Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter Xylinum tạo Cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở Quy mô Pilot

53 CHÖÔNG 4. KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 4.1 Laäp boä söu taäp gioáng Do gioáng thu nhaän töø caùc nguoàn khaùc nhau neân böôùc ñaàu tieân chuùng toâi tieán haønh kieåm tra laïi caùc ñaëc tính cuûa loaøi Acetobacter xylinum. 4.1.1 Sô tuyeån Töø 14 nguoàn gioáng vaø maãu thu thaäp nhö ñaõ giôùi thieäu qua baûng 3.1, chuùng toâi tieán haønh phaân laäp, taùch vaø laøm thuaàn thu ñöôïc toång coäng 59 chuûng vi khuaån sinh acid acetic. Treân moâi tröôøng thaïch ñóa, 59 chuûng vi khuaån treân moïc thaønh khuaån laïc töø cô chaát ethanol vaø saûn sinh ra acid höõu cô töông öùng laø acid acetic laøm tan CaCO3 taïo voøng phaân giaûi trong xung quanh khuaån laïc. Keát quaû kieåm tra ban ñaàu xaùc ñònh khaû naêng saûn sinh cellulose cuûa 59 chuûng vi khuaån Acetic cho thaáy: - Sau 24 giôø nuoâi caáy, chæ coù 12 chuûng vi khuaån xuaát hieän lôùp maøng treân beà maët moâi tröôøng ( hình 4.1). - Sau 48 giôø nuoâi caáy, coù theâm 9 chuûng vi khuaån xuaát hieän lôùp maøng treân beà maët moâi tröôøng. - Sau 72 giôø nuoâi caáy, coù theâm 8 chuûng vi khuaån xuaát hieän lôùp maøng treân beà maët moâi tröôøng. - Sau 96 giôø nuoâi caáy, khoâng thaáy xuaát hieän theâm chuûng vi khuaån naøo coù hình thaønh lôùp maøng moûng treân beà maët moâi tröôøng. Hình 4.1 Sô tuyeån nhanh moät soá chuûng vi khuaån coù khaû naêng saûn sinh cellulose 54 Töø 59 chuûng vi khuaån sinh acid acetic, chuùng toâi chæ sô tuyeån ñöôïc 29 chuûøng vi khuaån coù khaû naêng saûn sinh cellulose. 29 chuûng naøy ñöôïc duøng cho nhöõng nghieân cöùu tieáp theo. 4.1.2 Khaûo saùt ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa 29 chuûng vi khuaån 4.1.2.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi hoïc vaø teá baøo hoïc (1) (2) (3) (4) Hình 4.2 Hình aûnh vi theå cuûa moät soá chuûng ñaïi dieän Nhaän xeùt chung ñaëc ñieåm teá baøo hoïc cuûa 29 chuûng sô tuyeån: - Veà hình daïng teá baøo : Ña soá caùc chuûng ñeàu coù teá baøo hình que, tröïc khuaån. Coù 4 chuûng coù daïng caàu tröïc khuaån . 55 - Veà söï saép xeáp teá baøo : Taát caû caùc chuûng teá baøo ñeàu ñöùng rieâng leû. - Kích thöôùc teá baøo thay ñoåi töø 1-3µ m. Ña soá caùc chuûng coù kích thöôùc laø 2µ m. Nhöõng chuûng coù hình daïng teá baøo caàu tröïc khuaån coù kích thöôùc töø 1-2µ m. Ñaùng chuù yù 8 chuûng vi khuaån coù kích thöôùc töø 2-3µ m. Veà ñaëc ñieåm teá baøo , söï khaùc nhau giöõa caùc chuûng chuû yeáu ôû kích thöôùc teá baøo. - Veà ñaëc ñieåm nhuoäm Gram: Taát caû caùc chuûng thuoäc Gram aâm. Coù 2 chuûng keát quaû nhuoäm Gram thay ñoåi khi teá baøo giaø ( Khi non : Gram aâm, khi giaø : Gram döông ). - Khoâng coù khaû naêng di ñoäng. - Bao nhaày: Khi coøn non thì khoâng coù bao nhaày nhöng khi tröôûng thaønh thì coù voû nhaày bao quanh. - Khoâng sinh baøo töû. Hình 4.2 theå hieän hình aûnh vi theå ñaïi dieän cho moät soá chuûng. 4.1.2.2 Ñaëc ñieåm sinh tröôûng treân moâi tröôøng ñaëc Vi sinh vaät khi phaùt trieån treân beà maët moâi tröôøng ñaëc seõ hình thaønh caùc khuaån laïc ñaëc tröng cho chuûng ñoù( hình 4.3). Hình 4.3 Hình aûnh ñaïi theå khuaån laïc moät soá chuûng ñaïi dieän Ñaëc ñieåm sinh tröôûng vaø phaùt trieån treân moâi tröôøng ñaëc : Taát caû caùc chuûng ñeàu taïo khuaån laïc daïng troøn , traéng, ñuïc, ña soá beà maët khuaån laïc trôn boùng vaø caáu truùc khuaån laïc ñoàng nhaát. Sau 3 ngaøy nuoâi caáy, kích thöôùc trung bình cuûa khuaån laïc ñaït töø 3-5 mm (chæ coù 1 chuûng coù khuaån laïc daïng 56 ñieåm). Taát caû caùc chuûng, khuaån laïc ñeàu khoâng coù khaû naêng taïo huyeàn phuø trong nöôùc vaø khuaån laïc saâu thì ñoàng nhaát vaø khoâng sinh khí. Quan saùt söï sinh tröôûng cuûa caùc chuûng doïc theo veát caáy treân moâi tröôøng thaïch nghieâng ñeàu coù daïng daøy, meùp phaúng. 4.1.2.3 Ñaëc ñieåm sinh tröôûng treân moâi tröôøng loûng Taát caû caùc chuûng ñeàu coù khaû naêng taïo maøng. Maøng coù theå daïng phaúng hay xuø xì, khaù nhaày öôùt, noåi, höôùng leân thaønh bình ( phuï luïc). Coù 9 chuûng coù möùc sinh tröôûng maïnh taïo thaønh maøng daøy. Caùc chuûng coøn laïi taïo maøng moûng. 4.1.2.4 Ñaëc ñieåm sinh lyù a.Quan heä vôùi oxygen Hình 4.4 Quan heä vôùi oxy cuûa moät soá chuûng vi khuaån Quan saùt söï sinh tröôûng cuûa caùc chuûng khi nuoâi caáy baèng dòch vi khuaån troän vaøo moâi tröôøng agar chöa ñoâng. Hình 4.4 theå hieän quan heä vôùi oxy cuûa caùc chuûng vi khuaån cho thaáy taát caû caùc chuûng ñeàu thuoäc hieáu khí. b. Quan heä vôùi nhieät ñoä Baûng 4.1 Quan heä vôùi nhieät ñoä Nhieät ñoä nuoâi Caùc veát caáy 200C 300C 370C 450C Thöù nhaát - +++ - - Thöù hai - +++ - - Thöù ba - +++ - - +++: Sinh tröôûng maïnh - : Khoâng sinh tröôûng 57 Quan saùt söï sinh tröôûng cuûa caùc chuûng khi nuoâi caáy ôû 200C, 300C, 370C vaø 450C (baûng 4.1) cho thaáy caùc chuûng phaùt trieån toát trong khoaûng nhieät ñoä 300C. c. Quan heä vôùi pH Taát caû caùc chuûng khaûo saùt ñeàu thuoäc loaïi öa acid ( pH=4-5). Nhö vaäy, veà ñaëc ñieåm sinh lyù, caùc doøng vi khuaån ñeàu thuoäc loaïi hieáu khí , phaùt trieån toát ôû 300C vaø öa acid. 4.1.2.5 Ñaëc ñieåm sinh hoùa Kieåm tra caùc ñaëc ñieåm sinh hoaù theå hieän ñaëc ñieåm ñònh danh loaøi Acetobacter xylinum. Baûng 4.2. Keát quaû kieåm tra caùc ñaëc ñieåm sinh hoaù STT Ñaëc ñieåm Hieän töôïng Keát quaû (+/-) 1 Oxy hoaù ethanol thaønh acetic acid Moâi tröôøng chuyeån maøu vaøng sau ñoù chuyeån thaønh xanh luïc. + 2 Catalase Suûi boït khí + 3 Sinh tröôûng treân moâi tröôøng Hoyer Sinh khoái khoâng phaùt trieån - 4 Chuyeån hoaù glucose thaønh acid Voøng saùng xung quanh khuaån laic + 5 Chuyeån hoaù glycerol thaønh Dihydroxy acetone Voøng CuO xuaát hieän quanh khuaån laïc. + 6 Kieåm tra khaû naêng sinh saéc toá naâu Khoâng coù saéc toá naâu + 7 Kieåm tra khaû naêng toång hôïp cellulose Vaùng vi khuaån xuaát hieän maøu lam + 29 chuûng ñeàu coù chung keát quaû khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm sinh hoaù phaân loaïi nhö trong baûng 4.2. Keát quaû cho thaáy ñaây laø ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa loaøi Acetobacter xylinum. 4.1.3 Kyù hieäu Qua ñaùnh giaù caùc ñaëc tính cuûa Acetobacter vaø caùc ñaëc tính sinh hoùa cuûa Acetobacter xylinum coù theå khaúng ñònh 29 chuûng ñeàu laø Acetobacter xylinum. Do ñoù chuùng toâi ñaët kyù hieäu nhö neâu trong baûng 4.3 58 Baûng 4.3 Kyù hieäu boä söu taäp gioáng Kyù hieäu gioáng Nguoàn gioáng hoaëc nguoàn phaân laäp Ñaëc ñieåm rieâng (neáu coù) Acetobacter xylinum BC1 Vieän Coâng ngheä AÙ chaâu taïi Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC2 Vieän Coâng ngheä AÙ chaâu taïi Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC3 Vieän Coâng ngheä AÙ chaâu taïi Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC4 Vieän Coâng ngheä AÙ chaâu taïi Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC5 Vieän coâng ngheä Thöïc phaåm vaø moâi tröôøng Philippines Acetobacter xylinum BC6 Vieän coâng ngheä Thöïc phaåm vaø moâi tröôøng Philippines Acetobacter xylinum BC7 Tröôøng Ñaïi hoïc Kasetsart Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC8 Tröôøng Ñaïi hoïc Kasetsart Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC9 Tröôøng Ñaïi hoïc Kasetsart Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC10 Tröôøng Ñaïi hoïc Kasetsart Thaùi Lan Acetobacter xylinum BC11 Vieän Sinh hoïc Acetobacter xylinum BC12 Vieän Sinh hoïc Acetobacter xylinum BC13 Tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa TP.HCM Acetobacter xylinum BC14 Tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa TP.HCM Acetobacter xylinum BC15 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (tænh Bulacan- Philippines) Acetobacter xylinum BC16 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (Namli- Philippines) Teá baøo daøi- Maøng daøy Acetobacter xylinum BC17 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (tænh Pulalan- Philippines) Acetobacter xylinum BC18 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (tænh Bulacan- Philippines) Acetobacter xylinum BC19 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (Philippines) Acetobacter xylinum BC20 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát Acetobacter xylinum BC21 Phaân laäp töø dòch giaám nöôùc döøa Acetobacter xylinum BC22 Phaân laäp töø dòch giaám nöôùc döøa Acetobacter xylinum BC23 Phaân laäp töø maãu giaám gaïo Acetobacter xylinum BC24 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát Acetobacter xylinum BC25 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát (Campuchia) Teá baøo daøi- Maøng daøy Acetobacter xylinum BC26 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát Acetobacter xylinum BC27 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát Acetobacter xylinum BC28 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát (Campuchia) Teá baøo daøi- Maøng daøy Acetobacter xylinum BC29 Phaân laäp töø dòch giaám thoát noát 59 4.2 Caùc kieåu leân men treân nhöõng nguoàn nguyeân lieäu khaùc nhau Ñeå thay theá nöôùc döùa giaø, chuùng toâi söû duïng nguyeân lieäu coù chöùa carbohydrate nhö ræ ñöôøng, nöôùc mía, dòch traùi caây pheá thaûi, tinh boät. 4.2.1 Moâi tröôøng ræ ñöôøng 4.2.1.1 Saøng loïc gioáng cho nguoàn nguyeân lieäu ræ ñöôøng Keát quaû cho thaáy 29 chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån treân moâi tröôøng thaïch ræ ñöôøng trong cuøng ñieàu kieän nuoâi caáy ôû nhieät ñoä phoøng vaø thôøi gian nuoâi caáy 4 ngaøy. Treân moâi tröôøng dòch ræ ñöôøng, maät ñoä teá baøo phaùt trieån theå hieän qua baûng 4.4. Cuøng khaûo saùt ôû ñieàu kieän nuoâi caáy nhö nhau, coù söï töông quan giöõa sinh tröôûng phaùt trieån taïo khuaån laïc treân moâi tröôøng ñaëc vaø maät ñoä teá baøo treân moâi tröôøng loûng. Trong 29 chuûng vi khuaån khaûo saùt coù khaû naêng phuø hôïp vôùi moâi tröôøng ræ ñöôøng, chæ coù 6 chuûng phaùt trieån nhanh. Sau 4 ngaøy nuoâi caáy, maät ñoä teá baøo cuûa 6 chuûng naøy ñaït töø 32,11.106 ñeán 46,85.106 teá baøo/ ml. Ñoù laø caùc chuûng Acetobacter xylinum BC8, BC16, BC17, BC18, BC25 vaø BC28. Caû 6 chuûng naøy khi phaùt trieån treân moâi tröôøng ñaëc ñeàu coù söï phaùt trieån nhanh, töông öùng vôùi kích thöôùc cuûa khuaån laïc lôùn. Ñaëc bieät, chuûng A.xylinum BC16 kích thöôùc khuaån laïc ñaït ñöôïc lôùn nhaát (4mm) chæ sau 4 ngaøy nuoâi caáy ( baûng 4.4). Trong caùc boä söu taäp A.xylinum cuûa caùc nhoùm nghieân cöùu veà BC treân theá giôùi, ñöôøng kính lôùn nhaát khuaån laïc cuûa chuûng A.xylinum laø 4,5mm [75,112-120]. Ñöôøng kính khuaån laïc A.xylinum BC16 gaàn vôùi soá lieäu cuûa Kouda (1997), Ishikawa (1998), Sanchez (1999). Trong quaù trình khaûo saùt cho thaáy coù moái töông quan nhaân quaû giöõa ñöôøng kính khuaån laïc treân moâi tröôøng ñaëc vaø khaû naêng taïo maøng treân moâi tröôøng loûng. Moái töông quan naøy ñöôïc nhieàu nhaø nghieân cöùu ñeà caäp vaø löu yù ñeán trong quaù trình tuyeån choïn gioáng [11, 75,89]. 60 Baûng 4.4 Tuyeån choïn gioáng qua söï sinh tröôûng treân moâi tröôøng ñaëc vaø moâi tröôøng loûng Khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån treân moâi tröôøng ræ ñöôøng ñaëc stt Kyù hieäu chuûng vi khuaån Khaû naêng chung Ñöôøng kính khuaån laïc Maät ñoä teá baøo treân moâi tröôøng loûng (trieäu teá baøo/ ml) Thôøi gian xuaát hieän maøng (ngaøy) Ñoä daøy cuûa maøng (mm) 1 A. xylinum BC1 ++ 2-3mm 18,42 3 3 2 A. xylinum BC2 + 1-2mm 11,53 4 1 3 A.xylinum BC3 + Ñieåm 12,7 4 Raát moûng 4 A. xylinum BC4 ++ 1-2mm 18,32 4 2 5 A. xylinum BC5 + 1-2mm 7,12 4 Raát moûng 6 A. xylinum BC6 + Ñieåm 14,78 3 2 7 A. xylinum BC7 + Ñieåm 12,81 4 Raát moûng 8 A. xylinum BC8 +++ 3-4mm 35,62 2 5 9 A.xylinum BC9 ++ 3mm 15,3 4 4 10 A xylinum BC10 ++ 3mm 20,18 3 4 11 A.xylinum BC11 ++ 3mm 22,50 3 3 12 A.xylinum BC12 ++ 3-4mm 18,72 3 4 13 A.xylinum BC13 + Ñieåm 14,66 2 1 14 A.xylinum BC14 ++ 3mm 27,11 3 2 15 A.xylinum BC15 ++ 2-3mm 19,05 4 4 16 A.xylinum BC16 +++ 4mm 46,85 1 9 17 A.xylinum BC17 +++ 3-4mm 40,54 2 9 18 A.xylinum BC18 +++ 3mm 40,07 2 4 19 A.xylinum BC19 ++ 2-3mm 20,25 3 3 20 A.xylinum BC20 +++ 3-4mm 25,63 4 3 21 A.xylinum BC21 +++ 2-3mm 26,71 4 3 22 A.xylinum BC22 + 2mm 9,25 5 Raát moûng 23 A.xylinum BC23 + Ñieåm 8,97 3 Raát moûng 24 A.xylinum BC24 + Ñieåm 16,31 5 Raát moûng 25 A.xylinum BC25 +++ 3-4mm 45,65 2 8 26 A.xylinum BC26 + Ñieåm 5,25 4 4 27 A.xylinum BC27 + Ñieåm 14,32 3 4 28 A.xylinum BC28 +++ 3mm 32,11 1 5 29 A.xylinum BC29 +++ 3mm 26,97 3 4 Ghi chuù : +++: Sinh tröôûng maïnh; ++ : Sinh tröôûng vöøa phaûi; + : Sinh tröôûng yeáu Moät ñaëc ñieåm cuûa vi khuaån A.xylinum caàn ñöôïc löu yù laø söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån chæ môùi laø ñieàu kieän caàn maø chöa phaûi laø ñieàu kieän ñuû ñeå tuyeån choïn gioáng cho hieäu suaát sinh cellulose cao. Qua caùc chæ tieâu tieáp theo cho thaáy, chæ coù 3 chuûng (A.xylinum BC16, BC17 vaø BC25) coù thôøi gian xuaát hieän maøng sôùm nhaát sau 1 ngaøy nuoâi caáy, coù khaû naêng taïo maøng daøy vaø saûn löôïng 61 BC cao nhaát. Ñoä daøy cuûa nhöõng chuûng treân thay ñoåi khoaûng 8-9 mm. Saûn löôïng BC thu ñöôïc töø 715-815 g/ l BC töôi. Khaûo saùt hieäu suaát sinh BC trong leân men chìm chæ tuyeån choïn ñöôïc moät chuûng laø A.xylinum BC 16 ( baûng 4.5). Treân theá giôùi, nguoàn nguyeân lieäu trong leân men BC chuû yeáu söû duïng nöôùc döøa (Philippines) vaø moâi tröôøng toång hôïp töø hoùa chaát. So vôùi ñoái chöùng laø saûn löôïng S-BC thöïc nghieäm do chuùng toâi khaûo saùt treân moâi tröôøng nöôùc döøa ( ñaït 980 g/ l) vaø cuõng so saùnh vôùi caùc keát quaû ñaõ ñöôïc coâng boá [9,16,25,75] cho thaáy saûn löôïng cellulose vi khuaån treân moâi tröôøng ræ ñuôøng chæ ñaït 85 – 90%. Baûng 4.5 Tuyeån choïn gioáng qua saûn löôïng BC trong leân men beà maët vaø leân men chìm treân moâi tröôøng ræ ñöôøng Leân men beà maët (7 ngaøy) Leân men chìm(8 ngaøy) ST T Teân chuûng vi khuaån Ñoä daøy(mm) Saûn löôïng BC(g/l) Leân men laéc BC(g/l) Leân men suïc khí BC(g/l) 1 A.xylinum BC8 5 560 210 Khoâng phaùt trieån 2 A.xylinum BC16 9 805 505 500 3 A.xylinum BC17 9 815 255 250 4 A.xylinum BC18 4 412 105 98 5 A.xylinum BC25 8 715 250 245 6 A.xylinum BC28 5 540 110 72 Nhö vaäy, vôùi cô chaát ræ ñöôøng, ba chuûng A.xylinum BC16; A.xylinum BC17 vaø A.xylinum BC25 phaùt trieån nhanh coù khaû naêng sinh cellulose cao trong leân men beà maët ñaït töø 715-815g BC töôi/ l sau 7 ngaøy nuoâi caáy. Trong leân men chìm treân moâi tröôøng ræ ñöôøng A. xylinum BC16 coù öu theá nhaát ñaït 505g/ l vôùi kieåu leân men laéc vaø 530 g/ l trong leân men chìm kieåu suïc khí sau 8 ngaøy nuoâi caáy ( baûng 4.5). Moät soá hình aûnh chuûng A. xylinum BC16 coù öu theá caû trong leân men beà maët vaø leân men chìm qua hình 4.5. 