Tuyển chọn vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotics

úc đẩy cho khoa học trên thế giới ngày càng phát triển hơn nữa. Một trong số thành quả của công nghệ sinh học hiện nay có thể kể đến là Probiotics. Theo tiếng Hy Lạp thì probiotics có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và nó hiện đang được ứng dụng vô cùng rộng rãi trong đời sống hằng ngày của con người. Vậy probiotics là gì, tại sao nhu cầu sử dụng nó lại trở nên phổ biến ở khắp nơi trên thế giới như thế? Và hiệu quả mà nó mang lại liệu có giúp ích nhiều đến việc nâng cao chất lượng sống của con người chúng ta hay không? Quả thật, probiotics mang rất nhiều lợi ích khác bên cạnh như : hỗ trợ việc tiêu hóa thức ăn được tốt hơn và giảm sự rối loạn trong hệ đường ruột, đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B, cải thiện sự dung nạp lactose, cải thiện chức năng miễn dịch, ngăn chặn các chứng viêm nhiễm, giảm cholesterol, ức chế các vi khuẩn gây hại trong ruột. Do các công dụng hữu ích trên mà probiotics đã và đang được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn nữa để ứng dụng vào cuộc sống của con người. Hiện trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về probiotics và thu được những kết quả đáng kể. Hình 1.1 : Những công bố nghiên cứu về probiotics theo các năm [5] So với những năm 90 thì số nghiên cứu về probiotics đã tăng vọt lên rất nhiều trong thời gian gần đây (hình 1.1). Các nhà khoa học đã tìm ra hầu hết vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến trong những sản phẩm lên men thông thường để tạo ra các chế phẩm probiotic chất lượng phục vụ cho con người hằng ngày như : sữa chua uống Yakult, men vi sinh sống hỗ trợ điều kiện bệnh rối loạn tiêu hóa, …. Không những vậy, probiotics còn được chế biến để sử dụng cho các loài vật nuôi khác để ứng dụng trong nông nghiệp và góp phần tác động cải thiện môi trường. Điều hiển nhiên là do trên thực tế về mức độ an toàn sinh học và thiết thực thì probiotics luôn ở vị trí đứng đầu so với các phương cách khác. Bởi lẽ, tác động của probiotic xuất phát từ cơ chế điều hòa tự nhiên, không gây nên bất cứ một sản phẩm phụ có hại nào hay một tác động xấu nào đến cơ thể sinh vật chủ. Đối với vấn đề quan tâm trọn vẹn giữa yếu tố sức khỏe và môi trường hiện này thì đây có thể nói là một sản phẩm khá hoàn hảo. Một điều đáng quan tâm nữa đó là việc lạm dụng thái quá kháng sinh trong nuôi trồng khiến cho nhiều bất cập xảy ra và các nhà khoa học đã phải lên tiếng cảnh báo. Mặc dù, không ai phủ nhận hiệu quả kinh tế của việc sử dụng chúng như : tăng năng suất, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, phòng bệnh, nâng cao chất lượng sản phẩm, và tăng hiệu quả kinh tế cho người sử dụng. Song, nếu sử dụng kháng sinh quá nhiều sẽ gây ra việc tồn dư trong cơ thể động vật, sẽ ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người tiêu dùng. Ngoài ra, nếu chúng ta phối trộn với một lượng nhỏ không đúng quy cách, sẽ dẫn đến một hậu quả nghiêm trọng hơn là vô tình làm tăng thêm hiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh đối với người và vật nuôi. Và điều này sẽ dẫn đến kết quả tai hại là sẽ có những dịch bệnh rộng lớn trên toàn cầu không thể nào kiểm soát được ở trong tương lai. Ở Việt Nam, các chế phẩm probiotic cũng đang dần trở nên phổ biến, đa phần là được sử dụng trong chăn nuôi gia cầm và đã bắt đầu sử dụng cho các loài thủy hải sản. Bên cạnh đó là chế phẩm dược giúp hỗ trợ rối loạn tiêu hóa trong hệ đường ruột phù hợp cho từng đối tượng khác nhau. Các nghiên cứu về probiotic cũng đang được quan tâm tìm hiểu dựa trên những thành tựu trong nước và trên thế giới đã đạt được nhằm phục vụ cho nhu cầu ngày càng cao hiện nay. Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu để phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một vấn đề rất cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa để ngày càng nâng cao được hiệu quả, tính an toàn cũng như chất lượng cuộc sống ngày càng cao của con người chúng ta. Bởi đây được xem là sự tác động thân hữu của con người vào tự nhiên đã mở ra một chiến lược phát triển bền vững và an toàn. Tuy nhiên, để có được một chế phẩm probiotic thỏa mãn tất cả những yêu cầu được đặt ra với hoạt tính cao cần thiết, nhất định phải kể đến quá trình chọn lọc các chủng vi khuẩn để làm probiotic. Đây là bước cực kỳ quan trọng, bởi nó được xem là yếu tố quyết định vai trò, tác dụng của chế phẩm probiotic lên đối tượng cần quan tâm. Một chủng vi khuẩn có được