Vai trò của Auxin trong sự phát sinh hình thái rễ bắt định In Vitro từ khúc cắt thân cây đậu Vigna Angularis (Willd.) Ohwi Et Ohashi

OHWI ET OHASHI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT TS. LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn sinh lí thực vật của trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Đại học Sư phạm- Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn và giúp đỡ của Quý Thầy Cô. Để hoàn thành luận văn này, em chân thành gởi lời cảm ơn đến: Thầy hướng dẫn PGS. TS. Bùi Trang Việt đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm luận văn. Cô hướng dẫn TS. Lê Thị Trung đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cũng như tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện các thí nghiệm cho luận văn. Em xin chân thành cảm ơn cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Trần Thị Thanh Thủy, cô TS. Trần Thị Cúc, cô TS. Nguyễn Thị Mong, thầy TS. Phạm Văn Ngọt, thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ đã giảng dạy trong suốt thời gian em học tập tại trường. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô ở Bộ môn sinh lí thực vật trường ĐHKHTN: cô TS. Trần Thanh Hương, Thầy ThS. Phan Ngô Hoang, cô ThS. Trịnh Thị Cẩm Tú, cô ThS. Trần Thanh Hiền và em Hồ Thị Mỹ Linh quản lí phòng thí nghiệm trường ĐHSP đã cho em mượn dụng cụ và hóa chất để thực hiện thí nghiệm. Cảm ơn BGH trường THPT Nguyễn Văn Linh dã giúp đỡ để tôi có thời gian hoàn thành chương trình học. Xin gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp sinh học thực nghiệm khóa 19, khóa 20, các bạn bè đồng nghiệp và các em sinh viên ở phòng bộ môn sinh lí thực vật. Cuối cùng, con xin nói lời cảm ơn vô hạn với bố mẹ, người đã cố gắng nuôi dưỡng và dạy dỗ để con có thể được học tập và trưởng thành. Chị và Nhiên ơi cho em bày tỏ lòng biết ơn tới hai người nhé, đã có những hi sinh nhất định để em có thể thực hiện ước mơ làm cô giáo. Cảm ơn bé Trinh đã nấu cơm cho chị trong suốt năm qua. Cảm ơn anh luôn ở bên em, yêu thương và chia sẽ với em trong cuộc sống. Tp. HCM, tháng 8 năm 2011 Nguyễn Hồ Dịu Thắm MỤC LỤC 4TLỜI CẢM ƠN4T ...................................................................................................................... 3 4TMỤC LỤC4T ............................................................................................................................ 4 4TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT4T .................................................................................. 7 4TLỜI MỞ ĐẦU4T ...................................................................................................................... 1 4TCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU4T ............................................................................. 2 4T1. 1. Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4T .............................................................. 2 4T1. 1.1. Phân loại4T ................................................................................................................................... 2 4T1. 1. 2. Đặc điểm sinh học4T .................................................................................................................... 2 4T1. 1. 3. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới4T............................................................. 4 4T1. 1. 4. Thành phần hóa học4T ................................................................................................................. 4 4T1. 1. 5. Giá trị thực phẩm và giá trị dược liệu4T ....................................................................................... 4 4T1. 1. 6. Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi4T ................................................... 5 4T1.2. Sự phát sinh hình thái4T ........................................................................................................................ 6 4T1. 2. 1. Định nghĩa 4T ............................................................................................................................... 6 4T1. 2. 2. Phương pháp nghiên cứu4T .......................................................................................................... 6 4T1. 2. 3. Sự phát sinh rễ4T ......................................................................................................................... 7 4T1. 3. Vai trò các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái4T ....................................... 9 4T1. 3. 1. Vai trò của auxin trong sự tăng trưởng thực vật 4T ....................................................................... 9 4T1. 3. 1. 1. Sinh tổng hợp và vận chuyển auxin4T .................................................................................. 9 4T1. 3. 1. 2. Auxin trong sự phát triển rễ4T .......................................................................................... 10 4T1. 3. 1. 3. Auxin trong sự sinh trưởng, phân chia và phân hóa tế bào 4T.............................................. 11 4T1. 3. 2. Vai trò của giberelin trong sự tăng trưởng thực vật 4T ................................................................ 11 4T1. 3. 2. 1. Sự phát hiện4T ................................................................................................................... 11 4T1. 3. 2. 2. Nơi tổng hợp và di chuyển4T ............................................................................................. 12 4T1. 3. 2. 3. Tác dụng sinh lí4T ............................................................................................................. 12 4T1. 3. 3. Vai trò của Citokinin trong sự tăng trưởng thực vật 4T .............................................................. 13 4T1. 3. 3. 1. Sự phát hiện4T ................................................................................................................... 13 4T1. 3. 3. 2. Nơi tổng hợp4T ................................................................................................................. 13 4T1. 3. 3. 3. Tác dụng sinh lí4T ............................................................................................................. 13 4T1. 3. 4. Vai trò của axit abcisic (AAB)4T ............................................................................................... 14 4T1. 3. 5. Vai trò của Etilen4T ................................................................................................................... 15 4TCHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP4T .................................................................... 16 4T2.1. Vật liệu4T ........................................................................................................................................... 16 4T2. 2. Phương pháp4T .................................................................................................................................. 16 4T2. 2. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 16 4T2. 2. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro4T .............................................................................................. 17 4T2. 2. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ......................... 