Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng bacillus phân lập từ mắm cá

n men chúng tôi đã phân lập được 104 chủng vi khuẩn. Trong số đó có 51 chủng thể hiện hoạt tính protease khi nuôi trên môi trường MPA1 có bổ sung 1% gelatin. Ba chủng vi khuẩn (Tp91, Tp97, Tp98) có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease trên các môi trường chứa các nồng độ NaCl khác nhau từ 0 - 21% đã được lựa chọn để nghiên cứu. Bằng kĩ thuật di truyền phân tử chúng tôi đã định tên 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn là Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98. Ba chủng này đều sinh trưởng và sinh tổng hợp protease tốt nhất sau 24 h nuôi cấy ở 37 oC tốc độ 200 vòng/phút. Hoạt tính protease cực đại của 3 chủng Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98 lần lượt là 1045, 860 và 630 U/mL. Ngoài khả năng sinh tổng hợp protease cao, ba chủng Bacillus còn có khả ức chế một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp như Vibrio parahaemolyticus, V. furnissii, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis. Ba chủng Bacillus có những tiêu chuẩn cần thiết để có thể ứng dụng trong quy trình sản xuất nước mắm. Từ khóa: Nước mắm, Bacillus, protease. 1. Mở đầu Ở Việt Nam, nước mắm là sản phẩm truyền thống, được sản xuất từ lâu đời. Ngày nay, nước mắm không chỉ được sản xuất để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ở trong nước mà còn được xuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới. Nước mắm sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống thường mất nhiều thời gian nên lợi nhuận thấp và khó đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng lớn trên thị trường [1, 2]. Vì vậy, để tăng lợi nhuận cho người sản xuất đồng thời để đáp ứng nhu cầu sử dụng nước mắm ngày càng tăng thì cần có biện pháp rút ngắn thời gian sản xuất. Quá trình làm mắm có thể rút ngắn bằng cách điều chỉnh pH, nồng độ muối và nhiệt độ trong quá trình lên men. Sự điều chỉnh này với mục đích tối ưu hoá hoạt động của protease do vi khuẩn trong ruột cá sinh ra [3]. Một cách khác để rút ngắn quá trình sản xuất nước mắm là bổ sung protease hoặc vi khuẩn sinh tổng hợp protease để làm tăng tốc độ thủy phân protein [1, 2, 4, 5]. Kết quả các nghiên cứu gần đây của Yongsawatdigul và cộng sự cho thấy, sự bổ sung vi khuẩn sinh protease chịu mặn đã rút ngắn quá trình sản xuất nước mắm mà vẫn giữ được chất lượng nước mắm [5]. Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 107 Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn từ mắm cá đang lên men, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease mạnh ở các nồng độ muối khác nhau để định hướng ứng dụng trong quá trình làm mắm nhằm rút ngắn thời gian sản xuất. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu * Vật liệu nghiên cứu Các mẫu mắm cá đang lên men được lấy từ làng sản xuất nước mắm Sa Châu thuộc xã Giao Châu, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. * Môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu Môi trường phân lập vi khuẩn và giữ giống vi khuẩn là môi trường MPA cải tiến (viết tắt là MPA1). Thành phần môi trường gồm: cao thịt, 5g; pepton, 5g; NaCl, 50g; agar, 20g; nước cất, 1000 mL; pH 7,0. * Phương pháp phân lập vi sinh vật Pha loãng 1g mắm cá vào nước vô trùng có chứa 5% NaCl để đạt đến các độ pha loãng 5 x 10-3, 5 x 10-4, 5 x 10-5, 5 x 10-6. Hút 100µl dịch ở các nồng độ pha loãng nhỏ vào chính giữa đĩa môi trường dùng để phân lập, dùng que trang gạt đều. Sau 48 h ủ ở 37 oC dùng tăm cấy chuyển các khuẩn lạc vào môi trường giữ giống để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. * Phương pháp lên men vi sinh vật Cấy các chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa vào bình tam giác 100 mL có chứa 25 mL môi trường lỏng, nuôi ở 37 oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ (giống cấp 1). Hút và bổ sung 2.5% giống cấp 1 vào bình tam giác 100 mL chứa 25 mL môi trường thí nghiệm dạng lỏng. Tiến hành nuôi lắc ở điều kiện 37 oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Dịch lên men được thu lại ở các thời điểm khác nhau để xác định hoạt tính enzyme và mật độ tế bào. * Phương pháp tách chiết DNA tổng số và giải trình tự gen 16S rRNA Nuôi cấy chủng tuyển trọn trên môi trường MPA1 lỏng ở 37 oC trong 13 h. Tách DNA tổng số bằng bộ kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM (Mỹ). Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi gồm: - Mồi xuôi: 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) - Mồi ngược 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’). Chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính ở 95 oC trong 3 phút; lặp lại 30 chu kì (95 oC trong 30 giây, 55 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1.5 phút); 72 oC trong 10 phút và 4 oC cho để bảo quản. Sản phẩm PCR sau đó được gửi sang công ty Bioneer (Hàn Quốc) để giải trình tự. Trình tự nucleotide thu được sẽ được so sánh với trình nucleotide có trên ngân hàng gen để định tên chủng vi khuẩn. * Phương pháp thử khả năng đối kháng vi sinh vật Khả năng đối kháng của ba chủng tuyển chọn với các vi sinh vật kiểm định (Vibrio sp., Escherichia coli hay Salmonella sp.) thu nhận từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương được xác định theo phương pháp đột thạch nhỏ dịch [6]. * Phương pháp xác định hoạt tính Hoạt tính protease được xác định sơ bộ bằng phương pháp cấy chấm điểm và kiểm tra vòng phân giải bằng dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa [6]. Hoạt tính của enzyme cũng được xác định bằng phương pháp định lượng theo Nguyễn Văn Mùi (2007) [7]. Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 108 2.2. Kết quả và thảo luận 2.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào Từ mẫu mắm lên men lấy từ xã Giao Châu, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định, tiến hành pha loãng và phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA1. Sau 48 h ủ ở 37 oC chúng tôi đã thu được 104 khuẩn lạc vi khuẩn được kí hiệu Tp1 - Tp104. Những khuẩn lạc này đã được cấy tách sang môi trường MPA1 mới sau đó thử nghiệm khả năng sinh protease ngoại bào bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường MPA1 có bổ sung 1% gelatin. Kết quả cho thấy có 51 chủng (49%) có khả năng sinh protease ngoại bào trong đó có 4 chủng có đường kính vòng phân giải gelatin lớn hơn 2 cm, 25 chủng có vòng phân giải từ 1,5 đến 2 cm, và 22 chủng có vòng phân giải nhỏ hơn 1,5 cm. Chúng tôi đã chọn 29 chủng có vòng phân giải gelatin lớn hơn 1,5 cm để tiến hành nghiên cứu tuyển chọn lần hai. 2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease Một tiêu chí quan trọng trong lựa chọn các chủng vi khuẩn để ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước mắm là có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease trong điều kiện mặn cao [2, 3, 5]. Vì vậy chúng tôi đã cấy chấm điểm 29 chủng lựa chọn ở trên vào môi trường MPA1 có chứa 1% gelatin và các nồng độ NaCl khác nhau (từ 0 đến 21%). Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều sinh trưởng và sinh tổng hợp protease mạnh nhất trên môi trường không bổ sung NaCl hoặc bổ sung NaCl ở nồng độ thấp, khi nồng độ NaCl trong môi trường tăng cao thì khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme cũng giảm. Trong số 29 chủng thử nghiệm có 16 chủng có vòng phân giải protein trên các môi trường có bổ sung NaCl từ 0% tới 21%; 5 chủng có vòng phân giải trên môi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 18%; 2 chủng có vòng phân giải trên các môi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 15%; 6 chủng còn lại có vòng phân giải trên môi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 12%. Ba chủng vi khuẩn (ký hiệu là Tp91, Tp97 và Tp98) có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh trên các nồng độ muối khác nhau đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu (Hình 1 và Bảng 1). Hình 1. Vòng phân giải gelatin của 4 chủng vi khuẩn (Tp95, Tp96, Tp97, Tp98) ở nồng độ muối 18% Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 109 Bảng 1. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của ba chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường có các nồng độ muối khác nhau Tên chủng Đường kính (cm) Nồng độ NaCl 0% 3% 6% 9% 12% 15% 18% 21% Tp91 d 1,25 0,4 0,4 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 D 3,45 2,7 2,45 2,0 1,3 0,6 0,55 0,6 Tp97 d 1,9 0,45 0,48 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 D 3,55 2,65 2,45 2,05 1,4 1,1 1,15 0,95 Tp98 d 1,35 0,4 0,4 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 D 3,45 3,2 3,15 2,9 1,75 1,7 1,35 1,4 (d) đường kính khuẩn lạc, (D) đường kính vòng phân giải. 2.2.