62 a.Hình ảnh vi thể (x 10000) b.Nhuộm Gram (x1000) c.Khuẩn lạc trên môi trường đặc d.Màng trên môi trường lỏng Hình 4.5 Khaû naêng sinh tröôûng phaùt trieån vaø taïo maøng cuûa A.xylinum BC16 phuø hôïp vôùi moâi tröôøng ræ ñöôøng a vaø b – Quan saùt vi theå c – Khuaån laïc treân moâi tröôøng thaïch d – taïo maøng treân moâi tröôøng loûng 4.2.1.2 Ñoät bieán baèng tia UV choïn loïc doøng coù khaû naêng saûn sinh BC cao treân moâi tröôøng ræ ñöôøng Caùc nhaø khoa hoïc Nhaät baûn cho raèng caùc ñoät bieán ñeà khaùng Sulfagunidine cho BC naêng suaát cao [ 42-44, 101, 108]. a) Aûnh höôûng cuûa tia töû ngoaïi ñeán teá baøo vi khuaån Acetobacter xylinum 63 Keát quaû baûng 4.6 ghi nhaän, vôùi caùc lieàu chieáu xaï laàn löôït laø: 0, 30, 60, 90, 120 vaø 150 giaây; möùc gaây cheát gia taêng töø 94,8 % (ôû 30 s) leân ñeán 99,99% (ôû 120 s). ÔÛ lieàu chieáu xaï 150s möùc gaây cheát laø hoaøn toaøn 100% ( baûng 4.6). Baûng 4.6 Aûnh höôûng cuûa tia töû ngoaïi ñeán teá baøo vi khuaån A. xylinum Lieàu chieáu xaï (s) Soá löôïng teá baøo soáng/ ml dòch Möùc ñoä soáng soùt % Tyû leä gaây cheát % 0 46,00.106 100 0 30 23,92.106 5,20 94,80 60 75,90.104 1,65 98,35 90 55,20.102 0,02 99,98 120 9,20.102 0,01 99,99 150 0 0 100 b) Choïn loïc ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine Töø caùc chuûng vi khuaån Acetobacter xylinum BC16, BC17, BC18, BC25 vaø BC 28 phuø hôïp vôùi moâi tröôøng ræ ñöôøng, tuyeån choïn ñöôïc moät doøng ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine ngaãu nhieân vaø 2 doøng ñoät bieán UV khaùng Sulfaguanidine. Trong ba doøng ñoät bieán treân, hai doøng ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine do chieáu xaï ôû lieàu 60s ñeàu xuaát phaùt töø doøng goác A. xylinum BC16 vaø ñöôïc kyù hieäu laø A.xylinum BC16S1 vaø A.xylinum BC16S2, doøng ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine ngaãu nhieân töø doøng goác A. xylinum BC25 ñöôïc chuùng toâi kyù hieäu laø Acetobacter xylinum BC25S3. c) Khaû naêng leân men cellulose cuûa caùc doøng ñoät bieán treân moâi tröôøng ræ ñöôøng Caùc doøng ñoät bieán coù khaùc bieät so vôùi doøng goác nhö sau (baûng 4.7): - Trong 3 doøng ñoät bieán, maät ñoä teá baøo khoâng coù söï thay ñoåi so vôùi chuûng goác (ñaït töø 46,6-46,91.106 teá baøo/ ml so vôùi chuûng goác A.xylinum BC16 ñaït 46,85.106 teá baøo/ ml hoaëc 45,5.106 teá baøo/ ml so vôùi chuûng goác A.xylinum BC25 ñaït 45,65.106 teá baøo/ ml). - Xeùt ñeán saûn löôïng cellulose trong nuoâi caáy beà maët (S-BC) thì coù söï caûi thieän ôû A.xylinum BC25S3. So vôùi chuûng goác A.xylinum BC25 saûn löôïng S-BC taêng theâm ñöôïc töø 715 g/ l leân 812 g/ l (1,14 laàn). Möùc thay ñoåi saûn löôïng S-BC 64 cuûa caùc doøng A.xylinum BC16 ñoät bieán khoâng ñaùng keå. Nhö vaäy, ñeå thu nhaän S- BC treân moâi tröôøng ræ ñöôøng, chuùng toâi coù theå söû duïng caùc doøng A.xylinum BC16, BC16S1, BC16S2 hoaëc BC25S3. - Xeùt ñeán saûn löôïng cellulose trong nuoâi caáy chìm (A-BC) choïn loïc ñöôïc doøng A.xylinum BC16S1. Saûn löôïng A-BC taêng töø 505g/l (doøng goác) leân 700g/ l ôû doøng ñoät bieán A.xylinum BC16S1 cao gaáp 1,4 laàn. Baûng 4.7 Khaû naêng sinh tröôûng vaø toång hôïp cellulose cuûa caùc doøng ñoät bieán treân moâi tröôøng ræ ñöôøng Teân chuûng,doøng Maät ñoä teá baøo (106 teá baøo/ ml) Saûn löôïng sinh cellulose trong nuoâi caáy beà maët S-BC ( g/ l) Saûn löôïng sinh cellulose trong nuoâi caáy chìm A-BC (g/ l) A.xylinum BC16S1 46,91 800 700 A.xylinum BC16S2 46,60 800 500 A.xylinum BC25S3 45,50 812 355 A.xylinum BC16 46,85 805 505 A.xylinum BC25 45,65 715 350 Veà söï oån ñònh gioáng, trong nuoâi caáy beà maët choïn chuûng goác A.xylinum BC16; trong nuoâi caáy chìm söû duïng doøng A.xylinum BC16S1. Nhaèm boå sung vaøo boä söu taäp gioáng, chuùng toâi tieán haønh raø soaùt laïi caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa doøng A. xylinum BC16S1. Keát quaû veà caùc ñaëc ñieåm hình thaùi hoaøn toøan khoâng thay ñoåi so vôùi doøng goác. Doøng A. xylinum BC16S1 seõ ñöôïc tieáp tuïc nghieân cöùu ôû nhöõng phaàn tieáp theo trong nuoâi caáy chìm. Chuûng goác A. xylinum BC16 ñöôïc söû duïng trong nuoâi caáy beà maët. 4.2.1.3 Nhaân gioáng A. xylinum BC16 vaø A. xylinum BC16S1 Quaù trình nhaân gioáng quyeát ñònh ñeán naêng suaát vaø chaát löôïng BC trong giai ñoaïn leân men. Noäi dung cuûa phaàn naøy nhaèm xaùc ñònh caùc ñieàu kieän cho quaù trình nhaân gioáng phuø hôïp vôùi ñieàu kieän leân men ôû quy moâ pilot ( ñoà thò 4.1). a) Xaùc ñònh thaønh phaàn moâi tröôøng vaø caùc ñieàu kieän nuoâi caáy 65 1. Xaùc ñònh nguoàn N höõu cô 34 36 38 40 42 44 46 48 1 2 3 4 Nguoàn N Si nh k ho ái( tri eäu te á b aøo /m l) BC16 BC16S1 1. Pepton 2. Cao naám men 3. Dòch ñaäu naønh 4. Dòch naám men thuûy phaân 2. Xaùc ñònh toác ñoä quay cuûa maùy laéc 44 45 46 47 48 49 50 51 50 100 150 200 250 300 350 400 Voøng quay (voøng/phuùt) Si nh k ho ái ( tr ie äu te á b aøo / m l) (a) BC16 (b) BC16S1 3. Xaùc ñònh thôøi gian nhaân gioáng 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 1 2 3 4 5 6 7 Thôøi gian nhaân gioáng(ngaøy) Si nh k ho ái( tr ie äu te á b aøo /m l) (a) BC16 (b) BC16S1 4. Xaùc ñònh nhieät ñoä moâi tröôøng 0 10 20 30 40 50 60 25 C 28 C 30 C 32 C 35 C Nhieät ñoä Si nh k ho ái ( tri eäu te á b aøo /m l) BC16 BC16S1 Ñoà thò 4.1 Xaùc ñònh caùc ñieàu kieän nhaân gioáng caáp 2 cuûa A. xylinum BC16 vaø BC16S1 Caùc ñieàu kieän toái öu ñeå nhaân gioáng caáp 2 ( ñoà thò 4.1): - Moâi tröôøng ræ ñöôøng söû duïng nguoàn [N] höõu cô töø dòch naám men thuyû phaân hoaëc dòch ñaäu naønh thay theá nguoàn cao naám men. Caùc nguoàn [N] höõu cô naøy coøn ñoùng vai troø quan troïng cung caáp caùc acid amin vaø chaát kích thích sinh tröôûng cho vi sinh vaät. - Cheá ñoä laéc : 250 voøng/ phuùt. - Thôøi gian nhaân gioáng : 4 ngaøy. - Nhieät ñoä nuoâi caáy : 300C -320C. 66 b) Xaùc ñònh phöông thöùc khuaáy ñaûo nhaân gioáng caáp 3 Baûng 4.8 Keát quaû nhaân gioáng caáp 3 cuûa 2 chuûng BC16 vaø BC 16S1 Thieát bò nhaân gioáng Sinh khoái teá baøo A.xylinum BC16 (trieäu teá baøo/ml) Sinh khoái teá baøo A.xylinum BC16S1 (trieäu teá baøo/ml) Möùc ñoä nhieãm khi nhaân gioáng A.xylinum BC16 Möùc ñoä nhieãm khi nhaân gioáng A.xylinum BC16S1 1. Fermentor 51,18 50,75 _ _ 2. Thoåi khí 47,65 46,90 _ _ 3. Thoåi khí -Hoài löu 49,82 49,11 _ _ ( _ ) :khoâng phaùt hieän Xaùc ñònh phöông thöùc khuaáy ñaûo nhaân gioáng caáp 3 ñöôïc theå hieän qua baûng 4.8. Trong ñieàu kieän chuaån, nhaân gioáng trong fermentor cho löôïng sinh khoái teá baøo cao nhaát ñaït 50,75.106 teá baøo/ml ( A.xylinum BC16S1) vaø 51,18.106 teá baøo/ ml (A.xylinum BC16). Xeáp thöù hai laø nhaân gioáng trong thieát bò coù heä thoáng thoåi khí-hoài löu cho löôïng sinh khoái teá baøo ñaït 49,11.106 teá baøo/ml ( A.xylinum BC16S1) vaø 49,82.106 teá baøo/ ml ( A.xylinum BC16). Vôùi thieát bò coù heä thoáng thoåi khí , tuy löôïng sinh khoái teá baøo vaãn cao trong khoaûng töø 46,9 – 47,65.106 teá baøo/ ml nhöng coù söï suït giaûm trong quaù trình nhaân gioáng. Keát quaû nhaân gioáng khaùc nhau ôû caùc thieát bò treân chuû yeáu laø do söï cung caáp oxy, aùp suaát oxy, söï khuaáy ñaûo moâi tröôøng. Nhöõng vaán ñeà naøy ñaõ ñöôïc nhieàu taùc giaû ñeà caäp [103,110]. Qua thöïc teá saûn xuaát, nhaân gioáng caáp 3 theo phöông thöùc thoåi khí- hoài löu cho keát quaû khoâng coù söï khaùc bieät ñaùng keå so vôùi phöông phaùp nhaân gioáng trong fermentor (ñieàu kieän chuaån). Hieäu suaát nhaân gioáng trong thieát bò thoåi khí- hoài löu ñaït 97% so vôùi ñieàu kieän nhaân gioáng chuaån trong fermentor. Caùc ñieàu kieän nhaân gioáng caáp 3 hoaøn toøan töông töï nhö trong nhaân gioáng caáp 2 vôùi thieát bò coù heä thoáng thoåi khí-hoài löu. 4.2.1.4 Thaønh phaàn moâi tröôøng ræ ñöôøng phuø