17 4T2. 2. 4. Khảo sát ảnh hưởng của auxin trong sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis4T........................................................................................................................... 17 4T2. 2. 5. Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis4T ................................................................................................................................. 18 4T2. 2. 6. Ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ cao lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis4T ...................................................................................................... 18 4T2. 2. 7. Khảo sát sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin4T ........................................................................................................................................... 19 4T2. 2. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4T .................................... 19 4T2. 2. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây Vigna angularis 7 ngày tuổi4T .......................................................................................................................................................... 19 4T2. 2. 10. Đo cường độ hô hấp4T ............................................................................................................. 19 4T2. 2. 11. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 4T ............................................................. 19 4T2. 2. 12. Xử lý thống kết quả thu được4T ............................................................................................... 20 4TCHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN4T ......................................................................... 21 4T3.1. Kết quả4T ............................................................................................................................................ 21 4T3. 1. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 21 4T3. 1. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro4T .............................................................................................. 21 4T3. 1. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên chiều cao và khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ..... 23 4T3. 1. 4. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis4T........................................................................................................................... 25 4T3. 1. 5. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi.4T .............................................................................................................. 30 4T3. 1. 6. Ảnh hưởng của auxin ở nồng độ cao lên sự phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi.4T .............................................................................................................. 35 4T3. 1. 7. Khảo sát sự hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis 7 ngày tuổi theo thời gian dưới ảnh hưởng của cùng nồng độ auxin.4T ..................................................................... 37 4T3. 1. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp4T .................................... 38 4T3. 1. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây đậu Vigna angularis4T .......... 39 4T3. 1. 10. Sự thay đổi cường độ hô hấp và chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp ở cây Vigna angularis4T ............................................................ 40 4T3. 2. Thảo luận4T ....................................................................................................................................... 41 4T3. 2. 1. Khử trùng mẫu4T ....................................................................................................................... 41 4T3. 2. 2. Ảnh hưởng của AIA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro4T ...................................... 41 4T3. 2. 3. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn hình thành và phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp4T ....................................................................................................................................... 42 4T3. 2. 4. Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin 5mg/l4T ................................................................................................................................................. 44 4T3. 2. 5. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin4T ............................................................................... 44 4T3. 2. 6. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao cây và diện tích lá4T ............................................. 44 4T3. 2. 7. Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển rễ bất định4T ......................................................................................................................................... 45 4TCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ4T ......................................................................... 46 4T .1. Kết luận4T ........................................................................................................................................... 46 4T . 2. Đề nghị4T .......................................................................................................................................... 46 4T ÀI LIỆU THAM KHẢO4T ................................................................................................. 47 4TPHỤ LỤC4T ............................................................................................................................. 1 4TPHỤ LỤC 14T .......................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid. BA : Benzyl adenin. CĐHTTTV : chất điều hòa tăng trưởng thực vật. GAR3 R: Gibberellin. IAA : Indole-3-acetic acid. MS : Murashige và Skoog. TLT : trọng lượng tươi. LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ giai đoạn đầu khi con người biết trồng trọt, họ đã có ý thức chọn lọc các cây trồng mang những đặc tính có lợi cho con người. Quá trình chọn lọc như thế phải mất nhiều thời gian, hàng chục hoặc hàng trăm năm nhưng không mang lại hiệu quả cao. Đến đầu thế kỉ XX, sinh học đạt được nhiều thành tựu lớn như khám phá ra định luật di truyền Mendel, hiện tượng di truyền liên kết của Morgan và những nghiên cứu khác nữa, nhờ đó tạo ra cây trồng mang biến dị tổ hợp của nhiều gen có lợi. Và rồi kĩ thuật gây đột biến ra đời đã góp phần tạo ra nhiều giống mới có các đặc tính quý. Ngày nay chất lượng cuộc sống gia tăng, thị hiếu con người phong phú, nhu cầu về lương thực, thực phẩm lớn. Làm sao nhân nhanh nhiều giống hay tạo ra nhiều giống mới nhằm đáp ứng thị hiếu và nhu cầu con người là vấn đề lớn đặt ra cho các nhà chọn lọc và tạo giống vật nuôi và cây trồng. Phát sinh hình thái là cơ sở cho vi nhân giống thực vật nên rất được thế giới và nước ta quan tâm. Việc phát hiện auxin là chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã mở ra cho những nghiên cứu trồng trọt đầy hấp dẫn. Auxin kích thích khúc cắt hình thành rễ bất định là bước đột phá lớn cho nhân giống thực vật ( Environ, 2007 ). Đề tài “Vai trò của auxin trong sự phát sự phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi” được thực hiện nhằm tìm hiểu về các giai đoạn phát triển rễ bất định in vitro ở cây đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi dưới ảnh hưởng của auxin để bổ sung kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu và giảng dạy. