Xác định hàm lượng Cholesteron trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-Loop DNA TY ty thể Gà ri, Gà ác, Gà tre

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ................ ................... VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TƢ̣ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ................ ................... VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE Chuyên ngành : SINH HỌC THƢ̣C NGHIỆM Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS. TS Nguyễn Trọng lạng THÁI NGUYÊN, 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi . Các kết quả , số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác . Tác giả luận văn Vũ Thị Nhƣ Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS .TS Nguyễn Trọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này . Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và một số gia đình ở Cao Thượng - Tân Yên - Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tình trong việc nghiên cứu t hực nghiệm của đề tài. Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban giám hiệu, Khoa Sau đại học , Ban chủ nhiệm Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản luận văn này . Tác giả Vũ Thị Nhƣ Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nhƣ̃ng tƣ̀ viết tắt DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra – acetic acid EtBr Ethidium bromide Kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris- acetate-EDTA COI Cytochrome oxidase I PBS Phosphate Buffer Saline epp eppendorf Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Danh mục các bảng Bảng Tên bảng Trang 2.1 Kết quả c hiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau 20 3.1 Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 32 3.2 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33 3.3 Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so với gà Ri 43 3.4 Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 43 3.5 Hệ số tương đồng về tr ình tự nucleotide vùng D -loop ở mẫu nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Danh mục các hình Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol 6 1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus 12 2.1 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn cholesterol 20 2.2 Đường chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn cholesterol 21 3.1 Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33 3.2 Kết quả điện di DNA tổng số 35 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 3.4 So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 41 3.5 Quan hệ di truyền của một số giống gà 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục các bảng Danh mục các hình Mở đầu .......................................................................................................... 1 1.Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm ................................................................................. 3 1.1.1 Gà Á ............................................................................................. 4 1.1.2 Gà Ri............................................................................................. 5 1.1.3 Gà Tre. .......................................................................................... 6 1.2 Cholesterol .............................................................................................. 6 1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà ............................. 6 1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người ......................................................... 7 1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể ..................................................... 7 1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường. .......................................................................................................... 8 1.3 Đặc điểm DNA ty thể .............................................................................. 10 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể ............................... 10 1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể ...................................... 11 1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà....................................... 12 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ........................ 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu .................................................................................................. 18 2.1.1 Nguồn gốc mẫu ........................................................................... 18 2.1.2 Địa điểm thí nghiệm .................................................................... 18 2.2 Hoá chất và thiết bị ................................................................................. 18 2.2.1 Hóa chất ....................................................................................... 18 2.2.2 Thiết bị sử dụng .................................................................... 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 19 2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol ................ 19 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử ..................................................... 22 2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ......... 22 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................. 25 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR ............... 26 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................... 29 2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. ................................... 31 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu .................. 33 3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu ............................................................... 35 3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ........................... 35 3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ............................. 36 3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ........... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận .................................................................................................... 48 2. Đề nghị ..................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................. 50 PHỤ LỤC .............................................. 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 Mở đầu 1. Đặt vấn đề Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá. Đặc biệt, ngành chăn nuôi gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân. Sự phát triển nhanh chóng của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại hình...chăn nuôi. Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung với quy mô lớn tăng lên. Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu khắc nghiệt. Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất và tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn trong gia đình đã được cải thiện rất nhiều. Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã mắc rất nhiều bệnh khác nhau. Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não... Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước phát triển thuộc thế giới tây phương. Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới nhưng căn bệnh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao. Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm lượng cholesterol cũng thay đổi theo. Những nguồn thực phẩm giàu cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục, não, tim, lòng đỏ trứng... Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình. Trong trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao. Có nhiều loại trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt... Mỗi giống gà khác nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau. Như vậy việc lựa chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng. Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D- loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà. - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của 3 giống gà. - Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre. - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác, gà Tre. + Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên. + Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR. + Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà trên. - Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểm hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động. Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu: Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn. Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ. Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn. Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay. Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí của gà nhà được sắp xếp trong hệ thống giới động vật như sau: Giới động vật (Animal) Ngành động vật có xương sống (Chordata) Lớp chim (Aves) Bộ gà (Galliformes) Họ Trĩ (Fasianidea) Chủng Gallus (giống gà Bankip ) Loài Gallus gallus. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước Anh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà có năng suất cao hơn. Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng … 1.1.1 Gà Ác Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson. Đây là loại gà cỡ nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắng mượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón. Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa nhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp mà giá thành lại cao. Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mới được biết hết giá trị của nó. Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miền Bắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng Yên...Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn, chăm chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao. Như thế có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi chuồng) đều được cả. Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rất giàu axit amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit. Trứng của chúng tuy nhỏ (chỉ khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12]. Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không độc, có tác dụng bổ dưỡng cao. Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy và sau khi sinh. Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gà cho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất. Theo PGS.TS Trịnh Công Thành, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta áp dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lông chân và dòng gà Ác không có lông chân. Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạo dòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân và gà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) mà trước kia là 29/100 con cho trứng). 1.1.2 Gà Ri Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus gallus. Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng. Cổ thanh dài vừa phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xen lẫn màu đỏ tươi. Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu lông khác nhau ở con mái và con trống. Con mái có màu lông màu vàng rơm, vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh và lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn có màu lông khác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng... Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh. Gà Ri đẻ trứng sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi. Sản lượng trứng của gà mái trong một năm từ 80-120 quả. Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g. Gà Ri có khối lượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g, con mái từ 1,300 g đến 1,800 g. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảng canh ở nước ta. Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trong vườn hay ngoài đồng. Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vài nắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủ khi được thả ngoài vườn [4], [7], [8]. 1.1.3 Gà Tre Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam. Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen. Gà mái màu vàng, thấp chân. Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri. Gà Tre có tập tính là hay bay và đậu trên hàng rào. Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh. Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn quỹ gen của các loại gia cầm của nước ta. 1.2 Cholesterol 1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiều trong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển ở dạng tự do ở trong máu. Cholesterol có công thức cấu tạo như sau: Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol là nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tử của cholesterol là rượi cồn (alcohol). Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan... và đặc biệt trứng gà là loại thực phẩm có chứa nhiều cholesterol, trong đó chủ yếu là lòng đỏ trứng gà còn lòng trắng thì tuyệt nhiên không có hoặc rất ít [15], [18], [28]. 1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở ngƣời Cholesterol là chất béo steroid rất cần thiết cho cơ thể, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật cũng như cơ thể người. Cholesterol trong cơ thể người có 2 nguồn gốc: - Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay còn gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol). - Cholesterol hình thành trong tế bào hay cholesterol nội sinh (endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28]. Tuy vậy, tất cả các tế bào trong cơ thể có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ cholesterol. Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào. Khi lượng cholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng sẽ dẫn đến tăng nhẹ nồng độ cholesterol huyết tương. Tuy nhiên, khi lượng cholesterol hấp thụ tăng sẽ ức chế một trong những enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nội sinh. Đây là một yếu tố trong cơ chế điều hoà ngược để điều chỉnh nồng độ cholesterol trong máu. Chính vì vậy nồng độ cholesterol trong máu dao động khoảng 15% do ảnh hưởng của cholesterol trong thức ăn. Sự thay đổi lớn của hàm lượng cholesterol trong khẩu phần có thể dẫn đến làm thay đổi nồng độ cholesterol trong máu tới 30%. Đồng thời các chất béo bão hoà trong khẩu phần ăn cũng làm tăng cholesterol từ 15 - 25%. 1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic axit tại gan. Cholic axit sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối mật có tác dụng xúc tác trong quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 - Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường: + Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến thượng thận. + Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng. + Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone. + Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào. + Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì của da. Cùng với các chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng: +) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan trong nước +) Kháng tác động của nhiều hoá chất. +) Ngăn cản quá trình bốc hơi nước của da [15],[19], [28]. Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể khi hàm lượng của nó trong cơ thể ở mức phù hợp. Ở người trưởng thành, cholesterol toàn phần ở mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít. Những người có mức cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau. 1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vƣợt quá mức bình thƣờng Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh tim mạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não... Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim mạch ngày càng tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước. Đàn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đàn bà. Ở Mỹ, hàng năm có khoảng 6 triệu người bị bệnh tim và trong số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim và trong số này có khoảng 1/3 bị chết. Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau tim không hề có triệu trứng hay cảnh báo trước. Tần suất đàn ông Mỹ bị chết vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số. Ở Anh, tỉ suất này là khoảng 250/100.000 dân số [16], [21]. *Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là hiện tượng bệnh lý của lớp nội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành các mảnh có nguồn gốc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máu và ngăn cản sự lưu thông của dòng máu . Các biểu hiện bệnh lý trong giai đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc. Sự tổn thương thành mạch còn có thể do tác động cơ học của dòng máu và áp lực của động mạch nên vùng tổn thương. Khi có hiện tượng tổn thương, các tế bào nội mạc sẽ giãn, sưng, phân chia. Các tế bào cơ trơn thành mạch cũng có thể có phản ứng tương tự. Tại thành mạch máu có hiện tượng tập trung nhiều tế bào do sự di chuyển của các tế bào bình thường đến vùng tổn thương. Ngay sau đó, các thành phần lipit trong máu, đặc biệt là cholesterol sẽ tích tụ lại trong các tế bào đang phân chia, hình thành các mảnh xơ. Vì các mảnh này chứa một lượng lớn cholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng. Tiếp theo sau của quá trình bệnh lý , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổn thương và hình thành các mảnh xơ trong mạch máu. Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ. Đến giai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được mô tả bởi từ “xơ cứng động mạch” hoặc gọi đơn giản hơn là “hiện tượng cứng mạch máu” Các động mạch bị xơ cứng gần như mất hoàn toàn khả năng tăng kích thước (mất khả năng căng phồng) và dễ bị làm rách , làm thủng . Các phần tử mảnh xơ (có bề mặt thô nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy cơ hình thành các cục máu và huyết khối. Khi các huyết khối có mặt trong động mạch vành của tim hay các động mạch của não sẽ dẫn đến tắc động mạch, rối loạn hoạt động của tim, não và gây tổn thương nặng nề cho cơ thể thậm chí gây tử vong. Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra khi huyết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 khối hình thành trong động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi, động mạch dạ dày, ruột... [16], [21]. *Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu Để giảm hàm lượng cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau như sử dụng các loại thuốc có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe hay các loại thuốc có chứa Statin. Nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý. Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực phẩm có chứa nhiều cholesterol như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất béo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng. Có những người ăn thường xuyên một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả mà nó sẽ gây ra. Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể. Tuy nhiên, chúng ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý để góp phần đề phòng và giảm lượng cholesterol trong máu để tránh các bệnh về tim mạch. 1.3 Đặc điểm DNA ty thể 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể DNA ty thể (mtDNA) ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng. Kích thước của bộ gen ty thể thay đổi khác nhau ở mức phân loại Bộ trở lên. Ở tế bào động vật kích thước của mtDNA nhỏ, cho tới nay đã xác định được trình tự đầy đủ của bộ gen ty thể người, chuột, bò, tất cả đều có kích thước khoảng 16,5 kb. Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể. Mỗi ty thể có nhiều bản sao của DNA. Nấm men có kích thước bộ gen ty thể khoảng 84 kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiều vùng không mang intron dài xen kẽ giữa các vùng exon. Ở thực vật thì có sự biến động rất lớn về kích thước bộ gen ty thể, mtDNA của thực vật có kích thước tối thiểu khoảng 100 kb. Chức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 năng của những vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng, nhưng dường như chúng chỉ là những vùng không mã hoá. Kích thước của mtDNA ở động vật rất nhỏ nhưng tổ chức lại rất chặt chẽ. mtDNA ở động vật không có vùng intron, có một số gen gối lên nhau và hầu hết mỗi cặp bazơ đều có thể nằm trong một gen nào đó ngoại trừ vùng D- loop. D-loop là vùng điều khiển của mtDNA trên đó có các promotor của quá trình sao chép và phiên mã của mtDNA [25]. 