Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp Endo-Β-1,4-Glucanase

Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM --------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN- 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM --------------------------------- NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN! Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi đi học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên tháng 9 năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Tuân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin CMC Carboxyl methyl cellulose cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid DEAE Diethylaminoethyl ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid IU International unit kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani M Marker Nxb Nhà xuất bản OD Optical density PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TBE Tris base-Boric acid-EDTA TE Tris-EDTA v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE ............ 3 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE .................. 4 1.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................. 4 1.2.2 Phân loại ................................................................................................ 6 1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE .......................................... 7 1.3.1 Cấu trúc bậc một .................................................................................... 7 1.3.2 Cấu trúc không gian ............................................................................... 9 1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất ......................... 9 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ........................... 11 1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................... 12 1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 12 1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ......................................... 13 1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ...................................... 15 1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ....................................... 15 1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16 1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16 1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................................... 17 1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20 1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ............................................................... 25 2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25 2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26 2.1.4 Môi trƣờng .......................................................................................... 26 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.5 Dung dịch và đệm ................................................................................ 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28 2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28 2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28 2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ................................................................................................ 30 2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32 2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33 2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34 2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 35 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36 2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 42 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42 3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42 3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43 3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE .... 45 3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian ......................... 45 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................ 47 3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ............................................ 48 3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon ...................... 50 3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen ................. 52 3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu .......................................................... 54 3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE ............................................................ 55 3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 ................................ 55 3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE ........................................ 56 3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE ................. 57 3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất .......................................................... 57 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu ..................................................................... 58 3.4.3 pH phản ứng tối ƣu .............................................................................. 60 3.4.4 Độ bền nhiệt độ ................................................................................... 61 3.4.5 Độ bền pH ........................................................................................... 63 3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ......................................................... 64 3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại................................................................. 65 3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa ...................................................... 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ................................. 25 Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ..................... 26 Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27 Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein ............................................... 33 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori ............................... 43 Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian .......................... 79 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ................................................................ 50 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen ............................................................. 52 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu ................................ 81 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81 Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82 Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase ...................................... 85 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 66 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3 Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9 Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea ............................. 10 Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase ............................................................................. 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose............................................................... 30 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn ........................................ 36 Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu ............. 