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1. Giới thiệu về cây Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1. 1.1. Phân loại Giới : Plantae Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotiledoneae Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Chi : Vigna Loài : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng Hộ, 1999). 1. 1. 2. Đặc điểm sinh học Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi là cỏ nhất niên, thân đứng hay leo, cao 50 đến 80 cm, nhánh có cạnh, có lông dài. Bộ nhiễm sắc thể 2n = 22. Cuống 10 đến 12 cm, có lông, lá phụ xoan, đầu tròn, có thùy, dài 6 đến 8 cm, gân phụ 4 đến 5 cặp, lá bẹ thon, hình lọng, cao 8 mm. Chùm ở nách lá, dài 3 đến 10 cm, đài 5 răng ngắn; vành vàng, cao 15 mm, lườn xoắn 360 ( Phạm Hoàng Hộ, 1999 ). Hoa có màu vàng nhạt với những cánh hoa màu vàng chanh xếp thành từng cặp. Quả hình trụ, dài 5 đến 8cm, rộng 8 đến 10mm, không có lông, chứa 6 đến 10 hạt. Hạt có hình thuôn, hai đầu vuông, không có lông, dài 4 đến 7mm , đường kính 5mm, màu nâu sẫm ( Hu, 2005 ) Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi có thể được giữ ít nhất 5 năm nếu độ ẩm hạt là 13% và độ ẩm không khí 15%. Hạt nẩy mầm trên đất ở nhiệt độ 6 đến 10 P0PC nhưng tốt nhất là 30 đến 34 P0PC. Sau khi trỉa 7 đến 20 ngày cây mầm mới nhô lên khỏi mặt đất. So với các đậu khác, Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi phát triển rất chậm nên cần làm sạch cỏ giữa giai đoạn nảy mầm và ra hoa (Brink và Belay, 2006). Hình 1.1. Một số bộ phận chính của cây : a. nhánh; b. hoa; c.đài; d. nhụy; e. nhị; f.quả; g. hạt (Nguồn: Hu, 2005). Hoa kéo dài 30 đến 40 ngày. Cây tự thụ phấn nhưng vẫn có thể xảy ra thụ phấn chéo. Thời gian sinh trưởng khoảng 60, 80, 90 hoặc120 ngày. Rễ cây cộng sinh với vi khuẩn Bradyrhizobium nên có khả năng cố định N hơn 100kg N/ ha, con số này còn phụ thuộc vào độ ẩm và pH của đất (Brink và Belay, 2006). Vigna angularis sống tốt nhất ở vùng có khí hậu ấm áp và cận nhiệt đới với lượng mưa trung bình hằng năm 500 đến 1750 mm, và nhiệt độ từ 15 đến 30P0PC. Cây có thể chịu được nhiệt độ cao nhưng rất nhạy cảm với sương mù. Ở nhiệt đới, Vigna angularis thích hợp ở vùng cao và độ pH của đất từ 5 đến 7,5 (Brink và Belay, 2006). Ở Trung Quốc, Vigna angularis thường được trồng xen với ngô hoặc kê, còn ở Nhật thì luân canh xen vụ với khoai tây, củ từ hay lúa mì. Vigna angularis thường bị nhiễm bệnh do nấm, vi khuẩn hay do côn trùng tấn công như Erysiphe polygoni, Xanthomonas campestris, Matsumuraeses phaseoli … Quả đậu không dễ vỡ nên người ta có thể thu hoạch bằng máy gặt. Thông thường, người ta cắt bằng tay sau đó phơi nhiều ngày trước khi xếp thành đống khô. Khi độ ẩm hạt còn 16% thì tiến hành đập. Nhiều trái đậu có vỏ mỏng, hạt lại ẩm ướt nên đã nảy mầm bên trong vỏ quả. Sản lượng hạt thu hoạch trên một ha có thể đạt đến 3500kg. Ở Kenya, người ta trồng thí nghiệm và đã thu được khoảng 500 đến 600 kg trên ha (Brink và Belay, 2006). 1. 1. 3. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản xuất trên thế giới Vigna angularis được trồng ở vùng châu Á nhưng nguồn gốc của nó thì chưa được biết (Ohashi và Tahashahi, 1981). 2TViệc thuần hóa 2TVigna angularis 2Tđược biết tới từ thời xa xưa ở Hàn Quốc2T, Trung Quốc và Nhật, sau đó 2Tcây trồng này 2Tđược giới thiệu tới nhiều quốc gia khác trên thế giới. Tại Châu phi, Vigna angularis được trồng thí nghiệm ở Congo, Kenya và Angola. Khó có thể ghi lại số liệu sản lượng đậu Vigna angularis trên toàn thế giới vì nó được thống kê cùng với các loại đậu khác: Trung Quốc (470,000 ha), Nhật (60,000 ha), Hàn Quốc (25,000 ha) và Đài Loan (15,000 ha). Từ 1996 đến 2000, Nhật sản xuất hằng năm từ 70000 đến 90000 tấn, trong đó khoảng 80 đến 85% sản lượng này được thu hoạch từ phía bắc quần đảo Hokkaido5T.5T Tuy nhiên, mỗi năm Nhật Bản tiêu thụ 140.000 tấn nên phải nhập khẩu đậu từ các quốc gia như Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan và Canada. Vào những năm của thập niên 90, Trung Quốc hằng năm xuất khẩu trung bình 20.000 đến 40.000 tấn. Gần đây, Trung Quốc và Úc đã hợp tác nghiên cứu về việc sản xuất Vigna angularis. Hạt và bột làm từ hạt là hai thứ hàng hóa quan trọng trong các chợ phương đông (5TSingh và Jauhar, 2005;5T Brink và Belay, 2006). Ở nước ta, trồng lấy hột ở Nha Trang, Sài Gòn (Phạm Hoàng Hộ, 1999). 1. 1. 4. Thành phần hóa học Hạt đậu Vigna angularis có vị ngọt. 100 g hạt đậu chứa: nước 13,4 g; năng lượng 1377 kJ; protein 19,9 g; chất béo 0,5 g; carbohydrat 62,9 g; chất xơ 12,7 g; Ca 66 mg; Mg 127 mg; P 381 mg; Fe 5,0 mg; Zn 5,0 mg; vitamin A 17 IU; thiamin 0,46 mg; riboflavin 0,22 mg; niacin 2,6 mg, vitamin BR6R 0,35 mg; folat 622 μg. Ngoài ra, hạt đậu này còn có các axit amin không thay thế: tryptophan 191 mg; lysin 1497 mg; methionin 210 mg; phenylalanin 1052 mg; threonin 674 mg; valin 1023 mg; leucin 1668 mg và isoleucin 791 mg; và hứa các axit béo như axit linoleic 113 mg và axit oleic 50 mg (Brink và Belay, 2006). 1. 1. 5. Giá trị thực phẩm và giá trị dược liệu Hạt đậu khô có thể nấu chín để ăn hay làm thành bột dùng cho các món súp, các loại bánh và kem. Việc sử dụng đậu Vigna angularis gắn liền với nền văn hóa của quốc gia. Người Nhật có quan niệm Vigna angularis biểu hiện của sự thành công và may mắn. Vì thế, Ở Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc và Nhật, vào những dịp chúc mừng hạnh phúc như sinh nhật, đám cưới, kì thi… Vigna angularis được nấu chung với nếp để ăn. Người Nhật còn xem Vigna angularis là thành phần quan trọng trong những món ăn truyền thống như bánh bao, bột đậu trộn với agar để làm món tráng miệng. Ở Trung Quốc, bột đậu trộn với bột mì để làm sợi mì. Ở Nepal, người ta còn lấy những trái còn non và cây mầm giá để làm rau cải (Singh and Jauhar5T, 2005)5T. Ngoài ra, hạt Vigna angularis rang lên có thể được dùng để thay thế cho cà phê hay tẩm đường để ăn. Thân cây có thể dùng làm thức ăn cho gia súc hay làm phân bón cho đất. Đặc biệt, bột đậu còn thể dùng để sản xuất dầu gội, kem dưỡng da mặt hay là thành phần trong môi trường nuôi cấy. Người Trung Quốc còn biết sử dụng hạt đậu Vigna angularis để chữa các bệnh về thận, chứng táo bón, khối u, xảy thai, không tiết sữa, sự lưu thông máu, lợi tiểu... Lá đậu có tác dụng hạ sốt, còn cây mầm ngăn chặn sự xảy thai do bị thương ( Brink và Belay, 2006). Ở Việt Nam, tuy không được dùng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, Vigna angularis được các thầy thuốc Đông y coi là một vị thuốc dễ sử dụng và an toàn. Vigna angularis có tính mát, giúp giải nhiệt, chữa chứng suy nhược cơ thể. Rễ đắp trị sưng; hột lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999). 1. 1. 6. Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi Vigna angularis là một loại đậu phổ biến nhất ở Nhật, được nghiên cứu về mặt nông học cũng như thực vật học. Một số tác giả cho rằng phát sinh hình thái phấn hoa là một trong những điểm phân biệt đáng chú ý giữa chi Phaseolus và chi Vigna ((Ohashi và Tahashahi, 1981; Merechal et al., 1978). Để tăng khả năng kháng thuốc diệt cỏ, các gen hpt, gfp và phosphinothricin bar được chuyển vào Vigna angularis nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Mutasim et al., 2004). Một nhóm nhà khoa học phát hiện dịch chiết từ vỏ hạt Vigna angularis có chứa các proanthocyanidin và chất xơ nên có thể chống oxi hóa, chống chứng tăng huyết áp và chữa trị thận hư (Sato et al., 2009). Nhóm nhà khoa học người Úc đã nghiên cứu hiệu quả thời gian và các điều kiện cất giữ tác động đến tinh bột, protein, độ cứng và chất lượng hạt khi nấu. Để giữ được chất lượng đậu, tốt nhất nên bảo quản ở 10 P0PC, độ ẩm 65% (Yousif et al., 2002). 1.2. Sự phát sinh hình thái 1. 2. 1. Định nghĩa Phát sinh hình thái là thuật ngữ được dùng để chỉ những thay đổi của cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn thành chu trình phát triển ( Bùi Trang Việt, 2003 ). Phát sinh hình thái ở thực vật bao gồm các quá trình: - Phát sinh mô ( Histogenesis ) - Phát sinh cơ quan (Organogenesis) - Phát sinh phôi ( Embryogenesis ) Phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình cơ bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí và hướng mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết đinh hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật ( Bùi Trang Việt, 2003 ). 1. 2. 2. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu sự phát sinh hình thái in vitro dẫn tới nhiều ứng dụng của sinh học thực vật cho các nghiên cứu về thực vật học, sinh hóa học, vi nhân giống và phát triển cây trồng chuyển gen ( transgenic crops ) ( Lund et al., 2008; Mironova et al., 2010; Phillips, 2008 ). Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần phải tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trong các biến đổi hình thái và cấu trúc. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kĩ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là: - Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó. - Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích thước quá bé nhỏ của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các hormon thực vật ngoại sinh là cách hữu hiệu về sự phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt, 2000 ). 1. 2. 3. Sự phát sinh rễ Rễ mầm được phát triển từ sinh mô chóp (tiền sinh mô). Sinh mô này có một hoạt tính đặc biệt có thể riêng cho từng loài thực vật. Về nguồn gốc của rễ có thể có hai cách giải thích: - Do ba tế bào nguyên thủy tạo ra: một sẽ tạo ra vùng trục trung tâm, một sẽ tạo ra vùng vỏ, một sẽ tạo ra vùng chóp. Có thể mỗi vùng có tế bào nguyên thủy riêng. - Chóp rễ và vỏ tạo thành một nhóm không phân biệt có thể vì tế bào nguyên thủy chung cho cả ba vùng. Vì rễ thường khởi đầu từ trong trụ nên rễ thường được cho là có nguồn gốc nội sinh. Tuy nhiên, ở Cardamine pratensis, các thay đổi xảy ra ở vùng tế bào nằm phía ngoài vùng trụ. Đây là trường hợp rễ có nguồn gốc ngoại sinh. Sau khi thoát ra khỏi vỏ hạt và tăng trưởng, rễ sẽ phát triển và tạo rễ nhánh và rễ phụ. Sự phát triển đó gồm một loại phản ứng phân hóa. Rễ nhánh xuất hiện trên rễ chính, cơ chế giống rễ bất định. Sự tạo rễ bất định là một bước ngoặc quan trọng sự nhân giống vô tính những cây gỗ quý, những cây lương thực, thực phẩm. Rễ bất định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá, thực vật cấp thấp nhưng có mạch; đơn tử diệp hay song tử diệp nhân giống bằng giò, dây leo hay thủy thực vật hoặc những thực vật sống bám vào cây chủ. Hiện tượng hình thái giải phẫu thực vật có thể chung cho hai cơ quan rễ nhánh hoặc rễ bất định ( Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Rễ bất định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiên môi trường stress hay bị vết thương cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi. Có ít nhất hai con đường hình thành rễ bất định: từ những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tầng hay từ mô sẹo ( Pop et al., 2011 ). Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều nhân tố môi trường và các yếu tố nội sinh ( Sorin et al., 2005 ). Các tác giả cho rằng sự cân bằng chất hoạt hóa và chất ức chế phiên mã Auxin Response Factor ( ARF ) điều khiển sự tượng rễ bất định (Gutierrez et al., 2009 ). Auxin và etilen được xem là hormon kích thích sự hình thành rễ bất định trong khi cytokinin và gibberelin thì ngược lại (Pop et al., 2011). Sự hình thành rễ bất định của cành chiết, cành giâm chia làm ba giai đoạn: + Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên (tầng phát sinh) tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hóa mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). A Giai đoạn khử phân hóa tế bào xảy ra như sau: lúc ban đầu không bào còn to, lạp thể và ti thể phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống như tế bào mô phân sinh cấp hai; sau đó tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch nhân to ra. Sau giai đoạn hoạt hóa này, tế bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân sinh cấp một có khả năng sinh cơ quan. Tiếp theo, các tế bào có sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia tế bào để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ. Sự phân chia tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một ( Bùi Trang Việt, 2003 ). + Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn xuất hiện mầm rễ. + Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ thoát khỏi vỏ ra ngoài tạo nên rễ bất định ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). B Hình 1.2. Sự hình thành và phát triển rễ. A: Sự hình thành sơ khởi rễ; B: Sơ khởi rễ và rễ kéo dài ( Nguồn: Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001 ). 1. 3. Vai trò các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái Mở đầu thực sự cho các nghiên cứu về hormon tăng thực vật được đánh dấu bởi các thí nghiệm của Darwin ( 1880 ) về hiệu ứng của ánh sáng trên sự cong của diệp tiêu Avena và sự phát hiện của Went (1928 ) về vai trò kích thích sự kéo dài tế bào của auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Hormon là thuật ngữ do các nhà sinh lí học động vật Bayliss và Starling gọi vào năm 1904. Dựa vào định nghĩa hormon động vật, ta có định nghĩa: “hormon thực vật là một chất hữu cơ do tế bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác, ở đó, với nồng độ thấp, chất ấy gây ra một phản ứng sinh lý”. Song song với các hormon được tổng hợp trong cơ thể thực vật, ngày nay bằng con đường hóa học con người đã tổng hợp nên hàng loạt các chất khác nhau có hoạt tính sinh lí tương tự và đã có những ứng dụng rất rộng rãi trong nông nghiệp (Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật không phải là các chất dinh dưỡng, các vitamin hay những nguyên tố khoáng thiết yếu cho thực vật (Bùi Trang Việt, 2000 ) nhưng nó là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực vật in vitro (Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò r._.ất quan trọng trong việc đảm bảo mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lí của thực vật ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể tác động đến thực vật một cách trực tiếp ( sự phân chia tế bào, sự tăng trưởng tế bào) hay gián tiếp ( tương tác với các hormon hoặc các phân tử khác ) (Pop et al., 2011). Hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi là auxin và citokinin (Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). 