1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng mẹ. Ở hầu hết động vật có xương sống bộ gen này có chiều dài khoảng 16800 nucleotid, trong đó bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA và vùng điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter để tái bản và phiên mã mtDNA. DNA ty thể có những đặc tính đáng quan tâm như sau: (1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn khoảng 5 lần so với bất kỳ một gen nhân nào. (2) mtDNA là một phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp. Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5 – 10 lần so với các gen khác của mtDNA. Trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29]. 1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà * Đặc điểm cấu trúc ty thể gà Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank). Các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoril hóa trong ty thể. Gen ty thể gà có các đặc điểm riêng, khác với lớp thú và lưỡng cư đó là: một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà lại không có đặc điểm này. Đồng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì ATG. Trình tự đầy đủ này của hệ gene ty thể gà nhà là cơ sở cho nhiều công trình nghiên cứu về DNA ty thể của các giống, các ._.loài thuộc bộ gà (Galliormes). Toàn bộ DNA ty thể gà nhà được lập thành sơ đồ như sau: Hình 1.2. Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus (Desjadins và Morais, 1990) ND: NADH đehidrogenaza CO: cytocrom oxidaza H (Heavy strand): chuỗi nặng L (Light strand): chuỗi nhẹ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 * Đặc điểm di truyền của ty thể: Di truyền ty thể là di truyền theo dòng mẹ. Trong thực tế có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ tế bào mẹ. Đó là do bào quan này nằm trong tế bào chất, khi có sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng tạo thành hợp tử (tế bào con) thì tế bào con nhận chủ yếu tế bào chất từ trứng của mẹ, trong đó có chứa ty thể, còn ty thể của tinh trùng khi tham gia thụ tinh được loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc vào ubiquitin. Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt hai dòng ty thể của cả bố và mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này gọi là dị tế bào chất. DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể là do ty thể thiếu hụt cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể. Đặc biệt là vùng điều khiển D-loop của mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5–10 lần so với các gen khác của mtDNA. Trình tự nucleotit của vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29]. * Vai trò vùng D-loop trong phân loại gà Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn: đoạn I, II và III. Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ. Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III. Chính điều này đã làm cho vùng điều khiển của mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần so với các gen khác của ty thể. Vì vậy mà trình tự nucleotid của vùng D-loop là công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể cùng loài. 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới Hiện nay, trên thế giới ngành chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh cả về số lượng và chất lượng. Mỹ là nước đi đầu thế giới về ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt trong lĩnh vực tạo ra những giống gà cơ bản. Sau Mỹ là Pháp, Trung Quốc, Anh, Đức, Hà Lan… Ở các nước Đông Âu, chăn nuôi gia cầm cũng phát triển, điển hình là Hungari và Bungari. Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà: Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp. Với trình tự này, các nhà khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các đối tượng thuộc bộ gà. Năm 1994-1995, Fumihito và cộng sự [20] đã nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, ... dựa trên phân tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400 nucleotid đầu tiên trên vùng điều khiển của mtDNA. Kết quả nhận được đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60 nucleotide trên vùng điều khiển của mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus. Randi và cộng sự (1997) [29] đã phân tích trình tự của một phần đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam và đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai giống này. Năm 1999, Kimball và cộng sự [23] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ của gen cytocrom b (1143bp) và đoạn siêu biến (350bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn gen cho thấy sự khác nhau là rất ít. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Zhang và đồng tác giả (2002) [31] đã giải trình tự 539 nucleotid đầu tiên trong vùng D-loop của sáu chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-loop. Komiyama T và đồng tác giả (2004) [24] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-loop ty thể từ máu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phương của Nhật Bản, đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế làm nhóm ngoại. Trên cơ sở đó họ đã lập được cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể địa lý. 1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi trắng (L. hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi hông tía (L. diardi). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của mtDNA của 3 loài gà Lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên. Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop. Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện trên. Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao nuôi tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguồn gốc mẫu Các mẫu trứng, máu được lấy từ các giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đình Giã , Cao Thượng , Tân Yên, Bắc Giang. 2.1.2 Địa điểm thí nghiệm Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam. Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2 Hoá chất và thiết bị 2.2.1 Hóa chất Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ, Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1), agarose 0,8%... 2.2.2 Thiết bị sử dụng Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20oC Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc (Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc 110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác. 