42 Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). ................................................................................................. 44 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................... 45 Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................................................................... 46 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 48 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .................................................................... 49 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 51 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .............................................. 53 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 54 Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 ............................... 56 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide....... ............................................................................................... 57 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 58 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian ................................................................ 64 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 1 MỞ ĐẦU Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide. Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu của các enzyme. Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu cơ và xử lý môi trƣờng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớc hiện nay chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta là một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4- glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4- glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết -1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39]. Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các oligosaccharide). Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.2.1 Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Aspergillus niger [25], [26], A. flavus, A. fumigatus [27] A. terreus [29] Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P. brasilianum [33], Penicillium sp. [10], Phanerochaete chrysosporium [34]. Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase khá phong phú. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C. udai [20], [21], Pseudomonas fluoressens [42]. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Clostridium [57]. Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus [13], Streptomyces reticuli [61]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn đƣợc sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis [23], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xƣơng sống khác nhƣ mối [62], ở động vật thân mềm nhƣ Mytilus edulis [63]. Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật đƣợc xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme. Trƣớc hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lƣợng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con ngƣời chủ động tạo ra đƣợc. Chu kỳ sinh trƣởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật sinh trƣởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ, kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Đối với một số trƣờng hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme. Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trƣờng, thành phần dinh dƣỡng nuôi chúng cũng nhƣ một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lƣợng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, với vi sinh vật, ngƣời ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên các đối tƣợng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp hoặc tổng hợp định hƣớng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lƣu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 2.2.2 Phân loại Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1: thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; pedro/CAZY/db.html). Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợc xếp thành các nhóm khác nhau. Trƣớc đây, cellulase đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx đƣợc chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose [7]. Hiện nay, cellulase đƣợc chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose. -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose [30], [39], [45]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Các cellulase có nguồn gốc khác nhau đƣợc sắp xếp thành các họ. Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase đƣợc chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35]. Sau đó, cellulase đƣợc chia thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31]. Hiện nay, các cellulase đƣợc sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 [45]. 2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.3.1 Cấu trúc bậc một Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối lƣợng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lƣợng phân tử 31 kDa, đƣợc xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó, Cel B đƣợc xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid và khối lƣợng phân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus bao gồm 410 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các endoglucanase từ chủng A. niger Z10 có khối lƣợng phân tử 83 kDa và 50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và 55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối lƣợng 35 kDa [56]. Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt Humicola grisea. Cel12A của H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên các chuỗi ,  và các vùng nối (Hình 1.2) [55]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng vi sinh vật [55]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 2.3.2 Cấu trúc không gian Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng. Phân tử Cel12A của H. grisea cấu tạo bởi 1 chuỗi , 2 chuỗi  (A và B). Chuỗi -A đƣợc cấu tạo bởi 6 dải xoắn  (A1-A6), chuỗi -B đƣợc cấu tạo bởi 9 dải xoắn  (B1-B9). Các dải xoắn  đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tƣơng ứng các dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Hình 1.3A) [55]. 2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid là glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma reesei là E-116 và E-200 [55]. Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của Cel12A từ H. grisea [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các cellulase đƣợc thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain (CBD). Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian khác nhau. Cel12A của H. grisea có 3 vùng liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206, C216) đóng vai trò trung tâm. CBD1 với C175 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A6 liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177, và F180 bằng tƣơng tác Van der Walls. Liên kết giữa các amino acid trong CBD1 có kích thƣớc 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A). CBD2 với C206 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -B4 liên kết với các amino acid Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204. Liên kết giữa các amino acid trong CBD2 có kích thƣớc 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205) (Hình 1.4B). CBD3 với C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A4 liên kết với các amino acid W48, V87, W89, F214 và F219. Liên kết giữa các amino acid trong CBD3 có kích thƣớc 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55]. Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 2.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thƣờng phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose. Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác. Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các oligosaccharide, cellobiose và glucose. -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose [45], [58] (Hình 1.5). Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 2.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUC._.ANASE Các cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh. 2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phƣơng hƣớng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nƣớc quả và nƣớc uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscozyme 120L đƣợc ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tƣơng [14]. Trong quá trình sản xuất nƣớc cà rốt thƣờng sử dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đƣờng, protein còn có một lƣợng không nhỏ các phân tử khối lƣợng cao nhƣ cellulose và -glucan, làm ảnh hƣởng xấu đến quá trình lọc và chất lƣợng sản phẩm. Ngƣời ta thƣờng sử dụng -glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm nhƣ Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger, -glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã đƣợc sử dụng trong sản xuất bia. Ngoài ra, endoglucanase còn đƣợc sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 insolens đƣợc ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Glucanase từ Trichoderma reesei, A. niger đƣợc ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) đƣợc sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dƣợc phẩm cũng nhƣ có ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe. Khi đƣợc bổ sung vào cơ thể ngƣời và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan trọng nhƣ: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lƣợng cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thƣ, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng [38], [64]. Các phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tƣởng cho việc sản xuất các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các nƣớc trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm [48]. 2.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam. Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm nhƣ trứng, thịt, sữa cho thị trƣờng mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho ngƣời dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn. Một trong những vấn đề cần đƣợc giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi trƣờng xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con ngƣời. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Trƣớc tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã đƣợc đƣa ra và một trong những giải pháp đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học nhƣ sản xuất và bổ sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thụ chất dinh dƣỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trƣởng phát triển, nâng cao chất lƣợng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn đƣợc tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lƣợng vốn có, tiết kiệm chi phí chăn nuôi, đồng thời làm giảm lƣợng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Thức ăn gia súc, gia cầm đƣợc chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thƣờng không đƣợc tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu các chất dinh dƣỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung -glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn [14]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi làm tăng đáng kể tốc độ tăng trƣởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi. Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme nhƣ sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% [52]. Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến nhƣ: Rovazyme G2 (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme (cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease, amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF, Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-CF (Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase, amylase, protease, lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trƣờng Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase (200 BGU/g), phytase (1000 PU/g), α-amylase (30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g), protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) [3]. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn nuôi. Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn cho gia súc [2]. 2.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trƣớc khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme đã đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp này nhƣ neutrase 0,5L có chứa -glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp glucanase đƣợc sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [28]. 2.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu đƣợc nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ đƣợc tách riêng khỏi nhau Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì đƣợc giữ lại. Phƣơng pháp thông thƣờng là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một phƣơng pháp tốn kém và thƣờng gây ô nhiễm môi trƣờng do thành phần chlor tồn dƣ trong nƣớc thải. Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mới đƣợc đƣa ra để thay thế phƣơng pháp truyền thống, đó là sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy. Glucanase thƣờng đƣợc bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý glucanase trƣớc khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin [14], [15]. Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase đƣợc sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh [37]. 2.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa Cùng với protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase đƣợc ứng dụng để sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải là nơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tính đến năm 2002 đã có nhiều cellulase đƣợc sản xuất dùng cho bột giặt nhƣ: endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous [51]. 2.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trƣờng là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm có ích, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã đƣợc ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt. Năm 1999, Nguyễn Lan Hƣơng và cs đã phân lập và tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn đƣợc chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam [1], [5], [8], [12]. Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn đƣợc 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lƣợng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải đƣợc phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, đƣợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu đƣợc nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trƣờng [1]. Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hƣởng của cellulase đến nấm gây bệnh cây trồng nhƣ cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học [6]. 2.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trƣờng thành các chất dinh dƣỡng cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của mình. Khả năng Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trƣờng, nguồn carbon, nguồn nitrogen. Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản nhƣ các loại đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc phức tạp nhƣ glucan, tinh bột, cellulose. Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cƣa. Nguồn carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ƣu ấm là vỏ lạc hoặc rơm [12]. Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cƣa [18]. Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A. flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử dụng mùn cƣa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cƣa đƣợc xem là nguồn cơ chất tối ƣu. Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 với nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém [33]. Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 là rơm [10]. Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhƣng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trƣờng chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men [5]. Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase tổng số từ 46 đến 76 IU/g [11]. Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho thấy, các chủng A. niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau nhƣ: urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này [49]. Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trƣởng, các loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm: các loài ƣa lạnh và chịu lạnh; các loài ƣa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh có khả năng sinh trƣởng trong điều kiện dƣới 15C, các loài ƣa ấm thƣờng sinh trƣởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50C. Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9]. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợp Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1 và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ƣu là 31 và 34C [8]. Acharya và cs (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]. pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu: pH môi trƣờng ban đầu ảnh hƣởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trƣờng ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 6,7 [13]. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở môi trƣờng có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác nhƣ: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lƣợng giống đƣợc tiếp vào ban đầu. 2.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại cũng có sự khác nhau. Ảnh hƣởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50C. Ở nhiệt độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở nhiệt độ thấp dƣới 0C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhƣng lại có thể phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp [4]. Cellulase từ A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11]; trong khi đó cellulase từ A. niger Z10 là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55C [46]. Theo kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43]. Ảnh hƣởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trƣờng phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, pH tối ƣu cho hoạt động của cellulase từ A. niger NRRL-363 là 5,5 [11]; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5 [25]; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [46]; của endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [43]. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ƣa acid A. terreus M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải pH 2-5, trong đó pH 2 là tốt nhất [29]. Ảnh hƣởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và Zn 2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng) [56]. Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A. terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2 mM) [29]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng nhƣ bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hƣởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% [10]. 2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng. Các nghiên cứu đƣợc tiến hành trên nhiều phƣơng diện khác nhau liên quan đến loại enzyme này. Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt Nam, lƣợng rác thải ra ngoài môi trƣờng ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian thƣờng kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trƣờng, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu đƣợc nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hƣớng nghiên cứu đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm. Năm 1999, Tăng Thị Chính và cs đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 cellulase của một số chủng vi khuẩn ƣa nhiệt đƣợc phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ 80C, nhiệt độ lên men tối ƣu từ 45C đến 55C, pH môi trƣờng ban đầu thích hợp nhất là 8. Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48 giờ lên men [5]. Nguyễn Đức Lƣợng và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu tác giả thấy rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase của A. griseus là cao và khả năng này đạt tối ƣu ở 58C, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Qua nghiên cứu tác giả cũng thấy rằng nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cƣa [13]. Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cs đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn đƣợc một số chủng xạ khuẩn ƣa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [12]. Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy cellulose cao và tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn đƣợc hai chủng nấm sợi có khả năng phân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra đƣợc một số điều kiện tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này [8]. Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu, tác giả đã tìm ra đƣợc một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trƣờng trấu xay và một số chất thải công nghiệp nhƣ mật rỉ đƣờng [11]. Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao, Lý Kim Bảng và cs (1999) đã xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này đƣợc bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn đƣợc 15 ngày ủ, một nửa thời gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lƣợng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng [1]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 3 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 3.1.1 Chủng nấm Hai mƣơi sáu chủng A. awamori do Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất. Từ đó thu enzyme làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2 Thiết bị thí nghiệm Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Thiết bị Hãng sản xuất (quốc gia) Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Cân phân tích BL 150S Sartorius (Thụy Sỹ) Hệ thống chụp ảnh gel Wealtec (Mỹ) Hệ thống điện di ngang Mupid  (Nhật bản) Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc) Máy ly tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức) Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ) Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức) Máy chuẩn pH 827 pH Lab Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản) Tủ lạnh 4ºC, -20ºC, -80ºC Toshiba, Sanyo (Nhật Bản) Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 3.1.3 Hóa chất Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Hóa chất Hãng sản xuất (quốc gia) 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Fluka Cao nấm men Difco (Mỹ) DEAE Heldelberg (Đức) Peptone Merck (Đức) SDS Sigma (Mỹ) Sephadex G100 Pharmacia (Mỹ) Sodium dodecylsulfate Sigma (Mỹ) Triton X-100 Merck (Đức) Tween-20 BioBasic Inc (Mỹ) Tween-80 BioBasic Inc (Mỹ) CMC Prolabo (Pháp) 3.1.4 Môi trƣờng Môi trƣờng Czapek: 0,2% (w/v) NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4, 0,05% KCl, 2% Saccharose, pH 6,5. Môi trƣờng đặc bổ sung 2% agar. Môi trƣờng MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO4 1,4; KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10; tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lƣợng 0,1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4 18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO4 4,8 mM, CoCl2 15 mM. pH 7,0 [36], [60]. Môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 g/ml ampicillin. 