1. 3. 1. Vai trò của auxin trong sự tăng trưởng thực vật Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: acid indol-3-acetic ( IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA là dẫn xuất hay tiền chất của IAA, và có cùng vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin theo nghĩa rộng. 1. 3. 1. 1. Sinh tổng hợp và vận chuyển auxin Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, từ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng. Sau đó auxin di chuyển xuống rễ và tích tụ trong rễ. Trong quá trình phát sinh hình thái, sự di chuyển của auxin có vai trò trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động theo nồng độ trong sự phát sinh cơ quan ( Bùi Trang Việt, 1998; Berleth và cs, 2001). Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được nhìn rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển vận này, chúng bị thoái hóa bởi auxin – oxydase, điều này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp ra chúng. Như vậy auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào ( Dương Công Kiên, 2002 ). Auxin được tổng hợp thường không ở dạng tự do mà ở dạng liên kết với một acid amin hay glucid. Các dạng liên kết này không có hoạt tính auxin mà ở dạng dự trữ và vận chuyển của auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Sự di chuyển hữu cực từ ngọn tới gốc cần năng lượng, tùy thuộc vào sự định hướng của mô, ít chịu ảnh hưởng của trọng lực, rất chậm, thường xảy ra trong các tế bào nhu mô bao quanh bó mạch của thân và trong mọi tế bào diệp tiêu ( Bùi Trang Việt, 2000 ). 1. 3. 1. 2. Auxin trong sự phát triển rễ Auxin đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái. Đặc tính di chuyển và hiệu ứng theo nồng độ của auxin quyết định chiều hướng và tính hữu cực trong sự phát sinh cơ quan (Sachs, 1993). Từ khi auxin lần đầu được mô tả, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy sự liên hệ chặt chẽ giữa auxin với sự phát triển rễ (Overvoorde et al., 2010). Auxin giúp sự kéo dài tế bào, sự phân chia, sự phát triển và duy trì mô phân sinh ngọn rễ (Mironova et al., 2010). Một trong những hiệu ứng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào đã được chứng thực từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann) là khả năng phát sinh rễ. Hiệu ứng đó tạo nên một trong các ứng dụng quan trọng của auxin hoặc các chất gần giống auxin, là cơ sở của tất cả các sản phẩm thương mại (bột nhão hay dung dịch ) nhằm xúc tiến sự giâm cành (Nguyễn Như Khanh, 2007). Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ ( phát thể non của rễ ), nhưng ngăn cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Đặc tính này được ứng dụng phổ biến trong giâm cành, hiện tượng được chứng minh bao gồm ít ra là hai giai đoạn: tạo sơ khởi và kéo dài sơ khởi này (Mai Trần Ngọc Tiếng và các cs, 1980). Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin ( như thiamin mà rễ không tổng hợp được), axit amin (như arginin) và nhất là các hợp chất ortho- diphenolic ( như axit cafeic, axit chlorogenic) (Bùi Trang Việt, 2000). Vai trò của auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô. Trong môi trường chỉ có auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ mà thôi. Vì vậy trong kĩ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kì quan trọng và bắt buộc ( Vũ Văn Vụ, 1999). Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng auxin cảm ứng sự tượng rễ bất định (adventitious root initiation) ở các khúc thân in vitro với các nồng độ auxin khác nhau ( Lund et al., 2008; Mironova et al., 2010; Sorin et al., 2005). Cùng với bản chất, nồng độ và khuynh độ của auxin (auxin gradients) giải thích được phần nào về sự tạo rễ bất định ở mức phân tử (Gutierrez et al. 2009). Những thay đổi nồng độ auxin nội sinh liên quan với những giai đoạn sinh lí của rễ, nồng độ auxin nội sinh cao thường ứng với giai đoạn hình thành sơ khởi rễ (Caboni et al., 1997). Khi xử lí auxin ngoại sinh trên khúc cắt, nồng độ auxin nội sinh đạt tới đỉnh cao trùng với thời điểm tạo sơ khởi rễ (Pop et al., 2011). Điều đáng lưu ý là việc sử dụng auxin có hiệu quả ức chế ngay ở nồng độ thấp đối với hệ rễ. Đối với rễ, auxin có tác dụng kích thích ở nồng độ thấp khoảng 10P-10P – 10P-12P M; ở thân nồng độ cao hơn 10P-6P – 10P-7P M. Trong các auxin thì NAA và IBA là hai loại được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy mô. IAA ít được dùng hơn vì ít bền trong khi hấp khử trùng môi trường (Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). 1. 3. 1. 3. Auxin trong sự sinh trưởng, phân chia và phân hóa tế bào Auxin có ảnh hưởng quan trọng trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái thực vật. Auxin cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào thực vật ( Bùi Trang Việt, 2000). Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra ( Vũ Văn Vụ, 2008 ). Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân. Sự kéo dài tế bào rễ cần nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân. Ở nồng độ cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống. Đặc tính này được áp dụng trong nuôi cấy tế bào ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng ( tầng phát sinh libe- mộc ) đồng thời giúp sự phân hóa của mô dẫn (libe- mạch mộc), nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp. Như vậy auxin tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính ( Bùi Trang Việt, 2000 ). 1. 3. 2. Vai trò của giberelin trong sự tăng trưởng thực vật 1. 3. 2. 1. Sự phát hiện Năm 1926 Kurosawa (Nhật) phát hiện chất trích nấm Gibbrella fujikuroi gây bệnh lúa von. Năm 1938 Yabuta và Sumili cô lập từ Gibbrella một hỗn hợp mà họ gọi là giberelin nhưng chưa rõ bản chất (Bùi Trang Việt, 2000). Năm 2003, 126 loại GA khác nhau với vòng gibban cơ bản được tìm thấy ở thực vật và nấm. Giberelin là một nhóm lớn, đó là các giberelin ARxR hay GRxR theo thứ tự khám phá (Võ Thị Bạch Mai, 2004). 1. 3. 2. 2. Nơi tổng hợp và di chuyển Axit mevalonic là chất khởi đầu tổng hợp giberelin. Trong cây, giberelin ở dạng tự do hoặc dạng liên kết với các chất khác (glucose, protein…). Giberelin được tổng hợp trong lá non, phôi, rễ non, quả non và được tổng hợp mạnh trong lục lạp. Giberelin được chuyển từ mạch mộc qua libe nhờ liên hệ giữa hai hệ thống. Giberelin đi qua các mạch nhờ những tế bào tia lõi. Giberelin di chuyển nhờ sự thoát hơi nước. Trong cây bị cắt đứt ngọn, giberelin sẽ được đẩy theo ảnh hưởng sức đẩy của rễ ( Mai Trần Ngọc Tiếng , 2001 ). 1. 3. 2. 3. Tác dụng sinh lí Giberelin kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia nhân tế bào thân. Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì. Giberelin liều cao kích thích mạnh sự tăng trưởng lá. Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, giberelin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Giberelin ảnh hưởng rất rõ rệt lên sự sinh trưởng của các dạng đột biến lùn. Ảnh hưởng đặc trưng của giberelin lên sự ra hoa là kích thích sự sinh trưởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Trong sự biểu hiện phái tính của hoa, giberelin ức chế phát triển hoa cái (Vũ Văn Vụ và cs, 2008), kích thích sự tạo hoa đực ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật, giberelin làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi xoma. Ở mô sẹo thuốc lá, GAR3R đặc biệt có tác dụng cản sự tạo chồi khi nó có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và cản mạnh hơn khi mẫu cấy được nuôi trong tối. Thông thường GAR3R có tác dụng cản sự ra rễ và khi xử lí cành giâm với GAR3R ở nồng độ cao (1-10mg/l) ở ngay vị trí đáy cành giâm thì cành này sẽ không tạo được rễ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Ở một số loài thực vật, xử lí GAR3R trước khi chuyển cành giâm vào môi trường ra rễ sẽ làm tăng sự tạo rễ. Tác dụng làm tăng sự ra rễ xảy ra một cách mạnh mẽ khi xử lí acid giberelic ngay khi sự xuất hiện rễ bắt đầu, nhưng chỉ sau một thời gian ngắn sau đó thì acid giberelic lại có tác dụng cản (Nguyễn Đức Lượng- Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và tạo lại các dòng cây sạch bệnh, ích lợi của việc thêm kích thích tố giberelin vào môi trường nuôi cấy đã được kiểm tra bởi Pennazio và Redolfi (1974), hai tác giả này đã quan sát thấy việc gia tăng sự hồi phục của cây nuôi cấy lên đến 49% so với các cây đối chứng trong môi trường lỏng (Dương Công Kiên, 2002 ). Nồng độ giberelin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy khoảng từ 0,1 đến 10 ppm, thường dùng dưới dạng acid giberelic (GAR3R) (Võ Thị Bạch Mai, 2004). 1. 3. 3. Vai trò của Citokinin trong sự tăng trưởng thực vật 1. 3. 3. 1. Sự phát hiện Năm 1938 Bonner trích từ trái đậu một chất làm tăng trưởng tế bào của trái này và được gọi là citokinin. Năm 1955 Miller và Skoog chiết xuất từ tinh dịch cá thu chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh gọi là kinetin. Năm 1963 Letham và Miller chứng minh chất trích từ phôi nhũ bắp non có cùng hiệu ứng với kinetin, gọi là zeatin. Sau zeatin, hơn 30 citokinin khác nhau được cô lập. Ngày nay, citokinin chỉ một nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo có đặc tính sinh lý giống nước dừa hay kinetin (Bùi Trang Việt, 2000). 1. 3. 3. 2. Nơi tổng hợp Citokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng tương tự như các phytohormon khác ( Vũ Văn Vụ và cs 2008 ). Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các citokinin tự do cho cả cơ thể thực vật. Từ rễ, citokinin di chuyển trong mạch mộc để tới chồi ( Bùi Trang Việt, 2000; Kieber, 2002 ), khi rễ bị thương thì có một sự phát triển yếu của nụ vì không tạo đủ citokinin ( Mai Trần Ngọc Tiếng , 2001 ). Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp citokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). 1. 3. 3. 3. Tác dụng sinh lí Kích thích phân chia tế bào Citokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Citokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Có được hiệu quả này là do citokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp axit nucleic và protein ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). Khi nuôi cấy mô nghèo citokinin ( mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu ), auxin kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Kích thích tạo cơ quan Citokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). Citokinin kích thích sự tăng trưởng lá, sự phân hóa mầm. Citokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm và làm tăng sự nở hoa, tăng sự tượng hoa ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ) Citokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Chính vì vậy mà từ rễ lên chồi ngọn thì hiện tượng ưu thế ngọn càng tăng dần tương ứng với sự tăng hàm lượng auxin và giảm hàm lượng citokinin ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Skoog và Miller ( 1965 ) chứng minh khúc cắt lõi hay mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tùy theo tỉ lệ auxin/ citokinin ( A/C) trong môi trường nuôi cấy: A/C cao giúp sự tạo rễ ( thí dụ 2/0,2); A/C thấp giúp tạo chồi (thí dụ 2/0,5) ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Một tỉ lệ cân bằng giữa hai chất điều hòa trên chỉ tạo khối mô sẹo không phân hóa (Mok và cs, 1994). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ citokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng citokinin cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tạo thành rễ bất định khi không có hiện diện của auxin. Ví dụ, chồi củ cải đường ra rễ trong môi trường MS có bổ sung kinetin và không có auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Làm chậm lão hóa Citokinin làm chậm sự lão hóa ở chỗ là làm tăng sự kích thích hoạt động tổng hợp của protein và làm chậm sự thoái biến citokinin ( Võ Thị Bạch Mai, 2004 ). Dầu không cản hoàn toàn nhưng citokinin làm chậm rõ rệt sự lão suy lá; lá còn giữ màu lục khi được phun trên cây hay xử lí trực tiếp trên lá tách rời ( Bùi Trang Việt, 2000 ). Hiệu quả kìm hãm sự hóa già, kéo dài tuổi thọ của cơ quan có thể chứng minh là cành giâm ra rễ thì rễ tổng hợp cytokinin nội sinh và kéo dài thời gian sống của lá lâu hơn. Trên cây nguyên vẹn thì khi hệ thống rễ phát triển mạnh sẽ là lúc cây trẻ và sinh trưởng mạnh. Nếu hệ thống rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già (Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Trong nuôi cấy, nồng độ citokinin được sử dụng khoảng từ 0,1 đến 10 ppm, thường dùng nhất là 1 đến 2 ppm. Thường dùng phối hợp với auxin, khi dùng ở nồng độ cao thì mẫu cấy có thể cho ra nhiều chồi con nhưng sự tăng trưởng của từng chồi sẽ bị hạn chế (Võ Thị Bạch Mai, 2004). Citokinin cảm ứng sự biểu hiện các gen điều hòa bởi ánh sáng (Chen và cs, 1993; Crowell và cs, 1994) và cây các cây mầm bị hoàng hóa nếu được tăng trưởng trong điều kiện có mặt citokinin sẽ có kiểu hình như cây mầm tăng trưởng dưới ánh sáng (Chory và cs,1994) 1. 3. 4. Vai trò của axit abcisic (AAB) Axit abcisic được tổng hợp ở hầu hết các bộ phận của cây như rễ, lá, hoa, quả, hạt, củ và tích lũy nhiều ở các cơ quan già, các cơ quan đang ngủ nghỉ, cơ quan sắp rụng. Nó được vận chuyển trong cây không phân cực theo phloem hoặc xilem. Axit abcisic là một chất ức chế sự sinh trưởng rất mạnh nhưng nó không gây hiệu quả độc khi ở nồng độ cao ( Vũ Văn Vụ và cs, 2008 ). Là chất đối kháng với giberelin, axit abcisic cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của hạt và làm chậm sự kéo dài lóng (Bùi Trang Việt, 2000). Trong cơ quan đang ngủ nghỉ hàm lượng axit abcisic tăng gấp 10 lần thời kì dinh dưỡng. Sự ngủ nghỉ kéo dài cho đến khi nào hàm lượng axit abcisic trong chúng giảm đến mức tối thiểu. Axit abcisic kích thích sự rụng nhưng không phải là chất chủ yếu (so với etilen và auxin). Axit abcisic đã kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng rời ở cuống (Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Axit abcisic được xem như là một hormon của “stress” vì nó được hình thành mạnh để phản ứng với các “stress” hoặc điều kiện bất thuận của môi trường. Ví dụ: khi cây bị thiếu nước thì hàm lượng axit abcisic tăng nhanh trong lá, làm khí khổng nhanh chóng đóng lại và giảm ngay sự thoát hơi nước. Axit abcisic được xem là một hormon của sự hóa già. Mức độ hóa già của cơ quan và của cây gắn liền với sự tăng hàm lượng axit abcisic trong chúng (Vũ Văn Vụ và cs, 2008). 1. 3. 