Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng sinh tổng hợp Enzyme chitinase cao

trong luận án là trung thực và chưa được ai cơng bố Tác giả luận văn LỜI CÁM ƠN Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy là giảng viên khoa sinh học trường Đại học su phạm TP HCM, người đã định hướng đề tài cho tơi, quan tâm, giúp đỡ và thơng cảm cho hồn cảnh của tơi. Người đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tơi, đã nhiệt tình hướng dẫn tơi trong quá trình thực hiện đề tài. Tơi xin chân thành cám ơn TS. Dương Thị Hương Giang là giảng viên giảng dạy mơn Enzyme học, viện cơng nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, người đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong quá trình thực hiện đề tài Tơi xin cám ơn các em sinh viên: Phạm Thị Mỹ Ánh, Cao Thị Mỹ Phương, Nguyễn Huỳnh Trang Thu Hương, Nguyễn Trần Khiết lớp Cơng nghệ sinh học tiên tiến K33, Quang Anh Thư, Trần Kim Thoa, Vương Thị Hồng Thắm lớp Sư phạm Sinh học K34 đã nhiệt tình hỗ trợ tơi trong quá trình thực nghiệm và tổng hợp kết quả. Tơi xin cám ơn cha mẹ, chồng và các người thân của tơi, những người đã chăm sĩc cho con tơi, và tạo điều kiện cho tơi trong quá trình đi học và thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011 Nguyễn Thị Hà MỤC LỤC 15TLỜI CAM ĐOAN15T ................................................................................................................................ 2 15TLỜI CÁM ƠN15T ...................................................................................................................................... 3 15TMỤC LỤC15T ........................................................................................................................................... 4 15TDANH MỤC VIẾT TẮT15T ..................................................................................................................... 8 15TMỞ ĐẦU15T .............................................................................................................................................. 1 15TChương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU15T ................................................................................................. 2 15T .1. NS trong hệ sinh thái RNM15T ...................................................................................................... 2 15T .1.1. Giới thiệu về RNM15T ............................................................................................................. 2 15T .1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM15T .......................................................................................... 3 15T .1.2.1. Đặc điểm hình thái15T ....................................................................................................... 3 15T .1.2.2. Đặc điểm sinh sản15T ........................................................................................................ 4 15T .1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hĩa15T .......................................................................................... 4 15T .1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi15T ......................................................................................... 7 15T .1.2.5. Vai trị của NS trong hệ sinh thái RNM15T ........................................................................ 9 15T .2. Chitin và chitinase15T ................................................................................................................ 10 15T .2.1. Nguồn chitin:15T ................................................................................................................... 10 15T .2.2. Chitinase15T ........................................................................................................................... 13 15T .2.2.1. Nguồn chitinase:15T ........................................................................................................ 13 15T .2.2.2. Cơ chế hoạt động:15T ...................................................................................................... 13 15T .2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase:15T .................................................................. 14 15T .2.2.4. Tính chất sinh hĩa của chitinase15T ................................................................................. 14 15T .2.2.5. Phân loại chitinase15T ..................................................................................................... 15 15T .2.2.6. Ứng dụng của chitinase15T .............................................................................................. 16 15T .2.3. NS với khả năng sinh enzyme chitinase15T ........................................................................... 19 15T .2.3.1. Một số chủng NS cĩ HT chitinase cao15T ........................................................................ 19 15T .2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chitinase ở NS15T ............................................... 20 15T .3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngồi nước15T ............................................ 21 15T .3.1. Ngồi nước15T...................................................................................................................... 21 15T .3.2. Trong nước15T....................................................................................................................... 24 15TChương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP15T .................................................................................. 25 15T2.1. Vật liệu15T .................................................................................................................................... 25 15T2.1.1. Đối tượng nghiên cứu15T ...................................................................................................... 25 15T2.1.2. Hĩa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ15T ......................................................................... 25 15T2.1.3. Mơi trường15T ....................................................................................................................... 26 15T2.2. Phương pháp nghiên cứu15T ....................................................................................................... 27 15T2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống15T .......................................................................................... 27 15T2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi15T ...................................................................................... 27 15T2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS15T .............................................................. 28 15T2.2.4. Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5]15T ............................................................. 28 15T2.2.5. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL15T ............... 29 15T2.2.6. Phương pháp nuơi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase15T ................................. 29 15T2.2.7. Phương pháp tách chiết enzym thơ từ canh trường nuơi cấy15T .......................................... 29 15T2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vịng phân giải15T ................................................................................................................... 30 15T2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu15T ................ 30 15T2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8]15T ............................................................................. 33 15T2.2.11 Khảo sát MT và điều kiện nuơi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase của các chủng NS. [4], [10], [23], [32], [33]15T ...................................................................................................... 35 15T2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong MT nuơi cấy15T ..................................... 35 15T2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuơi cấy15T ....................................................................................... 