng, với các cường độ khác nhau. Có thể con vật kém ăn, giảm tăng trọng, có thể xác định các lợn bị ốm qua dấu hiệu các con vật này không gắng sức được. Khi di chuyển, chúng thường đi lùi lại phía sau và khi bị chặn lại chúng thường ít chống cự. ở các đàn gia súc bị nhiễm mãn tính thường có nhiều súc vật bị nhiễm không biểu hiện rõ trên lâm sàng. Các dấu hiệu lâm sàng có thể trở nên rõ hơn bởi sự kết hợp với các yếu tố gây nhiễm trùng đường hô hấp khác (Mycoplasma, vi khuẩn, virus). Các biến chứng như viêm khớp, viêm nội tâm mạc và áp xe ở các vị trí khác nhau có thể xảy ra cùng với nhiễm trùng A. pleuropneumoniae. 1.2.2.3. Bệnh tích Tổn thương bệnh lý đại thể chủ yếu ở đường hô hấp. Đa số các trường hợp bị viêm phổi với tổn thương ở các thùy đỉnh và thùy tim, cũng như một phần các mỏm trên của thuỳ hoành. ở các trường hợp lợn chết nhanh, khí quản và các phế quản chứa đầy các chất tiết nhầy bọt có lẫn máu. Có thể thấy một số tổn thương đại thể ở các trường hợp quá cấp tính, các vùng viêm phổi trở nên sẫm màu và chắc kèm theo viêm màng phổi có ít hoặc không có tơ huyết. Viêm màng phổi tơ huyết thường rất rõ ở các gia súc chết trong giai đoạn cấp tính của bệnh ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm trùng và khoang màng phổi chứa dịch lẫn máu. Khi tổn thương tiến triển nặng hơn, viêm màng phổi tơ huyết trên vùng phổi tổn thương trở nên xơ và có thể dính rất chặt màng phổi vào thành ngực. ở thể mãn tính, bệnh tích quan sát thấy là các ổ áp xe có kích thước khác nhau nằm chủ yếu ở trên thùy hoành và giới hạn với tổ chức xung quanh bởi một vỏ mô liên kết mỏng, một số vùng của màng phổi có thể bị viêm dính vào thành ngực. 1.2.2.4. Bệnh lý học Bệnh lý học của bệnh viêm phổi - màng phổi đã được nghiên cứu một cách kỹ lưỡng về cả vấn đề phát triển của các tổn thương lẫn mối liên quan giữa vi khuẩn và tổn thương tổ chức ở mức độ phân tử. Sự nhiễm trùng thường xảy ra do mầm bệnh trong không khí hoặc do tiếp xúc. Những nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng vi khuẩn thường tồn tại ở các amidan và dính bám vào biểu mô phế nang. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae ở phổi nhanh chóng bị thực bào hoặc dính lên đại thực bào phế nang và sản sinh ra độc tố Apx I, Apx II và Apx III. Hầu hết các độc tố có khả năng gây độc cho đại thực bào phế nang, các tế bào nội mô, tế bào biểu mô phế nang, tế bào nội mô của mao mạch thành phế nang, nhất là Apx III rất có hoạt tính chống lại đại thực bào phế nang. Các vi khuẩn có vỏ có khả năng chống lại được sự thực bào và dường như cũng kháng lại sự hoạt động của bổ thể. Sự hư hại do các độc tố và cytokine đi kèm với hiện tượng nhiễm trùng là nguyên nhân chủ yếu làm xuất hiện và tăng tổn thương (Inzana, 1991[32]). Thể quá cấp tính và cấp tính của bệnh gây nên hiệu ứng toàn thân tương tự như nhiễm khuẩn máu ở người. Có sự khác nhau về độc lực giữa các serotype và thậm chí ở cùng một serotype. Sự khác nhau đó là do sự khác nhau ở cấu trúc vỏ, khác nhau về thành phần LPS hoặc chủng loại dung huyết. Trên thực tế những serotype 1, 5, 9, 10 và 11 có độc lực mạnh hơn các serotype khác. Những tổn thương ở phổi là hậu quả của những sự thay đổi độc tố có thể