Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp Endo-Β-1,4-Glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2 1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2 1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3 1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5 1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10 1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16 1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16 1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22 2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22 2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23 2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao ............................................................................................... 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA............................................................................................................ 37 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu ............................................................................. 51 3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52 3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59 KẾT LUẬN .................................................................................................. 59 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61 TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61 TIẾNG ANH ................................................................................................ 64 PHỤ LỤC .................................................................................................... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57 Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea .. 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase ......................................................................................................... 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 ................................................................................................ 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae ........ 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). ............................................................................................................... 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT g Microgram l Microliter APS Ammonium persulphate Cel Cellulose CMC Carboxyl methyl cellulase cs Cộng sự EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kb Kilobase kDa Kilo Dalton M Marker (thang protein chuẩn) MTK Môi trƣờng khoáng MW Molecular Weight OD Optical density PCR Polymerase chain reaction SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane U Unit v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus). Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4- glucanase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐỊNH NGHĨA Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase. Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình. 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 1.2.1. Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo. Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài ƣa kiềm nhƣ Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995). Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme. Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003), A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao. 1.2.2. Phân loại enzyme 1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et al., 2008). Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002). 1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể. Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3. Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002). Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 peptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB đƣợc cảm ứng bởi D-xylose. Ở chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A. Trong đó, cel5A và cel61A có liên kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5), cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 và sự liên kết. Cel5A gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61 không có intron. Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase đƣợc chia làm 6 họ là A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào trung tâm xúc tác phức cellulase đƣợc chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al., 1991). Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9, (10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn (hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002). 1.3. CẤU TRÚC Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008). 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng 44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ chủng A. niger (49%). Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa. Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi α, β và các vùng nối. 1.3.2. Cấu trúc không gian Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β (B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và 205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ 29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β: B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175, C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên (Hình 1.1). Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực vanderval. Liên kết giữa các amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.2A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B). Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C). Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau. Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3). Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002) Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các ._.enzyme khác nhƣ exo-β-1,4- glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Bào tử của A. oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin. A. oryzae tiết ra môi trƣờng các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase, xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trƣờng có nguồn cơ chất tƣơng ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công nghiệp sản xuất các enzyme. Ở Nhật Bản A. oryzae đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn nhƣ xì dầu, rƣợu sakê và trong công nghiệp sản xuất enzyme nhƣ amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 lipase, phytase và pectinase. Ở Việt Nam A. oryzae đƣợc sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tƣơng. Năm 2001, bộ gene di truyền của A. oryzae đã đƣợc phân tích và giải mã. Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5). Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. Oryzae (Machida et al., 2005) 1.6. Ứng dụng Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh. 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lƣợng cao các chất khó tan là lignin và một phần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004). 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa một lƣợng β-glucan, chất này ảnh hƣởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004). Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp khô, phƣơng pháp này cho chất lƣợng cà phê không cao. Để tiến hành nâng cao chất lƣợng cà phê, phƣơng pháp lên men đã đƣợc áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tƣợng thẫm mầu, làm giảm chất lƣợng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thƣơng mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lƣợng cà phê đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt nhƣ hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lƣợng, 2003). 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi Nguồn thức ăn cung cấp năng lƣợng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dƣỡng nhƣ protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 dƣỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật. Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose nhƣ rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang đƣợc triển khai ở nhiều nƣớc, trong mọi lĩnh vực nhƣ sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thƣờng đƣợc sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hƣơng thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009). 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et al., 2004). 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ƣa nhiệt trong bể rác thải có khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 phân giải cellulose mạnh. Đặng Minh Hằng (1999) cũng phân lập đƣợc 2 chủng nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh và đã tối ƣu đƣợc các điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase. Hai mƣơi chủng xạ khuẩn, 40 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và khi bổ sung các chủng đó vào bể ủ sẽ rút ngắn thời gian ủ 5-7 ngày (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999). 192 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã đƣợc phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm mục, gỗ mục; trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh chiếm 42% (Phạm Thị Ngọc Lan et al., 1999). Nguyễn Lan Hƣơng và Hoàng Đình Hòa (2003) cũng đã phân lập đƣợc 15 chủng Bacillus có hoạt tính CMCase từ các mẫu rác sinh hoạt chứa cacboxymetyl cellulose. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất. Chế phẩm Micromix 3 đƣợc tạo ra bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao đã đƣợc bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí sẽ rút ngắn đƣợc thời gian ủ 15 ngày, giảm một nửa thời gian lên men, đồng thời lƣợng mùn tạo thành cũng cao hơn 29% và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng et al., 1999). Phức hệ cellulase đƣợc sử dụng để xử lý nguồn nƣớc thải do các nhà máy giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lƣợng, số lƣợng giấy là cellulose. Vì vậy, nƣớc thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xƣởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại and Trần Thị Hồng, 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE Nấm sợi A. oryzae chủ yếu sống hoại sinh phân giải nguồn cơ chất trong môi trƣờng nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh trƣởng và phát triển. Tốc độ tiết enzyme phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen. 1.7.1. Nguồn carbon Tùy loài vi sinh vật mà nguồn carbon đƣợc sử dụng để sinh endo-β-1,4- glucanase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn carbon. Nguồn carbon có thể là các loại carbohydrate đơn giản nhƣ đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc phức tạp nhƣ tinh bột, cellulose, xylan. Nguồn carbon phức tạp này thƣờng tồn tại ở hầu hết các sản phẩm, phế phẩm nhƣ trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà phê, mùn cƣa. Những chất này thƣờng đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn carbon thích hợp nhất để chủng T. reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase, tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan. Trong khi lõi ngô và xylan lại là nguồn carbon thích hợp cho chủng T. aurantiacus A-131 sinh tổng hợp CMCase (Kawamori et al., 1987). Nguồn phế phẩm từ quả cam ngọt (vỏ, cùi) đã đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh cellulase ở chủng A. niger, T. longi và Saccharomyces cerevisae (Omojasola and Jilani, 2008). Các loài Penicillium pinophilum, P. persicium, P. brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon là xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 sinh tổng hợp cellulase rất kém (Henning et al., 2005). Lê Thị Thanh Xuân và cs (2005) khi nghiên cứu chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cho thấy chúng sinh trƣởng mạnh nhất trên nguồn carbon là glucose và tinh bột, nhƣng nguồn carbon thích hợp để chủng sinh tổng hợp cellulase là cellulose và CMC. Trịnh Đình Khá (2006), khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DQT- HK1 cho thấy, chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trên nguồn carbon là rơm với nồng độ 0,6%. 1.7.2. Nguồn nitrogen Nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi sinh vật. Nguồn nitrogen tồn tại ở dạng vô cơ nhƣ urea, ammonium sulfate, natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử nhƣ cao thịt, cao thịt bò, bột đậu tƣơng, bột cá hay peptone. Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitrogen đƣợc sử dụng là khác nhau. Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài. Tang và cs (2004) khi tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng B. subtilis nhận thấy nguồn nitrogen vô cơ không thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase; còn nguồn nitrogen là cao nấm men và bột đậu tƣơng rất thích hợp cho khả năng sinh enzyme (Tang et al., 2004). Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tƣơng ảnh hƣởng mạnh mẽ tới quá trình tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và cs (2008) khi nghiên cứu trên chủng A. niger cho thấy peptone, ammonium sulfate và urea là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase. Ở một số chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt nguồn nitrogen vô cơ là KNO3 thích hợp cho tổng hợp cellulase mạnh nhất (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Bột đậu tƣơng là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ ảnh hƣởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng. Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ƣa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ƣa ấm và nhóm vi sinh vật chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh sinh trƣởng đƣợc trong điều kiện nhiệt độ dƣới 15°C; các loài ƣa ấm sinh trƣởng và phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37°C. Các loài chịu nhiệt sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C. Khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B. subtilis nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme là 37°C (Tang et al., 2004). Đối với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để các chủng này sinh enzyme cao từ 45-55°C (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999, Tăng Thị Chính et al., 1999). Ở các chủng nấm mốc nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase nằm trong khoảng từ 28-50°C (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Ojumu et al., 2003, Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase tối đa ở nhiệt độ 30°C (Trịnh Đình Khá, 2006). 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng pH môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay kiềm. pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase là 6,5-7,0 và pH tối ƣu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt là 7,0-7,5 và pH tối ƣu là 7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008). Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh nhất ở pH 7,5. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 cellulase mạnh trong môi trƣờng có pH ban đầu là 8,0 (Tăng Thị Chính et al., 1999). Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus lại thích hợp ở pH trung tính (Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999). Các chủng nấm Aspergillus lại thích hợp trong khoảng pH từ 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008). 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME Mỗi loại enzyme đƣợc tổng hợp từ các loài khác nhau có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau. Nhiệt độ, pH, các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hay các ion kim loại có ảnh hƣởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme. 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp và khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dƣới 0°C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhƣng lại có thể phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp. Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A. oryzae hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002). Endo-β- 1,4-glucanase gồm Cel A và Cel B từ chủng A. oryzae KBN616 có hoạt tính mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996). Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55C (Macarron et al., 1993), nhiệt độ tối ƣu của -glucosidase từ chủng Trichoderma reesei QM 9414 và chủng Trametes hirsuta là 50C (de la Mata et al., 1992, Nozaki et al., 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trƣờng, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc là acid. Endo-β-1,4-glucanase do các loài khác nhau có pH tối ƣu khác nhau. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002). CMCase của A. niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002). 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn đƣợc với cơ chất. Do đó tốc độ thủy phân của enzyme đƣợc tăng lên. Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme. Theo những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, các ion kim loại nhƣ Cu2+; Hg2+, Ag+ ức chế mạnh hoạt tính của các enzyme nhƣ xylanase, endoglucanase, mannanase, protease, cellulase (Nguyễn Thị Thảo, 2005, Trịnh Đình Khá, 2006, Đỗ Thị Tuyên et al., 2008, Gao et al., 2008). Trong khi đó ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng, Mg2+ làm giảm nhẹ hoạt tính (chỉ đạt 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính so với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 đối chứng (đạt 37%) (Sang et al., 1995). Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng Penicillium chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe 2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%); trong khi Mg 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+) (Chinedu et al., 2008). 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hƣởng rất mạnh tới hoạt tính của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa là khác nhau. Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của cellulase và SDS làm giảm mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. Các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính cellulase, riêng n-butanol ức chế mạnh mẽ hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Đỗ Thị Tuyên và cs (2008) các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol không ảnh hƣởng mạnh tới hoạt tính xylanase từ chủng A. ozyzae DSM1863, riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính xylanase. Tween 20 và Triton X-100 không ảnh hƣởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhƣng làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao 2%, trong khi đó SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1. Chủng giống Ba mƣơi lăm chủng nấm A. oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ) Việt Nam Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ) Cân phân tích BL 150S Sartorius (Đức) Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển) Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản) Hệ thống điện di SDS-PAGE Biometra (Đức) Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc) Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức) Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức) Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức) Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản) Tủ lạnh 4C, -20C, -80C Toshiba, Sanyo (Nhật bản) 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất dùng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (bảng 2.2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc) Cao nấm men Difco (Mỹ) CMC Sigma (Mỹ) Kit tinh sạch plasmide QIA prep Spin Miniprep Qiagen (Mỹ) Peptone Merck (Mỹ) Sephadex G100 Pharmacia Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ) Triton X-100 Merck (Đức) Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ) 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch Amp gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dịch arsenomolypdate 5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc; 0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88% phosphoric acid Dung dịch Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml dung dịch Bradford gốc Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch D 10% SDS; 25mM EDTA Dung dịch muối A 20% (w/v) Na2SO4; 2,5% (w/v) Na2CO3; 2,5% (w/v) muối Seignett; 2% (w/v) NaHCO3 Dung dịch muối B 15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue; 30% (v/v) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0 Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K Dung dịch RNase 10 μg/ml Rnase Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic Dung dịch Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0 Dung dịch Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS Dung dịch Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0 Đệm tra mẫu protein 5X (biến tính) 0,05% Brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Hỗn hợp muối AB Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1 2.1.5. Môi trƣờng Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi cấy trong 3 ml môi trƣờng khoáng (MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O; 0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1 ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O; 15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001). Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chủng E. coli DH5α đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 μg/ml ampicillin. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme Chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng ở nhiệt độ 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ. 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase Hoạt tính enzyme đƣợc định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nƣớc cất dày khoảng 0,5 cm, đƣợc đục lỗ đƣờng kính 0,5 cm. Năm mƣơi μl dịch enzyme đƣợc cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong 4C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch đƣợc ủ 4-6 giờ ở 37C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tƣơng đối của enzyme. 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944). Đơn vị hoạt độ là lƣợng enzyme phân giải cơ chất CMC thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 l glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm. Xây dựng đường chuẩn: Glucose đƣợc pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. Một ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo ở bƣớc sóng 660 nm. Độ hấp phụ và nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 glucose đƣợc vẽ theo chƣơng trình Excel. Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml. Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,0064x - 0,0024. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bƣớc sóng 660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1). Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong 100 mM đệm natri acetate pH 5,0 đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ 5 phút ở 50C sau đó bổ sung ngay các hóa chất định lƣợng đƣờng khử tạo thành. Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lƣợng đƣờng khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lƣợng đƣờng khử ngay. Một ml dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml hỗn hợp muối AB. Hỗn hợp đƣợc đun sôi cách thủy đúng 20 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate lắc đều đến khi hết bọt khí. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa y = 0.0064x - 0.0024 R 2 = 0.9943 0 0.2 0.4 0.6 0 20 40 60 80 100 Nồng độ glucose (µg/ml) O D (6 60 nm ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 cơ chất còn dƣ và so màu ở bƣớc sóng 660 nm. Mẫu đối chứng thay dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử bằng nƣớc cất. Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy ra hàm lƣợng đƣờng khử. 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 2.2.4.1. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C, có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme đƣợc thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-56 giờ (cách nhau 12 giờ) để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. 2.2.4.2. Tối ƣu nồng độ cơ chất cảm ứng Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung cơ chất CMC ở các nồng độ khác nhau 0,5; 0,7; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 2,7. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. 2.2.4.3. Tối ƣu nguồn carbon Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó, nguồn cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác là lactose, glucose, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt ở cùng nồng độ ban đầu (0,1%). Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính. Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon tốt nhất, để tối ƣu nồng độ carbon, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 pH 6,5 ở 30C có nồng độ carbon khác nhau: 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2%). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định. 2.2.4.4. Tối ƣu nguồn nitrogen Trong môi trƣờng MTK nuôi cấy chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 ban đầu, nguồn nitrogen sử dụng là peptone nhƣng không phù hợp để sản xuất chế phẩm enzyme do giá thành chi phí sản xuất rất cao. Với mục tiêu là sử dụng nguyên liệu sẵn có, peptone đƣợc thay thế bằ._. -1 ,4 -g lu ca na se tƣ ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 1996); Trong khi enzyme từ chủng A. niger bền ở dải pH từ 3,0-10,0 sau 1 giờ ủ (Hong et al., 2001). CMCase gồm C-I và C-II của chủng Cephalosporium sp RYM-202 bền ở dải pH rộng và hoạt tính vẫn còn duy trì trên 80% ở pH 11 sau 24 giờ ủ (Kang and Rhee, 1995). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. terreus M11 bền ở dải pH từ 2,0-5,0 (Gao et al., 2008). 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ Trong dung dịch enzyme, dung môi hữu cơ làm giảm hằng số điện môi và tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ cùng với các dung môi khác nhau ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, cả 5 dung môi khảo sát làm giảm hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase. Trong đó, n-butanol ảnh hƣởng mạnh nhất làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme chỉ còn 43%. Acetone và ethanol làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme còn 56% và 76%. Isopropanol và methanol làm giảm hoạt tính ít hơn so với đối chứng (80-81%) (Hình 3.16 và Bảng 4.16). Nhƣ vậy, các dung môi hữu cơ khảo sát ít ảnh hƣởng tới hoạt tính của endo-β- 1,4-glucanase trừ n-butanol. Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 0 40 80 120 ĐC MetOH EtOH IsOH Act n-BtOH Dung môi hữu cơ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa Các chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các chất tẩy rửa có nồng độ khác nhau là 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 và 2,0% ở nhiệt độ phòng, sau 4 giờ ủ hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55°C. Kết quả cho thấy, nồng độ các chất tẩy rửa càng cao thì hoạt tính của enzyme giảm càng mạnh. Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS ở 5 nồng độ đều làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme so với đối chứng. Hoạt tính tƣơng đối của enzyme khi ủ với Tween 20 ở nồng độ 0,4-0,8% vẫn còn duy trì đƣợc 63-77% so với đối chứng; trong khi ở nồng độ 1,2-2,0% làm hoạt tính enzyme giảm khá mạnh, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 31% ở nồng độ 2,0%. Tween 80, Triton X-100 và SDS làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme giảm mạnh. Đối với SDS hoạt tính enzyme bị ức chế rõ rệt. SDS ở nồng độ 0,4% hoạt tính chỉ đạt 15%, còn ở nồng độ 2,0% hoạt tính chỉ còn 4% so với đối chứng (Hình 3.17 và Bảng 4.17). Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 0 25 50 75 100 T20 T80 TX-100 SDS Chất tẩy rửa Hoạt tính end o-β-1,4-gluca nase tương đ ối (%) 0.4% 0,8% 1.2% 1,6% 2.0% 0 25 50 75 100 T20 T80 TX-100 SDS Chất tẩy rửa Ho ạt tí nh e nd o- β- 1, 4- gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại Để nghiên cứu ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các ion kim loại ở các nồng độ khác nhau là 4; 8 và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định ở 55°C. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 4 mM các ion kim loại và EDTA ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính enzyme. Trong đó, ion K+ làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme so với đối chứng (tăng 3%). Các ion kim loại khác và EDTA làm hoạt tính enzyme giảm nhẹ. Trong đó, ion Ag + làm hoạt tính enzyme giảm hơn cả (giảm 16%). Ở nồng độ 8-12% hoạt tính enzyme vẫn đƣợc duy trì từ 70-99% khi ủ với các ion kim loại. Trừ Fe2+ và Zn 2+ làm giảm mạnh hoạt tính enzyme Zn2+ 57%, Fe2+ 58%) (Bảng 3.4 và Bảng 4.18). Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại (mM) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase sau 4 giờ ủ (%) 4 8 12 Ag + 84 99 73 Ca 2+ 90 81 73 Co 2+ 92 93 92 Cu 2+ 96 92 87 EDTA 96 89 71 Fe 2+ 87 64 58 K + 103 86 83 Mn 2+ 97 82 77 Ni 2+ 95 92 70 Zn 2+ 87 62 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Gao và cs (2008) khi nghiên cứu endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. terreus M11 cho thấy, hoạt tính endo-β-1,4-glucanase giảm mạnh khi ủ với các ion kim loại Hg2+, Cu2+; Pb2+ và EDTA ở nồng độ 2,0 mM. Hoạt tính chỉ đạt 77% đối với ion Hg2+ và 59% với ion Cu2+. Trong khi Sr2+, Zn2+ và Mn2+ lại làm tăng hoạt tính của enzyme. Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng P. chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%). Trong khi Mn 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao nhất trong số 35 chủng đã đƣợc tuyển chọn. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng này (đăng ký trong Genebank: GQ382276) tƣơng đồng 99,7% với chủng thuộc chi Aspergillus trong cây phân loại. 2. Điều kiện để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase tối ƣu là: Thời gian 120 giờ; nhiệt độ 28°C; pH ban đầu 5,5; môi trƣờng khoáng MTK với 1% CMC; 0,4% lactose (nguồn carbon) và 1% bột đậu tƣơng (nguồn nitrogen) 3. Qua hai bƣớc tinh sạch bằng tủa ammonium sulfate 65% và cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, endo-β-1,4-glucanase tinh sạch đƣợc có độ sạch so với enzyme thô ban đầu là 2,6 lần và có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa. 4. Endo-β-1,4-glucanase hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55°C, bền ở 30-45°C và có hoạt tính cao trong pH 6,0. Các dung môi hữu cơ ít ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol. Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS), các ion kim loại và EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu nhƣ đều làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. KIẾN NGHỊ 1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với nguồn dinh dƣỡng là bột đậu tƣơng, lõi ngô, CMC và thành phần khoáng. 2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endo-β-1,4-glucanase từ môi trƣờng nuôi cấy. 3. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng cao chất lƣợng của vật nuôi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 4. Nghiên cứu cấu trúc gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase, tạo endo-β- 1,4-glucanase tái tổ hợp nhằm cải thiện năng suất và có những tính năng phù hợp mong muốn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999) Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551. 2. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999) Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797. 3. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinaza và celluloza của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsic, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324. 4. Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng năng lƣợng và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi-Viện chăn nuôi quốc gia: 16. 5. Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339. 6. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003) Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, xenluloza hoặc dầu ô lƣu trong quá trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 phân hủy chất thải hữu cơ, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291. 7. Nguyễn Lan Hƣơng, Lê Văn Nhƣơng, Hoàng Đình Hoà (1999) Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ƣa nhiệt độ có hoạt tính xenlulaza cao để bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 531-536. 8. Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 9. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307. 10. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học, hội nghị viện Công Nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội: 177-182. 11. Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Sản xuất cà phê theo phƣơng pháp enzyme, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 318-320. 12. Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999) Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus, Báo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội: 804-809. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 13. Nguyễn Thị Thảo (2005) Tối ƣu các điều kiện nuôi cấy chủng Serratia sp. DT3 sinh tổng hợp protease ngoại bào và xác định tính chất lý hóa, Luận văn thạc sỹ sinh học. 14. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 15. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Hoàng Thị Hà Giang (2008) Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ Actinomyces để xử lý phế thải nông nghiệp, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật: 901-903. 16. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007) Tƣơng lai ứng dụng enzyme trong xử lý phế thải, Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23: 75-85. 17. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Văn Thuật, Quyền Đình Thi (2008) Đánh giá một số tính chất hóa lý của xylanase từ chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 721-728. 18. Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh, Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính (2005) Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp xenllulaza cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 872-875. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 TIẾNG ANH 1. Acharya PB, Acharya DK, Modi HA (2008) Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate, Afr J Biotechnol, 7: 4147-4152. 2. Bergquist P, Gibbs M, Morris D, Teo V, Saul D, Morgan H (1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria, FEMS Microbiol Ecol 28: 99-110. 3. Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM (1990) Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello oligosaccharides, Biochem J, 266: 371-378. 4. Chellapandi P, Himanshu M, Jani (2008) Production of endoglucanase by the native strains of Steptomyces isolates in submerged fermentation, Brazil Microbiol, 39: 122-127. 5. Chinedu S, Nwinyi C, Okochi V (2008) Properties of endoglucanase of Penicillium chrysogemum PCL501, Austr Basic Appl Sci, 2(3): 738- 746. 6. Claeyssens M, Tilbeurgh HV, Tomme P, Wood TM, McRae SI (1989) Fungal cellulase systems. Comparison of the specificities of the cellobiohydrolases isolated from Penicillium pinophilum and Trichoderma reesei, Biochem J, 216: 819-900. 7. Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002) Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus nige1r Z10 wild-type strain, Turk J Biol, 26: 209-213. 8. Dahot M, Noomrio M (1996) Microbial production of cellulase by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source, J Islamic Acad Sci, 9: 119-124. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 9. de la Mata I, Estrada P, Macarron R, Dominguez JM, Castillon MP, Acebal C (1992) Chemical mechanism of beta glucosidase from Trichoderma reesei QM 9414 pH-defrendence of kinetic parameters, Biochem, 283: 679-682. 10. Fukuda H, Mikami S, Kizaki Y, Wakabayashi S (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci and Bioeng, 95(5): 479-484. 11. Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, Ma LJ, Wortman, JR, Batzoglou S, Lee SI, Basturkmen M (2005) Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1105-1115. 12. Gao JN, Weng HB, Xi Y, Zhu DH, Han SY (2008) Purification and characterization of a novel endo-β-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett, 30: 323-327. 13. Gielkens M, Dekkers E, Visser J, Graaff L (1990) Two cellobiohydrolase-encoding gene from Aspergillus niger require D- xylose and the xylanolytic transriptional activator XlnR for thier expression, Appl Envirion Microbiol, 65: 4340-4345. 14. Gilkes N, Henrissat B, Kilburn D, Miler R, Warren R (1991) Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence consveration, function, and enzyme families, Microbial Rev, 55: 303-315. 15. Hara Y, Hinoki Y, Shimoi H, Ito K (2003) Cloning and sequence analysis of endoglucanase genes from an industrial fungus Aspergillus kawachi, Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2010-2013. 16. Henning J, Morkeberg A, Krogh K, Olsson L (2005) Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary elechtrophoresis, Enzyme Microb Tech, 36:42-48. 17. Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon J (1989) Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis, Gene, 81: 83-95. 18. Hong J, Tamoki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumajai H (2001) Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast, J Biosc and Bioengin, 92: 434-441. 