Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --------------š&›-------------- NGUYỄN LUẬN XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ GEN VP1 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS VACXIN VIÊM GAN VỊT Ở VIỆT NAM VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ CHỦNG KHÁC CỦA THẾ GIỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH HÒA HÀ NỘI - 2008 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố hay bảo vệ trong một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008 Tác giả luận văn Nguyễn Luận Lời Cảm Ơn Sau thời gian học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành khoá học. Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS. Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), người thầy đã tận tình hướng dẫn trực tiếp và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, thực hành thí nghiệm và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Đoàn Thị Thanh Hương, Th.S Nguyễn Thị Bích Nga cùng toàn thể cán bộ Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến sâu sắc tới toàn thể các thầy giáo - cô giáo trong Nhà trường, khoa Sau đại học, Khoa Chăn nuôi - Thú y, đặc biệt là các thầy giáo - cô giáo ở Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành đề tài. Xin chân thành cảm ơn Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các cơ quan, những người thân, gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008 Nguyễn Luận MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ..1 Lời cảm ơn ..2 Mục lục ..3 Danh mục các chữ viết tắt ..6 Danh mục bảng ..7 Danh mục hình ......8 CÁC CHỮ VIẾT TẮT DPV : Duck Picornavirus DHV : Duck Hepatitis Virus VxXT : Vacxin do Xí nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất VxAC : Vacxin có nguồn gốc đưa về từ Ai Cập DNA : Axit Deoxyribonucleic RNA : Axit Ribonucleic VP : Viral Protein VPg : Viral Protein genome-linked PCR : Polymerase Chain Reaction RT-PCR : Revese Transcription - Polymerase Chain Reaction EDTA : Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP : Dideoxy Nucleotide Triphosphate X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase TAE : Tris Acetic acid EDTA LB : Luria Bertani-agar UTR : Untranslated Region BLAST : Basic Local Alignment Search Tool cs : cộng sự tr : trang DANH MỤC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 3.1 Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 39 4.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen VP1 của chủng virus vacxin Ai Cập (VxAC) 60 4.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen VP1 của chủng virus vacxin xưởng thuốc (VxXT) 61 4.3 Các chủng virus viêm gan vịt sử dụng so sánh 62 4.4 So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotit (trên đường chéo) và axit amin (dưới đường chéo) của hai chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng trên thế giới thuộc DHV-1. 70 DANH MỤC HÌNH Số hình Tên hình Trang 2.1 Tư thế chết điển hình ở trạng thái opistotonus của vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt (ảnh minh họa). 15 2.2 Gan vịt xuất huyết (ảnh minh họa). 15 2.3 Mô tả virus viêm gan vịt type I 22 2.4 Mô tả hệ gen và chuỗi polypeptit của virus viêm gan vịt 22 2.5 Cây phả hệ thể hiện liên quan của DHV-1 với 24 loại virus thuộc 11 chi trong họ Picornaviridae. Mối quan hệ được xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về axit amin của phức hệ protein [60]. Vị trí của nhóm virus viêm gan vịt (DHV 1) được chỉ dẫn bằng mũi tên 28 2.6 Cấu trúc của vector pCR 2.1-TOPO 33 3.1 Sơ đồ vị trí bám của mồi để thu nhận đoạn DNA (~0.8kb) chứa gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm gan vịt bằng cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh họa). 39 3.2 Sơ đồ qui trình nghiên cứu lưu giữ và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt 41 4.1 Kết quả điện di RNA tổng số được chiết tách từ mẫu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1% 52 4.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) của mẫu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1% 53 4.3 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp trên đĩa thạch (LB-agar 1,5%) có chứa kháng sinh kanamycin và X-gal, bao gồm các khuẩn lạc xanh và trắng cần chọn lọc. 55 4.4 Kết quả tách dòng vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, các sản phẩm DNA plasmid được kiểm tra bằng cách cắt với enzym EcoRI. 56 4.5 Giản đồ giải trình trình tự (chromatogram) thành phần nucleotit của vùng gen VP1 virus viêm gan vịt của chủng VxXT. Các nucleotit tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi đọc bằng tia laze cho hiển thị Adenine có màu xanh lá cây (green), Thymine có màu đỏ (red), Guanine có màu đen (black) và Cytosine có màu xanh nước biển (blue). 57 4.6 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của chủng virus viêm gan vịt VxAC nghiên cứu 58 4.7 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của chủng virus viêm gan vịt VxXT nghiên cứu 58 4.8 So sánh trình tự nucleotit gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới 64 4.9 So sánh trình tự axit amin vùng gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới 65 4.10 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần nucleotit. Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ 71 4.11 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAc và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần amino acid. Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ 72 1. MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuôi, ngành chăn nuôi vịt đang dần trở thành ngành sản xuất hàng hoá quan trọng, góp phần vào chương trình xoá đói giảm nghèo cho nông dân. Hàng năm, nước ta tiến hành nhập nội hàng loạt các giống vịt cao sản và được nhân ra trên diện rộng, các giống này tuy có ưu điểm cho năng suất cao nhưng sức đề kháng kém hơn rất nhiều so với giống vịt nội địa. Trong các bệnh diễn ra trên vịt, bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm hết sức nguy hiểm. Bệnh xảy ra cấp tính ở vịt con từ 1 - 6 tuần tuổi, lây lan nhanh, mạnh, tỷ lệ chết cao, có khi lên tới 100%, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi [2]. Hệ gen của virus gây bệnh viêm gan ở vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi đơn dương, có độ dài khoảng 7.600 – 7.700 nucleotit, chứa duy nhất một khung đọc mở đơn, gồm 3 tổ hợp gen P1, P2 và P3. Tổ hợp gen P1 mã hoá cho các loại protein cấu trúc VP0, VP1 và VP3. Tổ hợp gen P2 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm protein 2A, 2B và 2C. Cuối cùng, tổ hợp gen P3 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm 4 loại protein là 3A, 3B, 3C và 3D. Trong đó, đặc biệt quan trọng là protein cấu trúc VP1, được mã hoá bởi đoạn gen có độ dài 714 nucleotit. Đây là gen kháng nguyên, vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định tính gây bệnh của virus. Đối với các chủng virus vacxin, việc xác định được mức độ tương đồng với các chủng cường độc viêm gan vịt đang lưu hành có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Vì vậy, việc so sánh vùng gen VP1 trong giám định sinh phân tử không những có mục đích chẩn đoán mà còn giúp tìm hiểu tương đồng kháng nguyên, phân biệt được mức độ độc lực, cũng như xác định mức độ đồng nhất về tính kháng nguyên của virus. Mặt khác, các nghiên cứu gần đây về hệ gen và sinh học phân tử phân loại virus đều cho thấy virus viêm gan vịt thuộc về một nhóm mới trong họ Picornaviridae; hơn nữa, đã có biến đổi để tạo nên những genotype và serotype khác biệt [22], [36], [37], [61], [62], [60]. Đồng thời, các nghiên cứu này cũng xác định virus viêm gan vịt không còn thuộc chi Enterovirus hoặc ít nhất đã có những biến chủng, khiến cho virus không còn có những đặc tính vốn có trước đây như virus viêm gan vịt cổ điển [22], [61]. Tại Việt Nam, rất có thể virus viêm gan vịt cũng bị biến đổi tạo nên genotype, serotype thuộc nhóm mới như các nghiên cứu nước ngoài đã xác định. Tuy có rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học và có rất nhiều chủng virus viêm gan vịt được phân lập nhưng chưa có nghiên cứu sâu sắc nào về đặc tính sinh học phân tử, định hướng dịch tễ học phân tử trong phòng chống bệnh này. Xuất phát từ nhu cầu cần có dữ liệu sinh học phân tử gen và hệ gen cũng như xác định vị trí phân loại của virus viêm gan vịt có mặt tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới” 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Với tên đề tài nghiên cứu, mục tiêu của chúng tôi là: - Giải trình trình tự vùng gen VP1 của các chủng virus vacxin hiện có mặt tại Việt Nam. - So sánh vùng gen VP1 của chủng virus vacxin thu được với một số chủng virus vacxin và cường độc khác trên thế giới để có thể xác định được mức độ tương đồng giữa các chủng so sánh. - Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chủng virus vacxin này với các chủng virus viêm gan vịt của thế giới được thu nhận để so sánh. 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử về chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam. - Tạo cơ sở xác định tính tương đồng về gen và axit amin giữa các chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng virus khác của thế giới để từ đó giúp ích cho việc nghiên cứu vacxin phòng bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 BỆNH VIÊM GAN VIRUS Ở VỊT (DUCK HEPATITIS) Bệnh viêm gan vịt do một loại virus (Duck Hepatitis Virus – DHV) thuộc họ Picornaviridae gây ra, có 3 type virus gây bệnh khác nhau, bao gồm type I (DHV-1), type II (DHV-2) và type III (DHV-3), phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I. Bệnh có biểu hiện bệnh tích đặc trưng: gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên gan [66]. 2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh Bệnh viêm gan do virus ở vịt được phát hiện lần đầu tiên vào mùa xuân năm 1945 tại Mỹ bởi Levine và Hofstad [42], bệnh xảy ra trên đàn vịt con một tuần tuổi nhưng chưa phân lập được mầm bệnh. Levine và Fabricant theo dõi được bệnh này trên đàn vịt trắng Bắc Kinh ở đảo Long (Mỹ) vào năm 1949 và đã phân lập được virus gây bệnh này vào năm 1950 bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà [43]. Năm 1956, bệnh được phát hiện ở bang Massachusetts, Illinois và Michigan, sau đó bệnh xảy ra trên khắp nước Mỹ. Năm 1965, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở Norfolk – Anh trên những đàn vịt con đã được tiêm phòng vacxin nhược độc viêm gan vịt type I. Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên vịt đã phân lập được virus viêm gan vịt type II khác hẳn với virus viêm gan type I. Virus type II chỉ gây bệnh ở Anh. Năm 1968, virus viêm gan vịt type I đã gây bệnh trên khắp thế giới trong đó có một số nước Châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc... [64]. Trên đảo Long (Mỹ), bệnh viêm gan vịt đã xảy ra trên đàn vịt con được dùng vacxin nhược độc type I, bệnh xảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt của virus type I, tỷ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30% [58]. Haider và Calnek đã đặt tên virus này là virus viêm gan vịt type III, và cho đến nay, virus viêm gan vịt type III mới chỉ được công bố ở Mỹ [30]. Bệnh viêm gan vịt do virus type I đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam. Ở Việt Nam, Trần Minh Châu và cs đã nghi có bệnh viêm gan vịt do virus vào năm 1978 nhưng chưa phân lập được virus. Từ năm 1979 đến năm 1983, bệnh xảy ra đã được ghi nhận làm chết nhiều vịt ở các địa phương như ở Đông Anh - Hà Nội (1979 - 1980), ở Gia Lâm - Hà Nội (1983) đã làm chết hàng ngàn vịt [9], [5]. Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng qua điều tra 10 huyện thuộc 4 tỉnh và thành phố là Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Hà Tây, thấy bệnh xảy ra ở vịt con dưới 40 ngày tuổi, đặc biệt bệnh xảy ra nhiều và có tỷ lệ chết cao ở lứa tuổi 1 - 7 ngày tuổi [11]. Hàng năm, bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra thường xuyên. Tuỳ từng thời điểm mà bệnh xuất hiện ở các vùng địa lý khác nhau. 2.1.2 Loài mắc bệnh Trong tự nhiên, virus viêm gan vịt type I chỉ gây bệnh ở vịt con [1]. Vịt trưởng thành bị nhiễm virus không có triệu chứng lâm sàng, không ảnh hưởng đến sản lượng trứng. Gà, gà tây và các động vật khác không mắc bệnh. Gia cầm non một vài ngày hay vài tuần tuổi vẫn có thể bị nhiễm bệnh, con vật có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích và có kháng thể trung hoà trong máu. Gà con có thể bị nhiễm bệnh, bệnh thể hiện không điển hình và có thể truyền virus cho con khác [17]. Trong phòng thí nghiệm, dùng virus viêm gan vịt type I gây bệnh cho vịt con bằng cách cho uống hoặc tiêm phúc mạc, vịt có bệnh tích như gan sưng, xuất huyết lốm đốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng và có thể phân lập được virus từ gan 17 ngày sau khi cho uống. Các loài vật khác như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng, chó... đều không cảm thụ với bệnh. 2.1.3 Đường xâm nhập và cách lây lan Trong đàn vịt con bị bệnh, virus viêm gan vịt type I lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con khỏe, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao 100%. Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp, qua vết thương hoặc qua đường miệng. Có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp. Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau đó ít ngày [43], [50], [52]. Bệnh viêm gan vịt không lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt [16]. Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất ra ngoài theo phân sau 8 tuần [52]. Các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, đây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa [17]. Ở vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất qua phân ít nhất 1 tuần sau khi nhiễm bệnh. 2.1.4 Cơ chế gây bệnh của virus Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hoá, hô hấp hoặc vết thương rồi vào máu. Theo máu, virus đến các cơ quan phủ tạng đặc biệt là gan, đây là cơ quan thích hợp nhất đối với virus. Quá trình được biểu hiện qua hai giai đoạn: Ở giai đoạn đầu, virus gây rối loạn trao đổi chất ở gan, do quá trình trao đổi mỡ ở gan và đặc biệt là quá trình trao đổi cholesterol bị đình trệ làm cho lượng glycogen trong gan giảm thấp nhưng lượng lipit lại tăng cao. Vì vậy, vịt con ở thời kỳ cuối của bào thai thiếu năng lượng dẫn đến sức đề kháng của chúng bị giảm sút. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội mô huyết quản, gây ra xuất huyết đặc trưng. Virus sinh sản trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer. Khi kiểm tra thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể không được giải độc làm con vật chết do ngộ độc. 2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 2.1.5.1 Triệu chứng lâm sàng Thời kỳ nung bệnh từ 1 - 5 ngày, đôi khi kéo dài 8 - 13 ngày. Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào độc lực của virus, liều lượng và phương pháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể. Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau 1 - 2 giờ mắc bệnh, gây chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân (gọi là opistotonus), đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên sườn và vịt con thường chết ở tư thế này (hình 2.1). Đây là một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh. Một số trường hợp thấy vịt bị ỉa chảy, phân loãng, triệu chứng này không phải xuất hiện ở tất cả vịt. Bệnh kéo dài 2 - 3 ngày và có thể kéo dài hơn. Khi đã xuất hiện triệu chứng thì vịt ốm ít khi khỏi, phần lớn là chết. Những con ốm không có triệu chứng lâm sàng sau khi khỏi bệnh Hình 2.1 Tư thế chết điển hình ở trạng thái opistotonus của vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt (ảnh minh họa) Hình 2.2 Gan vịt xuất huyết (ảnh minh họa) Bệnh viêm gan vịt truyền nhiễm do virus có tỷ lệ chết biến động từ vài phần trăm đến 90% [15]. Vịt mắc bệnh do virus viêm gan vịt type I gây ra thường xảy ra đột ngột, thời gian nung bệnh ngắn chỉ trong vòng 24 giờ. Vịt chết tập trung vào ngày thứ 2 - 3 - 4 sau khi mắc bệnh, tỷ lệ chết rất cao có khi lên tới 100%. Farmer gọi bệnh viêm gan vịt là hội chứng thận thoái hoá mỡ và hoại tử tuyến tụy [25]. 2.1.5.2 Bệnh tích - Bệnh tích đại thể Bệnh tích tập trung chủ yếu ở gan (hình 2.2). Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ. Một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin. Bề mặt loang lổ do có nhiều điểm xuất huyết, xuất huyết lan rộng không có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau. Hiện tượng xuất huyết trên bề mặt gan không có ở tất cả vịt chết. Khi nhỏ bệnh phẩm vào niêm mạc mũi thì xuất huyết rất rõ ở gan. Khi tiêm bệnh phẩm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương và càng ít hơn khi gây ra bệnh qua đường miệng. Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn. Lách có thể sưng, thận tụ máu, hoặc lấm tấm xuất huyết. Tiêm chủng virus DH - EG - 2000 cho phôi gà 10 ngày tuổi thấy hiện tượng xuất huyết trên da. Hiện tượng xuất huyết gan và phù phôi xuất hiện gần như đồng thời trên tất cả các phôi. Ở những phôi có biểu hiện xuất huyết trên da thường xuất hiện kèm theo hiện tượng phù phôi, bệnh tích xuất huyết gan có lúc không xuất hiện cùng với xuất huyết trên da và phù. Một số phôi khi mổ khám không thấy bệnh tích nào khác ngoài hiện tượng gan xuất huyết [11]. - Bệnh tích vi thể Biến đổi vi thể của bệnh thường xuất hiện ở gan và đại não. Gan có những đám tế bào bị hoại tử, ống mật, viêm tăng sinh quanh mạch và viêm tăng sinh mô thần kinh đệm, lúc đầu là những bạch cầu có hạt sau đó là tế bào lympho và các tương bào. Ở vịt con không chết có sự tái sinh của các tế bào nhu mô gan. Sự tổn thương của tế bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêm gan của người [23]. Quan sát biến đổi vi thể ở phôi gà 10 ngày tuổi chết do nhiễm virus viêm gan vịt type I (chủng DH - EG - 2000) thấy tế bào hạt của nhiều cơ quan tăng sinh, gan có các điểm hoại tử, tăng sinh ống mật, phù dưới da, không quan sát thấy các thể bao hàm trong tế bào. Khi tiến hành làm tiêu bản vi thể thấy gan bị biến đổi, bè gan và các tế bào gan sắp xếp lộn xộn, các vi huyết quản xuyên tâm giãn rộng chứa hồng cầu và tế bào viêm. Có hiện tượng xuất huyết lan tràn trong nhu mô gan. Tế bào lympho tăng sinh mạnh, có thể tập trung thành từng đám lớn hoặc rải rác xen kẽ với những tế bào gan. Một số tế bào gan mất đi phần nguyên sinh chất, chỉ còn lại nhân, một số tế bào bị thoái hóa mỡ và thoái hóa không bào [11] Tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoang niệu mô phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi. Sau khi tiêm 24 - 72 giờ phôi chết có biểu hiện xuất huyết dưới da, gan xuất huyết và có nhiều điểm hoại tử. Trong trường hợp vịt bị bệnh ở thể cấp tính, sau khi nhiễm virus 24 giờ thấy tế bào gan thoái hoá, hoại tử, trong tế bào có các tiểu phần virus. 2.1.6 Chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus Dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và diễn biến bệnh lý để chẩn đoán sơ bộ bệnh viêm gan vịt do virus và có biện pháp xử lý kịp thời tại cơ sở chăn nuôi. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp diễn biến bệnh phức tạp nên việc chẩn đoán còn dựa vào kết quả của các kĩ thuật chẩn đoán. Mặt khác, bệnh được chẩn đoán thông qua triệu chứng và bệnh tích điển hình khi tiêm mẫu bệnh cho phôi gà, phôi vịt và vịt con. Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy virus trên môi trường tế bào một lớp gan phôi vịt cũng được sử dụng, virus gây ra hiện tượng co tròn và hoại tử tế bào. Các phản ứng huyết thanh không được sử dụng trong việc chẩn đoán các ổ bệnh cấp tính. Tuy nhiên, ngay từ thời gian đầu Levine và Fabricant (1950)[43] đã dùng phản ứng trung hoà cho các mục đích như: giám định virus, đánh giá miễn dịch đối với vacxin và điều tra về dịch tễ học. Các phản ứng xét nghiệm thường dùng là phản ứng trung hoà trên phôi gà, trên phôi vịt hay ở vịt con. Theo báo cáo của Malinovskaya thì phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) nhạy hơn phản ứng trung hoà [64], [45]. Phản ứng trung hoà được sử dụng để định type viêm gan vịt type I [65] và dùng phản ứng bảo hộ chéo để phân biệt virus viêm gan vịt type I, type II và type III [29]. 2.1.7 Phòng chống bệnh Đây là bệnh do virus gây ra nên không điều trị được bệnh, để làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra có thể tiến hành một số biện pháp sau: - Phát hiện bệnh sớm, can thiệp bằng cách tiêm huyết thanh miễn dịch hay kháng thể viêm gan vịt chế từ lòng đỏ trứng cho vịt. Bệnh do virus viêm gan vịt type I gây ra, dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh type I hay dùng kháng thể viêm gan vịt type I chế từ lòng đỏ trứng tiêm cho vịt con với liều 0,5ml cho một con. Hiện nay, các nhà khoa học đã nghĩ tới việc dùng kháng thể phòng bệnh và trị bệnh. Năm 2001, công ty HANVET sản xuất kháng thể viêm gan vịt với liều phòng 0,5ml/con, liều điều trị 1ml/con, tiêm dưới da hoặc cho uống [13]. - Tiêm thẳng vacxin vào ổ dịch cũng có thể khống chế được bệnh viêm gan virus ở vịt. Việc khống chế bệnh bằng cách này dựa trên cơ sở của hiện tượng cản nhiễm trong miễn dịch chống virus của cơ thể sinh vật. Thực tế cho thấy, việc dùng vacxin có hiệu quả hay không còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kháng thể truyền từ mẹ, thời gian vịt con tiếp xúc với virus cường độc viêm gan vịt. Nếu vịt con sinh ra chưa có miễn dịch thì cần được tiêm phòng trong vòng 24 giờ đầu, sau 4 - 7 ngày tiêm nhắc lại, mỗi lần tiêm là 0,5ml kháng thể lòng đỏ hay kháng huyết thanh. Ở đàn vịt con được vịt mẹ truyền cho kháng thể, nếu bị nhiễm bệnh tự nhiên thì việc dùng vacxin sẽ kém hiệu quả. Còn đối với đàn vịt con đã sớm tiếp xúc với virus cường độc thì việc sử dụng vacxin sẽ không có hiệu quả. Vì vậy, việc áp dụng các biện pháp vệ sinh thú y thích hợp và tẩy uế chuồng trại sẽ góp phần rất quan trọng trong việc giải quyết căn bệnh này. 2.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE I 2.2.1 Đặc tính nuôi cấy virus Virus viêm gan vịt là loại kí sinh nội bào tuyệt đối [8]. Để gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do bệnh viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lí bằng kháng sinh. Có thể cấy chuyển virus viêm gan vịt trên động vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào. 2.2.1.1 Nuôi cấy trên phôi trứng Tiêm bệnh phẩm vào màng nhung niệu, vào túi noãn hoàng cũng có hiệu quả như tiêm vào niệu nang [52]. - Trên phôi vịt: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi. Sau khi gây nhiễm 24 - 72 giờ, phôi chết với bệnh tích như phôi còi cọc, xuất huyết dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử. Những phôi chết muộn, nước xoang niệu mô có màu xanh nhạt và có bệnh tích rõ hơn. Ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước ối có màu xanh và gan bị xanh - đen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà [13]. - Trên phôi ngỗng: Virus viêm gan vịt cũng có khả năng nhân lên trên phôi ngỗng. Phôi chết sau khi cấy virus vào xoang niệu mô 2 - 3 ngày [24]. - Trên phôi gà: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi gà 9 - 10 ngày tuổi. Với lần cấy chuyển đầu tiên, virus cho tỷ lệ phôi chết 10 - 60% sau khi gây nhiễm 5 - 6 ngày. Phôi có bệnh tích còi cọc, phù phôi, xuất huyết dưới da [43]. Nuôi cấy liên tục trong 68 đời, hiệu giá virus duy trì ở mức độ 10-4 đến 10-6 [16]. Như vậy, gây bệnh cho bào thai có thể được sử dụng để chẩn đoán viêm gan do virus. Trong thiên nhiên, một số chủng độc với độc lực giảm ở những lần cấy truyền đầu tiên có thể không gây chết phôi [16]. Ở phôi gà chết và bị giết sau khi gây nhiễm 5 - 6 ngày đã phát hiện thấy xuất huyết nặng dưới da, phôi còi và bị thuỷ thũng thành chất nhầy như gelatin. Gan bào thai sưng, màu vàng - xanh lá cây hoặc màu xanh - đen, trên gan thường thấy các ổ hoại tử từng điểm hoặc từng vệt nhỏ xoắn lấy nhau hình thành từng đám như hình lưới hay có nhiều điểm xuất huyết loang lổ. Khi gây bệnh bằng chủng có độc lực yếu có thể không quan sát thấy sự kìm hãm phát triển của phôi thai [52]. 2.2.1.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào Virus type I có khả năng nhân lên trên nhiều loại tế bào như tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi gà, thận phôi vịt, thận phôi gà, gan phôi vịt, thận phôi ngỗng... [32]. Trên môi trường nuôi cấy, sau 8 giờ gây nhiễm có thể quan sát thấy sự huỷ hoại tế bào (CPE - Cytopathogen Effect), đạt cực đại sau 2 - 4 ngày. Sự huỷ hoại tế bào biểu hiện bằng những cụm tế bào co tròn, nguyên sinh chất đặc lại tạo không bào, tế bào vỡ ra rồi chết. Dựa vào đặc điểm này để thể đánh giá hiệu giá virus. Với việc cấy truyền virus lần thứ 25 trên tế bào thận phôi vịt, virus không còn khả năng gây huỷ hoại tế bào trên tế bào thận phôi gà. Năm 1972, Maiboroda và cs đã theo dõi sự phát triển của virus viêm gan vịt trên tế bào thận phôi vịt một lớp bằng kĩ thuật kháng thể huỳnh quang thấy virus gây biến đổi bệnh tích tế bào, hàm lượng virus cao nhất sau 2 ngày gây nhiễm [44] và kết quả ở tế bào thận lợn con cũng tương tự [64]. 2.2.1.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ Virus viêm gan vịt có khả năng nhân lên ở vịt con dưới một tuần tuổi. Huyễn dịch bệnh phẩm chứa virus viêm gan vịt được tiêm dưới da, tiêm bắp, cho uống hoặc nhỏ mũi cho vịt. Trong vòng 18 - 48 giờ sau khi gây nhiễm, thường dưới 24 giờ vịt thí nghiệm có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của bệnh. Các loài động vật khác như thỏ, chuột lang, chuột bạch, chó... virus không có khả năng nhân lên. 2.2.2 Sức đề kháng của DHV-1 Virus viêm gan vịt thuộc loại virus không có vỏ bọc ngoài nên mẫn cảm với formalin, đề kháng cao với ete và chloroform. Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, virus có khả năng sống sót trong thời gian dài [66]. Virus có khả năng tồn tại lâu bên ngoài môi trường; trong rơm lót chuồng, trong thức ăn, nước uống, virus có thể tồn tại từ 15 đến 40 ngày. Virus tương đối ổn định ở nhiệt độ thấp, nhưng bị bất hoạt nhanh chóng ở nhiệt độ cao. Ở nhiệt độ 4oC virus tồn tại được khoảng 2 năm. Ở 50oC trong 1 giờ không ảnh hưởng đến chuẩn độ virus, nhưng phần lớn virus bị vô hoạt ở 56oC sau 30 phút. Ở nhiệt độ 37oC, virus viêm gan vịt tồn tại 21 ngày, khi cho virus tác dụng với dung dịch formalin 0,01% thì virus viêm gan vịt vẫn tồn tại được trong 8 giờ. Ở nhiệt độ 15oC - 20oC, virus bị vô hoạt hoàn toàn bởi formaldehyde 1% hay NaOH 1% trong 3 giờ chloramin 3% trong thời gian 5 giờ [15]. Theo Reuss (1959)[52], virus mất độc lực trong các điều kiện nhiệt độ phòng từ 48 đến 96 giờ. Trong tủ lạnh, sức hoạt động của virus tồn tại 120 giờ. Ở nhiệt độ -20oC virus tồn tại được khoảng 9 năm. Làm lạnh đến -38oC, giữ được khả năng lây lan của virus trong 8 tháng hoặc lâu hơn [6]. Ở 56oC và 60oC, tuy virus kháng với tác dụng của ion Mg++ 1M nhưng khi không có mặt của cation này thì virus rất nhạy cảm với các nhiệt độ trên [62]. Virus viêm gan vịt có khả năng kháng trypsin và amonium sulphate. Tế bào chứa virus có thể tồn tại ở pH = 3 trong 9 giờ. Virus không bị vô hoạt bởi lysol 2%; creolin 15%, naphthalysol, xylonaphtha hay anhydrous sodium carbonat 20%. Theo Haider, ở điều kiện có 5% phenol virus bị vô hoạt hoàn toàn [31]. Trong tự nhiên, khi điều kiện vệ sinh kém virus có thể tồn tại được 10 tuần. Trong phân ẩm virus sống được 37 ngày. 2.2.3 Đặc tính kháng nguyên của virus DHV-1 Kết quả của phản ứng trung hoà huyết thanh cho thấy giữa ba type virus viêm gan vịt không có mối quan hệ kháng nguyên với nhau, không xảy ra phản ứng trung hoà chéo giữa virus viêm gan vịt type I với huyết thanh kháng virus viêm gan ở người và ở chó [60], [66]. Virus viêm gan vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của gà, vịt, cừu, chuột lang, thỏ, lợn. Virus không ngưng kết hồng cầu khỉ khi thí nghiệm ở pH = 6,8 - 7,4; nhiệt độ 4oC; 24oC; 37oC. 2.2.4 Biến dị của virus Trong tự nhiên, kháng nguyên của virus viêm gan vịt type I thường không ổn định, dễ bị biến dị [56]. Đã phân lập được các type virus biến dị ở Ấn Độ, Ai Cập... và chứng minh sự biến dị của virus type I bằng phản ứng huyết thanh học. Vịt được miễn dịch với type I không đủ bảo hộ khi công cường độc bằng chủng virus biến dị [55]. 2.3 SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ SƠ ĐỒ PHẢ HỆ VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE I 2.3.1 Sơ lược về Picornavirus Picornavirus là những virus có kích thước nhỏ, xuyên qua được màng lọc Beckelfeld và Seitz [43]. Qua kính hiển vi điện tử, virus là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, hệ gen chứa RNA sợi đơn dương, khoảng 7100 - 9000 nucleotit. Capsid có cấu tạo dạng khối đa diện, đường kính khoảng 27 - 30nm (hình 2.3). Hiện nay, họ Picornaviridae gồm có 23 loại virus và được nhóm vào 9 chi, đó là Enterovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus và Teschovirus [57]. Ngoài ra, đã có giả thuyết nên nhóm 3 loại virus là Porcine Enterovirus 8 (PEV-8), Simian Virus 2 (SV-2) và Duck Picornavirus (DPV) xếp chung vào một chi mới và dự kiến đặt tên nhóm là “Sapelovirus” [40]. Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều thiếu cấu trúc mũ hoá (methylation) ở đầu 5’ mà thay vào đó là một protein nhỏ gọi là VPg (Viral Protein genome-linked). VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốc tyrosin [20]. Trong hệ gen của các virus có một vùng nucleotit làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES (Internal Ribosome Entry Site). Đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạp dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho quá trình dịch mã không phụ thuộc điểm mũ của hệ gen virus [19]. Phần gen nằm giữa 2 vùng không dịch mã 5’UTR và 3’UTR (UTR - Untranslated Region), chứa đựng một khung đọc mở đơn có kích thước khá lớn, mã hoá cho một chuỗi polypeptit chung, có chiều dài khoảng hơn 2000 axit amin (hình 2.4). Hình 2.3 Mô tả virus viêm gan vịt type I (ảnh minh họa) Hình 2.4 Mô tả hệ gen và chuỗi polypeptit của virus viêm gan vịt (ảnh minh họa) Ở chuỗi polypeptit chung, phần protein ký hiệu L (Leader Protein)._. là protein dẫn, tiếp đó là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4(1A), VP2(1B), VP3(1C) và VP1(1D). Đoạn cuối cùng gồm 7 protein phi cấu trúc là protein 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D (hình 2.4). Tuy nhiên, giữa các chi khác nhau sẽ có sự thay đổi nhỏ về trật tự sắp xếp này. Chuỗi polypeptit chung của Picornavirus thường bị phân giải bởi một, hai hoặc cả ba enzym protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro thành 10, 11 hoặc 12 chuỗi polypeptit (thành 10 chuỗi polypeptit đối với Kobuvirus và Parechovirus; thành 11 chuỗi polypeptit đối với Enterovirus, Rhinovirus và Hepatovirus, hoặc thành 12 chuỗi polypeptit đối với Aphthovirus, Cardiovirus, Erbovirus, Teschovirus và nhóm PEV-8/SV2/DPV) [40]. Số lượng chuỗi protein được tạo thành phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như sự có mặt hay vắng mặt protein L; số lượng protein 2A và sự phân cắt hay không phân cắt VP0 thành VP4 và VP2. Phần lớn ở các virus trong họ Picornaviridae, VP0 là một loại protein được myristyl hoá (gọi là myristate), tức là được gắn thêm axit béo bão hòa gồm 14 cacbon tại vị trí Glycin theo qui luật (GxxxS/T) thông qua mối liên kết amid, từ đó VP0 có thể tự phân tách thành protein VP4 và VP2. Hầu hết những virus trong họ Picornaviridae đều có một protein 2A, chỉ riêng Ljungan Virus có thể có 2 loại protein 2A [35]. 2.3.2 Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt type I Đây là một Picornavirus nên có hình thái giống với hình thái chung. Là loại virus có kích thước nhỏ, khoảng 20 - 30nm, không có vỏ bọc ngoài, có 32 capxome, hệ gen chứa axit ribonucleic (RNA), sợi đơn dương, có độ dài khoảng 7690 nucleotit, ở đầu cuối 3’có thêm đuôi đuôi poly (A) dài khoảng 18 nucleotit. 2.3.2.1 Thành phần hệ gen Hệ gen chứa khoảng 29% Adenine, 23% Guanine, 21% Cystein và 28% Uracil. Trong đó, hàm lượng G + C chiếm khoảng 44% của hệ gen. DHV-1 chứa duy nhất một khung đọc mở nằm ở vị trí từ nucleotit thứ 625 đến 7375 (Open Reading Frame: ORF), mã hoá cho một chuỗi polypeptit gồm khoảng 2249 axit amin gọi là protein chung [22]. Tất cả các chủng DHV-1 đều có cùng kích thước trong đoạn ORF và đầu cuối 3’UTR, nhưng chủng DRL-62 của DHV-1 thì lại khác, DRL-62 chứa đựng 315 nucleotit ở đầu cuối 3’UTR và có khác biệt về chiều dài đầu 5’UTR [36], [60]. Chuỗi protein chung ngay sau khi được tổng hợp, phải trải qua nhiều lần myristyl hoá, glycosyl hoá và phân cắt để tạo nên các protein sản phẩm độc lập. 2.3.2.2 Cấu tạo hệ gen của virus viêm gan vịt type I (DHV-1) Trình tự hệ gen của virus viêm gan vịt type I đã được xác định với sự cấu tạo đặc trưng của một Picornavirus, gồm có những vùng sau: - Vùng không dịch mã ở đầu 5’ (5’UTR - 5’ Untranslational Region): Là một vùng gen độ dài khoảng 625 nucleotit, không mã hoá nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình sao mã, tăng cường độc lực và tạo khung vỏ capsid. DHV-1 cũng bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà thay vào đó là một protein nhỏ gọi là VPg. Ở đầu 5’ DHV-1 có bộ mã khởi đầu để bắt đầu cho quá trình dịch mã, bộ mã này được đặt ở vị trí nucleotit thứ 627 của hệ gen. Mặt khác, đầu 5’ hệ gen RNA của DHV-1 chứa vùng gen làm vị trí cho ribosome đi vào gọi là IRES [51], được đặt ở trong miền Kozak tối ưu (GxxAUGG) [22], [39], tại vị trí nucleotit thứ 626 và được bao bọc trong một cấu trúc bậc hai [67]. IRES được phân thành 4 loại dựa trên cấu trúc sơ cấp và cấu trúc thứ cấp [19]. Có một yếu tố hoạt động duy trì ở dạng cis nằm ngay cạnh yếu tố IRES là motif Yn-Xm-AUG. Trong đó, Yn là một vùng giàu pyrimidine, Xm