được nhìn thấy sau 3 giờ nhiễm trùng thử nghiệm và trở nên dần dần rõ ràng hơn. Vách phế nang trở nên phù thũng và sự xung huyết các mao quản tăng lên. Mạch bạch huyết dãn ra cùng với dịch phù, fibrin và các tế bào viêm. Sự tập trung tiểu cầu và các tế bào bạch cầu trung tính cũng có thể được thấy ở vách phế nang bị tổn thương và cả huyết khối động mạch cùng sự hoại tử thành mạch có thể phát triển gây nhồi huyết. Những khuẩn lạc nhỏ của vi khuẩn có thể thấy ở các vách phế nang bị nhiễm trùng và cũng có thể xuất hiện nhiễm vi khuẩn huyết. Bờ của tổn thương trở nên bị lấp đầy bởi xác chết hoặc đại thực bào bị tổn thương hoặc những mảnh vụn của tế bào và nhanh chóng phân ranh giới rõ với vùng phổi xung quanh sau 4 ngày nhiễm bệnh. Có dịch mủ kèm theo vi khuẩn ở các phế quản. Theo thời gian, những tổn thương ở vùng trung tâm trở nên hoại tử và sự lành bệnh xảy đến với sự xơ hóa. 1.2.2.5. Chẩn đoán Để chẩn đoán đúng bệnh viêm phổi – màng phổi do A. pleuropneumoniae gây ra cần căn cứ vào đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng kết hợp với các bệnh tích ở phổi và màng phổi. - Đặc điểm dịch tễ: Lịch sử bệnh của đàn, thường xảy ra ở lợn 2 – 6 tháng tuổi. Mật độ đông đúc, điều kiện thông gió, thông hơi không đủ. Có sự tiếp xúc giữa lợn mới và lợn cũ, giữa các nhóm tuổi, nhiệt độ môi trường thay đổi tạo điều kiện cho bệnh phát ra. - Triệu chứng lâm sàng: Trên lâm sàng có thể nghi viêm phổi - màng phổi ở các đợt cấp bùng phát. Con vật chết đột ngột, thể quá cấp tính thường tiến triển trong vài giờ - 2 ngày. Con vật sốt cao (410C), ho ướt, khó thở thường có máu lẫn bọt chảy từ mũi và miệng. - Bệnh tích: Kiểm tra các bệnh tích trên phổi, màng phổi và sự nghiên cứu các tổn thương và dựa trên các bệnh tích điển hình trên phổi như: Sự xuất hiện của dịch rỉ viêm, cùng các vùng hoại tử được bao quanh bởi hàng rào các mảnh tế bào bạch cầu trung tính là bằng chứng rõ ràng nhất cho viêm phổi – màng phổi. ở thể nhiễm trùng mãn tính, mổ khám thấy ổ áp xe cứng, ranh giới rõ ràng kết hợp với viêm màng phổi cùng viêm màng ngoài bao tim cũng là một bệnh tích có giá trị chẩn đoán. Bên cạnh đó cần phải tiến hành chẩn đoán vi khuẩn học để khẳng định chẩn đoán. ở các động vật mới chết dễ dàng tìm thấy căn nguyên bệnh tại phế quản hoặc dịch tiết ở mũi và vùng phổi tổn thương. Lấy tổ chức phổi bị tổn thương nhuộm gram thấy nhiều cầu trực khuẩn gram âm. Phân lập lần đầu A. pleuropneumoniae từ các tổ chức và chất tiết có thể được tiến hành trên thạch máu cừu 5% cùng với đường cấy ngang của Staphylococcus aureus. Sau khi nuôi cấy hiếu khí qua đêm, khuẩn lạc nhỏ xuất hiện ở xung quanh đường cấy thẳng (đòi hỏi NAD) được bao bọc xung quanh bởi vùng sáng dung huyết hoàn toàn. Điều này cho chẩn đoán vi khuẩn học nhanh. Chúng có thể mọc trên thạch chocolate nhưng không rõ rệt trên môi trường này. Trong trường hợp nhiễm trùng ghép mà thường là với P. multocida hoặc cùng với các vi khuẩn khác thì ta cần sử dụng môi trường chọn lọc. Jacobsen và Nielsen (1995) [34] đã đưa ra một môi trường chọn lọc có thể phân lập vi khuẩn từ amidan. Tuy nhiên việc phân lập có thể bị thất bại trong trường hợp tổn thương mãn tính hoặc đã được chữa trị. Trong trường