5. Vai trò của Etilen Nhiều nghiên cứu xác minh etilen gây nên hai hiệu quả sinh hóa trong quá trình chín của quả: biến đổi tính thấm của màng dẫn đến sự giải phóng các enzym liên quan đến quá trình chín và kích thích sự tổng hợp các enzym gây nên các biến đổi sinh hóa trong quá trình chín. Etilen hoạt hóa sự hình thành tầng rời ở cuống, lá, hoa, quả qua việc kích thích sự tổng hợp các enzym phân hủy thành tế bào (Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Etilen kích thích sự ra hoa của một số thực vật, chẳng hạn xử lí etilen hoặc các chất có bản chất tương tự như etilen đã kích thích dứa, xoài ra hoa trái vụ (Vũ Văn Vụ và cs, 2008). Etilen kích thích sự kéo dài thân cây mầm và sự tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000). CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Hạt Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi từ cơ sở sản xuất Xuân Hồng. - Cây con Vigna angularis in vitro 7 ngày sau sự nảy mầm trên môi trường MS. - Khúc cắt trụ hạ diệp và trụ thượng diệp (để nghiên cứu quá trình phát triễn rễ) (ảnh 2.1). Ảnh 2.1. Vật liệu trong nuôi cấy tạo rễ bất định. A: Cây con in vitro 7 ngày tuổi; B: Các khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí 1, 2, 3. C: Các khúc cắt trụ hạ diệp ở vị trí 1, 2, 3. 2. 2. Phương pháp 2. 2. 1. Khử trùng mẫu Hạt được rửa dưới vòi nước chảy và lắc trong calcium hypochlorite 10% và thủy ngân clorua 0,1% (Hình 2.1), sau đó được nuôi cấy trên môi trường MS, ở nhiệt độ 27 ± 2 P0PC, chiếu sáng 2000 ± 200 lux (12 giờ mỗi ngày). Sau 7 ngày nuôi cấy, ghi nhận tỉ lệ mẫu không nảy mầm và tỉ lệ mẫu sống và không nhiễm. 1,3 cm A 0, 6 cm C B 0, 6 cm 2. 2. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro Sử dụng môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung vitamin, sucrose 30 g/l, agar 6 g/l (pH 5,7) được hấp khử trùng (121 P0PC trong 15 phút). Hạt Vigna angularis sau sự khử trùng được gieo vào mỗi ống nghiệm có chiều dài 20 cm và đường kính 2 cm để tạo cây in vitro. Sự nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 27 ± 2 P0PC, ánh sáng 2000 ± 200 lux (12 giờ mỗi ngày). Các điều kiện này được áp dụng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo. 2. 2. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên khả năng tạo rễ của cây con in vitro Hạt Vigna angularis được đặt vào từng ống nghiệm như trong sự nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro (phương pháp 2.2.2). Môi trường MS được bổ sung BA 1 mg/l và IAA ở các nồng độ 0,1; 1; và 5 mg/l. Qua 7 ngày nuôi cấy, các kết quả về chiều cao thân, chiều dài rễ và số lượng rễ con được ghi nhận. 2. 2. 4. Khảo sát ảnh hưởng của auxin trong sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis Trụ hạ diệp của cây con in vitro 7 ngày tuổi được sử dụng trong thí nghiệm này. Từ vị trí cổ rễ của cây con cắt bỏ một đoạn dài 5 mm, tiếp tục cắt trụ hạ diệp thành 3 đoạn ( tương ứng với các vị trí 1, 2, 3 được minh họa trong ảnh 2.1 ), mỗi đoạn dài 5 mm. Các đoạn (khúc cắt) này được nuôi cấy trong bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung IAA ở các nồng độ 0,1; 1; và 5 mg/l theo đúng vị trí (chiều ngọn-gốc) của các khúc cắt. Mẫu (Hạt) Rửa mẫu dưới vòi nước chảy trong 30 phút Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng Ngâm và lắc nhẹ bằng xà phòng 5% trong 3 phút Đưa hạt vào tủ cấy vô trùng Ngâm và lắc mẫu bằng cồn 700 trong 20 giây Rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng Ngâm và lắc mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút Hình 2.1. Sơ đồ qui trình khử trùng hạt đậu Vigna angularis Sau 24 và 48 giờ nuôi cấy, lần lượt cắt phần đoạn trụ hạ diệp ngập trong môi trường nuôi cấy ( khoảng 2,5 mm ) thành 10 lát mỏng. Dưới kính hiển vi, quan sát số sơ khởi rễ và rễ kéo dài của mỗi lát cắt. Kết quả là giá trị bình quân của 6 khúc cắt. Chỉ tiêu số lượng và chiều dài rễ được đánh giá vào ngày thứ 7 sau khi cấy. 2. 2. 5. Ảnh hưởng của auxin lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis Các khúc cắt trụ thượng diệp in vitro có nguồn gốc từ cây con in vitro 7 ngày tuổi là vật liệu nuôi cấy. Từ đỉnh cây cắt bỏ một đoạn dài 5mm, tiếp đó cắt liên tiếp 3 đoạn trụ thượng diệp ( tương ứng với ba vị trí 1, 2, 3 được minh họa trong ảnh 2.1 ), mỗi đoạn dài 5 mm. Mẫu thí nghiệm được cấy theo vị trí 1, 2, 3 trong các bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung IAA 0,1; 1; và 5 mg/l theo đúng vị trí (chiều ngọn-gốc) của các khúc cắt. Sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy, phần gốc của mỗi đoạn trụ thượng diệp chìm trong môi trường ( khoảng 2,5 mm ) được cắt thành 10 lát mỏng. Quan sát dưới kính hiển vi để đếm số sơ khởi rễ và rễ kéo dài của từng lát cắt. Kết quả thống kê là giá trị trung bình của 6 khúc cắt. Chỉ tiêu số lượng và chiều dài rễ được xác định vào ngày thứ 7 sau khi cấy. 2. 2. 6. Ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ cao lên sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp của cây đậu Vigna angularis Từ kết quả khúc cắt trụ thượng diệp của cây con 7 ngày tuổi ở vị trí thứ nhất tạo rễ mạnh trong môi trường MS có bổ sung IAA 5 mg/l (so với các vị trí khác), các khúc cắt ở vị trí thứ nhất này được đặt trong các bình tam giác chứa môi trường MS có bổ sung IAA với các nồng độ 5; 7,5; và 10 mg/l. Sau một tuần, ghi lại chiều dài và số lượng rễ trên từng mẫu thí nghiệm. Ngâm và lắc mẫu bằng calcium hypochlorite 10% trong 4 phút Quan sát và ghi nhận kết quả Rửa sạch mẫu nhiều lần bằng nước cất vô trùng Cấy mỗi hạt vào mỗi ống nghiệm chứa môi trường MS 2. 2. 7. Khảo sát sự phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian dưới ảnh hưởng của auxin Tiếp tục sử dụng môi trường MS có bổ sung IAA 5mg/l để nuôi cấy khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí thứ nhất. Chiều dài và số lượng rễ trung bình của mẫu cấy được xác định theo từng khoảng thời gian ở các ngày 5, 7, và 14 sau khi bắt đầu nuôi cấy. 2. 2. 8. Khảo sát sự di chuyển hữu cực của auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp Những đoạn trụ thượng diệp in vitro (dài 5 mm) ở các vị trí 1, 2 và 3 từ cây in vitro 7 ngày tuổi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l. Các khúc cắt được cắm vào môi trường theo chiều ngược, nghĩa là cực ngọn (dài 2,5 mm) sẽ được cắm vào môi trường và cực gốc quay lên trên. Sau 60 giờ, đoạn trụ thượng diệp (dài 2,5mm) nằm phía trên môi trường được cắt thành 10 lát mỏng. Quan sát dưới kính hiển vi để đếm số sơ khởi rễ và rễ kéo dài. Kết quả là giá trị trung bình của 6 lát cắt. Sau 7 ngày, chiều dài trung bình rễ và số rễ hình thành là những chỉ tiêu theo dõi. 2. 2. 9. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên chiều cao và diện tích lá ở cây Vigna angularis 7 ngày tuổi Sau khử trùng, hạt đậu Vigna angularis được ngâm 24 giờ trong bình tam giác 100 ml chứa môi trường MS có bổ sung IAA (0,01; 0,1; 1; và 5 mg/l ), và sau đó được cấy trong các ống nghiệm chứa môi trường MS. Vào ngày thứ 8 và 12, tất cả lá in vitro của từng cây được chụp ảnh, và diện tích lá được tính nhờ phần mềm LIA 32. Cùng với diện tích lá, chiều cao thân cũng được xác định. 2. 2. 10. Đo cường độ hô hấp Qua các thí nghiệm, khúc cắt trụ thượng diệp ở vị trí thứ nhất có khả năng ra rễ mạnh trên môi trường MS bổ sung IAA 5mg/l nên được dùng làm vật liệu để đo cường độ hô hấp sau 0, 48, và 5 ngày nuôi cấy bằng cách dùng máy Warburg. Máy này gồm một bồn chứa nước có bộ phận điều nhiệt và khuấy. Các áp kế Warburg gắn vào thành bồn. Cử động lắc của giá áp kế sẽ giúp sự khuyếch tán khí giữa mẫu vật, dung dịch ngâm mẫu vật và pha khí trong bình. Cường độ hô hấp của mô được xác định qua lượng OR2R hấp thu (μl) trên trọng lượng tươi trên giờ. 2. 