hôïp kieåu leân men beà maët Keát quaû cuûa phaàn saøng loïc gioáng, caûi thieän gioáng tuyeån choïn A. xylinum BC16 phuø hôïp vôùi kieåu leân men beà maët (cho hieäu suaát sinh cellulose cao, cho ñoä daøy 67 maøng lôùn). A. xylinum BC16 ñaõ xaùc ñònh caùc ñieàu kieän nhaân gioáng tieáp tuïc khaûo saùt trong phöông thöùc leân men beà maët treân moâi tröôøng ræ ñöôøng. Choïn nguoàn [N] höõu cô phuø hôïp moâi tröôøng leân men ræ ñöôøng Söû duïng boán moâi tröôøng ræ ñöôøng coù nguoàn [N] höõu cô khaùc nhau laø pepton, cao naám men, dòch ñaäu naønh vaø dòch naám men thuyû phaân. Veà maät ñoä teá baøo, caû 4 moâi tröôøng ræ ñöôøng vôùi 4 nguoàn [N] höõu cô khaùc nhau ñeàu cho maät ñoä teá baøo dao ñoäng töø 30,5.106 ñeán 42,65.106 teá baøo / ml. Moâi tröôøng ræ ñöôøng vôùi nguoàn [N] höõu cô laø cao naám men cho maät ñoä teá baøo cao nhaát ñaït 42,65.106 teá baøo / ml. Moâi tröôøng ræ ñöôøng vôùi nguoàn [N] höõu cô laø dòch naám men thuyû phaân vaø dòch ñaäu naønh cuõng cho maät ñoä teá baøo oån ñònh ôû möùc khoûang 42,15.106 teá baøo/ ml sau 4 ngaøy nuoâi caáy. Söû duïng pepton cho maät ñoä teá baøo thaáp nhaát. Töông öùng nhö vaäy, xeùt khaû naêng saûn sinh ra BC, moâi tröôøng söû duïng nguoàn [N] höõu cô laø dòch naám men thuyû phaân thu ñöôïc saûn löôïng BC töôi ñaït 905g/ l töông ñöông vôùi BC khoâ ñaït 7,5 g/ l moâi tröôøng ( ñoà thò 4.2). Töø saûn löôïng BC thu ñöôïc, so saùnh giaù thaønh giöõa caùc nguoàn [N] höõu cô, tính oån ñònh vaø khaû naêng ñaùp öùng nhu caàu leân men quy moâ lôùn, choïn nguoàn dòch naám men thuyû phaân hoøan toøan coù theå thay theá cao naám men truyeàn thoáng. Nguoàn dòch chieát naám men coù thaønh phaàn oån ñònh nhö ñaõ trình baøy ôû phuï luïc, ñöôïc söû duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tyû leä dòch chieát naám men Vôùi 5 möùc tyû leä dòch naám men, maät ñoä vi khuaån trong dòch leân men khoâng coù söï khaùc bieät ôû 4 möùc 3%, 5%, 7% vaø 9% ñeàu ñaït töø 45,86.106 teá baøo/ ml ñeán 45,92.106 teá baøo/ ml. ÔÛ möùc thaáp 1%, maät ñoä teá baøo thaáp hôn ñaït 39,85.106 teá baøo/ ml. Xeùt chæ tieâu quan troïng laø saûn löôïng BC sinh ra, löôïng BC thu ñöôïc cao nhaát khi söû duïng moâi tröôøng ræ ñöôøng vôùi noàng ñoä 5% ñeán 9% dòch chieát naám men, ñaït 910-918g BC töôi/ lít moâi tröôøng vaø BC khoâ ñaït 7,5 g/ l ñeán 7,55 g/ l moâi tröôøng. 68 Tyû leä dòch naám men thuyû phaân laø 5% choïn cho caùc nghieân cöùu tieáp theo. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tyû leä ræ ñöôøng Nguoàn [C] töø ræ ñöôøng chính laø cô chaát ñeå vi khuaån phaùt trieån vaø sinh toång hôïp cellulose [15]. Tìm hieåu aûnh höôûng cuûa noàng ñoä carbon ñoái vôùi vieäc sinh toång hôïp cellulose, chuùng toâi thay ñoåi tyû leä ræ ñöôøng vôùi 4 möùc laø 2%, 4%, 6% vaø 8%, vaø khoâng thay ñoåi caùc thaønh phaàn khaùc. 1.Xaùc ñònh nguoàn [N]höõu cô 600 700 800 900 1000 1 2 3 4 Nguoàn [N] Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) 1. Pepton 2. Cao naám men 3. Dich ñaäu naønh 4. Dòch naám men thuûy phaân 2.Xaùc ñònh tyû leä dòch naám men thuûy phaân 600 700 800 900 1000 Tyû leä[N] % Sa ûn lö ôïn gB C (g /l) 3.Xaùc ñònh tyû leää ræ ñöôøng 500 600 700 800 900 1000 Tyû leä [C] % Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) Ñoà thò 4.2 Thaønh phaàn moâi tröôøng ræ ñöôøng phuø hôïp kieåu leân men beà maët Vôùi noàng ñoä ræ ñöôøng baèng 4% vaø 6% löôïng BC cao nhaát ñaït 915-922g BC töôi/ lít moâi tröôøng vaø töông öùng laø 7,57g BC khoâ/ lít moâi tröôøng. Noàng ñoä ræ ñöôøng taêng leân 8% coù xu höôùng öùc cheá quaù trình sinh toång hôïp cellulose vi khuaån. Hieän töôïng naøy xaûy ra do moái lieân quan vôùi maät ñoä teá baøo trong quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån A. xylinum. Noàng ñoä ñöôøng cao daãn ñeán quaù trình haáp thu nguoàn dinh döôõng keùm do taïo söï cheânh leäch aùp suaát thaåm thaáu cuûa teá baøo [1]. Noàng ñoä ræ ñöôøng quaù thaáp seõ khoâng ñuû cô chaát cho quaù trình toång hôïp BC. Giöõa 2 tyû leä, 4% ræ ñöôøng laø tyû leä thích hôïp. Vaäy moâi tröôøng ræ ñöôøng 4% coù boå sung dòch naám men thuûy phaân 5% laø moâi tröôøng ræ ñöôøng phuø hôïp trong leân men beà maët vôùi A.xylinum BC16. 4.2.1.5 Thaønh phaàn moâi tröôøng ræ ñöôøng phuø hôïp kieåu leân men chìm Keát quaû cuûa quaù trình saøng loïc gioáng vaø tuyeån choïn gioáng thu nhaän A. xylinum BC16S1 laø doøng phaùt trieån nhanh cho hieäu suaát sinh BC cao treân moâi tröôøng ræ ñöôøng trong ñieàu kieän nuoâi caáy chìm. 69 Caùc keát quaû choïn nguoàn [N] höõu cô phuø hôïp, khaûo saùt tyû leä [C], tyû leä dòch naám men thuûy phaân nhaèm xaùc ñònh thaønh phaàn moâi tröôøng vôùi A. xylinum BC16S1 ñöôïc theå hieän qua ñoà thò 4.3. 1.Xaùc ñònh nguoàn [N]höõu cô 500 550 600 650 700 750 800 1 2 3 4 Nguoàn ä[N] Sa ûn lö ôïn g B C tö ôi g /l) 1. Pepton 2. Cao naám men 3. Dich ñaäu naønh 4. Dòch naám men thuûy phaân 2.Xaùc ñònh tyû leä dòch naám men thuûy phaân 500 550 600 650 700 750 Tyû leä (N] % Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) 3.Xaùc ñònh tyû leä ræ ñöôøng 500 550 600 650 700 750 800 Tyû leä ræ ñöôøng % Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) Ñoà thò 4.3 Thaønh phaàn moâi tröôøng ræ ñöôøng phuø hôïp kieåu leân men chìm - Xeùt treân 4 nguoàn [N] höõu cô khaùc nhau trong moâi tröôøng leân men ræ ñöôøng, saûn löôïng A-BC cao nhaát khi leân men treân caùc moâi tröôøng ræ ñöôøng söû duïng cao naám men, dòch ñaäu naønh vaø dòch naám men thuyû phaân (ñaït 710-718g/ l), thaáp nhaát laø moâi tröôøng söû duïng pepton (ñaït 650g/ l). Xeùt tính hieäu quaû kinh teá vaø söï khaùc bieät khoâng ñaùng keå saûn löôïng A-BC, chuùng toâi choïn dòch naám men thuyû phaân boå sung vaøo moâi tröôøng leân men ræ ñöôøng ñeå gia taêng tyû leä [N] vaø boå sung chaát kích thích sinh tröôûng. - Vôùi 5 möùc tyû leä dòch naám men thuyû phaân töø 1% ñeán 9%, saûn löôïng BC coù xu höôùng taêng daàn töø möùc 1% ñeán 5% (töø 560 g/ l taêng leân 712 g/ l) vaø oån ñònh ôû caùc möùc töø 5% ñeán 9% (ñaït 710-715 g BC töôi/ l). Möùc 5% tyû leä dòch naám men thuyû phaân laø möùc ñöôïc choïn cho thí nghieäm keá tieáp. - Khaûo saùt caùc tyû leä ræ ñöôøng töø möùc 2% ñeán 8%. Saûn löôïng A-BC coù xu höôùng taêng daàn töø möùc 2% ñeán 6% ræ ñöôøng. Saûn löôïng BC ñaït ñöôïc cao nhaát laø 780 g/ l khi söû duïng moâi tröôøng ræ ñöôøng 6%. ÔÛ möùc 8% ræ ñöôøng, saûn löôïng A- BC coù xu höôùng giaûm coøn 650 g A-BC töôi/ lít. Vaäy, nguoàn [N] höõu cô ñöôïc choïn laø dòch chieát naám men thuyû phaân 5%, tyû leä ræ ñöôøng laø 6% laø moâi tröôøng ræ ñöôøng phuø hôïp trong leân men chìm vôùi vi khuaån A.xylinum BC16S1. 70 4.2.2. Moâi tröôøng nöôùc mía. Nhöõng thaêm doø ban ñaàu cho thaáy vôùi haøm löôïng dinh döôõng cao, nöôùc mía pha loõang coù theå ñöôïc söû duïng laøm moâi tröôøng saûn xuaát cellulose vi khuaån. Tuy nhieân caùc nghieân cöùu chæ môùi döøng laïi ôû söï phoái troän 2 nguyeân lieäu nöôùc döøa vaø nöôùc mía vôùi caùc chuûng gioáng quen thuoäc treân moâi tröôøng nöôùc döøa [8]. 