hợp tiền cấp tính, vi khuẩn có thể được phân lập từ cả ở các cơ quan khác (nhiễm trùng huyết). Có thể dùng kỹ thuật PCR hoặc test huyết thanh với kháng thể hấp thụ hoặc kháng thể đơn dòng để xác định vi khuẩn phân lập được có phải là A. pleuropneumoniae không. Có thể xác định tới các serotype bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR cho các gen hoạt hoá cấu trúc của độc tố hoặc có thể sử dụng kháng thể đơn dòng với từng serotype. Bệnh dịch tả lợn, đóng dấu lợn và các bệnh nhiễm trùng do liên cầu phải được xem xét đến trong việc chẩn đoán phân biệt ở các trường hợp quá cấp và cấp tính. Trong những trường hợp nhiễm trùng cấp tính và mãn tính, các bệnh tích của phổi phải được phân biệt với các bệnh tích gây ra bởi các tác nhân vi khuẩn sinh mủ như A.pyogenes, Staphylococcus aureus, trực khuẩn dạng bạch cầu và Fusobacterium necrophorum. Đồng thời, khi chẩn đoán bệnh viêm phổi – màng phổi do A. pleuropneumoniae gây nên cần phải phân biệt với các bệnh khác như viêm phổi địa phương do Mycoplasma, hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS), bệnh cúm và viêm phổi do Salmonella choleraesuis,… và chẩn đoán phân biệt với một số vi khuẩn khác trong họ Pasteurellae như P. multocida, P. haemolytica, H. parasuis, A. minor,.. Ngoài ra, có thể tiến hành chẩn đoán bằng các phản ứng huyết thanh học như: + Phản ứng Complement Fixation test (CFT): Là một trong những phương pháp kiểm tra sớm nhất để chẩn đoán A. pleuropneumoniae, sử dụng có thể phát hiện phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Kỹ thuật này được Mittal và cs mô tả (1983)[40]. + Phản ứng Indirect hemaglutination test (IHA): Phát hiện kháng thể trong huyết thanh. + ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): Phát hiện kháng thể đặc hiệu cho từng thành phần như vỏ, Lipopolysaccarit độc tố. 1.2.2.6. Phòng bệnh Có thể tiến hành phòng bệnh viêm phổi - màng phổi theo một số cách. Các trại không bị mắc bệnh và nhiễm khuẩn phải duy trì chính sách cách ly. Khi đưa lợn mới vào đàn thì con đó phải xuất phát từ đàn không bị bệnh và nên cách ly chúng trong một thời gian trước khi cho chúng vào đàn. Một khi đã xuất hiện bệnh ở một trại thì việc loại trừ tác nhân gây bệnh có thể gặp khó khăn, mặc dù về lâm sàng đàn gia súc có thể bình thường. Do vậy, các chương trình kiểm soát phải tính đến các đặc điểm dịch tễ học của bệnh viêm phổi - màng phổi. Ưu tiên hàng đầu là phải hạn chế thiệt hại kinh tế bằng cách sử dụng các phương pháp phòng bệnh và điều trị bằng kháng sinh. Có thể điều trị bệnh ở giai đoạn sớm bằng cách điều trị các nhóm gia súc nghi bệnh và chuyển đến nơi sạch, cách ly cho tới khi giết thịt. Có thể dùng thuốc liên tục hoặc ngắt quãng, nhưng không bao giờ được dùng kéo dài và cần thường xuyên theo dõi sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Các biện pháp chăn nuôi thông thường cũng được sử dụng để kiểm soát bệnh hô hấp như: áp dụng hình thức chăn nuôi “cùng vào - cùng ra” (all in – all out) ở các trại chuyên vỗ béo, cai sữa sớm,… sẽ làm giảm đáng kể nguy cơ nhiễm khuẩn. ở các đàn bị nhiễm khuẩn mãn tính, cần tiêm chủng vacxin. Đã có nhiều loại vacxin được sản xuất cho bệnh này gồm 2 nhóm chính: Các vi khuẩn