xem là có khả năng làm probiotics hay không là phụ thuộc vào kết quả của khâu tuyển chọn này. Do đó mà tôi đã chọn đề tài đồ án tốt nghiệp nhan đề “Tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng probiotics”. Mục tiêu đồ án tốt nghiệp : Tuyển chọn các chủng tiềm năng probiotics trong bộ sưu tập vi khuẩn lên men lactic phân lập từ chế phẩm probiotic dược, thực phẩm lên men truyền thống (nem, sữa, dưa muối) và hệ vi sinh đường ruột người theo tiêu chuẩn khả năng kháng vi sinh vật, chịu acid và chịu muối mật. Nội dung đồ án tốt nghiệp : _Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng chịu acid. _Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng chịu muối mật. _Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị (Bacillus substilis, Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas spp.) _Đề xuất hướng sử dụng các chủng vi khuẩn lên men lactic có các hoạt tính trên. Phương pháp thực hiện đồ án tốt nghiệp : Qua nhiều tài liệu tham khảo và các bài báo cáo nghiên cứu khoa học về probiotics, các phương pháp tuyển chọn vi khuẩn probiotic được tiến hành dựa trên những kết quả kiểm tra của các nhà nghiên cứu một cách khá chi tiết. Cho nên, từ các nguồn thông tin này bắt đầu tiến hành thí nghiệm trên những chủng đã được phân lập trong bộ sưu tập vi khuẩn lên men lactic. Cuối cùng là thu nhận số liệu, dựng đồ thị để phân tích đánh giá các chủng vi khuẩn này và đưa ra kết luận cuối cùng. Phương pháp xử lý số liệu : Sử dụng phần mềm excel tính toán và vẽ đồ thị biểu diễn. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn : _Tìm hiểu về các phương pháp tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic. _Góp phần chọn lọc ra những chủng vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng probiotics. CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về Probiotics : 2.1.1 Giới thiệu chung : Kể từ khi Alexander Fleming phát hiện ra tính chất kháng vi khuẩn của nấm Penicillium spp. vào năm 1929 (Fleming, 1929), thế giới đã chứng kiến ưu thế nhanh chóng của thuốc kháng sinh trong điều trị các bệnh khác nhau. Sự phát triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng sinh đã khiến cho ngành y học quá tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh như đại diện cho phương pháp chữa trị chống lại các bệnh khác nhau. Tuy nhiên, tồn tại một số hạn chế nhất định liên quan với phương pháp trị liệu kháng sinh. Tác động loại bỏ của thuốc kháng sinh không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu kháng sinh cũng dẫn đến thay đổi hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu mà có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngừng sử dụng cách điều trị này. Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của nhiều chủng vi khuẩn kháng lại kháng sinh chẳng hạn như Enteroccus spp. kháng vancomycin và Staphylococcus aureus kháng methicillin trong môi trường bệnh viện cũng là một mối quan tâm ngày càng tăng đối với những người làm việc trong nghề y. Hơn nữa, một vài bệnh lây nhiễm từng được cho rằng sẵn sàng có thể xử lý với thuốc kháng sinh bây giờ đang bị công nhận như là mối đe dọa sức khỏe nghiêm trọng. Ví dụ, bệnh tiêu chảy có thể do Clostridium difficile, một mầm bệnh cơ hội, hoạt động khi có sự mất cân bằng của hệ vi sinh vật trong ruột thông thường diễn ra trong suốt quá trình điều trị kháng sinh. Mặc dù bệnh này nói chung được điều trị thành công với một loại thuốc kháng sinh thứ hai, tuy nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái diễn mặc cho các phương pháp trị liệu kháng sinh (Sanders, 1999). Chính vì những nguyên nhân này, mọi người đều nhận ra rằng ngăn ngừa hoặc giảm nguy cơ bị bệnh thích hợp hơn là để đến lúc phải điều trị bệnh. Thực tế, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo trên toàn cầu về giảm việc sử dụng thuốc kháng sinh trong y học và đề xuất các nỗ lực để ngăn cản bệnh thông qua sự phát triển của các vắc xin có hiệu quả hơn và an toàn hơn (Stanton et al., 2001). Một môi trường chung đã được tạo ra mà trong đó cả bác sĩ lẫn bệnh nhân đang tìm kiếm biện pháp phòng ngừa hơn là chữa bệnh, để hệ vi sinh vật trong ruột cơ thể người không bị ảnh hưởng xấu. Và một cách tiếp cận nhanh chóng đạt được sự công nhận là khái niệm probiotics, một khái niệm chung chỉ phần bổ sung dinh dưỡng chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật (đặc biệt là vi khuẩn hoặc nấm men) mà khi đưa vào cơ thể con người có một tác động có lợi bằng việc cải thiện hệ vi sinh vật nội sinh (Markowitz và Bengmark, 2002). So với các nhược điểm như đắt, tính hóa học và xâm hại ruột của thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotics là an toàn, không hề đắt, tự nhiên, và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào. Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không phải là mới. Trên hàng nghìn năm về trước, rất lâu trước khi có sự tìm ra thuốc kháng sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men. Các bằng chứng cho thấy quá trình sản xuất sữa lên men được ghi trong “Book of Genesis”. Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là vào khoảng 2500 năm trước công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt (Chopra và Doiphode, 2002). Các nhà khoa học đầu tiên, như Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng và thuốc của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày (Oberman, 1985). Một sự giải thích khoa học cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic có trong sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi người đoạt Giải Nobel, nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff. Trong bài thảo luận xuất sắc của ông " Việc kéo dài cuộc sống " (‘The prolongation of life’), Metchnikoff đã tuyên bố "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật hữu ích (Metchnikoff, 1907 ". Người ta đề xuất rằng sự tiêu hóa một vài vi khuẩn được chọn lựa có thể có ích lợi ảnh hưởng đến vùng dạ dày-ruột của con người. Metchnikoff tin vào lý do chính gây ra quá trình lão hóa của con người là do chất độc tạo thành bởi sự thối rữa và sự lên men trong ruột (O ' Sullivan et al., 1992 ). Và khi nhận thấy quá trình lên men lactic của sản phẩm sữa ngăn chặn sự thối rữa, ông ta đã tin rằng sự tiêu thụ sản phẩm sữa lên men như thế sẽ tương tự với việc ngăn chặn lại quá trình thối rữa ruột. Metchnikoff đưa ra giả thuyết rằng cuộc sống khoẻ mạnh và lâu dài của nông dân Bungari là do sự tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men. Ông tin khi được tiêu thụ, các vi khuẩn lên men trong sản phẩm ảnh hưởng tốt đến hệ vi sinh vật của ruột kết: giảm hoạt động của vi khuẩn độc, bằng cách ấy dẫn đến cuộc sống thọ. Điều này khiến cho Metchnikoff đã khuyên trong sách của ông rằng uống đồ uống chẳng hạn như sữa chua chứa vi khuẩn lactic sẽ ngăn cản lão hóa. Ngoài ra, cùng một thời gian, Henry Tissier đã phân lập Bifidobacteria, thành viên của nhóm vi khuẩn lactic, từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ và nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi và Shimamura, 1993). Tissier tin rằng sự thống trị của Bifidobacteria trong cơ thể trẻ sẽ chiếm chỗ của các vi khuẩn thối rữa liên quan đến sự xáo trộn dạ dày và sự tự thành lập của chúng để chiếm chỗ của các vi khuẩn có ích trong ruột. Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào giả thuyết ảnh hưởng lớn của Bifidobacteria tới số trẻ em này(O ' Sullivan et al., 1992). Lý thuyết của ông được khẳng định bởi quan sát lâm sàng trẻ nuôi bằng sữa mẹ so với trẻ được nuôi bằng sữa hộp (Rasic và Kurmann, 1983). Mặc cho sự diễn ra Thế chiến I và cái chết của Metchnikoff làm giảm nhẹ lượng tiền đang quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn của ông ấy, nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotics rõ ràng đã được thành lập. Nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ vừa qua. Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này cũng như về bảo đảm sự sống sót của các vi khuẩn này khi ở trong vùng dạ dày-ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001). Các kiến thức có được về probiotics thông qua những nghiên cứu này đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa. Từ các quan sát từ sớm của Eli Metchnikoff và các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotics với sản phẩm sữa lên men đã tiếp tục cho đến tận hiện đại. Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại. 2.1.1.1 Định nghĩa Probiotics là gì : Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian. Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật (Gomes và Malcata, 1999). Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó. Vì vậy, khái niệm “probiotics” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” ( Havenaar và Huis in't Veld, 1992 ). Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một hệ sinh thái vi sinh vật ở người trưởng thành (Tannock, 1990); mặc dù phương pháp trị liệu kháng sinh, bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này, nhưng trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự hiệu chỉnh (annock, 1983). Vi khuẩn probiotic được tiêu thụ với số lượng lớn cũng không đủ để trở thành chủng chiếm ưu thế trong ruột và có thể hiếm khi được phát hiện trong mẫu ruột hoặc phân sau một hay hai tuần sau sự tiêu hóa. Do đó, quan trọng là chúng ta phải hiểu trên thực tế ảnh hưởng của probiotic có thể được đem lại bởi các sự kết hợp và cơ cấu hoạt động ít thân thiết hơn và tạm thời hơn so với hệ vi sinh vật của người (Sanders, 1999). Vì vậy, định nghĩa về probiotics hiện tại chỉ còn là “vi sinh vật sống mà đi ngang qua vùng ruột và làm lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng”. (Tannock et al., 2000) . 2.1.1.2 Hiệu quả sử dụng probiotic : Do nhiều yếu tố, một phần lớn lượng vi sinh vật có lợi trong đường ruột bị giảm hay bị tiêu diệt như bị tiêu chảy, sử dụng kháng sinh trong chữa bệnh, điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hoạt động của hệ tiêu hóa như thủy phân đường lactoza trong sữa, giảm khả năng hấp thụ thức ăn và giảm tính đề kháng của cơ thể. Chính bởi lẽ đó mà cơ thể của chúng ta cần phải bổ sung thêm một lượng đủ lớn sinh khối vi khuẩn có lợi nhằm cải thiện sức khỏe. Hình 2.1 : Tác dụng của probiotics Đã có rất nhiều chế phẩm probiotics dành cho người hay cho vật nuôi được đăng kí bảo hộ sáng chế. Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobicillus spp. hoặc Streptococcus spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii hay Bacillus subtilis. Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotics có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự điều chỉnh hệ vi sinh vật trong đường ruột (Hình 2.1). Những chế phẩm này có hiệu quả sử dụng được biết tới như sau : Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến : Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu. Cơ chế này đã được nghiên cứu và kết luận rằng : Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư. Sản xuất các hợp chất kháng ung thư : sinh ra những acid yếu có lợi cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành và hồi phục chức năng. Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột, như các enzyme phân (nitroreductase, β-glucuronidase) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trong trực tràng. Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro hay in vivo, việc mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh cãi. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa : Probiotics kìm hãm sự phát triển của mầm bệnh và cải thiện hệ thống miễn dịch của dạ dày và giảm nguy cơ nhiễm một số mầm bệnh phổ biến như Salmonella và Shigella. Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng đó là probiotics phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra các kháng sinh hay là những chất cạnh tranh. Hình 2.2 : Tác động đến hệ vi sinh đường ruột (Modified after stewart et al. 1995) Từ hình 2.2, nhận thấy được tác động của probiotics đến hệ vi sinh vật đường ruột như sau : _Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh. _Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột. Vị trí nào được các vi khuẩn probiotics gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn. _Vi khuẩn probiotics tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những vi sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các chủng probiotics là: _Bacteriocin. _Hydrogen peroxide. _Acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic). _Diacetyl. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose: Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng đường lactoza của cơ thể bằng cách cung cấp men lactaza cho đường ruột và dạ dày. Sử dụng các thực phẩm có chứa các chủng vi khuẩn này giúp cải thiện rõ rệt khả năng tiêu hóa đường lactose. Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh : Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao. Ngoài ra, giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc các bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh. Kích thích hệ thống miễn dịch : Thực phẩm chức năng probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin. Sự hấp thụ thực phẩm probiotic đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể. Tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn. Hình 2.3 : Cơ chế kích thích hệ thống miễn dịch của probiotics Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotics ở hình 2.3 có thể được trình bày theo 3 cách sau : _Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vật hay hạt carbon. _Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và interferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu). _Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là IgA. Các tác dụng khác : Probiotics còn có một số tác dụng khác như giảm tác dụng phụ của kháng sinh, giảm nhiễm trùng đường niệu ở người. Đối với việc sử dụng probiotics trong chăn nuôi còn mang lại hiệu quả cao nhờ có khả năng tăng trọng (5%) ở gia cầm, giảm tỉ lệ mắc các bệnh do nhiễm trùng và tiêu chảy ở động vật non. Bảng 2.1 : Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotics [8] [13]. Chủng Tác dụng lâm sàn trên người Lactobacillus rhamrosus GG (ATCC 53103) Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy do kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus johnsonii (acidophilus) LJ-1 (La1) Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori. Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus reuteri (BioGaia Biologics) Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIV dương tính. Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực đối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của người khỏe mạnh. Lactobacillus plantarum DSM9843 (299v) Cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng acid béo mạch ngắn trong phân. Saccharomyces bourlardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu chảy cho bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ống. Chủng trong sữa chua (Streptococcus thermophilus hay L. Delbrueckii subsp bulgaricus) Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus, không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi bị tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng lên hoạt tính enzyme phân. Vào khoảng cuối năm 1940 đã có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh vật đường ruột này. Đầu tiên là việc bổ sung thuốc kháng sinh vào trong thức ăn đã thúc đẩy sự tăng trưởng của vật nuôi. Do đó mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh hưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột và cách thức nó tác động lên vật chủ là như thế nào. Vấn đề thứ hai, là vì ngày càng có nhiều vật nuôi bị bệnh đã cung cấp nhiều cho thí nghiệm nhằm khám phá hệ vi sinh vật trong đường ruột của những vật chủ sẵn có này. Và kết luận đã nhận định rằng L.acidophilus không là vi khuẩn Lactobacillus duy nhất có trong ruột non mà còn nhiều vi sinh vật khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm probiotics. Những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy có khoảng 1014 vi sinh vật thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồn tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì vậy, việc nghiên cứu về những vi sinh vật có thể sử dụng làm probiotics ngày càng được mở rộng. Đồng thời sau nhiều nghiên cứu ấy, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều vi sinh vật có thể sử dụng làm probiotics (bảng 2.1). 2.1.1.3 Thành phần của Probiotic : Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) Lactobacillus Bifidobacterium Other lactic acid bacteria Non-lactic acid bacteria L. acidophilus L. amylovorus L. casei L. cripatus L. delbrueckii subsp.Bulgaricus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. Longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteroides Pediococcus acidolactici Streptococcus thermophilus Sporolactobacillus inulinus Bacillus cereus var. Toyoi Escherichia coli Nissle 1917 Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccheromyces boulardii 2.1.1.4 Tiêu chuẩn tuyển chọn chủng Probiotic : Từ rất nhiều nghiên cứu và thông tin về các vi sinh vật được chọn lựa làm probiotics phải đáp ứng được hai tiêu chuẩn sau : + Tiêu chuẩn về an toàn. + Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng. Hình 2.4: Các tiêu chuẩn tuyển chọn probiotic cho người (M. Saarela et al. 2000) Khía cạnh an toàn của probiotics bao gồm những điểm cụ thể sau : _Có định danh chính xác. _Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người. _Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh. _Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh. _Không liên quan tới bệnh tật. _Không gây khử liên hợp muối mật. _Đặc điểm duy truyền ổn định. _Không mang các gene đề kháng kháng sinh có thể truyền được. Lẽ tất nhiên, tính an toàn của các chủng probiotics là điều được quan tâm hàng đầu. Có một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotics như: nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotics, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotics, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotics và vật chủ. Các probiotics thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As Safe). Bảng 2.3 : Vi khuẩn probiotics và tính an toàn của chúng [3] [14] Giống vi sinh vật Khả năng lây nhiễm Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch (AIDS). Lactococcus Không gây bệnh. Streptococcus Gây bệnh cơ hội, có S. thermophilus được sử dụng trong các sản phẩm sữa. Enterococcus Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng kháng sinh. Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics. Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người. Probionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotics. Saccharomyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người. Đối với những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics (bảng 2.3) cho người đều bắt buộc phải đạt những yêu cầu trên, song đối với vật nuôi chúng ta có thể giảm bớt đi một số yêu cầu, chủ yếu là tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng nó. Để một probiotics có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng phải có những đặc điểm sau : _Chủng vi sinh phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất, dễ nuôi cấy. _Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm. _Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm. _Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng, để tồn tại được chúng phải có hai đặc tính là: có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vị của người; đồng thời chúng phải có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotics có thể sống sót được khi đi qua ruột non). _Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ : khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người được xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotics. Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng bám dính. _Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng. _Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm. _Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng với các vi sinh gây bệnh, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh đường ruột. _Sản xuất các chất kháng vi sinh vật (như bacteriocins, H202, acid hữu cơ…). _Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư. 2.1.2 Quy trình chọn lọc các chủng Probiotic : Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu gene Tên chi, loài, ký hiệu chủng. Đăng ký trong bảo tàng giống quốc tế nào? Xác định chức năng In vitro Trên động vật Đánh giá độ an toàn _In vitro trên người và động vật _Trên người : pha 1 Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu nhiên gồm nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng uống thuốc vờ (DBPC)* để xác định tính công hiệu của chủng hoặc sản phẩm. Tốt nhất nên thử nghiệm DBPC độc lập lần 2 để khẳng định kết quả. Dán nhãn Tên chi, loài, ký hiệu chủng Số lượng tối thiểu vi khuẩn sống Điều kiện bảo quản thích hợp Thông tin liên hệ với khách hàng PROBIOTICCCSSSS Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng probiotics với phương pháp điều trị thông thường Hình 2.5 : Sơ đồ theo hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn probiotics Phân lập các dòng vi khuẩn Sàng lọc in vitro Sàng lọc in vivo quy mô nhỏ Kiểm tra khả năng gây bệnh đối với vật chủ Không đạt OK? Đạt Đạt Thử nghiệm in vivo quy mô pilot OK? Khả năng gây bệnh đối với điều kiện nuôi (nếu cần) OK? OK? Loại bỏ PROBIOTIC Đạt Đạt Không đạt Không đạt Không đạt Hình 2.6 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm probiotic 2.1.3 Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotic : Probiotics Sự bám dính Chịu acid dạ dày Kháng vi sinh vật Chịu được muối mật Thử nghiệm in vivo Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic đều dựa trên cơ sở sự ức chế tăng trưởng vi sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic, khái quát như hình 2.7 Hình 2.7 : Sơ đồ khái quát tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật 2.2 Khả năng chịu acid, chịu muối mật và chịu enzyme tiêu hóa của các chủng Probiotic : 2.2.1 Khả năng chịu acid : Nguyên tắc : pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra như oxalic acid, butylic acid, folic acid,… Chính vì vậy các vi khuẩn probiotics cần phải chịu được điều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dày và ruột thì mới có thể phát huy đ._.