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp hoá sinh xác định hàm lƣợng cholesterol * Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol) được chiết bằng chloroform. Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn, cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether. Dịch chiết được cô cạn bằng máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol. Cholesterol trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005) [22]. * Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác nhau trong cùng một giống. Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả trứng vào cốc thủy tinh. Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Tiếp theo là các bước: + Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml. + Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút. + Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút. + Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml. + Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút. + Gộp dịch chiết vào bình gạn. + Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp. + Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay. + Cô quay đến khô ở 300C. + Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 + Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C. + Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. + Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão hòa, 10 ml nước. + Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether. + Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất. + Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 30 0C đến khô. + Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol. + Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng. Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút, lượng mẫu bơm 10 l. Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng cholesterol của mỗi mẫu [22]. Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau : X = m D A CA s sm 100  Trong đó: X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g) Am: Diện tích pic mẫu As: Diện tích pic chuẩn Cs: Nồng độ chuẩn D: Độ pha loãng m: khối lượng mẫu cân (g) 100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Như vậy, để xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí nghiệm thì trước hết ta phải xây dựng đường chuẩn cholesterol ở các nồng độ khác nhau: 2,04 ppm, 20,4 ppm, 204 ppm, 1 mg/ml, 2,04 mg/ml. Để xây dựng được đường chuẩn cholesterol thì ta phải xác định chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau đó. Kết quả về chiều cao và diện tích của peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau được thể hiện qua bảng 2.1. Bảng 2.1. Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau Nồng độ cholesterol (ppm) Thời gian chạy máy (phút) Diện tích Chiều cao 2,04 33,159 19502 543 20,4 33,190 69573 1946 204 33,178 715249 17001 1000 33,054 3309741 91236 2040 33,329 7396448 181428 Từ các kết quả về chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn chúng ta có thể xây dựng đường chuẩn cholesterol theo diện tích hoặc theo chiều cao như sau: 1000000 2000000 3 00 00 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 500 1000 1500 2500 DiÖ n tÝ ch cña pic ch ole ste rol 0 204 204020,4 Nång ®é cholesterol (ppm) Hình 2.1. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn cholesterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Ch iÒu ca o c ña pic ch ole ste rol 2500204015001000500 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 20420,4 Nång ®é cholesterol (ppm) Hình 2.2. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn cholesterol Như vậy, dựa vào đường chuẩn cholesterol chúng ta có thể xác định được lượng cholesterol có trong các mẫu nghiên cứu cần xác định. 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật * Nguyên tắc chung Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biện pháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp. Cuối cùng DNA được kết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm. * Quy trình tách chiết Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tế bào bị phá vỡ). Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]. Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 370C trong một giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng. Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffer saline (PBS) và ly tâm. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu. Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy. Hơn nữa pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 hợp chloroform: isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần. Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50l CH3COONa3M, pH=5,2 và 1 ml ethanol 100%. Ethanol có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẫy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -200C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa trong máy sấy và hòa tan tủa trong nước cất 2 lần. Trong dung dịch này có nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại bỏ RNA bằng RNAase, ủ ở 370C trong 2- 3 giờ. Quy trình tách chiết DNA tổng số theo Sambrook và Russell [30] có thể được tóm tắt như sau : (1): Ủ máu đông lạnh trong 37oC trong 1 giờ cho máu tan. (2): Hút vào mỗi eppendorf (epp, loại 1,5 ml) 500 l máu. (3): Bổ sung 500 l dung dịch PBS 1X, sau đó vortex và li tâm 6000 vòng/phút trong 15 - 20 phút, 4 0C, đổ dịch và thu cặn. (4): Bổ sung 1ml dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 l protease K (20 mg/ml). Mẫu được ủ ở 650C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng. (5): Chia vào mỗi epp 500 l dịch. (6): Bổ sung một lượng tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên cùng sang ống mới. (7): Thêm một thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên cùng sang ống mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 (8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ qua đêm ở - 20oC. (9): Thu tủa bằng cách li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15-20 phút, 4oC. Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào mỗi epp. (10): Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Bỏ dịch và thu cặn. (11): Làm khô tủa trong máy sấy và hòa tủa vào 50 l nước khử ion vô trùng, búng nhẹ. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose * Nguyên tắc chung Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do có sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích thước lớn) hoặc polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ). Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% bởi gel agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1- 20kb) [2]. * Quy trình kỹ thuật - Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X. Đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30 phút, khi gel đông cứng thì rút răng lược ra và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE 1X sao cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ 1 – 2 mm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với một lượng thích hợp (3 - 8 l) được trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ trên gel. Chạy điện di với dòng điện một chiều có cường độ dòng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế 100-120 V. Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc nào cần ngừng điện di. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm bản gel trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml. Sau khi ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa trong nước sạch và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad). 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản khuếch đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền. Kỹ thuật này được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền [26]. * Nguyên tắc chung PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA taq polymerase. Enzyme này được chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (950C), làm nguội (37- 65 0 C) và ủ lâu ở 720C. Trong dung dịch có chứa 4 loại deoxynucleotide (dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonucleotide, mỗi mồi sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn của DNA khuôn tương ứng, từ đó mạch được tổng hợp kéo dài. * Nguyên liệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 - DNA khuôn phải được tinh sạch và ít bị đứt gãy , có chứa trình tự đích cần nhân lên . Nồng độ DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100 ng/phản ứng. - Mồi: là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất lượng sản phẩm PCR. Nồng độ mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong thí nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l). Cặp mồi được sử dụng đó là : + Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’. + Mồi ngược L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’. H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ số là vị trí nucleotide trên mtDNA trong trình tự đầy đủ của gà mà đầu 3’ của mồi tiếp hợp vào (Desjadins và Morais, 1990) [17]. Cặp mồi H1255- L16725 được lựa chọn vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ gà. - Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong môi trường đệm phù hợp với hoạt động của enzyme và nó có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đệm là buffer dream taq. Nó phù hợp với hoạt động của emzyme taq polymerase và trong dung dịch đệm này có chứa Mg2+. Vai trò của ion Mg 2+ là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzyme. Sau khi khảo sát chúng tôi sử dụng nồng độ Mg2+ là 10 mM cho kết quả PCR tốt nhất. - 4 loại dNTPs: nồng độ của 4 loại dNTPs phải bằng nhau và phụ thuộc nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ các dNTPs lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy, nồng độ của các dNTPs là 1mM là phù hợp. - Taq DNA polymeaza của hãng Fermentas - Nước khử ion vô trùng. Thông thường phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm các thành phần sau: Nước 14,8 l Buffer dream taq 2,5 l dNTPs 2,5 l H1255 (mồi xuôi ) 1 l L16725 (mồi ngược) 1 l Taq DNA polymeraza 0,2 l DNA khuôn 3 l Tổng thể tích 25 l PCR là một quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 35 chu kì), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94-950C trong khoảng một phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lượng G-C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94 0C trong một phút. Trước khi bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ biến tính được đặt ở 940C trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến tính hoàn toàn. - Giai đoạn gắn mồi: ở giai đoạn này, nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi. Chúng tôi đã thử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 chạy phản ứng ở một số giá trị nhiệt độ khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 550C. - Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 720C để cho enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Tốc độ tổng hợp của phản ứng khoảng 1000 nuleotide/ phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là 1 phút 20 giây. Sản phẩm cuối cùng của chu kỳ trước sẽ là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ đó mà có đủ lượng DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi kết thúc 35 chu kì, chúng tôi đặt nhiệt độ ở 720C trong mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ 40C. * Quy trình nhiệt của phản ứng PCR có thể được tóm tắt như sau: Bước 1: 94oC - 4 phút Bước 2: 94oC - 1 phút Bước 3: 55oC - 1 phút Bước 4: 72oC - 1 phút 20 giây Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 34 lần. Bước 5: 72oC - 10 phút. Sản phẩm PCR được giữ ở 4oC. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 l sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR. 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR Sau khi điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di toàn bộ sản phẩm PCR thu được ở mỗi mẫu. Sau đó chúng tôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 tiến hành thôi gel theo protocol của hãng Promega để thu sản phẩm PCR tinh sạch. Quy trình được tiến hành như sau: - Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR. - Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml. - Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân. - Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng của băng gel ta vừa cắt). - Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ 1 mg gel: 1 l dung dịch 1. - Ngâm trong nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết. - Chuyển sang cột và để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 4 0 C, trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch phía dưới. - Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/ phút, 4 0C, trong một phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới. - Bổ sung thêm 500 l dung dịch 2 và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong 5 phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới. - Ly tâm lại một phút, 12000 vòng/ phút, 40C. - Cho vào máy sấy 5 phút. - Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nước cất 2 lần, để ở nhiệt độ phòng trong khoảng một phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 4 0C, trong một phút. Sau khi đã thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di để kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 0,8%. Nếu điện di xuất hiện băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước đoạn DNA cần nhân trong phản ứng PCR thì sản phẩm thôi gel đủ chất lượng để tiến hành đọc trình tự. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA *Nguy._.