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào, định danh 3 chủng tuyển chọn bằng kĩ thuật di truyền phân tử Khuẩn lạc của 3 chủng tuyển chọn đều có màu trắng ngà, bề mặt trơn bóng và hơi nhăn ở chính giữa khuẩn lạc. Tế bào của cả ba chủng đều có dạng trực khuẩn, gram dương, có bào tử ở chính giữa tế bào, tế bào đứng rời hay từng đôi một (Hình 2A, B, C). Sau khi tách chiết DNA tổng số của 3 chủng tuyển chọn và chạy PCR chúng tôi đã thu được các đoạn gen có kích thước hơn 1400 bp, các đoạn gen này đã được gửi sang Hàn Quốc giải trình tự. So sánh trình tự gen 16S rRNA của ba chủng tuyển chọn (phụ lục) với các trình tự gen trong ngân hàng gen thế giới chúng tôi nhận thấy: trình tự gen 16S rRNA của chủng Tp91 và chủng Tp97 giống 100% so với trình tự gen của nhiều chủng Bacillus subtilis và một số chủng B. tequilensis, trong khi đó trình tự gen 16S rRNA của chủng Tp98 giống 100% so với trình tự gen của nhiều chủng B. subtilis và giống 99% so với chủng B. tequilensis. Dựa vào các kết quả này chúng tôi đặt tên cho 3 chủng tuyển chọn lần lượt là Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98. Nhiều nghiên cứu trước kia đều nhận thấy Bacillus sp. là nhóm chịu và ưa mặn khá phổ biến trong các sản phẩm lên men từ thủy sản đặc biệt là trong giai đoạn đầu của quá trình lên men [3, 5]. Bacillus đóng vai trò quan trọng trong các quá trình lên men truyền thống do có khả năng phát triển ở dải pH rộng, sản xuất nhiều enzyme ngoại bào quan trọng. Rất nhiều loài Bacillus có khả năng sinh nhiều loại kháng sinh như subtilin, eumycin, bacilin, bacillomin nên có khả năng chống lại nhiều loại vi khuẩn có hại [8]. Hình 2. Hình dạng tế bào của chủng (A) Tp91, (B) Tp97 và (C) Tp98 dưới kính hiển vi quang học (100X) Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 110 2.2.4. Sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau Hình 3. Mật độ tế bào và hoạt tính protease của chủng (A) Bacillus sp. Tp91, (B) Bacillus sp. Tp97 và (C) Bacillus sp. Tp98 ở các thời gian nuôi cấy khác nhau Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 111 Chúng tôi tiến hành lên men ba chủng Bacillus trên môi trường MPA1 lỏng ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Lấy mẫu tại các thời điểm khác nhau nhằm xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của các chủng nghiên cứu. Kết quả cho thấy ở cả ba chủng nghiên cứu mật độ tế bào đạt cực đại sau 24 h nuôi cấy, sau đó mật độ tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian nuôi cấy (Hình 3A, 3B, 3C). Tương ứng với sự sinh trưởng của vi sinh vật, hoạt tính emzyme cũng tăng theo thời gian nuôi cấy và đạt giá trị cực đại sau 24 h nuôi cấy. Hoạt tính protease cực đại của ba chủng Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98 lần lượt là 1045, 860 và 630 U/mL. Sau 24h hoạt tính enzyme giảm do mật độ tế bào giảm, nhưng lại tăng lên ở 36h. Hoạt tính enzyme tăng lúc 36 h có thể là do các tế bào chết đã bị ly giải, khi đó protease nội bào được giải phóng ra môi trường. Kết quả của nghiên cứu này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu trước đó của Sehar và Hameed (2011) đối với chủng vi khuẩn Bacillus sp. HS-4 phân lập được từ vùng đất mặn. Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng thời điểm mật độ tế bào Bacillus sp. HS-4 đạt giá trị cực đại cũng là thời điểm hoạt tính protease đạt cực đại [9]. Tuy nhiên hoạt tính protease của ba chủng Bacillus phân lập được trong nghiên cứu này cao hơn nhiều so với hoạt tính protease của chủng Bacillus sp. HS-4 (295 U/mL). 2.2.5. Khả năng đối kháng của 3 chủng tuyển chọn với một số vi sinh vật có hại thường gặp Hầu hết các vi khuẩn có hại đều bị ức chế bởi nồng độ muối cao trong quá trình làm mắm. Tuy nhiên nồng độ muối cao trong mắm sẽ làm tăng thời gian sản xuất và làm giảm giá trị cảm quan của nước mắm, vì vậy muốn rút ngắn thời gian sản xuất và tăng giá trị cảm quan của nước mắm thì cần giảm nồng độ muối trong quá trình sản xuất. Tuy nhiên nếu giảm nồng độ muối thì các vi sinh vật gây hại sẽ có điều kiện phát triển và khi đó chất lượng mắm bị giảm [3]. Nghiên cứu tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease mạnh nhưng lại đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa phổ biến như Vibrio sp., Escherichia coli hay Salmonella sp. sẽ mang lại nhiều ý nghĩa cho ngành công nghiệp sản xuất nước mắm. Các chủng này khi được sử dụng làm giống khởi đầu cho quá trình làm mắm sẽ sinh tổng hợp protease để thủy phân protein của cá, đồng thời kháng lại sự phát triển của một số vi sinh vật có hại. Do đó có thể giảm được nồng độ muối và