35 15T2.2.11.3. Khảo sát pH của MT15T ................................................................................................ 35 15T2.2.11.4. Khảo sát nhiệt độ nuơi cấy15T ....................................................................................... 36 15T2.2.11.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl15T .................................................................... 36 15T2.2.11.6. Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin15T ........................................................................... 36 15T2.2.12. Tối ưu điều kiện nuơi cấy nấm P. citrinum bằng qui hoạch thực nghiệm [10], [17]15T ..... 36 15T2.2.13. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thơ từ chủng P. citrinum [4], [43], [44]15T ............. 39 15T2.2.13.1. Thu nhận tủa protein15T ................................................................................................ 39 15T2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CPE chitinase thơ [9]15T ......................... 39 15T2.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của chitinase15T ..................................................... 39 15T2.2.14. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của chế phẩm enzyme chitinase [4], [20]15T .......................................................................................... 40 15T2.2.15. Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm [4], [46]15T....................................................................................................................................... 41 15TChương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN15T ......................................................................................... 42 15T3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ 15T ........................................................................................................................................................ 42 15T3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng thu được15T ................................................. 43 15T3.2.1. Chủng nấm số 1615T ............................................................................................................. 43 15T3.2.2. Chủng nấm số 1015T ............................................................................................................. 45 15T3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS P. citrinum và A. protuberus15T ......................................................................................... 47 15T3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuơi cấy15T ................................................................... 47 15T3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy15T .................................................................................. 48 15T3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuơi cấy15T ............................................................................. 51 15T3.3.6. Ảnh hưởng của HL chitin trong MT nuơi cấy15T ................................................................. 53 15T3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hĩa điều kiện nuơi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum15T ................................................................ 55 15T3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thơ từ chủng P. citrinum15T ........................................ 58 15T3.4.1. Thu nhận CP chitinase thơ bằng muối (NHR4R)R2 RSOR4 R15T ......................................................... 58 15T3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase15T ............................................ 58 15T3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thơ15T ........................................... 60 15T3.5. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thơ để phịng trừ nấm hại cây trồng15T ........ 62 15T3.5.1. Ứng dụng CPE chitinase thơ vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani15T. 62 15T3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thơ vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm15T 64 15TChương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ15T ......................................................................................... 66 15T4.1. Kết luận15T ................................................................................................................................... 66 15T4.2. Kiến nghị15T ................................................................................................................................. 67 15T ÀI LIỆU THAM KHẢO15T ................................................................................................................. 67 15TPHỤ LỤC15T........................................................................................................................................... 74 15TPHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE15T ............................................................... 74 15TPHỤ LỤC 2 – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD15T ..................................................................... 75 15TPHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM15T ............................................................................... 76 15TPHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH15T ................................................................................................ 77 15TPHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU15T .......................................... 79 DANH MỤC VIẾT TẮT BT: bào tử BSA: Bovine serum albumin CPE: chế phẩm enzyme DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit HT: hoạt tính HTC: hoạt tính chung HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lượng KL: khuẩn lạc MT: mơi trường NC: nuơi cấy OD: mật độ quang ∆OD: hiệu số giữa mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu thật PTHQ: phương trình hồi qui RNM: rừng ngập mặn U: đơn vị hoạt độ enzyme TTN: thuốc trừ nấm MỞ ĐẦU RNM Cần Giờ cĩ hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt ở đây đã làm cho sinh vật, cũng như NS cĩ tính thích nghi cao và tạo ra sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với điều kiện khác. Hệ vi sinh vật ở đây rất đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất cĩ HT sinh học như các loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… và chất kháng sinh để cĩ thể phân hủy các chất cĩ trong hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ơ nhiễm. Một trong những nguồn rác thải dồi dào ở RNM đĩ là các loại vỏ của động vật chân khớp ở biển như: tơm, cua, ghẹ…cĩ thành phần chủ yếu là chitin. Chitin là chất khĩ phân hủy. Cĩ thể sử dụng nhiều biện pháp hĩa lý khác nhau để phân hủy chitin nhưng chi phí rất cao. Hiện nay người ta đã nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm… nhưng chỉ cĩ enzyme chitinase do vi sinh vật tổng hợp đặc biệt là do nấm tổng hợp mới cĩ HT cao, ổn định với nhiệt độ và pH. Ngồi ra enzyme chitinase cịn cĩ rất nhiều ứng dụng trong nơng nghiệp, cơng nghiệp và y học. Khả năng khử chitin làm cho chitinase cĩ giá trị trong phịng trừ dịch bệnh, giảm ơ nhiễm MT. Chitinase được khai thác sử dụng như là tác nhân phịng trừ sinh học. Chúng cũng cĩ vai trị quan trọng trong sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phịng trừ muỗi, sản xuất các chitooligosaccharid hoạt hĩa. Trong vitro những thí nghiệm thử HT kháng nấm bằng cách sử dụng Trichderma harzianum đã làm phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides. Vì những lý do trên chúng tơi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn một số chủng NS từ RNM Cần Giờ cĩ khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao” Mục tiêu của đề tài: Gĩp phần tìm hiểu đặc điểm và vai trị của enzyme chitinase từ các chủng NS cĩ nguồn gốc từ RNM Cần Giờ làm cơ sở cho việc ứng dụng trong thực tiễn Nhiệm vụ của đề tài 1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ cĩ trong phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hĩa Trường ĐH Sư phạm TPHCM. Chọn ra 2 chủng cĩ khả năng sinh enzyme chitinase cao 