là một đoạn dài 15 - 25 nucleotit, theo sau là mã AUG. Trình tự motif Yn-Xm-AUG ở DHV-1 là AUG-CA-AUG [60]. Tại vùng 5’UTR hệ gen có cấu trúc bậc hai tạo ra cấu trúc vòm khép kín (stem - loop). Những Picornavirus type I không có cấu trúc hình “lá sồi” ở đầu 5’UTR, do vậy, đầu 5’UTR của DHV-1 có thể sở hữu một IRES loại II và cũng duy trì một bản sao thứ hai của cấu trúc tetranucleotit GNRA (RNRA2) [60], [62]. - Vùng không dịch mã ở đầu cuối 3’ (3’UTR - 3’ Untranslational Region): Vùng này có độ dài khoảng 315 nucleotit, lớn hơn vùng 3’UTR khác của những Picornavirus có nguồn gốc động vật. Mặt khác, đầu cuối 3’UTR ở DHV-1 có thể tạo ra năm cấu trúc RNA bậc hai, còn đầu cuối 3’UTR của DPV (Duck Picornavirus) chỉ có thể tạo thành 4 cấu trúc RNA bậc hai. Vùng 3’UTR có vai trò trong quá trình nhân lên của những Picornavirus [54]. - Protein L (Leader Protein): Trong họ Picornaviridae, protein L xuất hiện trong 5 chi virus là Teschovirus, Aphthovirus, Erbovirus, Cadiovirus và Kobuvirus. Trong DPV, protein L có chiều dài khoảng 451 axit amin, lớn nhất trong họ Picornaviridae. Có kích thước khoảng 67 axit amin (ở Encephalomyocarditis Virus) đến 219 axit amin (ở Equine Rhinitis B Virus) và sở hữu một motif GxCG có chức năng như enzym protease – trypsin [61]. - Protein 2A: Protein này có 3 phân đoạn protein là protein 2A1, 2A2 và protein 2A3. Đây là một trong những đặc điểm đặc trưng của DHV-1 [62]. - Protein cấu trúc của DHV-1 Có 3 vùng protein cấu trúc gồm protein VP0, VP3 và protein VP1. Trong đó, vùng VP1 có tính ổn định cao và có tính sinh miễn dịch, nằm trên bề mặt ngoài cùng của tất cả các Picornavirus, chứa đựng hầu hết những motif mà có chức năng tương tác với thụ thể của tế bào và kháng thể trung hòa đơn dòng [49]. Trình tự protein VP1 này là khác nhau trong giữa các chi virus [62]. - Protein phi cấu trúc Một số protein phi cấu trúc như protein 2C, 3C và 3D, chứa đựng những motif đặc trưng khác hẳn với những motif trong các protein đã biết ở Picornavirus khác, gồm có motif GxxGxGK (S/T) - kéo dài từ axit amin thứ 145 đến 152 và motif DDLxQ - từ axit amin thứ 192 đến 196 trong protein 2C, những motif này có chức năng như enzym helicase [26], [33]. Motif GxxGxGK (S/T) cũng xuất hiện trong protein 2A2 (GksGsGKS; axit amin thứ 6-13). Trong motif DDLxQ ở protein 2C, Leucin được thay thế bởi Phenyalanin. Ở DHV, motif GxCG được định vị tại axit amin thứ 142 - 145 (GSCG) của protein 3C, còn bộ ba xúc tác thì được đặt tại vị trí H38-D69-C144 trong enzym 3Cpro. Một số motif được bảo tồn đặt trong protein 3Cpol là KDELR, PSG, YGDD và FLKR [33], [40]. Motif YGDD được đặt ở vị trí axit amin thứ 281 - 320 trong protein 3Cpro, còn motif KDELR ở vị trí axit amin 150 - 154 và motif FLKR đặt ở vị trí axit amin thứ 365 - 368. Trong motif PSG, Prolin được thay thế bởi Cystein tại axit amin thứ 280 - 282. Trong hệ gen DHV-1, vùng gen được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là vùng gen mã hoá cho protein VP1, dài khoảng 700 nucleotit. Vùng VP1 gây ảnh hưởng đáng kể đến sự biến đổi về gen; về đặc điểm hình thái và thích hợp cho quá trình phân tích sự phát sinh loài của virus [47], [49]. Vùng gen mã hoá protein VP1 được chứng minh là vùng gen kháng nguyên, quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của virus. Những đột biến trong vùng gen VP1 dễ dẫn đến thay đổi thành phần axit amin và đặc tính gây bệnh của virus, từ đó có thể hình thành ra biến chủng mới. Với sự trợ giúp của phương pháp sinh học phân tử, vùng gen mã hoá cho VP1 được chọn làm đích để phân tích, so sánh, chuẩn đoán các chủng virus cường độc viêm gan vịt, để giúp tìm ra những vùng hay thay đổi và những vùng không thay đổi, tìm hiểu những vùng gen tạo ra các axit amin độc lực. Trên cơ sở các dữ liệu cùng với các phương pháp hiện đại sẽ có thể thay đổi vùng gen không mong muốn của virus, để tạo ra loại vacxin thế hệ mới tốt nhất, tạo điều kiện cho công tác phòng bệnh đạt được kết quả cao. 2.3.3 Sơ lược về phả hệ virus DHV-1 Với sự trợ giúp của các phương pháp sinh học phân tử, hệ gen của một số chủng virus viêm gan vịt type I trên thế giới đã được xác định. Các nghiên cứu cho thấy virus viêm gan vịt là một loại virus thuộc họ Picornaviridae. Trước đây, dựa vào một số đặc tính của chúng mà DHV-1 được xếp vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae [66]. Tuy nhiên, những nghiên cứu trong những năm gần đây đang có nhiều tranh cãi về việc xếp virus này vào chi nào trong họ Picornaviridae cho thích hợp. Năm 2006, toàn bộ trình tự hệ gen (genome) của 2 chủng virus viêm gan vịt DRL-62 và R85952 đã được xác định. Mặc dù virus viêm gan vịt type I trước đây đã được phân loại như một Enterovirus dựa trên những nền tảng cơ bản về hình thái học và những đặc tính hoá lý của hạt virus, nhưng khi so sánh 2 chủng DHV-1 với những virus khác thấy protein 2A1 của 2 chủng DHV-1 này có mối liên hệ với protein 2A của chi Aphthovirus và protein 2A3 giống với protein 2A của Parechovirus. Ngoài ra, các phân tích trình tự hệ gen của DHV-1 cho thấy virus có quan hệ gần gũi với các thành viên của chi Parechovirus hơn là chi Enterovirus. Tuy nhiên, có sự tương đồng thấp giữa chủng DHV-1 với những họ hàng gần của chi Parechovirus, Ljungan Virus và Human Parechovirus. Vì vậy, DHV-1 có thể thuộc về một chi mới trong họ Picornaviridae [36], [37]. Năm 2007, trình tự hệ gen của 3 chủng virus viêm gan vịt type I khác cũng đã được xác định [60], đó là chủng virus phân lập ở Thái Lan (03D), chủng vacxin của Mỹ (5886), chủng vacxin của Anh (H). So sánh sự tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự các cặp axit amin với 2 virus điển hình HPeV- Human Parechovirus và LV-Ljungan Virus thuộc chi Parechovirus để xác định loài và định type cho virus trong cùng một chi. Tiêu chuẩn để xác định các virus thuộc cùng một chi đó là tương đồng về trình tự axit amin khoảng 34 - 35% và có khoảng 44 - 55% sự tương đồng về trình tự nucleotit. Tỷ lệ tương đồng về trình tự các cặp axit amin và nucleotit trong vùng gen VP1 giữa DHV-1 với LV đạt khoảng 23,0 đến 24,6% (axit amin) và khoảng 26,0 đến 28,8% (nucleotit). Tỷ lệ này trong phần VP1 giữa DHV-1 và HPeV là khoảng 23,8 đến 26,7% (axit amin) và khoảng 26,1 đến 31,0% (nucleotit). Trong khi tỷ lệ tương đồng về trình tự axit amin và nucleotit giữa HPeV và LV là khoảng 33,9 đến 39,6% (axit amin) và khoảng 31,3 đến 40,1% (nucleotit). Do đó, DHV-1 không được thừa nhận xếp vào trong cùng một chi chung với HPeV và LV. Ding và Zhang đã đề nghị xếp virus viêm gan vịt vào một chi mới trong họ Picornaviridae (Hình 2.5) [22]. Cũng trong năm 2007, hai chủng virus viêm gan vịt type I đã được xác định, đó là chủng DHV - C80 và chủng vacxin được tiếp truyền trên phôi gà của Trung Quốc. Chủng DHV-C80 có tỷ lệ G+C khoảng 44%, tương đối giống so với những Parechovirus (42% đối với Ljungan Virus) và Teschovirus (45% đối với Porcine Teschovirus 1). Chuỗi protein của DHV-C80 có tỷ lệ tương đồng khoảng từ 11 đến 28% so với 9 chi trong họ Picornaviridae, với Parechovirus tỷ lệ này tương đối cao (khoảng 26 đến 28%). Vì vậy, DHV-1 có thể thuộc một nhóm mới trong họ Picornaviridae, và có quan hệ gần gũi nhất với chi Parechovirus [22]. Nhánh mới được tạo ra đã chia những Picornavirus thành 11 chi. Trong đó, DHV-1 tạo thành một nhánh riêng biệt nằm ở giữa Parechovirus và Hepatovirus trong cây phả hệ. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên sự phân tích trình tự của cả chuỗi polypeptit và trình tự vùng 3Dpol. Theo sơ đồ thì DHV-1 là một nhánh đơn khác biệt với tất cả các chi Picornavirus khác [61]. Hình 2.5 Cây phả hệ thể hiện liên quan của DHV-1 với 24 loại virus thuộc 11 chi trong họ Picornaviridae. Mối quan hệ được xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về axit amin của phức hệ protein [60]. Vị trí của nhóm virus viêm gan vịt (DHV 1) được chỉ dẫn bằng mũi tên. Ngày nay đã có đầy đủ cơ sở dữ liệu gen học cho phép phân DHV-1 vào 3 genotype là A, B và C. Trong đó, genotype A bao gồm tất cả các DHV-1 cổ điển cho đến nay; genotype B và C bao gồm các chủng mới phân lập gần đây (2006 - 2008) ở Đài Loan và Hàn Quốc. Vì có tính biến đổi di truyền cao, đặc biệt là biến đổi ở vùng chứa gen mã hoá protein mang tính kháng nguyên nên quần thể virus viêm gan vịt gây bệnh có nhiều serotype khác nhau, điều này sẽ ảnh hưởng rất lớn tới vấn đề vacxin và miễn dịch [38], [63]. Hiện nay, chưa có một tài liệu nào công bố về sinh học phân tử gen và hệ gen của virus gây bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam. Do vậy, việc nghiên cứu về hệ gen và phân loại virus viêm gan vịt tại Việt Nam là một việc làm hết sức cần thiết nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc phòng trị bệnh ở nước ta đạt được hiệu quả cao nhất. 2.4 MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS VIÊM GAN VỊT Khi đưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba,... Hàm lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2 - 3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm. Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, trước hết cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Tham gia vào cơ chế này có vai trò của da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, đặc biệt là vai trò của các tế bào làm nhiệm vụ thực bào. Sau đó, cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với hoạt động của các cơ quan, tế bào có thẩm quyền miễn dịch, tạo kháng thể đặc hiệu để loại trừ kháng nguyên. Cũng như nhiều bệnh truyền nhiễm khác, miễn dịch chống bệnh viêm gan virus của vịt gồm miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động. 2.4.1 Miễn dịch thụ động Ở gia cầm non, hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện. Ngay từ lúc mới sinh, cơ thể chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu. Trạng thái miễn dịch chỉ có được sau khi cơ thể vịt mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể đặc hiệu cho con non qua lòng đỏ trứng [34]. Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch thụ động của vịt con được nhận từ mẹ đã được nghiên cứu rất nhiều. Việc tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ động tốt cho vịt con. Theo Asplin (1958)[16], dùng virus viêm gan vịt type I nhược độc qua phôi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thời điểm 2 - 4 tuần trước khi lấy trứng đem ấp sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho vịt con. Reuss (1959)[52] cho biết tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ động cho đàn vịt con. Rispens (1969)[53] khuyến cáo người chăn nuôi nên tiêm vacxin hai lần cho đàn vịt giống cách nhau ít nhất 6 tuần. Vịt mẹ sẽ có khả năng truyền kháng thể thụ động cho vịt con trong vòng 6 tháng sau lần tiêm vacxin thứ hai. Ở vịt con, hàm lượng kháng thể thụ động sẽ giảm dần trong hai tuần đầu sau khi nở [59]. Ở vịt mẹ, hàm lượng kháng thể phải đạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động hoặc 1/32 trong phản ứng trung hoà mới có thể bảo hộ cho vịt con khỏi bị mắc bệnh [27]. Ngoài ra, miễn dịch thụ động ở vịt con với bệnh viêm gan vịt còn được tạo ra bằng cách dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh hoặc kháng thể từ lòng đỏ tiêm cho vịt con [53]. 