4.2.2.1 Saøng loïc gioáng phuø hôïp vôùi moâi tröôøng nöôùc mía Thoâng qua caùc chæ tieâu saøng loïc gioáng, thu nhaän ñöôïc keát quaû qua baûng 4.9: Baûng 4.9 Tuyeån choïn gioáng phaùt trieån treân moâi tröôøng nöôùc mía thoâng qua söï phaùt trieån treân moâi tröôøng ñaëc vaø loûng Khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån treân moâi tröôøng ræ ñöôøng ñaëc Stt Kyù hieäu chuûng vi khuaån Khaû naêng chung Ñöôøng kính khuaån laïc Maät ñoä teá baøo treân moâi tröôøng loûng (trieäu teá baøo/ ml) 1 Acetobacter xylinum BC1 ++ 2-3mm 16,55 2 Acetobacter xylinum BC2 ++ 1-2mm 12,45 3 Acetobacter xylinum BC3 + Ñieåm 12,06 4 Acetobacter xylinum BC4 ++ 1-2mm 15,73 5 Acetobacter xylinum BC5 + 1-2mm 11,22 6 Acetobacter xylinum BC6 + Ñieåm 15,50 7 Acetobacter xylinum BC7 +++ 3-4mm 32,80 8 Acetobacter xylinum BC8 +++ 3-4mm 40,58 9 Acetobacter xylinum BC9 ++ 3mm 16,72 10 Acetobacter xylinum ._.BC10 ++ 3mm 21,09 11 Acetobacter xylinum BC11 +++ 3mm 23,34 12 Acetobacter xylinum BC12 ++ 3-4mm 20,05 13 Acetobacter xylinum BC13 + Ñieåm 16,67 14 Acetobacter xylinum BC14 +++ 3mm 29,36 15 Acetobacter xylinum BC15 ++ 2-3mm 20,92 16 Acetobacter xylinum BC16 +++ 3-4mm 45,95 17 Acetobacter xylinum BC17 +++ 4mm 45,08 18 Acetobacter xylinum BC18 +++ 3mm 48,15 19 Acetobacter xylinum BC19 ++ 2-3mm 21,62 20 Acetobacter xylinum BC20 +++ 3-4mm 24,35 21 Acetobacter xylinum BC21 +++ 2-3mm 28,01 22 Acetobacter xylinum BC22 ++ 2mm 16,25 23 Acetobacter xylinum BC23 + Ñieåm 17,33 24 Acetobacter xylinum BC24 + Ñieåm 18,52 25 Acetobacter xylinum BC25 +++ 3-4mm 41,76 26 Acetobacter xylinum BC26 + Ñieåm 14,23 27 Acetobacter xylinum BC27 + Ñieåm 17,92 28 Acetobacter xylinum BC28 +++ 3mm 45,64 29 Acetobacter xylinum BC29 +++ 3mm 27,08 Ghi chuù: +++: Sinh tröôûng maïnh; ++: Sinh tröôûng vöøa phaûi; +: Sinh tröôûng yeáu - Xeùt treân möùc ñoä sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa khuaån laïc coù 8 chuûng phaùt trieån nhanh treân moâi tröôøng nöôùc mía. 71 - Veà yeáu toá maät ñoä teá baøo trong moâi tröôøng loûng thu ñöôïc 7 chuûng phaùt trieån nhanh, maät ñoä teá baøo dao ñoäng töø 32,80.106 ñeán 48,15.106 teá baøo/ml (ñaùng chuù yù laø coù 6 chuûng truøng vôùi caùc chuûng sô tuyeån treân moâi tröôøng ræ ñöôøng). Baûy chuûng coù maät teá baøo cao laø A. xylinum BC7, BC8, BC16, BC17, BC18, BC25, BC28. Söï töông öùng giöõa möùc ñoä phaùt trieån cuûa khuaån laïc vaø maät ñoä teá baøo bieåu hieän roõ nhaát ôû A.xylinum BC17, ñöôøng kính khuaån laïc ñaït 4 mm sau 5 ngaøy nuoâi caáy vaø maät ñoä teá baøo ñaït 45,08.106 teá baøo/ ml. - Caû 7 chuûng ñeàu phaùt trieån cho löôïng BC cao khi leân men beà maët, thoâng qua chæ tieâu ñoä daøy maøng vaø saûn löôïng S-BC. Tuy nhieân, qua khaûo saùt hieäu suaát sinh cellulose trong nuoâi caáy chìm chæ saøng loïc ñöôïc 1 chuûng duy nhaát laø A. xylinum BC17 cho hieäu suaát sinh cellulose cao ( baûng 4.10). Baûng 4.10 Tuyeån choïn gioáng phaùt trieån nhanh treân moâi tröôøng nöôùc mía coù khaû naêng saûn sinh cellulose cao Leân men beà maët Leân men chìm stt Teân chuûng vi khuaån Ñoä daøy (mm) Saûn löôïng BC (g/l) Leân men laéc BC (g/l) Leân men suïc khí BC (g/l) 1 A.xylinum BC7 5 740 Khoâng phaùt trieån Khoâng phaùt trieån 2 A.xylinum BC8 5 736 Khoâng phaùt trieån Khoâng phaùt trieån 3 A.xylinum BC16 5 725 115 90 4 A.xylinum BC17 9 810 510 480 5 A.xylinum BC18 5 755 380 365 6 A.xylinum BC25 6 750 205 186 7 A.xylinum BC28 4 800 95 50 Trong caùc thí nghieäm tieáp theo nhaèm söû duïng nöôùc mía laø nguyeân lieäu leân men, chuùng toâi söû duïng A. xylinum BC17 laø chuûng thích hôïp cho caû hai kieåu leân men beà maët vaø leân men chìm treân moâi tröôøng nöôùc mía. 72 4.2.2.2 Nhaân gioáng A. xylinum BC17 Dieãn bieán sinh khoái teá baøo A.xylinum BC17 theo caùc ñieàu kieän nhaân gioáng caáp 2 qua ñoà thò 4.4 cho thaáy: - Moâi tröôøng nöôùc mía söû duïng nguoàn [N] höõu cô töø dòch naám men thuûy phaân, dòch chua ñaäu naønh coù theå thay theá nguoàn [N] höõu cô truyeàn thoáng laø cao naám men. - Sinh khoái teá baøo taêng daàn theo toác ñoä quay cuûa maùy laéc töø 100-250 voøng/ phuùt vaø giaûm daàn khi toác ñoä laéc taêng leân. - Thôøi gian nhaân gioáng : 5 ngaøy . Maät ñoä gioáng ñaït 51.106 teá baøo/ ml. - Nhieät ñoä nuoâi caáy :28-320C . Ngoaøi khoûang nhieät ñoä naøy vi khuaån khoâng coù daáu hieäu phaùt trieån. 1.Xaùc ñònh nguoàn [N]höõu cô 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 2 3 4 Nguoàn [N] Si nh k ho ái( tri eäu te á b aøo /m l) 1. Pepton 2. Cao naám men 3. Dòch ñaäu naønh 4. Dòch naám men thuûy phaân 2. Xaùc ñònh toác ñoä quay cuûa maùy laéc 42 43 44 45 46 47 48 49 50 100 150 200 250 300 350 400 Toác ñoä laéc (voøng/phuùt) Si nh k ho ái( tri eäu te á b aøo /m l) 3. Xaùc ñònh thôøi gian nhaân gioáng 30 35 40 45 50 55 1 2 3 4 5 6 7 Thôøi gian(ngaøy) Si nh k ho ái( tri eâu te á b aøo /m l) 4.Xaùc ñònh nhieät ñoä nuoâi caáy 0 10 20 30 40 50 60 25 C 28 C 30 C 32 C 35 C Nhieät ñoä nuoâi caáy Si nh k ho ái ( tri eäu te á b aøo /m l Ñoà thò 4.4 Xaùc ñònh caùc ñieàu kieän nhaân gioáng caáp 2 cuûa A.xylinum BC17 73 Xaùc ñònh phöông thöùc nhaân gioáng caáp 3. Vôùi 3 phöông aùn nhaân gioáng caáp 3, keát quaû theå hieän qua baûng 4.11. Baûng 4.11 Keát quaû nhaân gioáng caáp 3 vi khuaån A.xylinum BC 17 Thieát bò nhaân gioáng Sinh khoái teá baøo A.xylinumBC17 (trieäu teá baøo/ml) Möùc ñoä nhieãm 1. Fermentor 50,78 _ 2. Thoåikhí 48,60 _ 3. Thoåikhí -Hoài löu 50,08 _ (_): Khoâng nhieãm Nhaân gioáng caáp 3 trong thieát bò leân men thoåi khí-hoài löu ñaït 98% so vôùi nhaân gioáng trong fermentor, tuy nhieân maät ñoä sinh khoái teá baøo khoâng coù söï khaùc bieät lôùn. Ñieàu kieän nhaân gioáng cuûa A. xylinum BC17: Söû duïng moâi tröôøng dòch nöôùc mía boå sung dòch chieát naám men thuûy phaân, cheá ñoä maùy laéc 250 voøng/ phuùt, thôøi gian nhaân gioáng 5 ngaøy, nhieät ñoä 28oC – 32oC. Nhaân gioáng caáp 3 trong fermentor hoaëc thieát bò coù heä thoáng thoåi khí-hoài löu. 4.2.2.3 Thaønh phaàn moâi tröôøng nöôùc mía phuø hôïp kieåu leân men beà maët vaø leân men chìm BC Caùc keát quaû choïn nguoàn [N] höõu cô phuø hôïp, tyû leä dòch naám men thuûy phaân vaø tyû leä [C] nhaèm xaùc ñònh thaønh phaàn moâi tröôøng leân men vi khuaån A. xylinum BC17 bieåu dieãn qua nhoùm ñoà thò 4.5. Treân moâi tröôøng nöôùc mía cho caû 2 kieåu leân men beà maët vaø leân men chìm vôùi vi khuaån A.xylinum BC17, nguoàn [N] höõu cô phuø hôïp laø dòch naám men thuyû phaân 5%, tyû leä dòch nöôùc mía laø 10% cho saûn löôïng BC cao. Saûn löôïng S-BC ñaït 923± 3g BC töôi/ lít moâi tröôøng, töông ñöông 7,56± 0,2 g BC khoâ/ lít moâi tröôøng. Saûn löôïng A-BC ñaït 709± 1g BC töôi/ lít moâi tröôøng, töông ñöông 5,9 ± 0,2 g BC khoâ/ lít moâi tröôøng. 74 1.Xaùc ñònh nguoàn [N]höõu cô 0 200 400 600 800 1000 1 2 3 4 Nguoàn N Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) S-BC A-BC 1. Pepton 2. Cao naám men 3. Dich ñaäu naønh 4. Dòch naám men thuûy phaân 2.Xaùc ñònh tyû leä dòch naám men thuûy phaân 0 200 400 600 800 1000 Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) S-BC A-BC 3.Xaùc ñònh tyû leä nöôùc mía 0 200 400 600 800 1000 Tyû leä nöôùc mía Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) S-BC A-BC 4.So saùnh caùc moâi tröôøng 0 200 400 600 800 1000 1200 1 2 3 Caùc moâi tröôøng toái öu Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) S-BC A-BC 1. Nöôùc döøa 2.Ræ ñöôøng 3.Nöôùc mía Ñoà thò 4.5 Thaønh phaàn moâi tröôøng nöôùc mía phuø hôïp kieåu leân men beà maët vaø leân men chìm So saùnh caùc moâi tröôøng qua ñoà thò 4.5: - Moâi tröôøng ræ ñöôøng: Saûn löôïng S-BC thu ñöôïc laø 915± 5g BC töôi/ lít moâi tröôøng ræ ñöôøng, töông öùng vôùi 7,55 ± 0,2 g BC khoâ/ lít moâi tröôøng. Saûn löôïng S- BC trong leân men moâi tröôøng nöôùc döøa giaø ñaït 985g BC töôi/ lít moâi tröôøng, töông öùng 8,1 g BC khoâ/ lít. So vôùi ñoái chöùng laø moâi tröôøng truyeàn thoáng nöôùc döøa giaø, hieäu suaát sinh S-BC treân moâi tröôøng ræ ñöôøng ñaït khoaûng 93%. - Moâi tröôøng nöôùc mía: Saûn löôïng S-BC thu ñöôïc laø 923± 3 g BC töôi/ lít moâi tröôøng nöôùc mía, töông öùng vôùi 7,56 ± 0,2 g BC khoâ/ lít moâi tröôøng. So vôùi ñoái chöùng laø moâi tröôøng truyeàn thoáng nöôùc döøa giaø, hieäu suaát sinh S-BC treân moâi tröôøng nöôùc mía ñaït khoaûng 94%. 