2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến lồi 2 chủng thu được 3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS đã chọn. Chọn ra 1 chủng NS cĩ HT enzyme chitinase cao để tối ưu hĩa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm. 4. Thu nhận và nghiên cứu một số đặc điểm của CPE chitinase thơ 5. Bước đầu thử nghiệm tác dụng chế phẩm chitinase thơ trong phịng trừ nấm bệnh hại cây trồng Địa điểm và thời gian nghiên cứu Nghiên cứu nội dung 1 tại PTN Vi sinh – Sinh hĩa Trường ĐHSP Tp HCM Nghiên cứu nội dung 2 tại Phịng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp. HCM Nghiên cứu nội dung 3,4,5 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 4 năm 2011 đến tháng 9 năm 2011 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NS trong hệ sinh thái RNM 1.1.1. Giới thiệu về RNM * Giới thiệu chung về RNM Diện tích RNM trên thế giới khoảng 15.429.000 ha. Khu vực châu Á cĩ diện tích RNM lớn nhất là Ấn Độ-Thái Bình Dương với diện tích khoảng 6.9 triệu ha. Nước cĩ diện tích RNM lớn nhất châu Á là Bangladet với 600.000 ha. Việt Nam cĩ 252.500 ha RNM phân bố ở cả 3 miền: bắc, trung, nam RNM được hình thành nhờ phù sa do các con sơng cùng với trầm tích biển do thủy triều mang vào tạo thành các bãi lầy. RNM chịu tác động của cả biển lẫn lục địa nên tài nguyên sinh vật rất đa dạng phong phú và chính sự tác động này đã làm cho sinh vật cĩ những cơ chế tồn tại rất đặc biệt RNM cĩ những vai trị hết sức quan trọng: Hạn chế tác hại của song thần và bão lớn, bảo vệ đê biển, làm chậm dịng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sĩng khi triều cường, bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ nước ngầm, làm sạch MT nước khi cĩ lũ quét, sạt lở đất, cung cấp nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu và lợi ích của con người * Giới thiệu về RNM Cần Giờ - Tp HCM RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gịn, nằm ở cửa ngõ đơng nam thành phố Hồ Chí Minh. Thuộc xã Long Hịa, huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. RNM cĩ khí hậu nĩng ẩm, lượng mưa thấp. Nhiệt độ trung bình 25,8P0PC, biên độ dao động nhiệt trong ngày 5-7P0PC, thời điểm cĩ nhiệt độ cao nhất: tháng 12, tháng 1. Độ mặn trung bình: 1,5 – 2,5 %, tùy theo khu vực cĩ thể lên đến 18%, độ mặn phụ thuộc vào thủy triều của biển đơng và lưu lượng nước sơng Đồng Nai, sơng Sài Gịn. Độ mặn lớn nhất khi triều cường, nhỏ nhất khi triều kém Hệ sinh vật: thực vật trên 150 lồi, động vật thủy sinh khơng xương sống trên 700 lồi, cá trên 137 lồi, động vật cĩ xương sống trên cạn cĩ 9 lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, 4 lồi động vật cĩ vú, chim cĩ khoảng 130 lồi. Vi sinh vật gồm nấm men, NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… vi sinh vật cĩ vai trị hết sức quan trọng đối với hệ sinh thái RNM. Vi sinh vật phân bố rộng rãi và cĩ mặt trong mọi cơ chất của RNM. Nhiều vi sinh vật cĩ những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên cho đến nay những nghiên cứu về vi sinh vật ở RNM cịn rất ít, chưa tương xứng với qui mơ và tiềm năng của hệ vi sinh vật RNM 1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái NS là nhĩm cĩ cấu tạo tế bào nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ ngồi vào trong gồm: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và nhân phân hĩa. Tế bào nấm khơng cĩ diệp lục tố, một vài lồi nấm cĩ rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng gọi là neocercosporin Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên cơ quan sinh sản, đĩ chính là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành BT là một tế bào sinh sản, thường cĩ dạng hình cầu. Mỗi lồi nấm cĩ hình dạng BT và màu sắc BT cĩ khác nhau. Chính màu sắc của BT đã tạo nên màu sắc của các KL và màu sắc đặc trưng của các chi và lồi nấm. Sợi nấm cĩ đường kính trung bình 5-10µm, đơi khi rất lớn tới 25µm nhưng cũng cĩ khi rất nhỏ chỉ 1-2µm. Chiều dài sợi nấm cĩ thể đạt vài chục centimet. Sợi nấm cĩ thể cĩ vách ngăn tạo thành dạng đa bào, tuy nhiên do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào cĩ thể cĩ một, hai nhiều nhân hay chẳng cĩ nhân nào. Sợi nấm cũng cĩ thể khơng cĩ vách ngăn, bên trong sợi nấm chứa nhiều nhân được gọi là các tế bào đa nhân, gặp ở các lớp Trichomycetes, Oomycetes Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên cơ quan sinh sản là cuống sinh BT. Từ cuống sinh BT sẽ hình thành nên các BT. BT là một tế bào sinh sản, thường cĩ dạng hình cầu. Khi BT được phân tán từ cơ thể mẹ đến nguồn cơ chất thích hợp nĩ sẽ nảy mầm, phát triển theo cả 3 chiều tạo thành hệ sợi nấm mới. Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên rất nhiều tạo thành một đám, ta cĩ thể quan sát bằng mắt thường. Hệ sợi nấm phát triển đến giai này được gọi là KL. Tùy theo lồi mà KL cĩ các hình dạng khác nhau nhưng thường cĩ hình cầu. Sau một thời gian, trên các sợi nấm khí sinh sẽ hình thành các BT cĩ hình dạng và màu sắc khác nhau đặc trưng cho từng lồi 1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản NS cĩ nhiều hình thức sinh sản, trong đĩ chủ yếu là hình thức sinh sản bằng BT. Sau đây là một số hình thức sinh sản ở NS: Sinh sản vơ tính: Sinh sản vơ tính theo kiểu đứt đoạn, sinh sản vơ tính bằng BT áo, sinh sản vơ tính bằng BT kín, sinh sản vơ tính bằng BT đính Sinh sản hữu tính: sinh sản hữu tính bằng BT túi (Ascospore), sinh sản hữu tính bằng BT đảm (Basidiospore), sinh sản hữu tính bằng BT nỗn (Oospore), sinh sản hữu tính bằng BT tiếp hợp (Zigospore). 1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hĩa - Sinh lí: Các lồi sinh vật nĩi chung và NS nĩi riêng cĩ sự sinh trưởng, phát triển và đặc điểm phân bố phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố MT. RNM là một hệ sinh thái chịu nhiều tác động của giĩ bão, chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền (chất thải sinh hoạt, chất thải cơng nghiệp) lẫn chất thải từ MT biển…Vấn đề ơ nhiễm là điều khơng thể tránh khỏi nhất là ơ nhiễm VSV gây bệnh. Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS ở RNM. Nhiệt độ: NS thuộc nhĩm VSV ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 20P0PC – 50P0PC, cá biệt cĩ một số ít lồi cĩ thể sống sĩt ở 0P0PC và 60P0PC. pH: là yếu tố cĩ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của NS, NS phát triển tốt ở MT hơi axit (pH = 4 – 6). Tuy nhiên cũng cĩ một số lồi phát triển ở pH < 3 hay pH < 9 (Ingold, 1967). pH làm thay đổi tính chất của màng tế bào và làm ảnh hưởng đến sự phân ly của các cấu tử thức ăn trong MT. Do đĩ, sự hấp thu các loại thức ăn vào trong tế bào bị thay đổi. MT cĩ pH quá cao hay quá thấp đều làm cho sự sinh trưởng của NS yếu đi. Ánh sáng: ánh sáng khơng cần cho quá trình sinh trưởng của hầu hết các lồi NS, nhưng ánh sáng lại ảnh hưởng đến sự hình thành BT của một số lồi nấm Khí oxi: nồng độ oxi rất cần cho hoạt động sống của NS vì chúng là nhĩm hiếu khí bắt buộc. Nguồn C: cơ thể nấm khơng cĩ diệp lục nên khơng cĩ khả năng tự dưỡng và phải sống kí sinh, hoại sinh hay cộng sinh. Chúng là những VSV dị dưỡng hĩa năng hữu cơ. NS cĩ khả năng đồng hĩa nhiều nguồn C khác nhau, ngồi những đường đơn dễ hấp thụ như glucose chúng cũng sử dụng trực tiếp các đường như mantose, saccarose… Nguồn N: N đĩng vai trị quan trọng trong việc tham gia thành phần cấu tạo của các protein và đặc biệt là enzyme. NS cĩ khả năng đồng hĩa cả nguồn N hữu cơ lẫn vơ cơ, các chủng NS khác nhau cĩ nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn N. Độ mặn: Đa số các NS ở RNM đều cĩ khả năng chịu mặn cao. Chúng cĩ thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 2% - 20%. Thậm chí một số NS ở RNM cịn cĩ thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30%. Đây là một đặc điểm rất cĩ ý nghĩa sinh thái đối với RNM. - Sinh hĩa [1] Trong quá trình sinh trưởng và phát triển NS tiết ra MT ngồi nhiều sản phẩm như các sắc tố, các chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm, trong đĩ nhiều chất cĩ HT sinh học cĩ ý nghĩa quan trọng đối với con người cũng như hệ sinh thái như các các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng sinh… MT sống khắc nghiệt ở RNM làm cho kiểu trao đổi chất của chúng khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền. Do đĩ, các sản phẩm trao đổi