đã chết (vacxin vô hoạt) và các vacxin với một số thành phần cấu tạo của vi khuẩn. Vacxin vô hoạt toàn khuẩn đặc hiệu theo serotype có thể có miễn dịch với các serotype khác có phản ứng chéo. Hiện nay vacxin đang được dùng phổ biến là vacxin chết (vô hoạt). Vacxin vô hoạt đặc hiệu theo serotype có thể miễn dịch chéo. Mở rộng phổ bảo vệ bằng cách kết hợp tất cả các serotype có ở trong vùng để chế tạo vacxin thì hiệu quả bảo hộ cao hơn (Straw và cs, 1999 [57]). Hiện nay các vacxin thử nghiệm là các vacxin nhược độc được dùng theo đường khí dung hoặc đường uống đã có một số tác dụng bảo vệ nhất định. Thường dùng vacxin khi kháng thể của mẹ giảm đi và đem lại sự bảo vệ cao trong phòng thí nghiệm, làm giảm tỷ lệ tử vong, giảm số điều trị cần dùng, tăng trọng lượng hàng ngày và cải thiện hiệu quả chuyển hóa thức ăn, chất lượng thịt cũng được nâng cao, ít bị viêm phổi và chi phí thấp. Các thế hệ vacxin cũ thường không phải luôn luôn có hiệu quả. Trên thực tế vacxin không ngăn cản hoàn toàn được tình trạng mang vi khuẩn nhưng đã được sử dụng như một biện pháp trợ giúp trong các chương trình tiêu diệt bệnh này. Vấn đề khử trùng cũng phải luôn được quan tâm đến trong quá trình phòng bệnh. Vi khuẩn nhạy cảm với nhiều chất tiệt trùng thông thường. Với những đàn đã nhiễm A. pleuropneumoniae thì giết thịt toàn bộ và xây dựng lại với các con lợn xuất phát từ các đàn đã biết chắc chắn là không nhiễm vi khuẩn gây viêm phổi – màng phổi là biện pháp được lựa chọn. Tuy nhiên luôn cần đánh giá kỹ lưỡng hiệu quả kinh tế. Dựa trên xét nghiệm huyết thanh học đối với lợn ngay sau khi mới đẻ và tách các lợn con ở 2 tuần tuổi riêng biệt hẳn với các đàn có khả năng bị nhiễm bệnh, những con lợn này nếu chúng có huyết thanh chẩn đoán âm tính tới tuần tuổi 12 sẽ dược dùng để tái tạo lại đàn. Các lợn sữa có huyết thanh chẩn đoán dương tính được nhất loạt loại trừ cho tới khi toàn bộ đàn lợn giống có kết quả huyết thanh chẩn đoán âm tính. Chương trình này có thể cần 6 - 12 tháng. Trong quá trình loại trừ, toàn bộ đàn được bảo vệ phòng tái nhiễm bằng cách cho ăn thức ăn có bổ sung kháng sinh ví dụ như: Cotrimoxazole (Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1:20; 250 mg/kg/thức ăn). Tuy nhiên theo một số kết quả nghiên cứu thì chương trình này chỉ thành công một phần (Lariviere và cs, 1988 [38]) hoặc thậm chí thất bại, đồng thời các yêu cầu hiện nay về tránh dư cặn kháng sinh trong sản phẩm thịt lợn làm cho các chương trình này không thực tế. Vì vậy, để tăng hiệu quả trong ngành chăn nuôi lợn, việc kết hợp dùng vacxin phòng bệnh viêm phổi - màng phổi và các biện pháp chăn nuôi khác là hết sức cần thiết để xây dựng lại đàn lợn khỏe mạnh, không bị bệnh. 1.2.2.7. Điều trị Theo những thông báo trước đây, ở điều kiện phòng thí nghiệm vi khuẩn A. pleuropneumoniae rất nhạy cảm với Penicillin, Ampicilin, Cephalosporin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Colistin, Sulfonamide, Cotrimoxazole (Trimethoprim + Sulfamethoxazole) và Gentamycin với nồng độ ức chế tối thiểu thấp. Vi khuẩn này có nồng độ ức chế tối thiểu cao với Streptomycin, Kanamycin, Spectinomycin, Spiramycin và Lincomycin (Nicolet và Schifferli, 1982 ; Inoue và cs, 1984) [43], [30]. Prescott và Baggot (1993) [52] đã thông báo về tính mẫn cảm của vi khuẩn này với các thuốc kháng sinh. Sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc với Ampicillin, Streptromycin, Sulfonamide, Tetracyclin và Chloramphenicol là vấn đề đáng lo ngại, thường gặp ở các serotype 1, 3, 5 và 7 (Gil Bride và Rosendal, 1984) [28], nhưng hiếm gặp ở các serotype khác, nhất là serotype 2 (Nicolet và Schifferli, 1982 ; Inoue và cs, 1984) [43], [30]. Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae truyền theo Plasmid. Kháng sinh được lựa chọn phải là kháng sinh có nồng độ ức chế tối thiểu thấp nhất và có đặc tính dược động học tốt nhất. Do vậy, các kháng sinh nhóm Betalactamin A (chủ yếu Penicillin và Cephalosporin), Chloramphenicol, Cotrimoxazole và với một mức độ nhất định nào đó, Tetracyclin được coi là có tác dụng nhất. Một số mới có gần đây như các dẫn suất Quinolon (Enrofloxacin) hoặc Cephalosporin bán tổng hợp – Ceftiofur sodium đã được chứng minh trên thực nghiệm rất có hiệu quả. Người ta đã thu được những kết quả tốt trên thực nghiệm khi dùng Tiamulin và hỗn hợp Lincomycin và Spectinomycin. Moore và cs (1996) [42] đã dùng Tilmicosin cho vào thức ăn. Cần làm kháng sinh đồ khi lựa chọn kháng sinh thích hợp để điều trị. Điều trị kháng sinh chỉ có hiệu quả ở giai đoạn mới phát triển của bệnh, khi đó nó có thể làm giảm tỷ lệ tử vong, nếu điều trị muộn thì có thể có nhồi máu hoặc tổn thương mãn tính làm cho gia súc bị rối loạn hô hấp ngay cả khi chúng qua khỏi được. Phải dùng kháng sinh liều cao (tiêm bắp thịt hoặc dưới da vì gia súc ốm thường không ăn uống được). Để đảm bảo nồng độ thuốc có hiệu quả ổn định trong máu có thể cần tiêm nhiều lần, tùy theo đặc tính mẫn cảm của thuốc sử dụng. Sự điều trị thành công phụ thuộc chủ yếu vào việc phát hiện sớm dấu hiệu lâm sàng và điều trị sớm. Nếu các con lợn ăn uống bình thường có thể cho thuốc kháng sinh vào thức ăn hay nước uống cũng cho kết quả tốt. Có thể sử dụng thuốc uống và qua thức ăn trong việc điều trị dự phòng cho lợn dễ bị nhiễm bệnh khi di chuyển tới một vùng nào đó. ở một số đợt dịch gần đây việc kết hợp thuốc tiêm với thuốc uống thường cho kết quả tốt. Mặc dù có vẻ thành công trên lâm sàng nhưng cần nhớ rằng điều trị bằng kháng sinh không loại trừ hoàn toàn nhiễm trùng ở một đàn gia súc. Nhiễm trùng mãn tính ở các ổ áp xe phổi hoặc ở amidan của các con vật lành mang mầm bệnh tồn tại tạo thành một nguồn nhiễm trùng lớn cho các súc vật khác. Những con vật bị bệnh nặng có thể không hồi phục được ngay cả khi được điều trị chăm sóc và tốt nhất là giết thịt để tránh lây nhiễm. 2. Nội dung - nguyên liệu vàphương pháp nghiên cứu 2.1. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida cư trú tại đường hô hấp trên của lợn các lứa tuổi khỏe mạnh và lợn nghi mắc bệnh đường hô hấp. - Xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được. - Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được. - Xác định serotype của các chủng vi khuẩn phân lập được. - Chọn chủng vi khuẩn, chế tạo autovacxin phòng bệnh viêm phổi - màng phổi của lợn. - Chế tạo thử nghiệm autovacxin phòng bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn. 