75 - Saûn löôïng A-BC treân hai moâi tröôøng ræ ñöôøng vaø nöôùc mía cao hôn so vôùi moâi tröôøng truyeàn thoáng nöôùc döøa giaø khoûang 1,2 laàn. - So vôùi cacù coâng boá cuûa caùc taùc giaû khaùc, caû saûn löôïng S-BC thu ñöôïc treân moâi tröôøng ræ ñöôøng vaø nöôùc mía laø töông ñöông, saûn löôïng A-BC ñaït khoaûng 75% [56, 75, 112- 120] 4.2.3 Moät soá moâi tröôøng khaùc 4.2.3.1 Moâi tröôøng taän duïng phuï phaåm traùi caây Nghieân cöùu naøy nhaèm leân men saûn xuaát BC töø nguoàn nguyeân lieäu nöôùc quaû, cuï theå laø nöôùc eùp maét döùa vaø phuï phaåm xoaøi – döùa töø quy trình saûn xuaát xoaøi – döùa ñoùng hoäp cuûa caùc nhaø maùy cheá bieán thöïc phaåm (Bình Döông) baèng caùc phöông phaùp leân men khaùc nhau. Tuyeån choïn nhanh caùc chuûng vi khuaån A.xylinum BC7, BC8, BC16, BC17, BC18, BC25, BC28 treân moâi tröôøng dòch traùi caây, chuùng toâi saøng loïc ñöôïc 4 chuûng saûn sinh cellulose treân moâi tröôøng dòch traùi caây. Ñoù laø A.xylinum BC16, BC17, BC18, BC28. Saûn löôïng BC thu ñöôïc töø 2 moâi tröôøng dòch traùi caây vôùi caùc kieåu leân men beà maët, laéc vaø suïc khí theå hieän qua baûng 4.12 vaø baûng 4.13. So saùnh vôùi caùc moâi tröôøng khaùc ( nöôùc döøa giaø, ræ ñöôøng, nöôùc mía, toång hôïp), roõ raøng saûn löôïng BC thu ñöôïc töø caùc moâi tröôøng phuï phaåm traùi caây chæ ñaït khoaûng 70% ( vôùi A.xylinum BC18 laø chuûng cho hieäu quaû cao nhaát). Tuy nhieân vieäc söû duïng nguoàn phuï phaåm naøy coøn coù yù nghóa giaûi quyeát oâ nhieãm moâi tröôøng. Saûn löôïng BC khoâng cao cuõng coøn do khaâu tuyeån choïn gioáng chöa ñaày ñuû. Trong giôùi haïn cuûa ñeà taøi, chuùng toâi chæ döøng laïi ôû möùc thaêm doø ban ñaàu. Baûng 4.12 Saûn löôïng BC töôi thu ñöôïc töø moâi tröôøng phuï phaåm traùi caây (g/l) Moâi tröôøng maét döùa Moâi tröôøng phuï phaåm xoaøi döùa Chuûng vi khuaån Beà maët Laéc Suïc khí Beà maët Laéc Suïc khí A.xylinumBC16 498 0,00 0,00 400 0,00 0,00 A.xylinumBC17 532 308 485 406 325 450 A.xylinumBC18 650 455 520 572 396 445 A.xylinumBC28 480 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 76 Baûng 4.13 Saûn löôïng BC khoâ thu ñöôïc töø moâi tröôøng phuï phaåm traùi caây (g/l) Moâi tröôøng maét döùa Moâi tröôøng phuï phaåmxoaøi döùa Chuûng vi khuaån Beà maët Laéc Suïc khí Beà maët Laéc Suïc khí A.xylinumBC16 3,95 0,00 0,00 3,10 0,00 0,00 A.xylinumBC17 4,10 2,57 3,85 3,13 2,94 3,65 A.xylinumBC18 5,59 3,62 4,09 4,61 3,01 3,64 A.xylinumBC28 3,80 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4.2.3.2 Khaû naêng taïo BC cuûa moät soá chuûng A.xylinum khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng tinh boät thuûy phaân Quaù trình leân men cellulose vi khuaån trong coâng nghieäp tieâu thuï moät löôïng lôùn cô chaát ñöôøng, ít nhieàu aûnh höôûng ñeán giaù thaønh. Chuùng toâi tieán haønh thaêm doø söû duïng nguoàn nguyeân lieäu tinh boät saün coù, reû tieàn ñeå leân men BC. Tinh boät ñöôïc thuûy phaân baèng nguoàn amylase cuûa malt. Trong giôùi haïn chæ döøng laïi ôû möùc thaêm doø( laøm tieàn ñeà cho vieäc môû roäng caùc nguoàn nguyeân lieäu saûn xuaát cellulose vi khuaån phuø hôïp ôû Vieät Nam), chuùng toâi söû duïng hai moâi tröôøng hoùa chaát toång hôïp ñaõ ñöôïc coâng boá [85], trong ñoù glucose ñöôïc thay theá baèng nguoàn tinh boät thuûy phaân bôûi amylase ( baûng 4.14). Qua thaêm doø 4 chuûng vi khuaån, A.xylinum BC16 coù öu theá treân caû hai moâi tröôøng tinh boät, saûn löôïng S-BC khoaûng 580-585 g BC töôi/ l moâi tröôøng, ñaït 70% so vôùi caùc moâi tröôøng toái öu ræ ñöôøng vaø nöôùc mía. So vôùi moâi tröôøng toång hôïp (Moon Soo Heo vaø Hong Joo Son, 2001) [85] saûn löôïng S-BC ñaït khoaûng 80%. Baûng 4.14 Saûn löôïng BC thu töø moâi tröôøng tinh boät ( g/l ) Moâi tröôøng tinh boät (TB1) Moâi tröôøng tinh boät (TB2) Chuûng vi khuaån S-BC A-BC S-BC A-BC A.xylinum BC16 680 320 685 350 A.xylinum BC16S1 545 575 508 550 A.xylinum BC17 685 280 650 285 A.xylinum BC18 420 259 450 280 77 Doøng A.xylinum BC16S1 vaãn coù öu theá trong leân men chìm, cho saûn löôïng A-BC laø 550-575 g BC töôi/ lít moâi tröôøng. Caùc taùc giaû Moon Soo Heo vaø Hong Joo Son( 2001) [85] chæ khaûo saùt ôû giai ñoaïn leân men tónh, neân phaàn naøy chuùng toâi chæ so saùnh vôùi caùc moâi tröôøng toái öu maø chuùng toâi ñaõ khaûo saùt treân ñaây. Möùc saûn löôïng naøy chæ ñaït khoaûng 65-75% so vôùi caùc moâi tröôøng toái öu ræ ñöôøng, nöôùc mía. Keát quaû treân coøn do aûnh höôûng cuûa khaâu tuyeån choïn gioáng. Muïc ñích khaûo saùt naøy chæ laø thaêm doø ñeå môû roäng nguoàn nguyeân lieäu leân men cellulose vi khuaån. 78 4.3 Caùc ñieàu kieän nuoâi caáy aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men. Tieáp theo caàn ñaùnh giaù caùc yeáu toá aûnh höôûng quaù trình leân men BC : 4.3.1 Aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu moâi tröôøng 0 200 400 600 800 1000 pH=3 pH=3.5 pH=4 pH=4.5 pH=5 pH=5.5 pH=6 Sa ûn lö ôïn gB C g /l S-BC A-BC Ñoà thò 4.6 Aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu ñeán saûn löôïng BC trong leân men beà maët vaø leân men chìm treân moâi tröôøng ræ ñöôøng Aûnh höôûng cuûa pH (3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6) ñeán saûn löôïng S-BC vaø A-BC theå hieän qua ñoà thò 4.6. Qua 2 khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu ñeán saûn löôïng S-BC vaø A-BC coù moät soá nhaän xeùt nhö sau: pH dao ñoäng töø 4,0 ñeán 4,5 cho saûn löôïng BC cao (saûn löôïng S-BC ñaït töø 910-915g töôi/ lít moâi tröôøng, saûn löôïng A-BC ñaït töø 750-760 g/ lít moâi tröôøng). Ngoaøi khoaûng pH=4,0 -4,5 tuy maät ñoä teá baøo cao vaãn khoâng quyeát ñònh ñeán saûn löôïng BC cao. Moät soá caùc nghieân cöùu chöùng minh ñöôïc pH ngoaøi khoaûng [4,0-4,5], tuy vaãn naèm trong khoaûng pH ñeå teá baøo sinh tröôûng toát nhöng do enzyme sinh toång hôïp cellulose hoaït ñoäng keùm hoaëc kích thích hoaït ñoäng cuûa enzyme cellulase daãn ñeán giaûm löôïng BC thu ñöôïc [88 ]. Do ñoù, ñieàu kieän veà maät ñoä teá baøo cao chæ môùi laø ñieàu kieän caàn maø chöa ñuû. Moät soá caùc baùo caùo khaùc cho thaáy, tuy maät ñoä vi khuaån A. xylinum cao nhöng neáu tyû leä caùc teá baøo khoâng coù khaû naêng toång hôïp cellulose (kyù hieäu laø Cel-) cao, cuõng seõ daãn ñeán söï suït giaûm saûn löôïng BC ( theo Krystynowicz, 2002) [57,88 ]. Trong leân men BC quy moâ lôùn, ñeå traùnh söï nhieãm taïp, xu höôùng leân men trong ñieàu kieän pH thaáp ñaõ ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc coâng boá [52,93]. Töø thöïc 79 nghieäm, chuùng toâi nhaän thaáy pH ban ñaàu toái öu laø 4-4,5. ÔÛ pH=3,5 saûn löôïng S- BC thu ñöôïc laø 768 g/ l moâi tröôøng, baèng 84% so vôùi moâi tröôøng pH toái öu. Saûn löôïng A-BC thu ñöôïc laø 565 g/ l moâi tröôøng, baèng 75% so vôùi moâi tröôøng pH toái öu. Tuy saûn löôïng BC noùi chung chæ ñaït töø 75-84% nhöng haïn cheá ñöôïc söï nhieãm taïp trong leân men quy moâ lôùn. Vaäy: - Trong ñieàu kieän leân men chuaån, coù theå khoáng cheá ñöôïc söï nhieãm taïp, pH ban ñaàu toái öu laø pH =4-4,5 cho saûn löôïng caû S-BC vaø A-BC cao (S-BC = 915± 5 g/ l; A-BC = 755± 5 g/ l). - Trong ñieàu kieän caàn haïn cheá söï nhieãm taïp, pH =3,5 laø möùc ñöôïc choïn. Tuy chæ ñaït saûn löôïng S-BC baèng 84% vaø A-BC chæ baèng 75% so vôùi ñieàu kieän chuaån, nhöng haïn cheá ñöôïc söï nhieãm taïp trong leân men. Ñieàu naøy phuø hôïp vôùi xu höôùng tuyeån choïn gioáng A.xylinum chòu pH thaáp [52,93]. 