chất của chúng, trong đĩ đặc biệt là hệ enzyme cũng mang tính chất khác lạ hơn HT enzyme thủy phân ngoại bào NS là nhĩm VSV cĩ tiềm năng lớn nhất sinh các enzyme thủy phân ngoại bào. Đa phần các enzyme dùng trong cơng nghiệp cĩ nguồn gốc từ NS. Cellulase: là enzyme ngoại bào cĩ khả năng cắt đứt liên kết 1–4 β - glucosid của phân tử cellulose để tạo thành các đơn phân glucose. Cellulose là thành phần chủ yếu trong xác thực vật do đĩ enzyme này cĩ vai trị quan trọng trong việc phân giải những hợp chất hữu cơ tồn đọng trong MT. Enzyme này được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như thức ăn gia súc, cơng nghiệp thực phẩm nhờ khả năng phân giải cellulose. Những NS cĩ khả năng phân giải cellulose là các nấm thuộc chi Aspergillus (Asp.niger, Asp.flavus, Asp.oryzae…), Fusarium (F.oxysporum, F.solani), Penicillium, Trichoderma… Amylase: là enzyme thủy phân tinh bột và những chất cĩ cấu trúc tương tự. Vì tinh bột cũng là một trong những sản phẩm chủ yếu của thực vật nên vai trị của amylase cũng giữ một vị trí hết sức quan trọng trong việc phân giải các sản phẩm với thành phần chủ yếu là tinh bột và gĩp phần trong việc làm sạch MT. Những NS cĩ khả năng phân giải mạnh tinh bột là Asp.candidus, Asp.awamori….Cũng như cellulose, dựa vào đặc tính phân giả mạnh tinh bột mà amylase được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực sản xuất rượu, bia, bánh mì… Protease: là enzyme thủy phân liên kết peptid trong các polypeptide tạo thành các chuỗi polypeptide ngắn hơn, các đipeptide hay các axit amin. Trong tự nhiên enzyme này cĩ tác dụng khống hĩa: phân giải các hợp chất hữu cơ cĩ bản chất protein trong xác động thực vật và sinh vật nĩi chung thành các hợp chất đơn giản và cuối cùng thành các phân tử vơ cơ. Con người đã ứng dụng enzyme này trong các lĩnh vực của đời sống như cơng nghiệp thịt, da, tơ tằm … nhằm tận dụng khả năng phân giải protein của chúng cũng như tận dụng những sản phẩm từ quá trình phân giải đĩ. Những NS cĩ khả năng sinh protease mạnh là nhĩm mốc vàng (Asp.flavus, Asp.oryzae, Asp.funginatus…) và nhĩm mốc đen (Asp.niger, Asp.awmori, Asp.usamii…) Pectinase: là enzyme xúc tác quá trình phân giải pectin thành các hợp chất đơn giản như galacturonic, galactose, methanol….được ứng dụng trong sản xuất nước quả, rượu vang, hoặc trong sản xuất cà phê hịa tan, chế biến đay gai…Những NS cĩ khả năng sinh pectinase cao được chú ý là P.glaucum, Asp.awamori, P.citrinum… Chitinase: Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucoszamine liên kết với nhau bởi mối liên kết β - 1,4 – glucosid. Hàng năm trong tự nhiên cĩ thể tạo 10P10P – 10P14P tấn chitin. Chitinase bị VSV (chủ yếu là NS) phân giải liên kết β - 1, 4 – glucosid tạo ra các N-acetyl- glucoszamine. Hệ chitinase mạnh cịn giúp các NS (Trichoderma spp., Glyocladium spp., Chaetomium spp.) tăng cường hiệu quả tiêu diệt các lồi nấm gây bệnh (Fusarium oxysporium, Botritiscinerea, Pyricularia oryzae… cĩ thành tế bào là chitin) và các lồi nấm B. bassiana, M. anisopliae, P. fumosoroseus… chống các lồi cơn trùng cĩ vỏ chitin. Các NS này được sử dụng làm tác nhân kiểm sốt sinh học chống các VSV gây bệnh và cơn trùng trong nơng – lâm nghiệp. VSV nĩi chung và NS nĩi riêng thường khơng cĩ khả năng tạo được tỉ lệ cân đối giữa các enzyme, cĩ lồi tạo được nhiều enzyme này, lồi khác lại tạo nhiều enzyme khác. Các lồi nấm thường cĩ HT amylase và chitinase rất mạnh [6][7] HT sinh các chất kháng sinh: Chất kháng sinh là một trong số những sản phẩm trao đổi chất bậc hai do NS sản xuất ra. Hiện cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu vai trị của chất kháng sinh đối với đời sống. Tuy nhiên, hiện cĩ hai giả thiết về vai trị của chất kháng sinh được nhiều nhà khoa học ủng hộ hơn cả. Giả thuyết thứ nhất cho rằng việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo khả năng sống sĩt cao cho chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là với các lồi cĩ BT. Người ta đã xác định được một số chất kháng sinh cĩ tác dụng ức chế sự nảy mầm của BT chính chủng sinh ra chất kháng sinh đĩ. Cĩ thể chất kháng sinh cĩ vai trị kìm hãm sự nảy mầm của BT cho đến khi điều kiện MT ngồi hồn tồn thích hợp cho sự phát triển của chúng. Giả thiết thứ hai cho rằng việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh cĩ lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đĩ chúng cĩ thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các lồi khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đĩ. Gần đây người ta phát hiện ra NS ở RNM là nguồn VSV cĩ tiềm năng sinh các chất kháng khuẩn và enzyme đặc biệt là chitinase cĩ ý nghĩa lớn cho sự tồn tại của thực vật chịu mặn Độc tố nấm: Một sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm đáng được quan tâm đĩ là độc tố nấm (mycotoxin). Đây là một trong số những mối nguy hại lớn cho sức khỏe con người và động vật khi sử dụng thức ăn cĩ chứa một HL độc tố nhất định hoặc ăn phải nấm cĩ khả năng sinh độc tố. Hiện cĩ trên 300 loại độc tố nấm đã được con người phát hiện. Trong số đĩ, nguy hiểm nhất là aflatoxin, đặc biệt là aflatoxin B1. Phần lớn các NS ở RNM đều cĩ khả năng sản sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV cĩ hại như chất kháng sinh, độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng trong quá trình cạnh tranh của đời sống. Một số NS cịn cĩ HT diệt cơn trùng mạnh, cĩ thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt cơn trùng một cách an tồn. Đây là một nguồn gen quý, rất cĩ giá trị đối với sinh học và y học. Kết luận: Với những đặc điểm đáng chú ý như trên, NS đang trở thành đối tượng rất được quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác triệt để những đặc tính sinh học quý phục vụ cho đời sống con người. 1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi Hiện nay cĩ hai phương pháp được sử dụng phổ biến là ph._.ương pháp phân loại truyền thống và phương pháp phân loại hiện đại bằng sinh học phân tử. *Phương pháp truyền thống: Chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái. Dayal (1975) đã dựa vào 7 đặc tính để phân loại nấm sợi: đặc điểm hình thái, ký chủ đặc thù, đặc điểm sinh lý, đặc điểm tế bào học, đặc điểm di truyền học, đặc điểm kháng huyết thanh, đặc tính sinh hĩa và phân loại số học. Cĩ nhiều khĩa phân loại được sử dụng như: Saccardo P.A (1880 – 1886), Baron G.L (1968), Hughes S.T (1953), Ellis M.B (1971), Ainsworth G.C (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1986), Barnett H.L và cộng sự (1972), Nguyễn Lân Dũng (2000), Samson (2004) * Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Đây là phương pháp kỹ thuật rất hiện đại và tương đối mới mẻ. Các thao tác cơ bản được sử dụng là kĩ thuật thu nhận DNA, chạy PCR và giải trình tự axit nucleic. Thu nhận DNA Yêu cầu của kỹ thuật này là phải thu được các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, khơng bị phân hủy bởi tác nhân hĩa học và cơ học. Ba bước cơ bản của kĩ thuật DNA : Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phĩng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Loại bỏ các thành phần khơng mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này cĩ tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha cĩ chứa DNA. Thu nhận axit nucleic. Làm kết tủa axit nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu nhận các axit nucleic dạng cơ đặc, dễ bảo quản. Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) Nguyên tắc Khuếch đại một trình tự DNA lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1 (biến tính) Trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94P0PC – 95P0PC trong vịng 30 giây – 1 phút. Bước 2 (lai) Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuơn. Nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 40P0PC – 70P0PC và kéo dài trong vịng 30 giây – 1 phút. Bước 3 (tổng hợp) Nhiệt độ được tăng lên đến 72P0PC là nhiệt độ mà DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Giải trình tự axit nucleic Các phương pháp xác định trình tự axit nucleic đều dựa trên 2 nguyên tắc: Nguyên tắc hĩa học (phương pháp Maxam và Gilbert) Dựa vào các phản ứng thủy giải hĩa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn cĩ kích thước hơn kém nhau một nucleotid. Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger) Quá trình tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase bên cạnh nguồn nguyên liệu là các đơn phân nucleotic cịn được bổ sung thêm các đơn phân dideoxinucleotid. Kết quả là quá trình kéo dài chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại khi cĩ một dideoxinucleotid tham gia vào chuỗi. Từ đĩ dẫn đến việc tổng hợp ra được một nhĩm gồm nhiều đoạn DNA cĩ kích thước hơn kém nhau một nucleotide. Sau đĩ, các phân đoạn DNA được điện di trên gel polyacrylamid. Dựa trên kết quả điện di người ta cĩ thể xác định được trình tự của đoạn DNA cần thiết. So sánh đối chiếu với trình tự gen trong ngân hàng gen để xác định lồi. 1.1.2.5. Vai trị của NS trong hệ sinh thái RNM Với đặc điểm riêng của NS ở RNM, chúng đã mang lại nhiều vai trị mang tính quyết định đối với hệ sinh thái RNM. Trong điều kiện của RNM – nơi mà nguồn dinh dưỡng chủ yếu là các biopolymer của sinh khối thực vật RNM và động vật biển thì các NS chính là tác nhân tham gia tích cực vào quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp này, là mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và tham gia khép kín chu trình sinh địa hĩa của RNM. Cụ thể hơn, nhờ hệ thống các enzyme ngoại bào mạnh như amylase, cellulase, protease,…chúng phân giải và chuyển hĩa các hợp chất hữu cơ, vơ cơ khĩ tan, cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng cho cả hệ sinh thái. Các chức năng trên cĩ thể kể đến như việc NS ở RNM phân hủy mùn bã hữu cơ thành nguồn thức ăn khống để nuơi dưỡng cây ngập mặn và tảo phù du, phân hủy các phần rơi rụng của cây ngập mặn thành mùn bã hữu cơ tạo nguồn thức ăn cho các động vật tiêu thụ cấp 1. Bản thân NS ở RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều lồi động vật nhỏ và ấu trùng của một số lồi (Odum, 1980; Alogi, 1989). NS ở RNM cũng là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho các VSV hĩa dị dưỡng khác, từ đĩ làm giàu quần thể VSV [6]. NS ở RNM cĩ vai trị lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hĩa học cĩ cấu trúc mạch vịng. Bên cạnh vai trị làm sạch MT sống nĩi chung, NS ở RNM cịn cĩ vai trị làm sạch MT sinh vật với chức năng là tác nhân kiểm sốt sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái. NS ở RNM chỉ cĩ mặt ở những lá đang phân hủy khi cịn tiếp xúc trực tiếp được với oxi tự do. Vì vậy, rất cĩ thể vai trị của nấm trong quá trình phân hủy các sản phẩm rơi rụng của RNM chỉ tồn tại khi các sản phẩm này cịn trơi nổi trên mặt nước hoặc gần với lớp bùn đất bề mặt RNM [6], [7]. NS cĩ khả năng biến đổi cơ chất, điều chỉnh MT cho các cơ thể khác sử dụng [6] Tuy nhiên, các hoạt động sống của NS ở RNM lại làm giảm lượng oxi trong đất, bùn RNM do quá trình hơ hấp, gây bệnh cho động thực vật hoặc thải vào MT một số chất độc như: ammoniac, sunfuahidro… [6], [7]. Kết luận: NS ở RNM cĩ vai trị vơ cùng quan trọng đối với chu trình tuần hồn vật chất trong hệ sinh thái RNM, cĩ vai trị bảo vệ MT sinh thái nĩi chung và MT sinh thái RNM nĩi riêng, cũng như cĩ vai trị to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các lồi sinh vật từ đĩ đĩng gĩp vào việc giữ cân bằng cho hệ sinh thái đặc biệt này. 1.2. Chitin và chitinase 1.2.1. Nguồn chitin: Chitin là một polysacharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau cellulose). Trong tự nhiên, chitin cĩ trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật khơng xương sống như: cơn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun trịn. Trong động vật bậc cao, các đơn phân của chitin là một thành phần chủ yếu trong mơ da, nĩ giúp cho sự tái tạo và làm liền các vết thương ở da. Trong thực vật, chitin cĩ ở vách tế bào nấm họ zygomycetes, trong sinh khối nấm mốc và trong một số loại tảo. Trong các lồi thủy sản đặc biệt là trong vỏ tơm, cua, ghẹ, HL chitin - chitosan chiếm khá cao từ 14 - 35% so với trọng lượng khơ.Vì vậy vỏ tơm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ơng đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nĩ. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ơng gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp cĩ nghĩa là vỏ giáp, nhưng ơng khơng phát hiện ra sự cĩ mặt của nitơ trong đĩ. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin cĩ dạng cơng thức giống với cellulose. Cấu trúc hố học của chitin: Chitin (CR8RHR13ROR5RN)n là một polymer mạch dài của N-acetylglucosamine, dẫn xuất của glucose, trong đĩ nhĩm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhĩm acetyl amin (-NHCOCHR3R) (cấu trúc I). Như vậy chitin là poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4) glycoside. Trong đĩ các đơn phân của chitin cũng được đánh số như của glucose. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine). Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luơn luơn trong liên kết cộng hĩa trị (covalent bond) với các protein, CaCOR3R và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1.1: Cấu trúc phân tử chitin Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình: α, β, γ – chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi đơn phân (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch. Cĩ thể biểu diễn mỗi đơn phân này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhĩm –CHR2ROH, phần đuơi chỉ nhĩm –NHCOCHR3R, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mơ tả như sau: Hình 1.2: Các cấu hình của chitin α - chitin cĩ cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngồi liên kết hydro trong một lớp trong cùng một mạch, nĩ cịn cĩ liên kết hydro giữa các lớp kề nhau giữa các mạch nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt khơng gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp khơng cĩ liên kết hydro. Dạng β - chitin cũng cĩ thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình acetyl hĩa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin cĩ cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucoside (18TH.F. Mark et al., 1965) Ứng dụng của chitin: Chitin cĩ ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất cĩ giá trị khác. Chitosan là một dạng chitin đã bị khử acetyl, nhưng khơng giống chitin, nĩ lại tan được trong dung dịch acid. Chitosan cĩ nhiều ứng dụng trong các ngành cơng nghiệp, nơng nghiệp, y dược và bảo vệ MT như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, làm thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đơng tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, màng bao hoa quả, bảo vệ MT…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tơm thơng qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan. Glucosamine được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan. Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thối hố khớp. 1.2.2. Chitinase 1.2.2.1. Nguồn chitinase: Chitinase từ thực vật: Ở thực vật, chitinase hiện diện chủ yếu ở hạt, thân, củ, hoa. Thực vật kích thích sinh tổng hợp chitinase như là một cơ chế phịng thủ trước các tác nhân gây bệnh. Chitinase của thực vật thường được tìm thấy ở giai đoạn đầu của sự sinh trưởng của cây. Chitinase thực vật thường thuộc dạng endochitinase, với trọng lượng phân tử nhỏ hơn chitinase từ cơn trùng. Chitinase từ cơn trùng: Chitinase trong cơn trùng đĩng một vai trị quan trọng như là một enzyme phân hủy lớp chitin trong thời kì lột xác của chúng. Sau khi endochitinase cắt ngẫu nhiên các lớp biểu bì tạo thành các chitinoligosacchride, exochitinase sẽ cắt tiếp để tạo thành 17TN-acetyl-glucosamine. Các monomer sinh ra sẽ được tái sử dụng tạo thành lại lớp biểu bì mới. Chitinase ở cơn trùng cĩ thể bị ức chế bởi allosaminidin. Chitinase cũng cĩ thể được tìm thấy trong động vật giáp xác như tơm sú. Chitinases ở động vật giáp xác được tạo thành trước khi quá trình lột xác ở lớp da xảy ra. Chitinase từ vi sinh vật: Vi sinh vật là nguồn cung cấp chủ yếu chitinase trong sản xuất. Hiện nay chitinase được tìm thấy trong các nhĩm vi khuẩn như là Serratia, Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Arthrobacter, Beneckea, Aeromonas, và Streptomyces. Ngồi ra, chitinase cũng được tìm thấy trong các chủng nấm như Trichoderma, Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor, Beauveria, Lycoperdon, Aspergillus, Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium, Stachybotrys, và Agaricus. Nguồn chitinase được tạo ra bởi vi sinh vật cho HL nhiều hơn so với động, thực vật, và nhìn chung enzyme cảm ứng ngoại bào thuộc hai loại endochitinase và exochitinase. Vi sinh vật cĩ khả năng phân hủy chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nhưng nguồn enzyme từ các chủng vi sinh vật khác nhau cĩ khả năng hịa tan trong dung dịch và kích thước rất khác nhau. Bên cạnh đĩ độ phức tạp và thành phần dị hợp trong phân tử cũng rất đa dạng. Chitin bên trong tế bào vi sinh vật do cĩ các cơ chế bảo vệ riêng nên khơng bị phân hủy bởi chitinase của chính tế bào đĩ nhưng khi tiết ra MT bên lại cĩ tính chuyên biệt để chuyển hĩa và thủy phân chitin (Cottrell MT et al.,1999; Keiko Shirai Matsumoto, 2006). 