3.1.5 Dung dịch và đệm Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml 88% phosphoric acid Đệm Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm KP (K2HPO4) 0,1 M K2HPO4, pH 6,5 Đệm tra mẫu protein (biến tính) 5x 10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch DNS (1000 ml) 205,4 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15 g Na2S2O5; 5,3 g DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol Dung dịch I Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 50 mM NaCl Dung dịch II Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 1000 mM NaCl Dung dịch III Đệm 80 mM phosphate, pH 7,5 Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch D 10% SDS; 25 mM EDTA Dung dịch nhuộm gel polyacrylamide 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch protease K 20 g/ml protease K Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Dung dịch RNase 10 g/ml RNase Dung dịch ampicillin gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch nhuộm gel agarose 0,1 g/ml ethidium bromide Đệm TE 100 mM Tris- HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0 Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 Đệm cell lysis 10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, pH 8,0 3.2 PHƢƠNG PHÁP 3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật Nuôi cấy hoạt hóa nấm sợi Các chủng A. awamori lấy từ các ống giống đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Czapek lỏng ở điều kiện 30C, pH 6,5, lắc 200 vòng/phút trong 72 giờ. Nuôi cấy nấm thu sinh khối enzyme Các chủng A. awamori sau khi hoạt hóa đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau 96 giờ nuôi cấy, dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch enzyme thô. 3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase Định tính hoạt tính endoglucanase Hoạt tính endoglucanase đƣợc xác định tƣơng đối theo phƣơng pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm đƣợc đục lỗ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 đƣờng kính 0,5 cm. 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme khuếch tán đều xung quanh. Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng dung dich 1% lugol và đo đƣờng kính vòng phân giải cơ chất. Hoạt tính tƣơng đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thƣớc đƣờng kính vòng phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (với D là đƣờng kính vòng ngoài và d là đƣờng kính lỗ) [7]. Xác định hoạt độ endoglucanase Hoạt độ endoglucanase đƣợc xác định chính xác dựa vào lƣợng đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [47]. Tiến hành Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút. Ống đối chứng: 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy ra và đun sôi cách thủy ._. 4 dung môi hữu cơ ở tất cả các nồng độ khảo sát đều có ảnh hƣởng ức chế hoạt động của endoglucanase, trong đó ethanol làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh nhất. Sau 2 giờ ủ với 30% (v/v) ethanol ở 37C, hoạt tính tƣơng đối của endoglucanase giảm chỉ còn 53% so với nhóm đối chứng (Hình 3.18, Bảng 3.20). Nhƣ vậy, ethanol là dung môi hữu cơ làm ức chế mạnh nhất và acetone là dung môi ức chế yếu nhất hoạt tính endoglucanase trong 4 dung môi hữu cơ khảo sát. 0 40 80 120 ĐC Act BtOH EtOH IsOH MtOH Ho ạt tín h e nd og luc an as e t ươ ng đố i (% ) Dung môi hữu cơ Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 10%; (): 20%; (): 30%; Act: Acetone; BtOH: n-Butanol; EtOH: Ethanol; IsoOH: Isopropanol; MtOH: Methamol. 4.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại Để đánh giá ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme đƣợc thêm vào các ion kim loại khác nhau với nồng độ 5, 10 và 15 mM. Sau 2 giờ ủ ở 37C hoạt tính endoglucanase còn Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 lại đƣợc xác định và so sánh với mẫu đối chứng. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ bảng 3.21 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại Kim loại Nồng độ (mM) Hoạt tính endoglucanase sau 2 giờ ủ (%) 5 10 15 Ag + 74 70 43 Ca 2+ 97 95 90 Co 2+ 99 96 79 Cu 2+ 126 137 148 EDTA 146 153 155 Fe 2+ 129 120 107 K + 92 86 87 Mn 2+ 70 63 54 Ni 2+ 96 93 74 Zn 2+ 94 79 78 Kết quả trên bảng 3.21 cho thấy, tính chất và mức độ ảnh hƣởng của các ion kim loại đối với hoạt tính của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 là khác nhau. Một số ion kim loại (Fe2+, Cu2+) và EDTA làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme. Khi nồng độ các ion trên thay đổi thì hoạt tính của endoglucanase cũng thay đổi theo các chiều hƣớng khác nhau. Khi nồng độ Cu 2+ và EDTA tăng từ 5 mM lên 15 mM thì hoạt tính enzyme tƣơng đối cũng tăng tƣơng ứng từ 126% lên 148% (đối với Cu2+), từ 146% lên 155% (đối với EDTA). Trong khi đó, khi nồng độ của Fe2+ tăng từ 5 mM lên 15 mM thì hoạt tính tƣơng đối của enzyme lại giảm từ 129% xuống còn 107%. Ngƣợc lại, các ion kim loại khác (Ag+, Ca2+, Co2+, K+, Mn2+, Ni2+, Zn 2+ ) lại làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme nghiên cứu với các mức độ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 khác nhau. Ở nồng độ thấp, các ion Ca2+, K+, Co2+, Ni2+, Zn2+ làm giảm nhẹ hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Khi nồng độ các ion này càng tăng, hoạt tính enzyme giảm càng mạnh. Riêng ion Ag+ và Mn2+ làm ức chế rõ rệt hoạt tính endoglucanase. Ở nồng độ 15 mM, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 43% (đối với Ag+) và 54% (đối với Mn2+) so với mẫu đối chứng. 4.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa Một số loại chất tẩy rửa có đặc tính hoạt động bề mặt nên khi đƣợc ủ cùng enzyme sẽ làm ảnh hƣởng đến cấu trúc và hoạt động của enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme đƣợc ủ cùng các dung dịch chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, SDS, Triton X-100) ở các nồng độ khác nhau từ 0,5; 1,0; 1,5; 2%. Sau 2 giờ ủ ở 37C hoạt tính còn lại đƣợc xác định. Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.19 và bảng 3.22 cho thấy, các chất tẩy rửa trên đều có ảnh hƣởng ức chế hoạt động xúc tác của enzyme nghiên cứu. tween 20 ở nồng độ 0,5-1,0% ảnh hƣởng yếu đến hoạt tính endoglucanase. Hoạt tính tƣơng đối giảm còn 90-78% so với đối chứng sau khi ủ enzyme cùng với 0,5-1% (v/v) Tween 20. Ở nồng độ 1,5-2% Tween 20, hoạt tính tƣơng đối chỉ còn 75-61%. Tween 80 làm giảm hoạt tính endoglucanase từ 83 xuống 64% khi tăng nồng độ từ 0,5 lên 2%. Triton X-100 làm giảm mạnh hoạt tính từ 82 xuống 59% so với đối chứng khi tăng nồng độ từ 0,5-2%. Riêng đối với SDS, thì hoạt tính endoglucanase bị ức chế rõ rệt. Nồng độ SDS càng cao thì hoạt tính tƣơng đối càng giảm, ngay ở nồng độ rất thấp 0,5% hoạt tính chỉ đạt 45% còn ở nồng độ cao 2% thì hoạt tính chỉ còn 16% so với đối chứng. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 0 40 80 120 ĐC Tween 20 Tween 80 SDS Triton X-100 Ho ạt tín h en do gl uc an as e t ươ ng đố i ( % ) Chất tẩy rửa Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 0,5%; (): 1%; (): 1,5%; (): 2%. Thƣờng SDS ức chế rất mạnh hoạt động của enzyme nói chung do có khả năng hình thành một lớp điện tích âm xung quanh phân tử protein enzyme và làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzyme. Do đó, enzyme mất khả năng liên kết và phân giải cơ chất. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa trên tới hoạt tính xúc tác của cellulase từ chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá (2006) cũng thấy rằng cả 4 chất trên đều là chất ức chế hoạt động của cellulase. Trong đó, SDS là chất ức chế mạnh nhất, hoạt tính enzyme giảm xuống còn 18% sau khi ủ với 2% SDS trong 2 giờ ở 37ºC [10]. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Chủng Aspergillus awamori VTCC-F-099 có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori đƣợc khảo sát. Chủng này đƣợc định loại bằng chỉ thị gene 28S rRNA. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA của chủng này đã đƣợc đăng ký trong GeneBank với mã số GQ892590. 2. Chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất sau 96 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 pH 6,5, lắc 200 vòng/phút ở 30C. Nồng độ cơ chất cảm ứng tối ƣu là 2% CMC, nguồn carbon và nitrogen thích hợp là lõi ngô (3%) và ammonium acetate (0,3%). 3. Đã tinh sạch đƣợc endoglucanase có khối lƣợng phân tử khoảng 32 kDa từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bằng phƣơng pháp sử dụng kết hợp cột sắc ký lọc gel sephadex-G100 và cột sắc ký trao đổi ion DEAE. Hiệu suất thu hồi endoglucanase khoảng 7%, độ sạch 3,1 lần. 4. Nhiệt độ và pH phản ứng tối ƣu của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 là 50C và 5,0. Enzyme này bền trong dải nhiệt độ 30-50C và dải pH 4,5-5,5. Ở các nồng độ 5 mM, 10 mM, 15 mM hoạt tính endoglucanase đều tăng nhẹ dƣới ảnh hƣởng của các ion kim loại: Fe2+, Cu2+ và EDTA. Ngƣợc lại, các ion Ag+, Ca2+, Co2+, K + , Mn 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ làm hoạt tính endoglucanase giảm. Đặc biệt là Ag+ làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh, chỉ còn 43% ở nồng độ 15 mM sau 2 giờ ủ ở 37C. Các dung môi: acetone, ethanol, methanol, iso propanol và n-butanol đều làm giảm hoạt tính endoglucanase. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Đặc biệt, dung môi 30% methanol làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh, còn 52% sau khi ủ 2 giờ ở 37C. Các chất tẩy rửa khảo sát đều làm giảm hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Đặc biệt là SDS làm giảm mạnh hoạt tính enzyme, chỉ còn 20% sau khi ủ với 2% SDS trong 2 giờ ở 37C. KIẾN NGHỊ 1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với các nguồn cơ chất sẵn có, rẻ tiền nhƣ: lõi ngô, bột giấy, bột đầu cá, bột đỗ tƣơng. 2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endoglucanase từ môi trƣờng nuôi cấy. 3. Nhân dòng, biểu hiện gene mã hóa endoglucanase, xây dựng quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp. 4. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nâng cao chất lƣợng của vật nuôi. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999), Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551. 2. Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thùy Dƣơng (2002), "Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi." Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, 2: 34-36. 3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2006), Danh mục thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi đƣợc nhập khẩu vào Việt Nam. Số 01/2006/QĐ-BNN. 4. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục. 5. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797. 6. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003), Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinase và cellulase của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phƣớc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập 2 và 3, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 8. Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339. 9. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003), Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, cellulose hoặc dầu ô lƣu trong quá trình phân hủy chất thải hữu cơ. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291. 10. Trịnh Đình Khá (2006), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase. Luận văn Thạc sỹ Khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 11. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003), Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL-363. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307. 12. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 177-182. 13. Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 804-809. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 14. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 15. Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ và cellolose tập 2, Nxb Khoa học và Kỹ thuật: 7-14. 16. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008), "Tối ƣu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863 và Aspergillus niger DSM1957 sinh tổng hợp xylanase", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(3): 349-355. Tài liệu tiếng Anh 17. Achary A, Prapulla S (2008), "Corncob-Induced endo-β-D-1,4 xylanase of Aspergillus oryzae MTCC 5154: Production and characterization of xylobiose from glucuronoxylan", J Agric Food Chem, 56(11): 3981-3988. 18. Acharya P, Acharya D, Modi H (2008), "Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate", Afr J Biotechnol, 7(22): 4147-4152. 19. Akiba S, Kimura Y, Yamamoto K, Kumagai H (1995), "Purification and characterizationof a protease-resistant cellulase from Aspergillus niger", J Ferment Bioeng, 79(2): 125-130. 20. Bagnara C, Gaudin C, Bélaïch JP (1987), "Physiological properties of Cellulomonas fermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium", Appl Microbiol Biotechnol, 26: 170-176. 21. Bagnara C, Toci R, Gaudin C, Bélaïch JP (1985), "Isolation and characterization of a cellulolytic microorganism, Cellulomonas fermentans, sp. nov", J Syst Bacteriol, 35: 502-507. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 22. Bergquist PL, Gibbs MD, Morris DD, Teo VSJ, Saul DJ, Morgan HW (1999), "Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria", FEMS Microbiol Ecol, 28: 99-110. 23. Campillo ED (1999), "Multiple endo-1,4--D-glucanase (cellulase) genes in Arabidopsis", Curr Top Dev Biol, 46: 39-61. 24. Cheryan MS, Shah PM, Witjitra K (1997), "Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum", Adv Appl Microbiol, 43: 1-33. 25. Coral G, Arikan B, Unaldi M, Guvenmes H (2002), "Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type Strain", Turk J Biol, 26: 209-213. 26. Dahot MU, Noomrio MH (1996), "Microbial production of cellulases by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source", J Islamic Acad Sci, 9(4): 119-124. 27. Das M, Prasad J, Ahmad S (1997), "Endoglucanase production by paper-degrading mycoflora", Appl Microbiol, 25: 313-315. 28. Dürre P (1998), "New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation", Appl Microbiol Biotechnol, 49: 639-648. 