4.3.2 Aûnh höôûng cuûa löôïng gioáng ban ñaàu vaø thôøi gian leân men Löôïng gioáng ban ñaàu vaø thôøi gian leân men laø 2 yeáu toá quan troïng aûnh höôûng trong quaù trình leân men cellulose vi khuaån. Vôùi caùc khaûo saùt thôøi gian leân men töø 4-8 ngaøy, phoái hôïp vôùi tyû leä gioáng thay ñoåi 5 möùc töø 4% ñeán 12%, keát quaû thu S-BC vaø A-BC qua baûng 4.15 vaø baûng 4.16 . Baûng 4.15 Dieãn bieán saûn löôïng cellulose (S-BC) treân moâi tröôøng ræ ñöôøng leân men beà maët theo tyû leä gioáng vaø thôøi gian leân men (g/l moâi tröôøng) Thôøigian leân men % gioáng 4 ngaøy 5 ngaøy 6 ngaøy 7 ngaøy 8 ngaøy 4% 350 410 505 630 715 6% 380 450 560 680 800 8% 500 690 860 950 980 10% 706 841 980 982 980 12% 864 975 981 980 980 80 Baûng 4.16 Dieãn bieán saûn löôïng cellulose (A-BC ) treân moâi tröôøng ræ ñöôøng leân men chìm theo tyû leä gioáng vaø thôøi gian leân men (g/l moâi tröôøng) Thôøigian leân men % gioáng 4 ngaøy 5 ngaøy 6 ngaøy 7 ngaøy 8 ngaøy 4% 266 390 475 560 640 6% 398 480 574 663 750 8% 490 582 670 760 835 10% 595 685 780 840 845 12% 692 750 820 845 845 Nhö vaäy, saûn löôïng cellulose thu ñöôïc treân moâi tröôøng ræ ñöôøng vôùi hai kieåu leân men (beà maët vaø chìm) ñeàu taêng theo tyû leä gioáng vaø thôøi gian leân men. Töø thöïc teá cho thaáy, tyû leä gioáng töø 4-6% keùo daøi thôøi gian leân men (saûn löôïng BC cuûa ngaøy leân men thöù 8 chæ baèng 73%-82% so vôùi ngaøy leân men thöù 6 vôùi tyû leä gioáng 10% ), trong leân men beà maët deã xaûy ra nhieãm taïp. Löôïng gioáng caøng cao caøng traùnh ñöôïc söï nhieãm taïp vaø ruùt ngaén thôøi gian leân men. Tuy nhieân löôïng gioáng caøng nhieàu caøng ñaåy giaù thaønh saûn phaåm leân cao. Caùc keát quaû treân laø trung bình cuûa nhieàu laàn laëp laïi cho thaáy: * Trong leân men beà maët: - Tyû leä gioáng döôùi 6% laø khoâng phuø hôïp: thôøi gian leân men keùo daøi, saûn löôïng S-BC thaáp vaø deã bò nhieãm taïp. - Tyû leä gioáng toái thieåu laø 8%, thôøi gian leân men 7 ngaøy. - Trong tröôøng hôïp muoán ruùt ngaén thôøi gian leân men thì coù theå taêng tyû leä gioáng: tyû leä gioáng 10% vôùi 6 ngaøy leân men hoaëc tyû leä gioáng 12% vôùi 5 ngaøy leân men. * Trong leân men chìm: - Tyû leä gioáng döôùi 6% laø khoâng phuø hôïp. - Tyû leä gioáng toái thieåu laø 8%, thôøi gian leân men 8 ngaøy. 81 - Trong tröôøng hôïp muoán ruùt ngaén thôøi gian leân men thì coù theå taêng tyû leä gioáng: tyû leä gioáng 10% vôùi 7 ngaøy leân men hoaëc tyû leä gioáng 12% vôùi 6 ngaøy leân men. Tyû leä gioáng vaø thôøi gian leân men laø 2 yeáu toá töông quan vôùi nhau vaø goùp phaàn quyeát ñònh saûn löôïng BC thu nhaän. Töø tyû leä gioáng laø 20% vaø thôøi gian leân men 10 ngaøy [11], ñeán nay ñaõ ruùt xuoáng tyû leä gioáng trung bình laø 10% vaø thôøi gian leân men 7-8 ngaøy, nhôø saøng loïc, caûi thieän, hoøan thieän gioáng vaø caùc yeáu toá leân men thích hôïp [112-120]. Keát quaû thöïc nghieäm cuûa ñeà taøi cho thaáy khoâng coù söï khaùc bieät so vôùi caùc coâng boá (Yoshinaga ï, 1997)[112-120]. 4.3.3 Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä trong quaù trình leân men BC Nhieät ñoä leân men phuø hôïp nhaát laø töø 28o-32oC trong caû leân men beà maët laãn leân men chìm. Ñaây cuõng laø nhieät ñoä ñeå vi khuaån A. xylinum phaùt trieån toát. Khi nhieät ñoä leân men dao ñoäng trong khoaûng töø 28-320C cho saûn löôïng S-BC ñaït cao nhaát töø 980-985g/ l moâi tröôøng vaø A-BC ñaït 840-846 g/ l moâi tröôøng. Ngoaøi khoaûng nhieät ñoä leân men [28-320C], saûn löôïng cuûa caû S-BC vaø A-BC ñeàu suït giaûm ñaùng keå (ñoà thò 4.7). 200 400 600 800 1000 1200 26C 28C 30C 32C 34C Nhieät ñoä Sa ûn lö ôïn g B C ( g/ l) S-BC A-BC Ñoà thò 4.7 Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä trong quaù trình leân men BC 4.3.4 Cheá ñoä khuaáy ñaûo trong nuoâi caáy chìm Cheá ñoä khuaáy ñaûo aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán maät ñoä teá baøo vaø quaù trình sinh toång hôïp cellulose vi khuaån [50, 51, 55, 58, 85, 90, 91]. 82 4.3.4.1 Dieãn bieán saûn löôïng A-BC theo toác ñoä quay cuûa maùy laéc 200 400 600 800 1000 150 200 250 300 350 400 450 Voøng/phuùt Sa ûn lö ôïn gB C (g /l) Ñoà thò 4.8 Dieãn bieán saûn löôïng A-BC theo toác ñoä quay cuûa maùy laéc Vôùi 6 cheá ñoä quay cuûa maùy laéc aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán löôïng oxy hoaø tan trong moâi tröôøng leân men vaø quaù trình sinh toång hôïp BC, saûn löôïng A-BC taêng daàn theo toác ñoä quay cuûa maùy laéc töø 150 ñeán 300 voøng/ phuùt. Sau ñoù saûn löôïng BC ñaït caân baèng ôû möùc 842-845g/ lít vôùi caùc toác ñoä quay 350, 400 voøng/ phuùt. Leân men quy moâ1 lít, toác ñoä quay phuø hôïp laø 300 voøng/ phuùt. 4.3.4.2 Dieãn bieán saûn löôïng A-BC theo phöông thöùc khuaáy ñaûo Söû duïng maùy laéc trong nuoâi caáy chìm ñeå thu A-BC chæ coù theå aùp duïng ôû phoøng thí nghieäm. Höôùng ñeán quy moâ pilot, trong giôùi haïn nhöõng thieát bò hieän coù, chuùng toâi thöû nghieäm khaûo saùt saûn löôïng A-BC theo 4 phöông thöùc khuaáy ñaûo nhö sau: Laéc (300 voøng/ phuùt); Thoåi khí-Hoài löu; Thoåi khí; Fermentor. Leân men laéc 300 voøng/ phuùt ñaõ xaùc ñònh laø toác ñoä laéc phuø hôïp ñeå cho saûn löôïng A-BC cao, ñaït khoaûng 840 g/ l moâi tröôøng, tuy nhieân phöông thöùc naøy chæ phuø hôïp quy moâ nhoû. Leân men trong Fermentor, saûn löôïng A-BC thu ñöôïc cuõng töông öùng vôùi Leân men laéc, ñaït 840± 1 g/ l moâi tröôøng. Nhöng caû 2 phöông thöùc treân hoaøn toaøn chæ aùp duïng quy moâ phoøng thí nghieäm. 83 500 600 700 800 900 1 2 3 4 Phöông thöùc khuaáy ñaûo Sa ûn lö ôïn g B C (g /l) 1. Laéc 3. Thoåi khí 2. Thoåi khí-Hoài löu 4. Fermentor Ñoà thò 4.9 Dieãn bieán saûn löôïng A-BC theo phöông thöùc khuaáy ñaûo trong quaù trình leân men Treân hai thieát bò thuûy ñoäng hoïc thoåi khí vaø thoåi khí- hoài löu, saûn löôïng A-BC coù suït giaûm. Ñoái vôùi phöông thöùc leân men thoåi khí, saûn löôïng A-BC chæ ñaït 650± 2 g/ l moâi tröôøng. Ñoái vôùi phöông thöùc thoåi khí- hoài löu, saûn löôïng A-BC ñaït 800± 2 g/ l moâi tröôøng, baèng 92% so vôùi ñieàu kieän chuaån. Nhö vaäy, ñeå saûn xuaát A-BC vôùi quy moâ döôùi 5 lít moâi tröôøng, neân söû duïng phöông thöùc duøng maùy laéc vôùi cheá ñoä 300 voøng/ phuùt; vôùi quy moâ lôùn hôn coù theå söû duïng phöông thöùc thuûy ñoäng hoïc thoåi khí- hoài löu. ÔÛ phöông thöùc naøy, khi moâi tröôøng ñöôïc luaân chuyeån ( töø bình 1 xuoáng bình 2 roài laïi bôm leân bình 1), caùc boït khí cuõng ñöôïc phaân taùn nhoû hôn so vôùi phöông thöùc suïc khí giuùp teá baøo vi khuaån tieáp xuùc toát hôn vôùi moâi tröôøng dinh döôõng vaø löôïng oxy hoaø tan trong moâi tröôøng cao hôn so vôùi phöông thöùc thoåi khí. 4.3.5 Nghieân cöùu caùc bieán ñoäng trong quaù trình leân men BC ôû phoøng thí nghieäm Muïc ñích nghieân cöùu caùc bieán ñoäng trong quaù trình leân men BC ôû phoøng thí nghieäm vôùi caùc thoâng soá toái öu veà gioáng, moâi tröôøng vaø caùc ñieàu kieän leân men laøm tieàn ñeà ñeå so saùnh vôùi quaù trình leân men BC ôû quy moâ pilot trong phaàn tieáp theo. Caùc bieán ñoäng trong quaù trình leân men giuùp chuùng toâi tieáp caän dieãn tieán leân men nhaèm coù nhöõng ñeà xuaát taêng hieäu quaû leân men BC. 84 4.3.5.1 Leân men beà maët Vôùi caùc thoâng soá toái öu veà moâi tröôøng, gioáng Acetobacter xylinum BC16 vôùi maät ñoä gioáng ñaït: 48.106 –5.107 teá baøo/ ml, tyû leä gioáng: 