1.2.2.2. Cơ chế hoạt động: Quá trình thủy phân chitin là sự kết hợp của một phức hệ enzyme bao gồm endo-chitinases (EC 3.2.1.1.4), exo-chitinases (EC 3.2.1.14), chitobiase (EC 3.2.1.30) and β-N-acetyl hexosaminidases (EC 3.2.1.52). Endochitinases cắt ngẫu nhiên bên trong chuỗi chitin tạo các đoạn oligo-N-acetyl glucosamine ngắn như là chitotetraose, chitotriose, và diacetylchitobiose. Exochitinases phân hủy chitin cho sản phẩm diacetylchitobiose khơng tạo ra các N-acetyl glucosamine hoặc oligomers. β-N- acetyl hexosaminidases cắt diacetylchitobiose cũng như chitotriose và chitotetraose tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine. (Sahai, A.S. and Manocha, M.S., 1993) Hình 1. 3: Cơ chế hoạt động của các enzyme chitinase 1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase: HT enzyme chitinase sinh ra ở mỗi lồi khác nhau thì khác nhau. HT của chitinase cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, độ pH, các ion kim loại và cơ chất phản ứng. Với Trichoderma harzianum, chitinase được hoạt hĩa khi cĩ sự hiện diện của các ion MnP2+P, FeP2+P, CaP2+ Pvà CoP2+P. Trong khi CuP2+P, ZnP2+P, HgP2+P và EDTA là những tác nhân gây kìm hãm mạnh lên hoạt động của enzyme ở chủng nấm này [63]. Chitinase từ Alternaria alternate địi hỏi CaP2+P và KP+P cho hoạt động của nĩ, enzyme này chịu nhiệt và mất 20% HT khi cho phản ứng ở nhiệt độ 60P0PC trong 60 phút [33] 1.2.2.4. Tính chất sinh hĩa của chitinase * Trọng lượng phân tử Trọng lượng phân tử của chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn khoảng 30kDa đến 120kDa. Ở tảo biển và thực vật bậc cao cĩ trọng lượng phân tử khoảng 30kDa. Ở các lồi thân mềm, chân đốt, động vật cĩ xương cĩ trọng lượng phân tử khoảng 40- 90kDa * Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis Điểm đẳng điện pI của chitinase cĩ giá trị từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và tảo; ở cơn trùng, giáp xác, thân mềm và cá là 4,7- 9,3; ở VSV là 3,5- 8,8. Hằng số Michaelis là 0,10- 0,11 (g/l). * Nhiệt độ hoạt động Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các chitinase cĩ thể cĩ những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho chitinase ở VSV hoạt động là 40PoPC, một số lồi sinh chitinase cĩ khả năng chịu nhiệt cao. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện HT thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp. từ 30- 45PoPC và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nĩng cĩ khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80PoPC. Penicillium chrysogenum cĩ nhiệt độ tối ưu là 40P0PC [57]. De-hui Dai (2011) đã chiết tách được chitinase từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus sp. Hu1 cĩ nhiệt độ hoạt động tối thích là 60P0PC [32] * Độ pH hoạt động Chitinase hoạt động trong khoảng pH 4,0 – 8,5 (Bendt và cộng sự, 2001). pH tối ưu cho enzyme chitinase ở thực vật bậc cao và tảo là 4 – 9; ở động vật là 4,8 – 7,5 và ở VSV là 3,5- 8,0. Chitinase của nấm HT cao nhất ở pH= 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. pH của chitinase cịn phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Các nghiên cứu đa số sử dụng cơ chất là glycol chitin và pH tối ưu khoảng 5,0 1.2.2.5. Phân loại chitinase * Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc hai họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19. Họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các lồi thuộc eukaryote, prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, ngồi ra cịn cĩ các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N- acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohhydrolase 18 cĩ cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn trịn, chúng hoạt động thơng qua cơ chế kiểm sốt mà các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas hydrophyla, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanoclaum album, Serratia marcescens… Họ Glycohydrolase 19 Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngồi ra cịn cĩ ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae,… Chúng cĩ cấu trúc hình cầu với một vịng xoắn. * Dựa vào trình tự amino acid Căn cứ vào trình tự amino acid, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhĩm: Nhĩm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử cĩ đầu amino giàu cystein nối với tâm xúc tác thơng qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein cĩ vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng khơng cần cho hoạt động xúc tác. Nhĩm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ cĩ tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu amino và peptide nhận biết ở đầu carboxyl, cĩ trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhĩm I. Chitinase nhĩm II cĩ ở thực vật, nấm và vi khuẩn. Nhĩm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhĩm I và II. Nhĩm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu cĩ ở lá cây 2 lá mầm, 41%- 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhĩm I, phân tử cũng cĩ giàu đoạn cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhĩm I. Nhĩm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) cĩ thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hố ở thực vật bậc cao. Ngồi ra, theo cơ chế xúc tác của chitinase ta cĩ các loại chitinase sau: endochitinase, chitin-1,4- β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosamine (exochitinase) và chitobiase. 1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase * Ứng dụng sản xuất chitosan Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều cĩ tính kháng nấm, kháng khuẩn, như ức chế hoạt động của một số loại vi khuẩn như E.Coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và cĩ tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả cĩ vỏ cứng bên ngồi, làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả, cĩ khả năng tự phân huỷ sinh học cao, cĩ khả năng tạo phức với một số kim loại chuyển tiếp như: Cu(II), Ni(II), Co(II)... Do vậy chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Trong lĩnh vực xử lí nước thải và bảo vê MT, dược học và y học, nơng nghiệp, cơng nghiệp, cơng nghệ sinh học * Ứng dụng trong sản xuất Glucosamin Glucosamine đặc hiệu trong điều trị thối hĩa khớp là do nĩ cĩ 3 tác dụng: kích thích sản xuất sụn, giảm đau khớp và chống viêm trong đĩ tác dụng kích thích sản xuất sụn đĩng vai trị quan trọng nhất. Glucosamine là thành phần chính của proteoglycan - 1 trong 3 thành phần (proteoglycan, collagen, tế bào sụn) cùng với nước cấu tạo nên sụn khớp. Proteoglycan như sợi dây thừng xâu chuỗi với collagen, cĩ vai trị giữ nước để làm trơn và nuơi dưỡng collagen * Ứng dụng trong việc phân lập tế bào trần Sử dụng enzyme chitinase để phá hủy vách tể bào của vi sinh vật tạo tế bào trần. Nghiên cứu về ảnh hưởng của một số nhân tố đến sự tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesi đã cho thấy vai trị của chitinase trong việc tạo tế bào trần [42], ứng dụng chitinase từ Enterobacter sp. NRG4 nuơi trên MT bán rắn để phân lập tế bào trần từ nấm và nấm men, thành tế bào nấm men Rhaffia Rhodozyme đã được phân giải thành cơng bằng hỗn hợp enzyme trong đĩ cĩ chitinase từ Baccilus circulans [26] * Ứng dụng sản xuất chitooligosaccharid, Nacetyl-D-Glucosamine Chitooligosaccharid đã được Murao (1992) và Stoyachenko (1994) sản xuất bằng enzyme chitinase do vi khuẩn Vibrio Alginolyticus và Streptomyces kurssanovii tổng hợp [52],[63]. Chitooligosaccharides và Nacetyl-D-lucosamine cũng được Ghanem (2011) sản xuất