rút ngắn thời gian làm mắm nhưng vẫn tạo ra mắm sạch phù hợp với nhu cầu người tiêu dùng. Vì lí do trên chúng tôi đã khảo sát khả năng đối kháng của 3 chủng nghiên cứu đối với một số chủng vi sinh vật có hại thường gặp, kết quả được thể hiện trong Bảng 2 và minh họa trong Hình 4. Bảng 2. Khả năng đối kháng của 3 chủng tuyển chọn với một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp Chủng Các chủng vi sinh vật kiểm định V. parahaemolyticus V. furnissii V. cholerae E. coli Sal. choleraesuis Tp91 + + - + + Tp97 + + - + + Tp98 + + - + + Ghi chú: + đối kháng, - không đối kháng Đoàn Văn Thược và Vũ Thị Thu Hiền 112 Kết quả cho thấy ba chủng tuyển chọn đều có khả năng ức chế V. parahaemolyticus, V. furnissii, E. coli, Sal. choleraesuis, tuy nhiên cả ba chủng này đều không có khả năng ức chế V. cholerae. Hình 4. Vòng vô khuẩn thể hiện khả năng ức chế của 3 chủng tuyển chọn đối với (A) E. coli và (B) V. parahaemolyticus 3. Kết luận Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease ở các nồng độ NaCl khác nhau từ 0 đến 21%. Ba chủng này đều thuộc chi Bacillus và được đặt tên là: Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 và Bacillus sp. Tp98. Ngoài khả năng sinh tổng hợp protease cao, ba chủng Bacillus còn có khả năng ức chế sự sinh trưởng của một số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa điển hình như V. parahaemolyticus, V. furnissii, E. coli và Sal. choleraesuis. Với khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease cao trên nhiều nồng độ NaCl khác nhau, đồng thời lại có khả năng ức chế một số loại vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa, ba chủng tuyển chọn có tiềm năng ứng dụng trong quy trình sản xuất nước mắm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vũ Ngọc Bội, 2004. Nghiên cứu quá trình thủy phân cá bằng enzyme protease từ B. subtilis S5. Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh. [2] Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Phương Nhuệ, Trịnh Thị Ngọc, 2011. Phân lập và nghiên cứu vi khuẩn ưa muối ưa kiềm sinh protease và bước đầu thử nghiệm để sản xuất nước mắm ngắn ngày. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 9(3) 452 – 463 [3] B. J. B.Wood, 1998. Fermented fish and fish products (Microbiology of fermented foods). Blackie academic & professional. pp 416-434. [4] N. G. Sanceda, T. Kurata and N. Hamano, 1996. Accelerated fermentation process of manufacture of fish sauce using histidine. J. Food Sci. 61(1): 220-222. [5] J. Yongsawatdigul, S. Rodtong, and N. Raksakulthai, 2007. Acceleration of Thai fish sauce fermentation using proteinases and bacterial starter cultures. J. Food Sci. 72(9): 382-390. Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá 113 [6] Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, 2011. Thực hành Vi sinh vật học. Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội. tr 95-105. [7] Nguyễn Văn Mùi, 2007. Thực hánh Hóa sinh học. Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. tr 74-76. [8] M. Schallmey, A Singh and O. P. Ward, 2004. Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50(1): 1-17. [9] S. Sehar and A. Hameed, 2011. Extracellular alkaline protease by a newly isolated halophilic Bacillus sp. Global J. Biotech. Biochem. 6(3): 142-148. ABSTRACT Isolation and characterization of three protease producing Bacillus strains from fermented fish One hundred and four bacterial strains were isolated from fermented fish. Of these, 51 strains were found to produce extracellular protease. Three bacterial strains named Tp91, Tp97 and Tp98 were able to grow and synthesize protease with high activity on mediums containing NaCl concentrations that ranged from 0 to 21percent. By using molecular genetic analysis, three bacterial strains were identified as Bacillus sp. Tp91, Bacillus sp. Tp97 and Bacillus sp. Tp98. Optimum biomass and proteolytic activity of the three Bacillus strains were achieved after 24 h of cultivation at 37oC and 200 rpm agitation. Maximum proteolytic activity of the three Bacillus strains were 1045 (Bacillus sp. Tp91), 860 (Bacillus sp. Tp97) and 630 U/mL (Bacillus sp. Tp98). Three Bacillus strains showed inhibitory activity against common gastroenteric bacteria such as Vibrio parahaemolyticus, V. furnissii, Escherichia coli and Salmonella choleraesuis. Three Bacillus strains can be used in fish sauce production. Key words: Fish sauce, Bacillus, peotease.