2.4.2 Miễn dịch chủ động Là loại miễn dịch thu được khi con vật bị mắc bệnh nhưng có đủ sức chống lại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có được sau khi tiêm vacxin. Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh đều có miễn dịch chắc chắn với virus của type gây bệnh. Tạo miễn dịch chủ động cho đàn vịt bằng cách sử dụng các loại vacxin nhược độc và vacxin vô hoạt. Vacxin sau khi vào cơ thể sẽ đi đến các cơ quan miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu. Trong kháng thể dịch thể dịch thể chống virus viêm gan vịt type I thì kháng thể 7S nhiều hơn kháng thể 19S (kháng thể 7S mẫn cảm với Cystein, còn 19S lại kháng với Cystein) [45]. Theo Asplin (1970)[18], vịt được tiêm vacxin có thể tạo được miễn dịch chủ động chống lại bệnh. Sử dụng vacxin viêm gan vịt nhược độc tiêm cho vịt lúc 2 - 3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vacxin vô hoạt vào thời điểm 22 tuần tuổi sẽ tạo được lượng lớn kháng thể trung hoà [28]. Trong huyết thanh của vịt khỏi bệnh có kháng thể trung hoà. Ở vịt 2 ngày tuổi, kháng thể trung hoà xuất hiện ở vịt con sau 4 ngày tiêm vacxin nhược độc viêm gan vịt type I [21]. 2.5 CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 2.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym DNA-polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn DNA làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung. Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài từ 6 - 30 nucleotit). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và được enzym DNA-polymerase điều khiển tổng hợp một đoạn DNA đặc thù. Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90oC (92 - 98oC) cho mạch xoắn kép DNA bung ra. Cả hai sợi DNA đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (gọi là oligonucleotide hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi. Trong kĩ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài giới hạn giữa hai đoạn mồi này. Độ dài sản phẩm PCR có thể vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó còn được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn đoạn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kì của phản ứng tính theo lí thuyết sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi [10]. Như vậy, kết quả là một đoạn DNA định trước được nhân lên với số lượng rất lớn. Ví dụ, sau 28 chu kỳ (228) số lượng bản sao DNA của PCR sẽ là: 1.073.741.824. 2.5.2 Phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Kĩ thuật RT-PCR (hay còn gọi là phản ứng PCR ngược) là một phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lí của phản ứng PCR bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi một sợi RNA làm khuôn thành cDNA, sau đó qua giai đoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn để tiếp tục thực hiện phản ứng PCR. RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong đó có Adenine, Guanine, Cytosine, Uracil. Chuỗi nucleotit này phải được chuyển đổi thành DNA hai sợi, mà thành phần Uracil được thay thế bằng Thymine. Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ đến vai trò của enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase - RT). Do vậy, giai đoạn này được gọi là giai đoạn chuyển ngược. Khi đã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR. Do vậy, giai đoạn này gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT-Reverse Transcription). Khi đã có cDNA hai sợi làm khuôn, phản ứng tiếp theo là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai đoạn nói trên được gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngược. Thay đổi nhiệt độ để phù hợp cho mỗi chu kỳ. Có thể sử dụng phản ứng RT-PCR một bước hoặc hai bước. 2.5.3 Kĩ thuật điện di Kĩ thuật điện di trên thạch agarose là hết sức quan trọng đối với người làm kĩ thuật di truyền và sinh học phân tử, đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử axit nucleic ở pH trung tính chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Khi đặt chúng vào một điện trường, các phân tử axit nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch đặc biệt khác, các phân tử axit nucleic tuỳ theo kích thước sẽ dịch chuyển với các tốc độ khác nhau. Loại có phân tử lượng lớn dịch chuyển chậm, loại bé hơn sẽ dịch chuyển nhanh hơn [10]. Có hai loại thạch agarose được sử dụng phổ biến trong kĩ thuật điện di đó là thạch agarose và thạch polyacrylamid. Thạch agarose được dùng để thực hiện điện di trong máy điện di, gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các phân tử axit nucleic có kích thước nhỏ trong các ứng dụng như xác định trình tự DNA. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu axit nucleic có trộn chỉ thị màu xanh Bromphenol vào các lỗ giếng của bản thạch và đặt một điện áp vào đó. Các axit nucleic ở trên thạch thường hiển thị khi nhuộm bằng Ethidium Bromide và được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Các axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh và ghi nhận lại được. Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker). DNA marker thường được dùng nhất là DNA của thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43 kb, được cắt bằng enzym giới hạn HindIII, tạo 8 phân đoạn với các chiều dài bao gồm 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb; 0,125 kb. Nhờ chỉ thị di truyền này mà có thể xác định được độ dài của đoạn axit nucleic cần phân tích [10]. 2.5.4 Nguyên lí tách dòng và lưu giữ nguồn gen Nguyên lí của việc dòng hoá là gắn nối sản phẩm PCR hoặc RT-PCR vào vector tách dòng và chuyển nạp vào tế bào chủ tạo dòng tái tổ hợp. Hình 2.6 Cấu trúc của vector pCR 2.1-TOPO Theo nguyên tắc, một đoạn DNA ngoại lai (sản phẩm của PCR hoặc RT-PCR) sẽ được cài vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được thiết kế sẵn gọi là plasmid mang - vector dẫn truyền (thường dùng vector pCR 2.1-TOPO) tạo thành vector tái tổ hợp (hình 2.6). Sau đó, vector tái tổ hợp này sẽ được chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng, thông thường là tế bào E. coli, để nhân lên với số lượng lớn các bản sao của DNA ngoại lai. Sau khi chuyển nạp, tiến hành chọn lọc tái tổ hợp theo hai cơ chế: Cơ chế X-gal, và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ các vi khuẩn không tái tổ hợp. Tách chiết các khuẩn lạc đơn dòng để thu được lượng DNA tái tổ hợp và kiểm tra xem đoạn DNA ngoại lai có được nối vào vector hay không bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn [10]. 2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu đặc tính phân tử gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt được sử dụng ở Việt Nam Việc lưu giữ hệ gen virus viêm gan vịt nói chung, đặc biệt với gen kháng nguyên VP1 nói riêng, là một việc làm hết sức quan trọng vì đây là những dữ liệu cung cấp thông tin về sự tiến hoá của virus và tương đồng kháng nguyên - miễn dịch giữa các biến chủng của virus viêm gan vịt, kể cả cường độc và vacxin. Với trình tự axit nucleic của vùng gen VP1 được phân lập và lưu giữ sẽ là cơ sở xác lập về dịch tễ học và xác định mối quan hệ về nguồn gốc tiến hoá và so sánh virus viêm gan vịt lưu hành ở Việt Nam và trên thế giới. Mặt khác, do virus viêm gan vịt có khả năng biến đổi, đặc biệt gần đây xuất hiện nhiều biến chủng sai khác di truyền đến mức cần phân biệt nhiều genotype khác nhau là genotype A, B, C [36], [61], [62], [63]. Các chủng thuộc các genotype khác nhau có thể phân biệt được bằng phương pháp PCR/RT-PCR [38]. Vacxin nhược độc viêm gan vịt hiện đang được sử dụng tại Việt Nam là kết quả được tạo ra của quá trình nhược độc hoá virus cường độc viêm gan vịt trên môi trường không cảm thụ. Đây là các chủng vacxin nhập từ nước ngoài vào, hiện đang được sản xuất tại Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương và một chủng khác đang nghiên cứu kiểm chứng. Việc tìm hiểu rõ đặc tính cấu trúc sinh học phân tử của gen VP1 các chủng vacxin này là hết sức cần thiết. Từ dữ liệu sinh học phân tử của chủng vacxin, việc so sánh sự giống và khác nhau của trình tự nucleotit và axit amin với các chủng cường độc của thế giới và của Việt Nam sẽ giúp chúng ta tìm hiểu được vùng gen kháng nguyên VP1 sâu sắc hơn, tạo điều kiện cho công tác phòng chống bệnh đạt được hiệu quả tốt nhất. 2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC Từ khi Levine và Hofstad lần đầu tiên phát hiện ra bệnh viêm gan vịt vào năm 1945, cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh. Trước đây, các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu về đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng - bệnh tích, đặc tính sinh học của virus, chế tạo vacxin… sao cho việc phòng chống bệnh viêm gan vịt đạt hiệu quả cao nhất mà chưa có nghiên cứu sâu sắc về đặc tính sinh học phân tử của hệ gen virus. Gần đây, bệnh viêm gan vịt do virus được nhiều tác giả quan tâm, đặc biệt là virus viêm gan vịt type I (DHV-1). Năm 2007, Tseng và Tsai đã xác định được đầy đủ hoặc gần như đầy đủ hệ gen của 3 chủng virus DHV-1, gồm một chủng được phân lập ngoài tự nhiên ở Đài Loan (là chủng 03D); một chủng vacxin nhược độc của Mỹ (chủng 5886) và một chủng vacxin của nước Anh (chủng H). Cho đến nay (2008), hệ gen của hàng chục chủng virus viêm gan vịt kể cả cường độc cũng như vacxin đã được giải mã và phân tích. Qua phân tích sự tiến hóa và phát sinh loài của DHV-1 thì DHV-1 được phân loại lại vào trong một chi mới trong họ Picornaviridae, tương tự, DHV-2 và DHV-3 được phân loại lại vào trong họ Astroviridae và được đặt tên lại là Duck Astrovirus (chi Astrovirus) [29], [46]. Dựa vào những đặc điểm riêng biệt của hệ gen như: gen VP0 không bị phân cắt; ba protein 2A không liên quan với nhau; sự tương đồng thấp về trình tự axit amin với tất cả những Picornavirus khác và những kết quả của việc phân tích phát sinh loài mà DHV-1 được xếp vào chi Picornavirus tách biệt và được coi là mẫu đầu tiên của một chi mới [61]. Một sự phân tích khác của Ding và Zhang trên chủng DHV-C80 (là một chủng vacxin thích ứng trên phôi gà ở Trung Quốc) cũng đề nghị nên xếp DHV-1 vào một chi riêng biệt trong họ Picornaviridae [22]. Ở nước ta, có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt và đặc tính sinh học virus viêm gan vịt những vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về đặc tính sinh học phân tử của virus viêm gan vịt. Bệnh viêm gan vịt được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1978 khi mà một số giống vịt ngoại được nhập vào nước ta một cách ồ ạt và được nuôi rộng rãi trong dân. Vào thời điểm này, Trần Minh Châu và cs đã ghi nhận bệnh ở Đông Anh - Hà Nội [6], nhưng lúc đó vẫn chưa phân lập được mầm bệnh. Từ năm 1979 đến năm 1983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương và làm chết rất nhiều vịt con [9]. Năm 1983, Trần Minh Châu và cs đã phân lập được một chủng virus cường độc tại một trại nuôi vịt ở Phú Xuyên - Hà Sơn Bình (chủng TT). Khi nuôi cấy virus này trên phôi vịt 12 ngày tuổi, virus gây chết phôi 100%, thời gian chết phôi từ 48 - 96 giờ, phôi có bệnh tích xuất huyết. Virus này được giảm độc lực bằng cách cấy truyền qua 39 đời trên phôi gà và tạo được chủng virus nhược độc (chủng VN) có lgELD50/0,2ml là 4 - 5 [5]. Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu đi, không gây bệnh cho vịt con [14]. Năm 1985, các tác giả Trần Minh Châu, Lê Thị Nông, Nguyễn Đức Tạo đã xây dựng qui trình sản xuất vacxin từ 3 chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược độc: TN (Hungari), E32 (Pháp) và VN (Việt Nam). Cả 3 chủng virus vacxin đều an toàn và có hiệu lực khi sử dụng. Khi miễn dịch cho vịt con rồi thử thách với cường độc thì bảo hộ được 70 - 100% vịt con [4]. Theo Nguyễn Văn Cảm và cs (2001)[3] cho biết, từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2001, qua điều tra 12 ổ dịch ở các địa phương là Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang, đã kết luận đây là những ổ dịch do virus viêm gan vịt gây ra. Ổ dịch có tỷ lệ nhiễm trong đàn lên đến gần 100%, tỷ lệ chết từ 48 - 90%. Theo Nguyễn Đức Lưu và cs (2001)[13], bệnh viêm gan vịt có cơ hội xảy ra nhiều hơn trên các giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta ở các địa phương như Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình, và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây tổn thất rất lớn cho các địa phương này. Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán (2002)[14] cho biết, bệnh viêm gan vịt do virus đã xảy ra ở nhiều nơi, gây thiệt hại nặng nề cho người chăn nuôi ở các tỉnh đồng bằng Nam Bộ. Nguyễn Văn Cảm và cs đã nghiên cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan vịt do virus nhằm đưa ra một phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác [3]. Bùi Thị Cúc, 2002[7] nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể và siêu vi thể bệnh viêm gan vịt do virus cho biết: bệnh tích siêu vi thể điển hình là màng nhân của tế bào gan bị thoái hoá và hoại tử; các glycogen trong tế bào gan bị phá huỷ, đồng thời xuất hiện các tiểu thể hình cầu có bán kính 100 - 300nm. Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng đã nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus nhược độc viêm gan vịt DH - EG - 2000 để có thể sản xuất vacxin phòng bệnh [11]. Đến năm 2007, Bùi Thanh Khiết đã nghiên cứu qui trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc trên và ứng dụng phòng - can thiệp vào thực tế sản xuất [12]. Ở nước ta, tuy có nhiều biện pháp phòng bệnh nhưng hiệu quả phòng bệnh vẫn chưa cao, hiệu quả khi sử dụng vacxin nhược độc và vô hoạt còn nhiều bất cập. Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng tới hiệu quả của việc phòng bệnh bằng vacxin có thể là do những loại vacxin này đơn chủng lại chứa phần kháng nguyên của các chủng nước ngoài nên không phù hợp lắm với những chủng virus tại Việt Nam. Do vậy, để có những loại vacxin có hiệu quả cao, phù hợp với những chủng virus ở nước ta thì cần có yêu cầu đặt ra là phải có những nghiên cứu về sinh học phân tử hệ gen của virus viêm gan vịt ở Việt Nam, để tìm hiểu về cấu trúc hệ gen, đặc biệt là tìm hiểu về cấu trúc của gen kháng nguyên VP1 để từ đó có thể tìm ra biện pháp chữa bệnh tốt nhất phù hợp với chủng virus tại Việt Nam. 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Để đạt được mục tiêu nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên cứu sau: - Xác nhận vùng gen VP1 của virus vacxin nhược độc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương sản xuất (kí hiệu: VxXT), và vacxin nhược độc viêm gan vịt chủng DH-EG của Ai Cập đang kiểm chứng (kí hiệu: VxAC). - Giải trình trình tự vùng gen VP1 của hai chủng virus vacxin nhược độc viêm gan vịt hiện có này ở Việt Nam. - So sánh đối chiếu trình tự nucleotit và trình tự axit amin của hai chủng virus vacxin này với một số chủng virus viêm gan vịt trên thế giới, đặc biệt là so với các chủng ở Châu Á. - Xác định phả hệ nguồn gốc của các chủng virus vacxin hiện có này ở Việt Nam. 3.2 NGUYÊN LIỆU 3.2.1 Giống virus và chuỗi gen VP1 - Chủng virus được dùng làm vacxin viêm gan vịt nhược độc do Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương (Hoài Đức - Hà Tây) sản xuất, ký hiệu là VxXT, ở dạng đông khô phân liều theo tiêu chuẩn. - Chủng vacxin viêm gan vịt nhược độc DH-EG-2000 từ Ai Cập do TS.Nguyễn Bá Hiên (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) cung cấp, ký hiệu là VxAC, ở dạng nước trứn._. gen có tỷ lệ tương đồng nucleotit trong khoảng 90 - 100% để so sánh, đặc biệt là các chủng virus có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc. Danh sách các chủng virus viêm gan vịt sử dụng để so sánh phân tích được chúng tôi liệt kê trong bảng 4.3. Bảng 4.3 Các chủng virus viêm gan vịt sử dụng so sánh STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc Số đăng ký trên Ngân hàng gen 1 DHV-1 VxXT Chủng nghiên cứu đang đăng ký 2 DHV-1 HS Hàn Quốc DQ812094.2 3 DHV-1 DRL-62 Hàn Quốc DQ219396.1 4 DHV-1 C-NMG Trung Quốc EU621873.1 5 DHV-1 Vac Trung Quốc EU395440.1 6 DHV-1 VxAC Chủng nghiên cứu đang đăng ký 7 DHV1vac-SH Trung Quốc EF502171.1 8 DHV1vac-ZJ-A2 Trung Quốc EF502172.1 9 DHV1vac-ZJ-A Trung Quốc AB030521.1 10 DHV1-E53 Trung Quốc EF151313.1 11 DHV1-FS Trung Quốc EU395438.1 12 DHV-1 SY6 Trung Quốc EF407862.1 13 DHV1-ZI07-3 Trung Quốc EF502170.1 14 DHV1-ZJ Trung Quốc EF382778.1 4.6.2 Kết quả đối chiếu so sánh thành phần nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của VxAC và VxXT với các chủng khác trên thế giới Quá trình phân tích và so sánh giữa các chuỗi gen VP1 về thành phần nucleotit và axit amin được thực hiện nhờ chương trình GENEDOC 2.5. Kết quả được trình bày ở hình 4.8 và hình 4.9. Hình 4.8 So sánh trình tự nucleotit gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới. Ghi chú: Dấu chấm (.) biểu thị giống với trình tự nucleotit tương ứng của VP1 của virus viêm gan vịt chủng VxAC. Sự sai khác về nucleotit của các chủng tiếp theo được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng. Hình 4.9 So sánh trình tự axit amin vùng gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới. Ghi chú: Dấu chấm biểu thị sự giống với trình tự axit amin của gen VP1 virus viêm gan vịt chủng VxAC. Sự sai khác về axit amin của các chủng tiếp theo được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng. Sự sai khác về thành phần nucleotit có thể gây ra những hậu quả nhất định cho việc mã hoá axit amin. Với kết quả so sánh trình tự, thành phần nucleotit và axit amin trên hình 4.8 và hình 4.9 cho thấy một sai khác vị trí nucleotit gây hậu quả nghiêm trọng. Đó là sự sai khác xảy ra ở vị trí nucleotit thứ 13 của chủng DHV1 vac ZJ - A2, ở vị trí nucleotit này là Thymidine, trong khi đó nucleotit ở vị trí này của các chủng virus khác là Cytidine. Sự sai khác nucleotit này đã dẫn đến việc mất đi một axit amin ở vị trí thứ 5 trong chuỗi polyprotein tương ứng mà chuỗi gen này mã hoá (hình 4.9). 4.6.2.1 Kết quả so sánh 2 chủng virus vacxin nghiên cứu VxXT và VxAC Khi so sánh thành phần nucleotit và axit amin giữa hai chủng virus vacxin nghiên cứu (VxAC và VxXT) chúng tôi thấy có sự sai khác vị trí nucleotit dẫn đến sự sai khác về axit amin và có những sai khác vị trí nucleotit không dẫn đến sai khác axit amin. Giữa chủng VxXT với chủng VxAC sai khác 29 vị trí nucleotit. Trong đó, có 11 vị trí sai khác nucleotit dẫn đến sự sai khác thành phần axit amin ở 9 vị trí tương ứng trong chuỗi polyprotein của hai chủng nghiên cứu, sự sai khác ở các vị trí nucleotit còn lại không dẫn đến sai khác về thành phần axit amin ở vị trí tương ứng. Kết quả so sánh được chúng tôi liệt kê như sau: - Các vị trí sai khác nucleotit dẫn đến sai khác thành phần axit amin ở các vị trí trong chuỗi polyprotein tương ứng, đó là các vị trí nucleotit thứ 142 (CnA) và 143 (CnT) dẫn đến sai khác vị trí axit amin thứ 48(AnD); vị trí nucleotit thứ 205 (CnT) dẫn đến sai khác vị trí axit amin thứ 69 (LnF); vị trí nucleotit thứ 539 (CnT) dẫn đến vị trí sai khác axit amin thứ 180 (TnI); vị trí nucleotit thứ 541 (TnC) và 542 (CnT) dẫn đến sai khác axit amin vị trí 181 (SnL); vị trí nucleotit thứ 548 (GnA) dẫn đến sai khác vị trí axit amin thứ 183 (RnQ); vị trí nucleotit thứ 558 (TnA) dẫn đến sai khác axit amin ở vị trí thứ 186 (NnK); vị trí nucleotit thứ 563 (CnT) dẫn đến sai khác axit amin thứ 188 (AnV); vị trí nucleotit thứ 655 (CnT) dẫn đến sai khác axit amin thứ 219 (HnY) và vị trí nucleotit thứ 670(TnC) dẫn đến sai khác axit amin ở vị trí thứ 224 (FnL). - Những vị trí sai khác nucleotit không làm thay đổi thành phần axit amin trong chuỗi polyprotein tương ứng ở 2 chủng vacxin nghiên cứu bao gồm các vị trí nucleotit thứ 9 (CnT); 33 (GnA); 45(GnA); 96 (CnT); 160(CnT); 162 (CnG); 201(CnT); 219(CnT); 234 (TnC); 246 (CnT); 282 (CnT); 302 (CnG); 372 (GnA); 387 (GnA); 450(TnC); 528 (TnC); 551 (GnA); và vị trí nucleotit thứ 621 (TnC). 4.6.2.2 Kết quả so sánh chủng virus VxXT với các chủng khác - Sự sai khác về nucleotit giữa chủng VxXT với chủng DHV1-HS là 4/714 nucleotit và sai khác về axit amin là 3/238 axit amin. - Sự sai khác về nucleotit giữa chủng VxXT với chủng DHV1-DRL-62 là 7/714 nucleotit và sai khác về axit amin là 3/238 axit amin - Sự sai khác về nucleotit giữa chủng VxXT với chủng DHV1 C-NMG là 27/714 nucleotit và sai khác về axit amin là 8/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1-Vac có sự sai khác lần lượt là 27/714 nucleotit và 8/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1 SH có sự sai khác lần lượt là 27/714 nucleotit và 8/238 axit amin - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1 vac-ZJ A2 có sự sai khác lần lượt là 49/714 nucleotit và 11/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1 vac-ZJ A có sự sai khác về nucleotit là 45/714 nucleotit và sai khác về axit amin 9/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1-E53 có sự sai khác về nucleotit là 27/714 nucleotit và sai khác 8/238 axit amin. - Sự sai khác về nucleotit giữa chủng VxXT với chủng DHV1-FS là 28/714 nucleotit và sai khác về axit amin là 8/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1-SY6 có sự sai khác về nucleotit và axit amin lần lượt là 57/714 nucleotit và 8/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1-ZI07-3 có sự sai khác về nucleotit là 61/714 nucleotit và sai khác 10/238 axit amin. - Giữa chủng VxXT với chủng DHV1-ZJ có sự sai khác về nucleotit là 31/714 nucleotit và có sai khác 9/238 axit amin. 4.6.2.3 Kết quả so sánh chủng virus VxAC với các chủng khác - Chủng VxAC có sự sai khác về nucleotit và axit amin với chủng DHV1-HS lần lượt là 29/714 nucleotit và 8/238 axit amin. - Chủng VxAC có sự sai khác về nucleotit và axit amin với chủng DHV1-DRL62 lần lượt là 26/714 nucleotit và 8/238 axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1 C-NMG có sự sai khác 4/714 nucleotit và 3/238 axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1 Vac có sự sai khác 2/714 nucleotit và 1/238 axit amin. - Chủng VxAC có sự sai khác về nucleotit và axit amin với chủng DHV1-vac-SH lần lượt là 2/714 nucleotit và 1/238 axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1-vac-ZJ A2 có sự sai khác về nucleotit là 42/714 nucleotit và 12/238 về axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1-vac-ZJ A có sự sai khác về nucleotit là 36/714 nucleotit và axit amin là 10/238 axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1-E53 có sự sai khác về nucleotit là 4/714 nucleotit và 1/238 về axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1-FS có sự sai khác về nucleotit là 3/714 nucleotit và 1/238 về axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1-SY6 