2. 11. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được định lượng bằng phương pháp hóa học sắc kí lỏng cao năng (HPLC). HPLC là sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với detector nhạy có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký với tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Hoạt động của HPLC cần có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài mililit/phút. Trong phương pháp này, mẫu chỉ cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình phân tích. 2. 2. 12. Xử lý thống kết quả thu được Các số liệu được sử lí thống kê bằng chương trình SPSS, phiên bản 11.5 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p=0,05 của giá trị được biển hiện bằng các mẫu tự khác nhau. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3. 1. 1. Khử trùng mẫu Hạt được khử trùng với calcium hypochlorite 10% và thủy ngân clorua 0,1% trong 4 phút. Sau 1 tuần nuôi cấy, với cùng một khoảng thời gian xử lý, tỉ lệ hạt không nảy mầm như nhau (3%), nhưng tỉ lệ mẫu sống thì không tương đương. Nếu xử lý bằng thủy ngân clorua 0,1%, 93% mẫu nảy mầm không bị nhiễm. Như vậy, thủy ngân clorua với nồng độ 0,1% rất thích hợp cho việc khử trùng mẫu ( bảng 3.1). Bảng 3.1. Kết quả khử trùng với calcium hypochlorite 10% và thủy ngân clorua 0,1% trong 4 phút. Chỉ tiêu theo dõi Calcium hypochlorite 10% ( Ca(OCl) R2R. 4HR2RO) Thủy ngân clorua 0,1% (HgClR2R) Tỉ lệ mẫu không nảy mầm 3% 3% Tỉ lệ mẫu sống và không nhiễm 26% 93% 3. 1. 2. Nuôi cấy hạt và tạo cây in vitro Nhìn chung, những cây in vitro 7 ngày tuổi được tạo ra từ sự nuôi cấy hạt trên môi trường MS có chiều cao tương đối đồng đều. Lúc này, cây cao khoảng 12 đến 13 cm, vẫn còn mang hai lá mầm và hai tử diệp (ảnh 3.1). Ảnh 3.1. Cây con 7 ngày tuổi trên môi trường MS được dùng để làm vật liệu ở các thí nghiệm tiếp theo. 0,6cm 3. 1. 3. Khảo sát ảnh hưởng của IAA và BA lên chiều cao và khả năng tạo rễ của cây con in vitro Trong các nghiệm thức thí nghiệm, cây con sau 7 ngày nuôi cấy từ hạt trên môi trường MS có sự sinh trưởng tốt nhất ( bảng 3.2 , ảnh 3.2 - 3.9). Bảng 3. 2. Chiều cao thân, chiều dài và số lượng rễ ở cây Vigna angularis sau sự nảy mầm 7 ngày trong môi trường MS có bổ sung AIA 0,1; 1; và 5 mg/l kết hợp với BA 1mg/l hay không. Nồng độ BA ( mg/l ) Nồng độ IAA ( mg/l ) Chiều cao thân ( cm ) Chiều dài rễ ( cm ) Số rễ / cây Đối chứng ( MS ) 12,30 ± 0,47P g 2,27 ± 0,13P d 22,70 ± 1,42Pg 1 0 5,60 ± 0,13P b 1,33 ± 0,14P c 1,83 ± 0,29P a 1 0,1 6,40 ± 0,18P b 0,60 ± 0,04P b 5,25 ± 0,25P b 1 1 5,00 ± 0,17P a,b 0,32 ± 0,02P a 6,90 ± 0,38P b,c 1 5 4,60 ± 0,25Pa 0,27 ±0,02P a 7,60 ± 0,31P c 0 0,1 9,50 ± 0,30P e 0,58 ± 0,19P b 13,50 ± 1,07P d 0 1 8,80 ± 0,32Pd 0,34 ± 0,08P a 14,7 ± 0,80P d 0 5 7,50±0,34P c 0,23 ±0,01P a 17,90 ± 0,43P e Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05 Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có hiệu ứng rõ rệt lên hình thái của cây con in vitro. Với BA 1mg/l, số rễ hình thành thấp nhất ( 1,83 ± 0,29P P), nhưng rễ dài hơn ( 1,33 ± 0,14P Pcm) so với các môi trường có áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Khi phối hợp IAA với BA, các chỉ tiêu theo dõi tùy vào tỉ lệ IAA / BA. Tỉ lệ này cao thì chiều cao cây và chiều dài rễ thấp, nhưng số rễ tạo ra nhiều nhất. Ví dụ, trên môi trường với IAA 5mg/l và BA 1mg/l, chiều cao cây là 4,60 ± 0,25 cm, chiều dài rễ là 0,27 ± 0,02 cm, và số rễ là 7,60 ± 0,31. Trong khi đó, trên môi trường với IAA 0,1mg/l và BA 1mg/l , chiều cao cây là 6,40 ± 0,18 cm, chiều dài rễ là 0,60 ± 0,04 cm, và số rễ là 5,25 ± 0,25. Khi xử lý riêng rẽ, IAA ở nồng độ cao cho nhiều rễ nhưng ức chế sự kéo dài thân và rễ. Ví dụ, với IAA 5mg/l, chiều cao cây là 7,50 ± 0,34 cm, chiều dài rễ là 0,23 ± 0,01 cm và số rễ là17,90 ± 0,43. Ngược lại, với IAA 0,1 mg/l, chiều cao cây là 9,50 ± 0,30 cm, chiều dài rễ là 0,58 ± 0,19 cm và số rễ là 13,50 ± 1,07. Ảnh 3. 4. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1 mg/l và IAA 0,1 mg/l Ảnh 3. 5. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1 mg/l và IAA 1 mg/l. Ảnh 3. 2. Cây Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS. Ảnh 3. 3. Cây Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1 mg/l. 1,5 cm 1,5 cm 1, 5 cm 1, 4 cm Ảnh 3. 6. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với BA 1mg/l và IAA 5 mg/l Ảnh 3. 7. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với IAA 0,1 mg/l Ảnh 3. 8. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với IAA 1 mg/l. Ảnh 3. 9. Cây in vitro Vigna angularis 7 ngày tuổi trên môi trường MS với IAA 5 mg/l 3. 1. 4. Ảnh hưởng của auxin lên các giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp của cây đậu Vigna angularis Quan sát dưới kính hiển vi toàn bộ các mẫu cấy thí nghiệm, ở tất cả các nghiệm thức, sơ khởi rễ chưa hình thành sau một ngày nuôi cấy, và chỉ xuất hiện khi đã nuôi cấy 48 giờ ( bảng 3. 3 ). Bảng 3. 3. Số sơ khởi rễ từ các khúc cắt trụ hạ diệp cây đậu Vigna angularis ở ba vị trí khác nhau và được nuôi cấy trong các môi trường MS có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau. Thời gian Nồng độ IAA Số sơ khởi rễ 1 cm 1,2 cm 1,2 cm 1 cm (giờ) ( mg/l ) Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 24 Đối chứng ( MS ) 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 0,1 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 1 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 5 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 0,00 ± 0,00Pa 48 Đối chứng ( MS ) 2,50 ± 0,42Pa3 1,33 ± 0,28Pa2 0,00 ± 0,00Pa1 0,1 2,83 ± 0,30Pa2 2,16 ± 0,30Pa2 0,00 ± 0,00Pa1 1 3,83 ± 0,11Pb2 3,58 ± 0,15Pb2 1,08 ± 0,00Pb1 5 4,00 ± 0,00Pb1 4,00 ± 0,00Pb1 4,00 ± 0,00Pc1 Các số trung bình trong cột với các mẫu kí tự khác nhau và các số trung bình trong hàng với các số thứ tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05. Khả năng tạo sơ khởi rễ giữa các vị trí khúc cắt ở môi trường nuôi cấy MS có bổ sung IAA 5mg/l tương đương nhau. Tuy nhiên, với IAA 0,1mg/l, so với các khúc cắt ở các vị trí 1 và 2, thì các khúc cắt ở vị trí 3 chưa cho sơ khởi rễ trong khoảng thời gian 48 giờ khảo sát giống như đối chứng. Sau 7 ngày nuôi cấy, phần đoạn thân của các khúc cắt trụ hạ diệp nằm chìm trong thạch đều hình thành rễ (ảnh 3.14 - 3.17). Đối với cả ba vị trí của khúc cắt, khả năng tạo rễ cao nhất khi sử dụng IAA 5mg/l ( bảng 3.4). Bảng 3. 4. Chiều dài rễ và số rễ tạo ra từ khúc cắt trụ hạ diệp cây đậu Vigna angularis ở ba vị trí khác nhau sau 7 ngày được nuôi cấy trong các môi trường MS có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ IAA ( mg/l ) 0 0,1 1 5 Chiều dài rễ (cm ) Vị trí 1 2,34 ± 0,18Pc2 2,51 ± 0,90P c2 1,2 ± 0,12P b 1 0,52 ± 0,09P a1 Vị trí 2 2,21 ± 0,18P c2 2,55 ± 0,11P c2 1,35 ± 0,13P b 1 0,57 ± 0,06P a1 Vị trí 3 1,32± 0,31P b 1 2,20 ± 0,11P c1 1,44 ± 0,11P b 1 0,59 ± 0,04P a1 Số rễ trung bình Vị trí 1 3,10 ± 0,32Pa2 3,91 ± 0,83P a 1 7,70 ± 0,94P b2 11,40 ± 0,90P c1 Vị trí 2 2,75 ± 0,37P a 1,2 3,73 ± 0,11P a 1 5,42 ± 0,42P b 1 9,75 ± 0,84._.