29. Gao J, Weng H, Xi Y, Zhu D, Han S (2008), "Purification and characterization of a novel endo-β-1,4-glucanase from thermoacidophilic Aspergillus terreus", Biotechnol Lett, 30: 323-327. 30. Gielkens M, Dekker E, Visser J, Graaff L (1999), "Two cellubiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D- Xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression", Appl Environ Microbiol, 65(10): 4340-4345. 31. Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC, Warren RAJ (1991), "Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families", Microbiol Rev, 55: 303-315. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 32. Gordon R, Haynes W, Pang C (1973), The genus Bacillus, Agriculture handbook, Washington DC. 33. Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR, Olsson L (2005), "Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis", Enzyme Microb Technol, 36: 42-48. 34. Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999), "Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase", Eur J Biochem, 259: 88-95. 35. Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon JP (1989), "Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene, 81(1): 83-95. 36. Hong J, Tamaki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumaga H (2001), "Cloning of a gene encoding a highly stable endo-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast", J Biosci Bioeng, 92(5): 434-441. 37. Howard RL, Abotsi E, van Rensburg ELJ, Howard S (2003), "Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production", Afr J Biotechnol, 2(12): 602-619. 38. Hsu CK, Liao JW, Chung YC, Hsieh CP, Chan YC (2004), "Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides\ affect the intestinal micro biota and precancerous colonic lesion development in rats", J Nutr, 134: 1523-1528. 39. Kang S, Ko E, Lee J, Kim S (1999), "Over production of β-glucosidase by Aspergillus niger mutant from lignocellulsic biomass", Biotechnol Lett, 21: 647-650. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 40. Karisson J, Saloheimo M, Siika-aho M, Tenkanen M, Penttilä M, Tjerneld F (2001), "Homologous expression and characterization of Cel61A (EG IV) of Trichoderma reesei", Eur J Biochem, 268: 6498- 6507. 41. Khan M, Ali S, Fakhru’l-Razi A, Alam M (2007), "Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme", J Environ Sci Health Part B, 42: 381-386. 42. Kim BH (1987), "Carbohydrate catabolism in cellulolytic strains of Cellulomonas, Pseudomonas, and Nocardia", Korean J Microbiol, 25: 28-33. 43. Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996), "Molecular cloning, purification and characterization of two endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus oryzae KBN616", Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544. 44. Laemmli U (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227: 680-685. 45. Lee RL, Weimer PJ, Zyl WH, Pretorius IS (2002), "Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology", Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506–577. 46. Macarrón R, Acebal C, Castiilón MP, Domínguez JM, Manta IDL (1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei", Biochem J, 289: 867-873. 47. Miller G (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem, 31: 426-428. 48. Nakakuki T (2003), "Development of functional oligosaccharides in Japan", Trends Glycosci Glycotechnol, 15(82): 57-64. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 49. Narasimha G, sridevi A, Buddolla V, Subhosh C, Rajsekhar R (2006), "Nutrient effect on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger", Afr J Biotechnol, 5(5): 472-476. 50. Ojumu T, Solomon B, Betiku E, Layokun S, Amigun B (2003), "Cellulase production by Aspergillus flavus Linn isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob", Afr J Biotechnol, 2(6): 150-152. 51. Ole K, Borchert TV, Fuglsang CC (2002), "Industrial enzyme applications", Curr Opin Biotech, 13: 345-351. 52. Omogbenigun OF, Nyachoti CM, Slominski BA (2004), "Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs", J Anim Sci, 82: 1053-1061. 53. Palonen H, Tenkanen M, Linder M (1999), "Dynamic interaction of Trichoderma reesei cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose at equilibrium and during hydrolysis", Appl Environ Microbiol, 65: 5229-5233. 54. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 55. Sandgren M, Gualfetti PJ, Christian P, Sigrid P, Shaw A, Gross LS, Saldajeno M, Berglund GI, Jones TA, Mitchinson C (2003), "The Humicola grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability", Protein Sci, 12: 2782-2793. 56. Sang JH, Yong JY, Hyen SK (1995), "Characterization of a bifunctional cellulase and its structural gene. The cel gene of Bacillus sp. D04 has exo- and endoglucanase activity", J Biol Chem, 270: 26012-26019. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 57. Sharma VK, Hagen JC (1995), "Isolation and characterization of Clostridium hobsonii comb. nov", Biores Technol, 51: 61-74. 58. Siddiqui K, Shemsi A, Anwar M, Rashid M, Rajoka M (1998), "Partial and coplete alteration of surface charges of carboxymethylcellulase by chemical modification: thermostabilization in water-miscible organic solvent", Enzyme Microbiol Technol, 24: 599-608. 59. Takada G, Kawasaki M, Kitawaki M, Kawaguchi T, Sumitani J-I, Izumori k, Arai M (2002), "Cloning and trascription analysis of the Aspergillus aculeatus No. F-50 endoglucanase 2 (cmc2) gene", Biosci and Bioeng, 94(5): 482-485. 60. Takashima S, Nakamura A, Hidaka M (1998), "Isolation of the creA gene from the cellulolytic fungus Humicola grisea and analysis of CreA binding sites upstream from the cellulase genes", Biosci Biotechnol Biochem, 62: 2364-2370. 61. Wachinger G, Bronnenmeier K, Staudenbauer WL, Schrempf H (1989), "Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces reticuli", Appl Environ Microbiol, 55: 2653-2657. 62. Watanabe H, Tokuda G (2001), "Animal cellulases", Cell Mol Life Sci, 58: 1167-1178. 63. Xu B, Janson JC, Sellos D (2001), "Cloning and sequencing of a molluscan endo--1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus edulis", Eur J Biochem, 268: 3718-3727. 64. Yasuda K, Roneker KR, Miller DD, Welch RM, Lei XG (2006), "Supplemental dietary Inulin affects the bioavailability of Iron in corn and soybean meal to young pigs", J Nutr, 136: 3033-3038. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 PHỤ LỤC Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori VTCC-F-099 Trình tự nucleotide Vị trí GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACCA ACCGGGATTG CCTCAGTAAC GGCGAGTGAA GCGGCAAGAG CTCAAATTTG AAAGCTGGCT CCTTCGGAGT CCGCATTGTA ATTTGCAGAG GATGCTTTGG GTGCGGCCCC CGTCTAAGTG CCCTGGAACG GGCCGTCAGA GAGGGTGAGA ATCCCGTCTT GGGCGGGGTG TCCGTGCCCG TGTAAAGCTC CTTCGACGAG TCGAGTTGTT TGGGAATGCA GCTCTAAATG GGTGGTAAAT TTCATCTAAA GCTAAATACT GGCCGGAGAC CGATAGCGCA CAAGTAGAGT GATCGAAAGA TGAAAAGCAC TTTGAAAGGA GAGTTAAACA GCACGTGAAA TTGTTGAAAG GGAAGCGCTT GCGACCAGAC TCGCCCGCGG GGTTCAGCCG GCATTCGTGC CGGTGTACTT CCCCGTGGGC GGGCCAGCGT CGGTTTGGGC GGCCGGTCAA AGGCCCCTGG AATGTAGTGC CCTCCGGGGC ACCTTATAGC CAGGGGTGCA ATGCGGCCAG CCTGGACCGA GGAACGCGCT TCGGCACGGA CGCTGGCATA ATGGTCGTAA ACGACCCGTC TTGAAACACG GACC 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 614 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian Thời gian (giờ) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 24 0,30 0,31 0,31 0,41 ± 0,002 74 48 0,39 0,38 0,38 0,49 ± 0,006 89 72 0,39 0,39 0,39 0,49 ± 0,002 91 96 0,45 0,43 0,44 0,55 ± 0,012 100 120 0,28 0,30 0,29 