có sự sai khác về nucleotit là 52/714 nucleotit và 10/238 về axit amin. - Giữa chủng VxAC với chủng DHV1-ZI07-3 sự sai khác về nucleotit là 55/714 nucleotit và 11/238 về axit amin. - Sự sai khác về nucleotit giữa chủng VxAC với chủng DHV1-ZJ là 8/714 và sai khác về axit amin là 4/238. Như vậy, qua kết quả so sánh ở trên chúng tôi thấy chủng VxXT có sự sai khác lớn (tương đồng thấp) về nucleotit với các chủng DHV1-ZI07-3, DHV1-SY6 và chủng DHV1-vac-ZJ A2, lần lượt là 61, 57 và 49/714 nucleotit. Nhưng chủng VxXT này lại có sự sai khác lớn nhất về axit amin với chủng DHV1-vac-ZJ A2 là 11/238 axit amin, tiếp đó là 10/238 axit amin so với chủng DHV1-ZI07-3. Ngược lại, chủng VxXT lại có sự sai khác thấp về nucleotit so với các chủng DHV1-HS và DHV1-DRL62, lần lượt là 4/714 và 7/714 nucleotit. Sự sai khác vủa chủng VxXT về axit amin so với 2 chủng này thấp nhất, đều là 3/238 axit amin. Do đó, chủng VxXT có quan hệ xa (không gần gũi) với các chủng DHV1-ZI07-3, DHV1-SY6 và chủng DHV1-vac-ZJ A2, nhưng lại có quan hệ gần gũi với 2 chủng là DHV1-HS và DHV1-DRL62. Với chủng VxAC, sự sai khác nucleotit cao nhất là với chủng DHV1-ZI07-3 là 55/714 nucleotit, sau đó với chủng DHV1-SY6 là 52/714 nucleotit, tiếp đó là với chủng DHV1-vac-ZJ A2 có 42/714 nucleotit. Nhưng về axit amin, chủng VxAC lại có sự sai khác lớn so với chủng DHV1-vac-ZJ A2 là 12/238 axit amin, tiếp đó với chủng DHV1-ZI07-3 là 11/238 và 10/238 axit amin so với chủng DHV1-SY6. Kết quả này giống với kết quả của chủng VxXT. Ngược lại, chủng VxAC có sự sai khác thấp về nucleotit và axit amin so với các chủng DHV1 Vac và chủng DHV1-vac-SH, sai khác lần lượt là 2/714 nucleotit và 1/238 axit amin. Như vậy, chủng VxAC coa quan hệ gần gũi với 2 chủng DHV1 Vac và DHV1-vac-SH, nhưng lại có quan hệ xa với các chủng DHV1-ZI07-3, DHV1-SY6 và chủng DHV1-vac-ZJ A2. Vì vùng gen VP1 là vùng gen kháng nguyên, vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định tính độc lực của virus nên chỉ cần sai khác một hoặc một vài axit amin thì cũng làm thay đổi tính kháng nguyên và tính độc lực của virus. Vậy những thay đổi thành phần axit amin kể trên trong chuỗi polyprotein liệu có ảnh hưởng đến tính kháng nguyên và tính độc lực của hai chủng virus vacxin nghiên cứu hay không, đó là điều cần phải xem xét và cần được nghiên cứu sâu hơn. 4.7 TỶ LỆ TƯƠNG ĐỒNG NUCLEOTIT VÀ AXIT AMIN GIỮA CÁC CHỦNG NGHIÊN CỨU Sau khi tiến hành so sánh thành phần nucleotit của gen VP1 và so sánh axit amin tương ứng giữa các chủng virus, chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ phần trăm mức độ tương đồng về thành phần nucleotit và axit amin. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 4.4. Qua bảng 4.4 cho thấy: chủng VxXT có tỷ lệ phần trăm mức độ tương đồng cao với hai chủng DHV1 DRL62 và chủng DHV1-HS, đều là 99% so về nucleotit và đạt mức độ tương đồng 98% về axit amin. Ngược lại, chủng VxXT lại có mức độ tương đồng thấp về nucleotit với các chủng DHV1 ZJ-07-3 và chủng DHV1-SY6 lần lượt là 91 và 92%. Chủng VxXT có tỷ lệ tương đồng thấp về axit amin so với chủng DHV1-vac-ZJ A2, chỉ đạt 93%. Kết quả này cho thấy chủng VxXT có chung nguồn gốc với hai chủng DHV1 DRL62 và chủng DHV1-HS của Hàn Quốc. Nói cách khác thì chủng VxXT cung cấp nguồn gen VP1 có thể có nguồn gốc từ các chủng virus vacxin của Hàn Quốc. Bảng 4.4 So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotit (trên đường chéo) và axit amin (dưới đường chéo) của hai chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng trên thế giới thuộc DHV-1. Bảng 4.4 cũng cho biết thành phần nucleotit và axit amin của chủng VxAC có tỷ lệ tương đồng cao với các chủng có nguồn gốc Trung Quốc là DHV1 C-NMG, DHV1-Vac, DHV-1-vac-SH, DHV-1 E53 và DHV1- FS, đều đạt 99% về nucleotit. Đối với tỷ lệ thành phần axit amin thì chủng VxAC có mức độ tương đồng đạt 99% so với 4 chủng là DHV1-Vac, DHV-1-vac-SH, DHV-1 E53 và DHV1- FS, nhưng mức độ tương đồng chỉ đạt 98% so với chủng DHV1 C-NMG. Mặt khác, chủng VxAC có mức độ tương đồng thấp đều đạt 92% về nucleotit so với 2 chủng là DHV1-ZJ07-03 và DHV1-SY6. Mức độ tương đồng chỉ đạt 93% về axit amin so với chủng DHV1-vac-ZJ-A2, kết quả này giống với kết quả so sánh của chủng VxXT. Từ kết quả này cho thấy chủng VxAC có chung nguồn gốc với các chủng virus kể trên của Trung Quốc, hay chủng VxAC có chứa virus nhược độc viêm gan vịt cung cấp nguồn gen VP1 có thể có nguồn gốc được xuất phát từ các chủng virus vacxin viêm gan vịt của Trung Quốc. Giữa hai chủng virus vacxin nghiên cứu (VxXT và VxAC) chỉ đạt mức độ tương đồng là 95% cả về trình tự nucleotit cũng như trình tự axit amin. Do vậy, hai chủng này không có mối quan hệ gần gũi với nhau. 4.8 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ PHẢ HỆ GIỮA HAI CHỦNG VIRUS NGHIÊN CỨU (VxAC VÀ VxXT) VỚI MỘT SỐ CHỦNG KHÁC Từ kết quả so sánh thành phần nucleotit và axit amin giữa các chủng virus nghiên cứu, chúng tôi sử dụng chương trình MEGA3.1 để tiến hành lập sơ đồ phả hệ của 2 chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng trên thế giới (đã được liệt kê trong bảng 4.3), dựa trên sự phân tích và so sánh chuỗi gen VP1. Kết quả được trình bày ở hình 4.10 và 4.11. Hình 4.10 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần nucleotit. Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ. Qua hình 4.10 và 4.11 cho thấy: hai chủng virus VxAC và chủng VxXT đều cùng một nhóm với các chủng virus của Châu Á, cụ thể là của Trung Quốc và Hàn Quốc, nhưng hai chủng này đã tách thành 2 nhánh riêng biệt so cả về thành phần nucleotit cũng như thành phần axit amin (hình 4.10 và 4.11). Chủng VxAC có mối quan hệ gần gũi hơn so cả về nucleotit và axit amin với các chủng của Trung Quốc và chủng VxXT lại có quan hệ gần gũi hơn với các chủng có nguồn gốc từ Hàn Quốc. Cụ thể, trên cây phả hệ về nucleotit có các chủng virus VxAC, chủng DHV1 C-NMG, chủng DHV1-Vac, chủng DHV1vac-SH, chủng DHV-1 E53, DHV1-FS và chủng DHV1-ZJ lập thành một nhóm có quan hệ gần gũi nhau, còn chủng VxXT thì tách biệt ra xa hơn. Chủng VxXT cùng với hai chủng khác có nguồn gốc từ Hàn Quốc là DHV1-HS và DHV1-DRL62 lập thành một nhóm riêng. Nói cách khác, chủng VxXT có mối quan hệ gần gũi với 2 chủng virus có nguồn gốc từ Hàn Quốc. Do đó, chúng tôi kết luận rằng chủng VxXT bắt nguồn từ Hàn Quốc, còn chủng VxAC được bắt nguồn từ Trung Quốc. Hình 4.11 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần amino acid. Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ. Khi so sánh trên cây phả hệ axit amin, chúng tôi thấy có sự thay đổi vị trí giữa các chủng virus. Chủng VxXT vẫn nằm trong cùng một nhóm với 2 chủng virus có nguồn gốc từ Hàn Quốc, nhưng hai chủng virus viêm gan vịt của Hàn Quốc được xếp lại gần nhau hơn, còn chủng VxXT không có mối quan hệ gần gũi như trước (so với vị trí trong cây phả hệ về nucleotit) (hình 4.11). Đối với chủng VxAC, chủng virus này được vẫn được xếp cùng nhóm với các chủng virus có nguồn từ Trung Quốc là chủng DHV1-Vac, chủng DHV1vac-SH, chủng DHV-1 E53, DHV1-FS và chủng DHV1-ZJ. Riêng chủng DHV1 C-NMG đã bị tách ra xa, không còn có quan hệ gẫn gũi với các chủng trong nhóm như ở trong cây phả hệ về nucleotit. Như vậy, không có sự thay đổi về vị trí của chủng VxAC và VxXT. Tuy hai chủng virus nghiên cứu vẫn nằm cách xa nhau nhưng quan hệ họ hàng giữa chúng bị đẩy ra xa hơn và tách thành 2 nhóm riêng biệt. Kết quả này phù hợp với kết quả so sánh tỷ lệ tương đồng về nucleotit và tỷ lệ tương đồng về axit amin ở trên. Hiện nay, ở nước ta vẫn chưa có công bố về giải mã gen hay hệ gen về chủng virus cường độc viêm gan vịt đang lưu hành. Vì vậy, việc xem xét mức độ tương đồng giữa các chủng viêm gan vịt đang có ở Việt Nam (chủng vacxin và chủng cường độc) là rất cần thiết. Giải mã thành công vùng gen VP1 của hai chủng vacxin sẽ tạo cơ sở dữ liệu sinh học phân tử cho những nghiên cứu tiếp theo về các chủng virus gây bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam. 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu giải mã và phân tích đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của hai chủng virus viêm gan vịt VxAC và VxXT, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Với cặp mồi DH3F và DH4R, vùng gen VP1 của hai chủng virus vacxin đã được thu nhận thành công bằng phản ứng RT-PCR, cung cấp nguồn gen cho việc nghiên cứu vacxin viêm gan vịt đang được sử dụng tại Việt Nam. 2. Quá trình dòng hoá được thực hiện thành công để đưa đoạn gen VP1 vào lưu giữ trong vector tách dòng, tạo nguyên liệu giải mã vùng gen VP1 của hai chủng virus vacxin VxXT và VxAC. 3. Vùng gen VP1 của hai chủng virus vacxin nghiên cứu (VxXT và VxAC) được giải trình trình tự thành công về trình tự chuỗi nucleotit và trình tự chuỗi axit amin tương ứng. 4. Giữa hai chủng VxXT và VxAC có mức độ tương đồng không cao, chỉ đạt 95% cả về trình tự nucleotit và trình tự axit amin. 5. Chủng VxXT có mức độ tương đồng cao và có quan hệ gần gũi với các chủng của Hàn Quốc nên chủng này được phán đoán có nguồn gốc từ Hàn Quốc. Với chủng VxAC có độ tương đồng cao với các chủng có nguồn gốc từ Trung Quốc nên chủng này có nguồn gốc từ Trung Quốc. 6. Sự thành công trong việc giải mã vùng gen VP1 của hai chủng virus VxXT và VxAC bước đầu đã xây dựng được cơ sở dữ liệu về gen/hệ gen về virus viêm gan vịt ở Việt Nam. 5.2 KIẾN NGHỊ Với mức độ nguy hiểm của bệnh đối với ngành chăn nuôi nói chung, chúng tôi có kiến nghị như sau: Cần nghiên cứu và giải mã gen/hệ gen của một số chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập ở Việt Nam. Từ đó lập phả hệ xem xét mối quan hệ giữa các chủng virus cường độc và virus vacxin có mặt ở Việt Nam, tạo điều kiện cho công tác phòng chống bệnh đạt hiệu quả tốt nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Xuân Bình (1995), 109 bệnh gia cầm, NXB Long An. Nguyễn Xuân Bình (2002), Bệnh của vịt và biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001), Nghiên cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt, Khoa học và kỹ thuật Thú y, 8(4), Hội thú y Việt Nam, tr. 48-51. Trần Minh Châu, Lê Thị Nồng, Nguyễn Đức Tạo (1985), Thăm dò chế tạo vacxin viêm gan vịt và sử dụng, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y (1985 - 1989), Viện Thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 41-45. Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng (1985), Thăm dò tạo chủng vacxin nhược độc viêm gan vịt bằng chủng phân lập tại địa phương, Khoa học và kỹ thuật Thú y, (4), tr. 3-8. Lê Minh Chí, Hồ Đình Chúc, Bùi Quý Huy (1999), Kết quả điều tra dịch bệnh gia súc, gia cầm 5 tỉnh phía Bắc (1995 - 1997), Khoa học và kỹ thuật Thú y, 6(3), Hội thú y Việt Nam, tr. 75-78. Bùi Thị Cúc (2002), Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể và siêu vi thể bệnh viêm gan siêu vi trùng vịt, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Viện khoa học kỹ thuật Việt Nam. Nguyễn Đường, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Lộc, Nguyễn Bá Hiên (1990), Vi sinh vật học đại cương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984), Đặc tính sinh học của giống virus vacxin viêm gan vịt chủng TN của Asplin và vacxin phòng bệnh ở Việt Nam, Khoa học và kỹ thuật Thú y, 2, (1-1985), tr. 21-25. Lê Thanh Hoà (2002), Sinh học phân tử: nguyên lý và ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 104 trang. Nguyễn Phục Hưng (2004), Tình hình mắc bệnh viêm gan vịt do virus ở một số tỉnh đồng bằng Bắc bộ, phân lập virus gây bệnh, Nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000 và qui trình sản xuất vacxin, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. Bùi Thanh Khiết (2007), Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH-EG-2000 và ứng dụng phòng, can thiệp dịch váo thực tế sản xuất, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. Nguyễn Đức Lưu, Lương Tất Nhợ, Hoàng Văn Tiêu, Nguyễn Hữu Vũ (2001), Nuôi ngan vịt và các bệnh thường gặp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán (2002), Bệnh viêm gan virus vịt, Khoa học và kỹ thuật Thú y, 9(1), Hội Thú y Việt Nam, tr. 87-90. Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ Đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, Đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. B. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Asplin F.D (1958), An attenuated strain of duck hepatitis virus, Vet Rec 70, pp. 1226-1230. Asplin F.D (1961), Notes on epidemiology and vaccination for virus hepatitis of ducks, Off. Int. Epizoot Bull 56, pp. 793- 800. Asplin F.D (1970), Examination of sera from wild fowl for antibodies against the viruses of duck plague duck hepatitis and duck influenza, Vet Rec 87, pp. 182-183. Chard L.S, Bordelea M.E, Pelletier J, Tanaka J, Belsham G.J (2006), Hepatitis C virus related internal ribosome entry sites are found in multiple genera of the family Picornaviridae, Virol 87, pp. 927–936. Cheney I.W, Naim S, Shim J.H, Reinhardt M, Pai B, Wu J.Z, Hong Z, Zhong W (2003), Viability of poliovirus/rhinovirus VPg chimeric viruses and identification of an amino acid residue in the VPg gene critical for viral RNA replication, Virol 77, pp. 7434–7443. Davis D and Hannant D (1987), Fractionation of neutralizing antibodies in serum of ducklings vaccinated with live duck hepatitis virus vaccine, Res Vet Sci 43, pp. 276- 277. Ding C and Zhang D (2007), Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1, Virology 361, pp. 9-17. Fabricant J, Rickard C.G and Levine P.P (1957), The pathology of duck virus hepatitis, Avian Diseases, pp. 256-275. Fabricant J and Levine P.P (2002), Duck virus hepatitis, Diseases of Poultry, (9th Ed), Lowa State University Press, Ames, Lowa, U.S.A. Farmer F, Chalmers W.S.K and Woolcock P.R (1987), The duck fatty kidney syndrome an aspect of duck viral hepatitis, Avian Pathology 2, pp. 227-236. Ghazi F, Hughes P.J, Hyypiä T and Stanway G (1998), Molecular analysis of human pacherovirus type 2 (formerly echovirus 23), Virol 79, pp. 2641-2650. Golubnichi V.P and Malinovskaya G.V (1984), Dynamics of postvaccinal antibodies in blood serum against duck hepatitis virus, Vet Nauk Proiz (Minsk) 22, pp. 72- 75. Gough R.E and Spackman D (1981), Studies with inactivated duck virus hepatitis vaccines in breeder ducks, Avian Pathol 10, pp. 471-479. Gough R.E, Borland E.D, Keymer I.F and Stuart J.C (1985), An outbreak of duck hepatitis type II in commercial ducks, Avian Pathol 14, pp. 227-236. Haider S.A and Calnek B.W (1979), In vitro isolation, propagation, and characterization of duck hepatitis virus type III, Avian Dis 23, pp. 715-729. Haider S.A (1980), Ducks virus hepatitis. In Hichner S.B., Domemuth C.H., Purchse H.G and Williams J.E (eds), Isolation and Indentification of avian Pathogens, 2nd Ed, Pp. 75-76. Hwang J (1966), Duck hepatitis virus in duck embryo liver cell culture, Avian dis, pp. 508-512. Itol M, Yamashita T, Tsuzuki H, Takeda N and Sakae K (2004), Isolation and indentification of a novel human pacherovirus, Virol 76, pp. 8920-8930. Jenkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007), Avian genomics and the innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp. 207-12. Johansson S, Niklasson B, Tesh R.B, Shafren D.R, Travassos da Rosa A.A and Lindberg A.M (2003), Molecular characterization of M 1146, an American isolate of Ljungan virus (LV) reveals the presence of a new LV genotype, Virol 84, pp. 837–844. Kim M.C, Kwon Y.K, Joh S.J, Lindberg A.M, Kwon J.H, Kim J.H and Kim S.J (2006), Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel lineage close to the genus Parechovirus in the family Picornaviridae, Virol 87, pp. 3307-3316. Kim M.C, Kwon Y.K, Joh S.J, Kim S.J, Tolf C, Kim J.H, Sung H.W, Lindberg A.M and Kwon J.H (2007), Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new genome and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains, Arch Virol 152, pp. 2059-72. Kim M.C, Kwon Y.K, Joh S.J, Kwon J.H and Lindberg A.M (2008), Differential diagnosis between type specific duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) and recent Korean DHV-1 like isolates using a multiplex polymerase chain reaction, Avian Pathol 37, pp. 7-171. Kozak M (1986), Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by Eukaryotic ribosomes, Cell 44, pp. 283-292. Krumbholz A, Dauber M, Henke A, Hirschfeld E, Knowles N.J, Stelzner A and Zell R (2002), Sequencing of porcine enterovirus groups II and III reveals unique features of both virus groups, Virol 76, pp. 5813–5821. Kumar S, Tamura K, Jakobsen I.B and Nei M (2001), Molecular evolutionary genetics analysis software, Arizona State University, Tempe, Arizona, USA. Levine P.P and Hofstad M.S (1945), Duck disease investigation, Annu Rep New York State Vet Coll, Ithaca Vet 40, pp. 71-86. Levine P.P and Fabricant J (1950), Virus disease of ducks in North America, Cornell Vet 40, pp. 71- 86. Maiboroda A.D (1972), Formation of ducks hepatitis virus in culture cells, Veterinariya (8), pp. 50- 52. Malinovskaya G.V (1982), Formation of 19s and 7s antibodies during imimunogenesis and pathogenesis of duck viral hepatitis, Vet Nauk Proiz (Minsk) 19, pp. 68- 70. Monroe S.S, Carter M.J, Herrmann J, Mitchel D.K and Fauquier A (2005), Family Astroviridae, In: Fauquet C.M, Mayo M.A, Maliloff J, Desselberger U, Ball L.A (Eds), Virus Taxonomy - Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elservier/Academic Press, London, pp. 859-864. Mulders M.N, Salminen M, Kalkkinen N and Hovi T (2000), Molecular epidemiology of coxsackievirus B4 and disclosure of the correct VP1/2A pro cleavage site: evidence for high genomic diversity and long-term endemicity of distinct genotypes, Virol 81, pp. 803–812. Nicholas K.B and Nicholas H.B (1999), GenDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Distributed by author. Oberste M.S, Maher K, Kennett M.L, Campbell J.J, Carpenter M.S, Schnurr D and Pallansch M.A (1999), Molecular epidemiology and genetic diversity of echovirus type 30 (E30): genotypes correlate with temporal dynamics of E30 isolation, J Clin Microbiol 37, pp. 3928–3933. Priz N.N (1973), Comparative study of virus hepatitis in animals (dogs and ducks) using different routes of influence, Vopr Virusol 6, pp. 696-700. Racaniello V.R (2001), Picornaviridae: the viruses and their replication, Fields Virology, pp. 685–722. Reuss U (1959), Versuche zur aktiven und passiven Immunisierung bei der Virus hepatitis der Entenkuken, Zentrabl Veterinaermed 6, pp. 808- 815. Rispens B.H (1969), Some aspects of control of infectious hepatitis in ducklings, Avian Dis 13, pp. 417-426. Rohll J.B, Moon D.H, Evans D.J and Almond J.W (1995), The 3’ untranslated region of Picornavirus RNA: features required for efficient genome replication, Virol 69, pp. 7835-7844. Sandhu T (1988), Personal communication. Shalaby M.A, Ayoub M.N.K and Reda I.M (1978), A study on a new isolate of ducks hepatitis virus and its relationship to other duck hepatitis virus strains, Vet Med j, Cairo Univ 26, pp. 215- 221. Stanway G, Brown F, Christian P, Hovi T, Hyypiä T, King A.M.Q, Knowles N.J, Lemon S.M, Minor P.D, Pallansch M.A, Palmenberg A.C and Skern T (2005), Family Picornaviridae, In: Fauquet C.M, Mayo MA., Maniloff J, Desselberger U, Ball L.A (Eds), Virus Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier/Academic Press, London, pp. 757–778. Toth T.E (1969), Studies of an agent causing mortality among ducklings immune to duck virus hepatitis, Avian Dis 13, pp. 535-539. Tripathy D.N and Hanson L.E (1986), Impact of oral immunization against duck viral hepatitis in passively immune ducklings, Prevent Vet Med 4, pp. 355-360. Tseng C.H, Knowles N.J and Tsai H.J (2007), Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus, Virus Res 123, pp. 190-203. Tseng C.H and Tsai H.J (2007), Sequence analysis of a duck picornavirus isolate indicates that it together with porcine enterovirus type 8 and simian picornavirus type 2 should be assigned to a new picornavirus genus, Virus Res 129, pp. 1-104. Tseng C.H and Tsai H.J (2007), Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus, Virus Res 126, pp. 19-31. Wang L, Pan M, Fu Y and Zhang D (2008), Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis, Virus Genes. Woolcock P.R and Fabricant J (1997), Duck hepatitis, In Diseases of Poultry, 10th Ed, Calnek B.W., BRNAes H.J., Beard C.W., McDougald L.R and Saif Y.M., eds, Iowa State University Press, Ames, Iowa, U.S.A, pp. 661- 673. Woolcock P.R (1998), Duck hepatitis, In a laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens, 4th Ed, American Association of Avian Pathologists, Kennet Squares, Pennsylvaria U.S.A, pp. 200-204. Woolcock P.R (2003), Duck hepatitis, Diseases of Poultry, 11th Ed, Iowa State Press, Ames, IA, pp. 343-354. Zuker M (2003), M fold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucleic Acids Res 31, pp. 3406–3415. Trang Web tham khảo PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng mã di truyền sử dụng cho virus The Bacterial Genetic Code (NCBI translation table 11) TTTTTCTTATTG F PheF PheL LeuL Leu TCTTCCTCATCG S SerS SerS SerS Ser TATTACTAATAG Y TyrY Tyr* STOP* STOP TGTTGCTGATGG C CysC Cys* STOPW Trp CTTCTCCTACTG L LeuL LeuL LeuL Leu CCTCCCCCACCG P ProP ProP ProP Pro CATCACCAACAG H HisH HisQ GlnQ Gln CGTCGCCGACGG R ArgR ArgR ArgR Arg ATT ATC ATA ATG I IleI IleI IleM Met ACTACCACAACG T ThrT ThrT ThrT Thr AATAACAAAAAG N AsnN AsnK LysK Lys AGTAGCAGAAGG S SerS SerR ArgR Arg GTTGTCGTAGTG V ValV ValV ValV Val GCTGCCGCAGCG A AlaA AlaA AlaA Ala GATGACGAAGAG D AspD AspE GluE Glu GGTGGCGGAGGG G GlyG GlyG GlyG Gly XXX: Potential initiation codon (always encodes fMet). TAA, TAG, TGA: Termination codon. Phụ lục 2: Ký hiệu quốc tế theo cặp hoặc bộ ba của các nucleotide (The DNA degenerate alphabet) A Adenosine R = A or G PuRin B = C, G or T not A C Cytidine Y = C or T PYrimidine D = A, G or T not C G Guanosine H = A, C or T not G T Thymidine N = A, C, G or T (aNy) V = A, C or G not T K = G or T Keto (in large groove) S = G or C Strong (3 H bonds) M = A or C aMino (in large groove) W = A or T Weak (2 H bonds) Phụ lục 3: Bảng ký hiệu 20 axit amin thông thường Glycin G Gly Asparagin N Asn Alanin A Ala Glutamin Q Glu Valin V Val Phenylalanin F Phe Leucin L Leu Tyrosin Y Tyr Isoleucin I Ile Tryptophan W Trp Prolin P Pro Aspartat D Asp Serin S Ser Glutamat E Glu Threonin T Thr Lysin K Lys Cystein C Cys Arginin R Arg Methionin M Met Histidin H His ._.