10%, nhieät ñoä leân men: 30-32oC, thôøi gian leân men: 7 ngaøy, pH ban ñaàu: pH=4. Ñeå tìm hieåu dieãn bieán trong quaù trình leân men cellulose vi khuaån, chuùng toâi ñaõ xaây döïng caùc bieán ñoäng qua ñoà thò 4.10. Maät ñoä teá baøo 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian( ngaøy) Tr ie äu te á b aøo /m l pH 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian(ngaøy) pH Ñöôøng toång 0 5 10 15 20 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian( ngaøy) g/ l Saûn löôïng S-BC 0 200 400 600 800 1000 1200 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian( ngaøy) g/ l Ñoà thò 4.10 Bieán ñoäng trong quaù trình leân men beà maët cellulose vi khuaån treân moâi tröôøng ræ ñöôøng ôû phoøng thí nghieäm Maät ñoä teá baøo coù xu höôùng taêng ñeán ngaøy thöù 4, ñaït cao nhaát ôû ngaøy thöù 4 laø 42,05.106 teá baøo/ml, sau ñoù giaûm daàn. Ñeán ngaøy thöù 7 coøn 14,1.106 teá baøo/ml. Theo dieãn bieán thôøi gian leân men, haøm löôïng ñöôøng toång giaûm daàn töø 15,5g/ l ôû ngaøy leân men thöù 2 coøn 0,69 g/ l ôû ngaøy leân men thöù 7. Löôïng acid sinh ra trong quaù trình leân men keùo theo pH moâi tröôøng giaûm daàn vaø pH = 2,1 ôû ngaøy leân men thöù 7. 85 Saûn löôïng S-BC taêng nhanh ñeán ngaøy thöù 5 vaø ñaït cao nhaát ôû ngaøy thöù 6, sau ñoù khoâng taêng vaø coøn coù xu höôùng giaûm. Ñieàu naøy coù theå do giaûm aåm ñoä S- BC khi ñaõ caïn kieät moâi tröôøng. 4.3.5.2 Leân men chìm Maät ñoä teá baøo 10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian( ngaøy) Tr ie äu te á b aøo /m l pH 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian(ngaøy) pH Ñöôøng toång 0 5 10 15 20 1 2 3 4 5 6 7 8 Thôøi gian( ngaøy) g/ l Saûn löôïng A-BC 0 200 400 600 800 1000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Thôøi gian (ngaøy) g/ l Ñoà thò 4.11 Bieán ñoäng trong quaù trình leân men chìm cellulose vi khuaån treân moâi tröôøng ræ ñöôøng ôû phoøng thí nghieäm Trong leân men chìm, xu höôùng taêng hay giaûm theo thôøi gian leân men ôû caùc chæ tieâu maät ñoä teá baøo, ñöôøng toång, pH töông töï nhö trong leân men beà maët. Tuy maät ñoä teá baøo trong leân men chìm cao hôn so vôùi leân men beà maët, nhöng dieãn bieán saûn löôïng A-BC thì khaùc haún. So vôùi leân men beà maët, saûn löôïng A-BC taêng ñeàu töø ñaàu ñeán ngaøy thöù 7 vaø oån ñònh ôû ngaøy leân men thöù 8, ñaït trung bình laø 840g/ l moâi tröôøng (ñoà thò 4.11). Saûn löôïng A-BC luoân thaáp hôn S-BC do söï haïn cheá cung caáp oxy trong leân men chìm. Hieäu suaát leân men A-BC chæ ñaït baèng 86% so vôùi S-BC. Saûn löôïng A-BC ñaït 840 g/ l, ñaït 85-89% so vôùi caùc keát quaû nghieân cöùu ôû ngoaøi nöôùc (vôùi caùc thieát bò leân men coù phaân caét kích thöôùc cuûa boït khí khi suïc) [19,31,49]. 86 4.4 Thöû nghieäm leân men saûn xuaát BC ôû quy moâ pilot. 4.4.1 Leân men beà maët treân dieän tích roäng 1,5 m2 Vôùi quy moâ leân men beà maët treân dieän tích roäng 1,5 m2, caùc bieán ñoäng quaù trình leân men coù söï khaùc bieät so vôùi phoøng thí nghieäm nhö sau: Maät ñoä teá baøo 0 10 20 30 40 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngaøy M aät ñ oä( tri eäu te á b aøo /m l) pH 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngaøy pH Ñöôøng toång 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ngaøy g/ l Saûn löôïng S-BC 0 200 400 600 800 1000 1200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ngaøy g/ l m oâi tr öô øng Ñoà thò 4.12 So saùnh caùc bieán ñoäng quaù trình leân men beà maët cellulose vi khuaån treân moâi tröôøng ræ ñöôøng ôûâ phoøng thí nghieäm vaø quy moâ pilot. (a) Phoøng thí nghieäm. (b) Quy moâ pilot So vôùi quaù trình leân men ôû phoøng thí nghieäm: - Veà maät ñoä teá baøo: Xu höôùng maät ñoä teá baøo gia taêng ñeán ngaøy thöù 5, ñaït cao nhaát 40,97.106 teá baøo/ ml. So vôùi quy moâ nhoû thì maät ñoä gia taêng chaäm hôn vaø taïi ñænh cuõng thaáp hôn. Chính söï thay ñoåi naøy, hai chæ tieâu ñöôøng toång vaø pH cuõng coù xu höôùng giaûm chaäm hôn so vôùi leân men quy moâ nhoû. 87 - Xeùt chæ tieâu troïng löôïng S-BC: khoâng theå khaûo saùt ôû ngaøy 2, 3, 4 nhö ôû phoøng thí nghieäm vì leân men beà maët quaù roäng. Thu hoaïch BC ôû ngaøy thöù 5, 6, vaø 7 (ngaøy thöù 6 laø ngaøy thu hoaïch ôû quy moâ phoøng thí nghieäm), keát quaû cho thaáy : Cuøng thöïc hieän vôùi caùc thoâng soá toái öu nhö ôû quy moâ phoøng thí nghieäm, nhöng ôû leân men beà maët treân moät dieän tích roäng quy moâ 100 lít/ meû, ôû ngaøy leân men thöù 6 chæ ñaït saûn löôïng S-BC baèng 63% so vôùi quy moâ nhoû. Ñeå ñaït ñöôïc saûn löôïng S-BC baèng 950 g BC töôi/ l moâi tröôøng töông ñöông vôùi quy moâ phoøng thí nghieäm, thôøi gian leân men phaûi keùo daøi theâm 3 ngaøy (toång thôøi gian leân men/ meû laø 9 ngaøy). Ngoaøi ra, vaán ñeà nhieãm taïp treân beà maët deã xaûy ra do dieän tích tieáp xuùc vôùi khoâng khí lôùn. Do ñoù caàn caùc thieát bò chuyeân duøng ñeå laøm saïch khoâng khí. Keát quaû thöïc nghieäm chæ ra raèng: Sau laàn leân men thöù 3, ñoä nhieãm taïp gia taêng, beà maët lôùp maøng cellulose deã bò nhieãm naám moác, coù theå phaùt hieän baèng maét thöôøng. Sau laàn leân men thöù 3 phaûi coù cheá ñoä khöû truøng phoøng leân men vaø thay môùi hoaøn toaøn caùc vaät lieäu loùt taïo khuoân. Nhö vaäy, chæ vôùi moät soá öùng duïng ñaëc bieät caàn dieän tích BC lôùn (nhö vaûi, giaáy…) thì môùi caàn phöông phaùp leân men beà maët treân dieän tích lôùn. Neáu chæ thu S-BC vôùi caùc öùng duïng thoâng thöôøng (thöïc phaåm, maøng trò boûng, cheá phaåm BC…) thì phöông phaùp leân men beà maët treân dieän tích lôùn laø khoâng caàn thieát vaø keùm hieäu quaû vì phaûi kieåm soaùt nghieâm ngaët ñeå traùnh söï taïp nhieãm vaø thôøi gian leân men keùo daøi ñeán 9 ngaøy. Naêng suaát leân men beà maët cellulose vi khuaån quy moâ pilot treân dieän tích roäng ñaït khoaûng 4,4 g/ l/ h. 4.4.2 Leân men beà maët quy moâ pilot treân khay nhoû. Cuõng vôùi muïc ñích thu S-BC chuùng toâi tieán haønh leân men beà maët quy moâ 200 lít / meû nhöng treân caùc khay nhöïa coù dieän tích 30 cm x 25 cm ñöôïc xeáp xen keû choàng leân nhau. Caùc khay ñöôïc ñaäy baèng giaáy baùo voâ truøng vaø ñöôïc xeáp trong phoøng saïch, thoâng thoaùng. 88 Saûn löôïng BC thu ñöôïc qua 3 meû leân men , moãi meû 200 lít, thôøi gian leân men 7 ngaøy nhö sau: - Meû 1: 188kg S-BC/ 200 lít moâi tröôøng, ñaït trung bình 940 g/ l moâi tröôøng. - Meû 2: 185kg S-BC/ 200 lít moâi tröôøng, ñaït trung bình 925 g/ l moâi tröôøng. - Meû 3: 183,5kg S-BC/ 200 lít moâi tröôøng, ñaït trung bình 918 g/ l moâi tröôøng. - Trung bình 3 meû leân men: ñaït 928 g S -BC / l moâi tröôøng. Keát quaû leân men S-BC quy moâ pilot treân khay nhoû ñaït 96% so vôùi quy moâ phoøng thí nghieäm, töông ñöông 6,5g/ l/ h. Nhaèm muïc ñích thu nhaän S-BC ñeå öùng duïng ôû quy moâ pilot, ngoaïi tröø moät vaøi öùng duïng ñaëc bieät caàn dieän tích BC lôùn, phöông thöùc leân men pilot treân khay nhoû cho hieäu quaû cao vaø deã daøng thöïc hieän. Caùc khay deã daøng khöû truøng vaø neáu nhieãm khay naøo thì loaïi boû khay ñoù. Töø thöïc nghieäm cho thaáy, giöõa caùc meû leân men chæ caàn thanh truøng duïng cuï leân men vaø phoøng leân men thoaùng saïch.Trung bình khoaûng sau 4 -5 meû leân men caàn khöû truøng phoøng leân men vaø caùc thieát bò söû duïng. 4.4.3 Leân men chìm quy moâ 75 lít / meû vôùi phöông thöùc thoåi khí-hoài löu. Trong phaàn naøy, chuùng toâi cuõng tieán haønh khaûo saùt caùc bieán ñoäng trong quaù trình leân men chìm quy moâ pilot, nhaèm giaûi thích cho keát qua._.