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành tại: - Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y - Các trại lợn thuộc Công ty giống lợn Thái Bình, Hải Phòng và Hà Tây 2.2.2. Đối tượng nghiên cứu Lợn ở các lứa tuổi khỏe mạnh và lợn nghi mắc bệnh đường hô hấp nuôi tại Thái Bình, Hải Phòng và Hà Tây. 2.2.3. Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Môi trường dùng là môi trường do hãng Oxoid (Anh), Merck (Pháp) sản xuất gồm: - Môi trường nước thịt - Môi trường thạch trường - Môi trường thạch máu - Môi trường thạch TSA (Tryptic Soy Agar) - Môi trường thạch Chocolate - Môi trường MacConkey - Môi trường Gelatin - Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) - Môi trường các loại đường: Pha các dung dịch đường: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Dulcitol, Galactose, Fructose... thành dung dịch 10% hoặc 20%, pha xong đem lọc và hấp ướt ở 1100C trong vòng 20 - 30 phút hay hấp cách quãng 1000C trong 30 phút, hấp 3 ngày liền. Mỗi ống nước peptone cho vào một loại đường theo tỷ lệ 0,5% Pha chỉ thị Andrade Fucxin axit : 0,5 g Nước cất : 100 ml Dung dịch NaOH 1N : 16 ml Nghiền fucxin trong cối sứ cho nhỏ mịn rồi hoà với nước cất cho tan hết. Cho từ từ dung dịch NaOH 1N vào, vừa cho vừa lắc cho đều khi màu dung dịch chuyển từ đỏ tươi sang đỏ nâu, thành vàng úa, vàng thẫm thì thôi (lượng NaOH nhỏ vào thường 12 - 17 ml, trung bình 16 ml). Để lắng 1 - 2 giờ rồi lọc qua giấy lọc. Hấp ướt 1200C trong 30 phút. 2.2.4. Hoá chất - Dung dịch PBS (Phosphat Buffer Solution): KH4PO4 : 0,389 g NaH2PO4 : 4,53 g NaCl : 8,5 g KCl : 0,2 g Nước cất vừa đủ : 1000 ml pH 7,2 - 7,4 Pha xong hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. - Giấy thử Oxidase: 1% dung dịch Tetramethy-p-Phenylendiamine dihydrochloride để ở nhiệt độ phòng. Giấy lọc được cắt thành dải nhúng vào dung dịch để khô và giữ ở nhiệt độ 40C. - Thuốc thử phản ứng Catalase: Dung dịch H2O2 3% - Dung dịch Kovac’s: Paradimetyl amino benzaldehyt : 5 g Cồn Butylic hoặc Izoamylic : 75 ml HCl đặc : 25 ml Hoà tan 5g Paradimetyl Amino Benzaldehyt vào 75 ml cồn Butylic hoặc Izoamylic đặt vào nồi đun cách thuỷ 50 - 600C. Sau đó cho từ từ từng giọt một 25 ml HCl đặc, để qua đêm đến khi xuất hiện màu vàng. - Dung dịch thuốc nhuộm gram: Dung dịch tím Genxian Dung dịch đỏ Fucxin Dung dịch cồn Acetol Dung dịch Lugol 2.2.5. Giống vi khuẩn - dụng cụ - máy móc - Giống vi khuẩn P. multocida, A. pleuropneumoniae chuẩn do úc và Nhật Bản cung cấp. - Giống vi khuẩn Staphylococcus aureus dùng cấy kèm khi phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae. - Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn A. pleuropneumoniae của úc và Nhật Bản. - Primer và hóa chất dùng trong phương pháp PCR để định type vi khuẩn P. multocida. - Dụng cụ máy móc trong phòng thí nghiệm. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu - Lấy dịch họng: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào họng của lợn. Tăm bông được để vào môi trường vận chuyển (Stuart Transport Medium) hoặc dung dịch PBS rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2 - 8 giờ, nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh dương. - Lấy bệnh phẩm là phổi có dấu hiệu bệnh tích viêm phổi của những lợn nghi bệnh ốm hoặc chết được mổ khám. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn - Đối với bệnh phẩm là dịch ngoáy họng, sau khi đưa về phòng thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy ngay trên các môi trường như: thạch máu, thạch TSA, thạch Chocolate, thạch MacConkey, nước thịt thường, sau đó bồi dưỡng ở tủ ấm thường 370C và tủ ấm 370C có bổ sung 5% CO2 trong 24 giờ. - Đối với bệnh phẩm là phổi, trước khi nuôi cấy lên các loại môi trường nêu ở trên thì vị trí phổi lẫy mẫu được đốt cháy bề mặt, dùng mũi kéo cắt vào phần phổi đã bị đốt cháy và lấy phần bệnh phẩm ở phía sâu bên trong dùng nuôi cấy để tránh tạp khuẩn. Sau khi nuôi cấy 24 giờ, căn cứ vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Actinobacillus, Pasteurella và tính chất mọc trên các môi trường sẽ tiến hành chọn khuẩn lạc điển hình, phết kính nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1500 lần, đồng thời làm các phản ứng sinh hóa và cấy giữ giống để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. - Khuẩn lạc Pasteurella multocida được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 370C trong 24 giờ có dạng tròn trơn, màu trắng đục, có mùi tanh của nước dãi khô. Không dung huyết trên thạch máu, không mọc trên môi trường MacConkey, phản ứng Indol dương tính, phản ứng Oxydase, Catalase dương tính, không di động. - Khuẩn lạc Actinobacillus pleuropneumoniae sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu và thạch Chocolate ở 370C trong 24 giờ trong điều kiện có 5% CO2 thấy khuẩn lạc nhỏ như giọt sương, hầu hết các chủng đều gây dung huyết. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Dịch ngoáy họng hoặc mẫu phổi Nuôi cấy trên các môi trường: Nước thịt, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate Phân lập, thuần khiết từng loại khuẩn lạc Nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn Giám định vi khuẩn qua các đặc tính sinh hoá và lên men đường Thử độc lực Định type Giữ giống 2.3.3. Phương pháp thử các đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được - Thử phản ứng Oxydase: Tiến hành trên giấy được thấm 1% dung dịch Tetrametyl-p-Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen sau 30 giây là phản ứng dương tính. Nếu không thấy xuất hiện màu tím đen hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính. - Thử phản ứng Catalase: Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên trên, trộn đều, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính. - Thử phản ứng Urease: Cấy giống vi khuẩn cần thử vào ống môi trường ure và bồi dưỡng trong tủ ấm 370C, sau 4 – 24h thì đọc kết quả. Nếu dung dịch có màu hồng thì phản ứng dương tính Dung dịch không chuyển màu thì phản ứng âm tính. - Thử phản ứng sinh Indol: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt. Để tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 0,5 ml dung dịch Kovac’s vào, phản ứng dương tính khi quan sát thấy một vòng màu đỏ trên mặt môi trường. - Các phản ứng lên men đường: Chủng vi khuẩn được thử cấy vào môi trường nước thịt để vào tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau đó nhỏ 0,2 ml canh khuẩn vào dung dịch đư._.