19. Kang M, Rhee Y (1995) Caeboxymethyl cellulases active and stable at alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp. RYM-202, Biotechnol Lette, 17: 507-512. 20. Kawamori M, Takayama K, Takasawa S (1987) Production of cellulase by a thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus A-131, Agric Biol Chem, 51: 647-654. 21. Khan M, Ali S, Fakhrul-Razi A, Alam Z (2007) Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme, J Environ Sci Health, 42: 381-386. 22. Kitamoto K (2002) Molecular biology of te Koij molds, Adv in Appl Microbiol, 51: 129-153. 23. Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996) Molecular cloning, purification and characterization of two endo-1,4-β-glucanases from Aspergillus oryzae KBN616, Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544. 24. Lee R, Weimer P, Vanzyl W, Pretorius I (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnolog, Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506-577. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 25. Macarron R, Acebal C, Castillon M, Dominguez M, Kata I, Pettersson G, Tomme P, Claeyssenst M (1993) Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei, Biochem J, 289: 867-873. 26. Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, Kusumoto K, Terai G, Kusumoto K, Arima T (2005) Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1157- 1161. 27. Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro-Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of Biotechnology, 1: 51-56. 28. Narasimha G, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajsekhar RB (2006) Nutrient effect on production of cellulolytic enzyme by Aspergillus oryzae, Afr J Biotechnol, 5: 472-476. 29. Nelson N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi mehtod for the determination of glucose, J Biol Chem, 153: 375-380. 30. Nozaki K, Seki T, matsui K, Mizuno M, Kanda T, Amano Y (2007) Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glucanase, isolated from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose, Biosci Biotechnol Biochem, 71(10): 2375-2382. 31. Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003) Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152. 32. Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste from orange, Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388. 33. Sandgren M, Guafetti, PJ, Paech, C, Paech S, Shaw A, Gross L, Saldajeno M, Berglund G, Jones T, Mitchinson C (2003) The Humicola Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability, Protein Sci, 12: 2782– 2793. 34. Sang J, Young J, Hyen S (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and structural gene. The cel gene of Bacillus sp. D04 has exo- endoglucanase activity, J Biol chem, 270: 26012-26019 35. Tang X, He G, Chen Q, Zhang X, Ali M (2004) Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology, Bioresour Technol, 93(2): 175-181. 36. Yamane Y, Furita J, Izuwa S, Fukuchi K, Shimizu R, Hiyoshi A (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci Bioeng, 95(5): 479-484. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 PHỤ LỤC Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose STT glucose (μl ) Đệm natri acetate pH 5,0 (l) Nồng độ (μg/ml) OD (660nm) 1 10 490 20 0,112 2 15 485 30 0,188 3 20 480 40 0,256 4 25 475 50 0,319 5 30 470 60 0,401 6 40 460 80 0,566 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 Trình tự nucleotide Vị trí Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian Thời gian (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 24 0,42 0,54 0,47 1,96 ± 0,062 101 36 0,46 0,50 0,48 1,99 ± 0,022 103 48 0,45 0,52 0,48 2,00 ± 0,033 104 60 0,37 0,47 0,42 1,73 ± 0,053 90 72 0,39 0,54 0,47 1,93 ± 0,075 100 84 0,40 0,48 0,44 1,81 ± 0,038 94 96 0,26 0,27 0,26 1,09 ± 0,002 56 108 0,36 0,36 0,36 1,49 ± 0,003 77 120 0,66 0,48 0,57 2,35 ± 0,091 122 132 0,28 0,57 0,42 1,75 ± 0,145 90 144 0,33 0,67 0,50 2,08 ± 0,170 107 156 0,22 0,63 0,42 1,76 ± 0,207 91 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nồng độ CMC (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 0,5 0,42 0,39 0,44 0,42 8,52 ± 0,014 100 0,7 0,49 0,48 0,48 0,48 9,86 ± 0,002 116 1,0 0,51 0,59 0,56 0,55 11,27 ± 0,025 132 1,5 0,43 0,41 0,43 0,42 8,58 ± 0,008 101 2,0 0,30 0,31 0,30 0,31 6,21 ± 0,012 73 2,5 0,21 0,22 0,24 0,22 4,53 ± 0,008 53 2,7 0,18 0,16 0,20 0,18 3,66 ± 0,012 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nguồn cacbon OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình Bã mía 0,33 0,38 0,35 0,82 ± 0,028 35 Cao nấm men 0,87 1,12 0,99 2,32 ± 0,124 100 CMC 0,27 0,26 0,26 2,11 ± 0,005 91 Glucose 0,57 0,41 0,49 2,61 ± 0,082 112 Lactose 0,40 0,35 0,38 11,81 ± 0,022 508 Lõi ngô 0,42 0,50 0,46 2,29 ± 0,040 99 Sacarose 0,61 0,61 0,61 1,93 ± 0,004 83 Vỏ cà phê 0,66 0,68 0,67 1,62 ± 0,009 70 Vỏ lạc 0,26 0,38 0,32 1,01 ± 0,060 43 Vỏ quýt 0,65 0,94 0,80 2,10 ± 0,0143 90 Trấu cám 0,51 0,62 0,57 1,09 ± 0,055 47 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nồng độ lactose (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 0,1 0,11 0,10 0,11 4,25 ± 0,002 100 0,2 0,20 0,11 0,15 6,24 ± 0,043 147 0,4 0,49 0,27 0,38 15,47 ± 0,111 364 0,6 0,22 0,16 0,19 7,57 ± 0,030 178 0,8 0,04 0,06 0,05 2,08 ± 0,010 49 1,0 0,09 0,18 0,14 5,52 ± 0,044 130 1,2 0,15 0,20 0,17 6,92 ± 0,026 163 1,4 0,19 0,26 0,23 9,13 ± 0,033 215 1,6 0,11 0,10 0,11 4,29 ± 0,005 101 1,8 0,11 0,09 0,10 4,13 ± 0,009 97 2,0 0,07 0,14 0,10 4,09 ± 0,034 96 2,2 0,12 0,14 0,13 5,13 ± 0,013 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nguồn nitrogen OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 TB Bột cá 0,14 0,20 0,17 3,39 ± 0,033 50 Bột đậu tƣơng 0,63 0,63 0,63 12,92 ± 0,002 189 Pepton 0,32 0,36 0,34 6,83 ± 0,020 100 Urea 0,32 0,48 0,40 8,13 ± 0,083 119 (NH4)2SO4 0,31 0,38 0,34 7,01 ± 0,036 103 NaNO3 0,15 0,13 0,14 2,79 ± 0,012 41 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nồng độ bột đậu tƣơng (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 TB 0,1 0,42 0,35 0,39 11,85 ± 0,034 100 0,5 0,11 0,22 0,16 4,99 ± 0,035 42 1,0 0,57 0,50 0,54 16,39 ± 0,02 138 1,5 0,21 0,24 0,22 6,83 ± 0,002 58 1,8 0,21 0,21 0,21 6,38 ± 0,001 54 2,0 0,20 0,17 0,19 5,67 ± 0,014 48 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 28 o C 0,39 0,34 0,32 0,35 14,23 ± 0,023 100 30 o C 0,28 0,28 0,26 0,27 11,03 ± 0,008 78 37 o C 0,17 0,14 0,12 0,15 5,86 ± 0,014 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 pH OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 3,5 0,39 0,42 0,45 0,42 17,04 ± 0,015 54 4,0 0,75 0,84 0,92 0,83 34,12 ± 0,050 108 4,5 0,78 0,78 0,70 0,75 30,71 ± 0,026 98 5,0 0,70 0,67 0,67 0,68 27,66 ± 0,010 88 5,5 0,81 0,89 0,91 0,87 35,70 ± 0,030 113 6,0 0,77 0,83 0,82 0,81 32,97 ± 0,019 105 6,5 0,80 0,69 0,82 0,77 31,48 ± 0,039 100 7,0 0,19 0,29 0,29 0,26 10,36 ± 0,035 33 7,5 0,31 0,32 0,25 0,29 11,88 ± 0,022 38 8,0 0,42 0,42 0,47 0,44 17,84 ± 0,018 57 8,5 0,49 0,38 0,38 0,42 17,01 ± 0,036 54 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ (oC) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 30 0,12 0,16 0,14 12,67 ± 0,021 19 35 0,12 0,19 0,15 14,23 ± 0,033 21 40 0,52 0,40 0,46 42,53 ± 0,060 63 45 0,55 0,53 0,54 49,58 ± 0,007 73 50 0,58 0,56 0,57 52,19 ± 0,009 77 55 0,75 0,73 0,74 67,69 ± 0,009 100 60 0,73 0,71 0,72 66,25 ± 0,007 97 65 0,53 0,55 0,54 49,67 ± 0,011 73 70 0,45 0,46 0,46 41,98 ± 0,006 62 75 0,50 0,51 0,51 46,60 ± 0,005 69 80 0,49 0,44 0,47 42,99 ± 0,026 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 pH OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 3,5 0,10 0,11 0,103 48,03± 0,003 50 4,0 0,10 0,10 0,104 48,49± 0,001 51 4,5 0,12 0,11 0,116 54,21± 0,002 57 5,0 0,12 0,13 0,126 58,79± 0,002 61 5,5 0,19 0,22 0,207 95,88± 0,013 100 6,0 0,13 0,14 0,135 62,91± 0,001 66 6,5 0,18 0,19 0,187 86,49± 0,003 90 7,0 0,14 0,14 0,136 63,14± 0,001 66 7,5 0,13 0,13 0,127 59,02± 0,001 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase Nhiệt độ ( o C) Thời gian ủ (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình ĐC 0 0,58 0,59 0,59 54,20 ± 0,002 100 30 1 0,52 0,51 0,51 53,56 ± 0,003 99 2 0,23 0,23 0,23 56,90 ± 0,001 105 4 0,21 0,21 0,21 65,74 ± 0,004 121 6 0,17 0,18 0,18 37,17 ± 0,001 69 8 0,14 0,15 0,14 36,90 ± 0,004 68 45 1 0,58 0,57 0,57 52,78 ± 0,005 97 2 0,55 0,56 0,56 51,04 ± 0,002 94 4 0,56 0,54 0,55 50,54 ± 0,006 93 6 0,54 0,55 0,54 49,99 ± 0,004 92 8 0,55 0,45 0,50 45,92 ± 0,005 85 50 1 0,41 0,45 0,43 59,60 ± 0,016 73 2 0,48 0,48 0,48 44,27 ± 0,003 82 4 0,39 0,38 0,38 35,20 ± 0,003 65 6 0,27 0,37 0,32 29,48 ± 0,046 54 8 0,23 0,22 0,22 20,78 ± 0,005 38 55 1 0,59 0,45 0,52 47,61 ± 0,067 88 2 0,57 0,63 0,60 55,26 ± 0,028 102 4 0,70 0,80 0,75 68,81 ± 0,049 127 6 0,63 0,58 0,60 55,30 ± 0,026 102 8 0,42 0,35 0,39 35,48 ± 0,034 65 60 1 0,58 0,58 0,58 53,24 ± 0,001 98 2 0,55 0,56 0,56 51,09± 0,005 94 4 0,54 0,52 0,53 48,80 ± 0,014 90 6 0,32 0,36 0,34 31,45 ± 0,021 58 8 0,32 0,30 0,31 28,56 ± 0,006 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase pH Thời gian ủ (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình ĐC 0 0,58 0,59 0,59 112,3 ± 0,002 100 4,5 1 0,52 0,51 0,51 68,64 ± 0,003 61 2 0,23 0,23 0,23 67,03 ± 0,001 60 4 0,21 0,21 0,21 65,66 ± 0,004 58 6 0,17 0,18 0,18 59,96 ± 0,001 51 5,5 1 0,58 0,57 0,57 81,23 ± 0,005 72 2 0,55 0,56 0,56 80,31 ± 0,002 71 4 0,56 0,54 0,55 76,65 ± 0,006 68 6 0,54 0,55 0,54 57,42 ± 0,004 51 6,0 1 0,41 0,45 0,43 99,31 ± 0,016 88 2 0,48 0,48 0,48 75,50 ± 0,003 67 4 0,39 0,38 0,38 73,67 ± 0,003 66 6 0,27 0,37 0,32 72,07 ± 0,046 64 6,5 1 0,59 0,45 0,52 67,03 ± 0,067 60 2 0,57 0,63 0,60 64,06 ± 0,028 57 4 0,70 0,80 0,75 59,94 ± 0,049 53 6 0,63 0,58 0,60 59,25 ± 0,026 53 7,5 1 0,58 0,58 0,58 68,41 ± 0,001 61 2 0,55 0,56 0,56 67,95 ± 0,005 60 4 0,54 0,52 0,53 67,49 ± 0,014 60 6 0,32 0,36 0,34 63,14 ± 0,021 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 CTR Nồng độ (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 TB ĐC 0 0,22 0,21 0,22 99,54 ± 0,001 100 Tween 20 0,4 0,16 0,16 0,16 76,19 ± 0,000 77 0,8 0,14 0,13 0,13 62,68 ± 0,002 63 1,2 0,08 0,09 0,08 39,56 ± 0,002 40 1,6 0,07 0,07 0,07 32,23 ± 0,001 32 2,0 0,07 0,07 0,07 31,32 ± 0,001 31 Tween 80 0,4 0,09 0,08 0,09 40,02 ± 0,003 40 0,8 0,08 0,08 0,08 37,73 ± 0,000 38 1,2 0,07 0,07 0,07 32,92 ± 0,001 33 1,6 0,07 0,07 0,07 31,78 ± 0,002 32 2,0 0,06 0,06 0,06 26,97 ± 0,001 27 Trixton X100 0,4 0,10 0,09 0,10 44,60 ± 0,004 45 0,8 0,09 0,09 0,09 40,02 ± 0,000 40 1,2 0,08 0,09 0,08 39,79 ± 0,001 40 1,6 0,09 0,08 0,08 38,87 ± 0,003 39 2,0 0,08 0,07 0,07 34,29 ± 0,003 34 SDS 0,4 0,03 0,03 0,03 15,29 ± 0,001 15 0,8 0,02 0,02 0,02 11,63 ± 0,001 12 1,2 0,02 0,01 0,01 7,51 ± 0,001 8 1,6 0,01 0,01 0,01 6,59 ± 0,001 7 2,0 0,01 0,01 0,01 4,30 ± 0,001 4 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ (oC) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 TB ĐC 0,16 0,17 0,17 76,65 ± 0,004 100 Metanol 0,13 0,14 0,13 62,00 ± 0,002 81 Ethanol 0,13 0,12 0,13 58,33 ± 0,002 76 Isopropanol 0,13 0,13 0,13 61,54 ± 0,000 80 Aceton 0,09 0,09 0,09 42,99 ± 0,002 56 n-Butanol 0,07 0,07 0,07 33,15 ± 0,001 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại Nồng độ (mM) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) Lần 1 Lần 2 TB ĐC 0 0,30 0,29 0,29 135,26 ± 0,003 Ag + 4 0,25 0,24 0,25 113,28 ± 0,001 8 0,29 0,29 0,29 131,42 ± 0,001 12 0,21 0,21 0,21 98,17 ± 0,002 Ca 2+ 4 0,28 0,25 0,26 121,52 ± 0,017 8 0,24 0,23 0,24 109,16 ± 0,002 12 0,21 0,22 0,21 99,08 ± 0,004 Co 2+ 4 0,27 0,27 0,27 124,50 ± 0,001 8 0,27 0,28 0,27 126,10 ± 0,003 12 0,27 0,27 0,27 124,73 ± 0,000 Cu 2+ 4 0,28 0,28 0,28 129,30 ± 0,000 8 0,27 0,27 0,27 124,27 ± 0,004 12 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,001 EDTA 4 0,25 0,31 0,28 129,30 ± 0,030 8 0,25 0,27 0,26 120,15 ± 0,010 12 0,20 0,21 0,21 95,42 ± 0,002 Fe 2+ 4 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,000 8 0,19 0,18 0,19 86,26 ± 0,002 12 0,16 0,17 0,17 78,02 ± 0,002 K + 4 0,30 0,30 0,30 138,69 ± 0,001 8 0,25 0,26 0,25 116,94 ± 0,002 12 0,24 0,24 0,24 111,90 ± 0,002 Mn 2+ 4 0,28 0,29 0,28 130,68 ± 0,003 8 0,24 0,24 0,24 111,45 ± 0,001 12 0,22 0,23 0,22 103,66 ± 0,004 Ni + 4 0,28 0,28 0,28 127,93 ± 0,001 8 0,27 0,27 0,27 124,45 ± 0,001 12 0,21 0,21 0,21 94,96 ± 0,000 Zn 2+ 4 0,25 0,26 0,26 118,32 ± 0,002 8 0,17 0,19 0,18 83,25 ± 0,010 12 0,17 0,17 0,17 77,11 ± 0,001 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 ._.