0,39 ± 0,008 71 144 0,27 0,26 0,26 0,36 ± 0,002 66 168 0,21 0,30 0,25 0,35 ± 0,043 64 192 0,23 0,23 0,23 0,33 ± 0,001 60 216 0,22 0,29 0,25 0,35 ± 0,036 64 240 0,22 0,24 0,23 0,33 ± 0,011 60 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ (C) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 25 0,21 0,21 0,25 0,32 ± 0,003 56 28 0,33 0,34 0,35 0,44 ± 0,013 78 30 0,47 0,49 0,41 0,56 ± 0,045 100 32 0,40 0,38 0,39 0,50 ± 0,007 88 37 0,33 0,34 0,34 0,44 ± 0,007 78 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng Nồng độ CMC (%) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 0 0,09 0,05 0,05 0,15 ± 0,023 19 0,2 0,11 0,07 0,08 0,18 ± 0,021 22 0,5 0,16 0,22 0,16 0,27 ± 0,035 34 1,0 0,52 0,55 0,51 0,64 ± 0,020 79 1,5 0,63 0,65 0,63 0,75 ± 0,010 93 2,0 0,62 0,73 0,71 0,81 ± 0,056 100 2,5 0,47 0,47 0,48 0,58 ± 0,005 72 3,0 0,38 0,39 0,38 0,49 ± 0,006 61 3,5 0,32 0,32 0,32 0,42 ± 0,003 52 4,0 0,32 0,32 0,32 0,42 ± 0,002 52 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô Lõi ngô (%) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 0,5 0,44 0,58 0,53 0,65 ± 0,067 70 1,0 0,54 0,49 0,97 0,78 ± 0,263 87 1,5 0,60 0,70 0,71 0,79 ± 0,058 88 2,0 0,41 0,58 0,79 0,71 ± 0,186 79 2,5 0,41 0,60 0,94 0,76 ± 0,269 85 3,0 0,53 0,78 1,01 0,90 ± 0,238 100 3,5 0,34 0,65 0,83 0,72 ± 0,251 81 4,0 0,38 0,60 0,80 0,71 ± 0,208 79 4,5 0,38 0,54 0,70 0,65 ± 0,159 73 5,0 0,22 0,42 0,64 0,53 ± 0,211 60 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate Ammonium acetate (%) OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 0,10 0,28 0,21 0,25 3,44 ± 0,038 69 0,15 0,30 0,23 0,25 3,58 ± 0,039 72 0,20 0,30 0,27 0,28 3,86 ± 0,014 78 0,25 0,31 0,32 0,35 4,25 ± 0,023 85 0,30 0,39 0,34 0,44 4,97 ± 0,050 100 0,35 0,34 0,26 0,31 4,03 ± 0,040 81 0,40 0,29 0,28 0,30 3,90 ± 0,012 78 0,45 0,27 0,28 0,28 3,74 ± 0,001 75 0,50 0,24 0,26 0,27 3,51 ± 0,012 71 0,55 0,24 0,24 0,26 3,40 ± 0,011 68 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu pH OD1 OD2 OD3 Hoạt tính endoglucanase IU/ml % 3,0 0,26 0,33 0,23 3,67 ± 0,051 70 3,5 0,32 0,34 0,26 4,05 ± 0,042 78 4,0 0,34 0,35 0,31 4,34 ± 0,021 83 4,5 0,36 0,38 0,32 4,58 ± 0,030 88 5,0 0,37 0,40 0,33 4,71 ± 0,036 90 5,5 0,38 0,41 0,33 4,79 ± 0,040 92 6,0 0,39 0,42 0,36 4,93 ± 0,030 94 6,5 0,42 0,46 0,37 5,22 ± 0,047 100 7,0 0,38 0,42 0,34 4,84 ± 0,040 93 7,5 0,37 0,40 0,30 4,62 ± 0,051 88 8,0 0,36 0,40 0,31 4,57 ± 0,048 88 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase IU/ml IU/mg protein IU/ml IU/mg protein 3 1,79 213,71 11 6,66 80,07 4 1,83 169,95 12 6,81 82,83 5 2,01 183,17 13 6,57 87,70 6 4,02 330,37 14 6,46 106,64 7 4,89 288,36 15 4,03 72,49 8 4,52 149,94 16 3,70 93,57 9 4,58 78,66 17 2,70 103,29 10 7,21 109,57 18 2,14 224,31 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase Phân đoạn Hoạt tính endoglucanase IU/ml IU/mg protein IU/ml IU/mg protein 3 0,76 79,74 11 2,01 48,75 4 0,73 56,86 12 1,91 43,89 5 0,82 55,75 13 1,91 40,60 6 1,53 71,65 14 1,62 34,68 7 1,30 62,10 15 1,01 23,12 8 1,13 57,80 16 0,98 30,99 9 1,07 56,16 17 0,60 24,09 10 1,78 57,59 18 0,49 24,49 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase CMC (%) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 0,2 84,15 ± 0,005 22 0,4 119,71 ± 0,007 32 0,6 179,43 ± 0,008 48 0,8 260,87 ± 0,010 69 1,0 295,95 ± 0,013 78 1,2 377,49 ± 0,060 100 1,4 283,28 ± 0,021 75 1,6 232,33 ± 0,009 62 1,8 173,19 ± 0,006 46 2,0 163,45 ± 0,006 43 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase Nhiệt độ Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 30 45,37 ± 0,005 42 37 60,67 ± 0,025 56 40 93,11 ± 0,004 85 45 95,35 ± 0,001 87 50 109,09 ± 0,004 100 55 64,95 ± 0,006 60 60 50,85 ± 0,001 47 65 45,76 ± 0,003 42 70 34,65 ± 0,004 32 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase Nhiệt độ Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 4,0 37,87 ± 0,009 17 4,5 144,65 ± 0,002 64 5,0 226,68 ± 0,002 100 5,5 184,88 ± 0,007 82 6,0 118,54 ± 0,005 52 6,5 95,25 ± 0,004 42 7,0 90,58 ± 0,003 40 7,5 82,20 ± 0,072 36 8,0 84,54 ± 0,010 37 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase Nhiệt độ Thời gian (giờ) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % ĐC 0 410,23 ± 0,005 100 6 399,02 ± 0,001 97 12 388,99 ± 0,008 95 24 385,77 ± 0,004 94 30 36 382,75 ± 0,002 93 48 285,43 ± 0,004 70 60 258,34 ± 0,001 63 72 236,23 ± 0,006 58 6 368,43 ± 0,007 90 12 355,86 ± 0,001 87 24 346,61 ± 0,005 84 40 36 314,85 ± 0,006 77 48 277,92 ± 0,006 68 60 254,15 ± 0,007 62 72 228,53 ± 0,005 56 6 361,13 ± 0,001 88 12 324,98 ± 0,004 79 24 302,38 ± 0,025 74 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 50 36 210,12 ± 0,001 51 48 150,88 ± 0,024 37 60 130,33 ± 0,005 32 72 124,09 ± 0,006 30 6 255,61 ± 0,014 62 12 179,33 ± 0,009 44 24 131,79 ± 0,006 32 60 36 91,36 ± 0,001 22 48 65,83 ± 0,008 16 60 59,60 ± 0,001 15 72 38,94 ± 0,001 9 6 202,22 ± 0,002 49 12 143,77 ± 0,010 35 24 112,50 ± 0,007 27 70 36 54,92 ± 0,002 13 48 26,57 ± 0,003 6 60 23,94 ± 0,001 6 72 23,35 ± 0,000 6 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase Đệm pH Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % Đối chứng 6,5 234,57 ± 0,008 100 3,5 56,48 ± 0,028 24 4,0 266,53 ± 0,008 114 Acetate 4,5 322,93 ± 0,020 138 5,0 347,29 ± 0,004 148 5,5 285,43 ± 0,004 122 6,0 241,78 ± 0,011 103 6,5 229,21 ± 0,008 98 Phosphate 7,0 245,38 ± 0,020 105 7,5 223,27 ± 0,004 95 8,0 210,21 ± 0,004 90 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase pH Thời gian (giờ) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % 4,0 0 259,02 ± 0,002 100 6 217,52 ± 0,031 84 12 166,28 ± 0,005 64 24 105,38 ± 0,001 41 36 73,33 ± 0,001 28 48 67,88 ± 0,004 26 60 54,24 ± 0,004 21 72 36,70 ± 0,002 14 4,5 0 322,35 ± 0,016 100 6 310,56 ± 0,014 96 12 269,06 ± 0,005 83 24 267,21 ± 0,006 83 36 264,19 ± 0,004 82 48 185,66 ± 0,000 58 60 122,34 ± 0,009 38 72 104,90 ± 0,004 33 5,0 0 310,76 ± 0,008 100 6 301,21 ± 0,002 97 12 281,14 ± 0,004 90 24 277,53 ± 0,001 89 36 275,00 ± 0,004 88 48 202,42 ± 0,006 65 60 149,52 ± 0,008 48 72 116,68 ± 0,003 38 5,5 0 253,47 ± 0,004 100 6 244,02 ± 0,001 96 12 217,62 ± 0,008 86 24 210,02 ± 0,005 83 36 203,59 ± 0,004 80 48 174,26 ± 0,006 69 60 175,82 ± 0,002 69 72 173,58 ± 0,007 68 6,0 0 209,43 ± 0,001 100 6 198,72 ± 0,001 95 12 192,58 ± 0,000 92 24 143,09 ± 0,008 68 36 137,73 ± 0,006 66 48 136,56 ± 0,005 65 60 125,45 ± 0,005 60 72 115,42 ± 0,010 55 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase Dung Môi Nồng độ (%) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % Đối chứng 0 372,91 ± 0,016 100 10 349,04 ± 0,031 94 Acetone 20 333,75 ± 0,004 89 30 325,95 ± 0,004 87 10 287,28 ± 0,003 77 n- Butanol 20 225,12 ± 0,025 60 30 213,53 ± 0,003 57 10 229,60 ± 0,001 62 Ethanol 20 198,52 ± 0,001 53 30 195,79 ± 0,002 53 10 365,02 ± 0,050 98 isopropanol 20 276,27 ± 0,044 74 30 258,24 ± 0,004 69 10 307,64 ± 0,001 82 Methanol 20 271,30 ± 0,011 73 30 266,82 ± 0,004 72 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase Chất tẩy rửa Nồng độ (%) Hoạt tính endoglucanase (IU/mg protein) % Đối chứng 0,0 213,53 ± 0,004 100 Tween 20 0,5 191,22 ± 0,008 90 1,0 167,83 ± 0,004 79 1,5 160,43 ± 0,006 75 2,0 131,30 ± 0,008 61 Tween 80 0,5 177,48 ± 0,001 83 1,0 160,43 ± 0,004 75 1,5 144,55 ± 0,003 68 2,0 136,56 ± 0,001 64 SDS 0,5 97,01 ± 0,005 45 1,0 83,17 ± 0,001 39 1,5 51,70 ± 0,001 24 2,0 33,48 ± 0,004 16 Triton X-100 0,5 175,73 ± 0,004 82 1,0 147,67 ± 0,002 69 1,5 134,32 ± 0,003 63 2,0 125,56 ± 0,010 59 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 ._.