từ Aeromonas sp và các loại vi khuẩn sinh chitinase [32] * Sản xuất protein đơn bào Vyas (1991) đã sử dụng enzyme chitinase từ Myrhothecium verrucaria trong việc sản xuất protein đơn bào [67]. Owhashi (2000) và Guevara (2006) cũng đã ứng dụng chitinase của Alternaria alternata được phân lập từ đất bị ơ nhiễm cá để sản xuất protein đơn bào phục vụ cho nơng nghiệp [56] * Trừ muỗi Mendosa ES, Vartak PH, Rao JU (1996) dùng enzyme chitinase từ Myrhothecium verrucaria để trừ cơn trùng gây hai trong đĩ cĩ muỗi Aedas aegypti. Gkargkas đã 15Tnghiên cứu về N-acetyl-[beta]-d- glucosaminidase được sinh ra bởi Fusarium oxysporum F3 phát triển trên m15Tơi trường bán rắn và ứng dụng trong trừ muỗi, nấm và cơn trùng gây bệnh [34] * Ứng dụng trong phịng trừ sinh học Đa số các lồi nấm gây bệnh đều chứa chitin như: Fusarium, Gliocladium, Rhizotonia, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium và Alternaria. Chitinase sẽ phân hủy chitin, ức chế nhiều nấm, cơn trùng và chân đốt gây hại. Các lồi cơn trùng như Lepidoptera trichoplusia (sâu cải), Pieris rapae, sâu trên râu bắp, bướm đêm, sâu thuốc lá… lớp Coleoptera bao gồm bọ cánh cứng khoai tây Colorado, bọ vịi voi vỏ trịn, bọ cánh cứng đậu Mexico và ấu trùng sống ở rễ bắp, lớp Homoptera bao gồm rệp cây bơng cải, rệp cây khoai tây, rệp đỏ California, lớp Thysanoptera bao gồm bọ trĩ củ hành, lớp Orthoptera bao gồm châu chấu, lớp Hemiptera bao gồm bọ xít ở lúa. Vai trị của enzyme chitinase sinh ra bởi Serratia marcescens trong việc phịng trừ Sclerotium rofsi đã được nghiên cứu bởi Ordentlich và cs (1988) [55]. Inbar J và Chet I (1991) chứng minh rằng chitinase sản sinh bởi Aeromonas cavie cĩ vai trị trong phịng trừ các vi khuẩn gây bệnh trong đất. Mahadevan (1997) đã nghiên cứu vai trị của chitinase trong việc trừ nấm Streptomyces lydicus WYEC 108, kết quả thành tế bào bị enzyme chitinase phá hủy. S. lydicus cũng sản sinh một hoặc nhiều kháng sinh kháng nấm nhưng chitinase giữ vai trị quan trọng trong phịng trừ nấm [40]. Vai trị của chitinase tử chủng stenotrophomonas maltophilia trong việc phịng trừ Bipolaris sorokiniana đã được Zhang (2000) chứng minh. Gen tổng hợp chitinase đã được chuyển vào thực vật để kháng cơn trùng. Chitinase ở thực vật là protein cảm ứng thơng qua sự nhiễm bởi tác nhân gây bệnh. Chitinase của cây khoai mỡ Trung Quốc được xịt lên dâu tây bị nhiễm nấm mốc bột, kết quả là những tác nhân gây bệnh màu trắng trên trái và lá của dâu biến mất trong ngày sau khi xịt và khơng xuất hiện trong thời gian hơn 2 tuần, thực vật chuyển gen kháng cơn trùng bằng gen sinh chitinase cũng đã được sản xuất. Cây thuốc lá với gen chitinase biểu hiện sự kháng lại cơn trùng độc [40]. Ứng dụng chitinase để trừ nấm gây bệnh tàn rụi chậm Phytophthora capsici trên cây tiêu với một hợp chất chứa chủ yếu là chitinase được tổng hợp từ vi khuẩn [24] * Ứng dụng trong y dược Trong cơ thể động vật và thực vật, chitinase liên quan đến cơ chế bảo vệ [35]. HT chitinase trong huyết thanh người cũng được báo cáo với vai trị chống lại những tác nhân gây bệnh [29] Chitinase được ứng dụng trong sản xuất thể nguyên sinh ở nấm, thuốc chữa bệnh bằng phương pháp hoạt hĩa các chitooligosaccharide. Hiện nay các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đốn mới các bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase từ Vibrio parahemolyticus (chitinase VP1). Nĩ kết hợp chặt chẽ với chitin và cĩ thể sử dụng như một mẫu dị để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mơ bệnh. Hiện nay chitinase được ứng dụng để chẩn đốn các bệnh do nấm gây ra dựa trên nguyên tắc chitin hiện diện nhiều trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm sợi hay vết chồi ở nấm men. Do đĩ cần một phương pháp nhuộm chitin đặc biệt cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn đốn nhanh chĩng, hiệu quả các lồi nấm gây bệnh. [35] Các nhà khoa học đã thử nghiệm HT kháng nấm của chitinase tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các loại nấm khác nhau như Aspergillus, Candida… Kết quả cho thấy hiệu quả của sự điều trị với tác nhân kháng nấm được ước lượng trên 3 thơng số là mức độ giảm tỉ lệ chết, mức độ giảm số lượng tế bào nấm nuơi cấy từ các cơ quan, mức độ giảm lưu thơng kháng nguyên nấm. [35] Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm khác (amphotericin B, các dẫn xuất azol…). Chitinase cĩ thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lượng khơng gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngồi ra, việc kết hợp giữa chitinase và laminarinase được ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn cơng vào vách tế bào nấm (so với chỉ dùng chitinase). [35] Bên cạnh đĩ, chitinase cĩ tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bơi ngồi da chống bệnh do vi nấm thường xảy ra ở các nước vùng nhiệt đới. * Ứng dụng xử lý nước thải Trong nước thải đặc biệt là nước thải của các nhà máy chế biến thủy hải sản chứa một lượng lớn chitin khĩ phân hủy gây ơ nhiễm mơi trường. Người ta cĩ thể sử dụng vi sinh vật cĩ khả năng sinh chitinase cĩ HT cao hoặc sử dụng CPE chitinase để xử lý nước thải nhiễm chitin. Wang (2001) đã xử lí nước thải chứa động vật cĩ vỏ bằng cách sử dụng enzyme chitinase từ vi khuẩn Bacillus cereus, B. alvei, and B. sphaericus phân lập từ nước thải [68]. Rattanakit (2007) sử dụng enzyme chitinase phân lập từ Aspergillus sp. để xử lý MT nhiễm chitin [60]. 1.2.3. NS với khả năng sinh enzyme chitinase 1.2.3.1. Một số chủng NS cĩ HT chitinase cao Rất nhiều chủng NS sinh enzyme chitinase như: Mucor rouxii [58], Rhizopus oligosporus, Penicillium janthinellum [31],9T Aspergillus fumigatus [29]9T, Trichoderma harzianum [53], Trichoderma reesei [42], Penicillium aculeatum [23], Penicillium chrysogenum [57], Streptomyces viridificans [36], Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Metarhizium Anisopliae, Aspergillus terreus [33], Aspergillus awamori [10], Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma harzianum, Trichoderma atroviride [4], 1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chitinase ở NS Nguồn dinh dưỡng nitrogen: Nguồn nitrogen cĩ ý nghĩa rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của NS. Đối với Trichoderma harzianum khi loại urea ra khỏi MT nuơi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp chitinase [36]. Khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào MT nuơi cấy bán rắn thì khả năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể [53]. Trong nuơi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào MT khơng ảnh hưởng đến HT chitinase Trichoderma longibrachiatum [41]. Đối với Streptomyces sp. NK 1057 khi cung cấp nguồn nitrogen từ cả 2 nguồn là cao nấm men và (NHR4R)R2RSOR4R thì sản lượng chitinase tăng từ 4-10% so với dùng riêng lẻ các nguồn này [54]. Nguồn dinh dưỡng carbon: Cơ chất dùng để cảm ứng sợi nấm sinh chitinase là chitin và các dẫn xuất của chitin. Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong MT nuơi cấy NS sinh chitinase, cần cĩ nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn carbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase. Nguồn dinh dưỡng khống Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… cĩ vai trị quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hố vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia thành phần cấu tạo protein, enzyme, điều hồ pH MT nuơi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme nĩi chung, chitinase nĩi riêng. Ảnh hưởng của pH Độ pH của MT cĩ cĩ ý nghĩa quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng NS. Mỗi lồi khác nhau thích nghi với một độ pH khác nhau. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cĩ HT cao nhất ở điều kiện pH= 5- 6 [65]. Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase cĩ HT cao khoảng pH= 4 – 6 [53] Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của NS. Nhiệt độ từ 28- 32PoPC là tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số NS, nhiệt độ tối đa dưới 50PoPC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp cĩ thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí cĩ thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng Để kích thích vi sinh vật tổng hợp chitinase người ta thường cho chất cảm ứng chitin vào mơi trường nuơi cấy, cĩ nhiều loại chitin, mỗi loại chitin với HL khác nhau cĩ ảnh hưởng khác nhau đến sự tổng hợp chitinase. Trong hầu hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1- 1,5% là VSV cĩ khả năng tạo chitinase [30]. Trong số các cơ chất chitin, chitin huyền phù cĩ khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất vì dễ phân giải hơn các loại khác [21]. Hệ chitinase của Trichoderma sp. cĩ thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthora primulae), vách tế bào nấm lớn (Shizophyllum commune, Trametes versicolor) hoặc chitin vỏ tơm, trong đĩ vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp hệ chitinase của Trichoderma tốt hơn chitin vỏ tơm [4]. Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ tơm, cua,…) để tạo chitinase từ NS Penicillium aculeatum nuơi cấy trên MT bán rắn [23] 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngồi nước 1.3.1. Ngồi nước * Nghiên cứu về chitinase li trích từ thực vật Abeles (1971) đã nghiên cứu và tinh sạch chitinase cĩ trong lá đậu [19]. Mauch (1988) đã tinh sạch chitinase và 0-1,3-glucanase từ vỏ đậu, tiềm năng kháng nấm của 2 loại enzyme này cũng đã được nghiên cứu [49]. Hou, Chen và Lin (1998) đã phát hiện enzyme chitinase ở các phần khác nhau trên cây khoai lang (Ipomoea batatas) và nghiên cứu các điều kiện tối ưu để enzyme hoạt động bằng cách sử dụng bột chitin thương mại [37] * Nghiên cứu về chitinase được sinh tổng hợp từ vi khuẩn Takahashi (1993) và Stoyachenko (1994) đã tinh sạch và khảo sát một số tính chất của enzyme chitinase từ Vibrio sp. và Streptomyces kurssanovii [63], [65]. Wang và Hang (2001) đã xử lí nước thải chứa động vật cĩ vỏ bằng cách sử dụng enzyme chitinase từ vi khuẩn Bacillus cereus, B. alvei, and B. sphaericus phân lập từ nước thải [68]. Vi k._.uberus: MT1 chứa 40% bột bắp trích béo, thời gian NC: 50 giờ, pH = 5,5, nồng độ muối NaCl 0 - 2%, nhiệt độ 30P0PC, hàm lượng chitin trong MT: 10-15% 3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hĩa điều kiện nuơi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum Từ kết quả thu được ở mục 3.3, chúng tơi nhận thấy chủng P. citrinum thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất trong 2 chủng nghiên cứu, thời gian nuơi cấy ngắn (36-40 giờ), nhu cầu chất cảm ứng khơng cao (chitin 10%), sử dụng nguồn carbon rẻ tiền (cám). Do đĩ chúng tơi chọn chủng P. citrinum để nghiên cứu tiếp nhằm thu nhận enzyme. Chúng tơi tiến hành thực hiện kế hoạch bậc 1 hai mức tối ưu tồn phần (kế hoạch 2PkP). Chọn các yếu tố ảnh hưởng và miền khảo sát như trong bảng 3.10 Bảng 3.10. Các mức và các khoảng biến thiên 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 0 5 10 15 20 25 Hàm lượng chitin (%) H oạ t t ín h HTC A. protuberus (U/ml) HTR A. protuberus (U/mg) HTC P. citrinum (U/ml) HTR P. citrinum (U/mg) Yếu tố Các mức Khoảng biến thiên Mức dưới Tâm Mức trên xR1R: thời gian 35 40 45 5 xR2R: nhiệt độ 35 40 45 5 xR3R: độ pH 4 4.5 5 5 PTHQ tuyến tính dạng: ∧ y = bR0R + bR1RxR1R + bR2RxR2 R+ bR3RxR3 R+ bR12RxR1RxR2 R+ bR13RxR1RxR3R + bR23RxR2RxR3 R+ bR123RxR1RxR2RxR3 Trong đĩ ∧ y : HT chitinase theo PTHQ - Tính các hệ số của PTHQ bR0R, bR1R, bR2R,...bRjR theo cơng thức ở mục 2.2.10 thu được kết quả: bR0 R= 0.1448; bR1 R= 0.0261; bR2R = -0.0197; bR3R = 0.0254; bR12R = 0.0017; bR13 R= 0.0319; bR23R = 0.0115; bR123R = - 0.0157 Bảng 3.11. Ma trận kế hoạch hĩa với biến số hằng Số tt thí nghiệm xR0 xR1 xR2 xR3 yRi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 - + - + - + - + 0 0 0 - - + + - - + + 0 0 0 - - - - + + + + 0 0 0 0,174 0.127 0.077 0.100 1.106 0.251 0.118 0.206 0.1874 0.1577 0.1667 Ghi chú: zR1R: thời gian nuơi cấy (giờ), zR2R: nhiệt độ MT nuơi cấy (P0PC), zR3R: độ pH của MT nuơi cấy; xR1R, xR2R, xR3R: biến số mã hĩa của biến thực zR1R, zR2R, zR3R; +1: mức trên, 0: tâm, -1: mức dưới, y: HTC enzyme chitinase Làm 3 thí nghiệm lặp tại tâm để kiểm tra tính cĩ nghĩa của các hệ số b 1706,0)1667.01577.01874.0( 3 1 =++= o y =211S 0.000231 005378,0 8 000231,0 ==bS Tính các hệ số t để kiểm tra tính cĩ nghĩa của các hệ số b 922,26 005378,0 1448,00 0 === bS b t ; tR1R = 4.849891; tR2R = 3.65709; tR3R = 4.731163; tR12R = 0.307864; tR13R = 5.94053; tR23R = 2.13848; tR123R = 2.9254 Với mức ý nghĩa p = 0,05, bậc tự do lặp fR2R = 3-1 = 2 tra bảng student ta cĩ tR0,05;2R = 4,303 Hệ số b cĩ ý nghĩa khi tRjR > tR0,05;2R. Như vậy tất cả các hệ số đều cĩ ý nghĩa trừ bR12R, bR23R, bR123 Sau khi loại bỏ hệ số khơng cĩ ý nghĩa thì PTHQ cĩ dạng = ∧ y 0.1448 + 0.0261xR1R - 0.0197xR2R + 0.0254xR3R + 0.0319xR1RxR3 Tính các giá trị tại các điểm thí nghiệm theo PTHQ và cĩ: ∧ 1y = 0.144876; ∧ 2y = 0.133145; ∧ 3y = 0.10554; ∧ 4y = 0.093809; ∧ 5y = 0.131868; ∧ 6y = 0.247929; ∧ 7y = 0.092532; ∧ 8y = 0.208593 Phương sai dư được tính theo cơng thức 00102,02 =duS Chuẩn số Fisher được tính theo cơng thức 408,4 000231,0 00102,0 2 11 2 === S SF du Giá trị tra bảng của chuẩn số Fisher ở mức ý nghĩa p = 0,05 và fR1 R= 4, fR2R = 2 là 19,3. Do F tính < F bảng nên PTHQ thu được tương thích với thực nghiệm Từ PTHQ ta thấy muốn tăng giá trị của thơng số tối ưu hĩa cần tăng thời gian và độ pH, giảm nhiệt độ. Từ đĩ chúng tơi tiến hành tối ưu hĩa bằng phương pháp Box – Wilson. Chọn bước nhảy là 2 đối với thời gian nuơi, 2 đối với nhiệt độ, 0,2 đối với pH. Bảng 3.12. Kết quả nuơi cấy P. citrinum theo kế hoạch leo dốc Số TT thí nghiệm Thời gian Nhiệt độ Độ pH HT chitinase U/ml 1 40 40 4.5 0,1729 2 42 38 4.7 0,2511 3 44 36 4.9 0,1004 4 46 34 5.1 0,1110 5 48 32 5.3 0,1088 6 50 30 5.5 0,2294 Kết quả cho thấy, điều kiện nuơi cấy trên MT bán rắn tối ưu cho P. citrinum sinh trưởng và tạo chitinase là: MT chứa 40% cám, chất cảm ứng là chitin 10%, thời gian nuơi cấy 42 giờ, nhiệt độ MT 38P0PC, độ pH 4,7, HL muối: 0,2%. Tiếp tục nuơi cấy để thu enzyme. 3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thơ từ chủng P. citrinum 3.4.1. Thu nhận CP chitinase thơ bằng muối (NHR4R)R2 RSOR4 Tiến hành tủa dịch enzyme thơ bằng muối (NH R4R)R2RSOR4 Rbão hịa 85% trong 3 giờ ở nhiệt độ lạnh 4-10P0PC. Ly tâm lạnh 9600 vịng/phút ở 0P0PC thu tủa ta được chế phẩm enzyme thơ. Để khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng, sau đĩ bảo quản trong tủ lạnh -20P0PC Lấy 0,02g CPE hịa vào 1ml dung dịch đệm acetat pH=5, sau đĩ đem thử HT chitinase theo mục 2.2.8. Ta thu được kết quả trình bày ở bảng 3.13 Bảng 3.13. Kết quả thử HT enzyme chitinase sau khi tủa bằng (NH R4R)R2 RSOR4 Canh trường (g) Thể tích dịch enzyme thơ (ml) Khối lượng Enzyme (g) (gCPE) HTC (U/ml) HTC (U/gCPE) 70 500 1,6 0,229 11,456 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase Tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.12.2. Chúng tơi thu được số liệu ở bảng 3.14 và minh họa trong đồ thị 3.6 Nhận xét: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme chitinase do chủng P. citrinum sinh ra là 60P0PC, nhiệt độ bền dưới 50P0PC. Kết quả này cho thấy chitinase của P. citrinum bền với nhiệt và hoạt động mạnh ở nhiệt độ khá cao, giống với chitinase của Thermomyces lanuginosus và Talaromyces emersonii cĩ nhiệt độ tối ưu cao, chitinase của Talaromyces emersonii cĩ HT cao nhất ở nhiệt độ 65P0PC [50]. Nhưng lại khác với nhiệt độ tối ưu của hầu hết enzyme chitinase ở nấm là 20 - 40P0PC [25][43]. Cĩ lẽ do điều kiện khắc nghiệt ở RNM làm cho chitinase của nĩ hoạt động mạnh ở nhiệt cao và bền với nhiệt. Bảng 3.14: HT của CPE chitinase thơ từ chủng P. citrinum theo nhiệt độ phản ứng Nhiệt độ (P0PC) ∆ OD (535 nm) Lượng Glucosamin (µmol/ml) HTC (U/ml) HTC U/gCPE Nhiệt độ bền 30 0,201 4,369 0,218 10,922 40 0,197 4,309 0,215 10,773 50 0,200 4,363 0,218 10,907 60 0,122 2,967 0,148 7,417 70 0,047 1,639 0,082 4,098 80 0,000667 0,805 0,040 2,012 Nhiệt độ tối ưu 30 0,148 3,424 0,171 8,561 40 0,216 4,648 0,232 11,619 50 0,231 4,915 0,246 12,288 60 0,247 5,200 0,260 13,000 70 0,108 2,717 0,136 6,793 80 0,016 1,072 0,054 2,680 Đồ thị 3.6. Sự biến thiên HT CPE chitinase thơ của chủng P. citrinum theo nhiệt độ phản ứng 0 2 4 6 8 10 12 14 20 40 60 80 100 Nhiệt độ phản ứng H oạ t t ín h U /g C PE Nhiệt độ bền Nhiệt độ tối ưu Hình 3.6. Dịch enzyme được tủa bằng (NHR4R) R2RSOR4 Hình 3.7. : Tủa chitinase thu được sau khi li tâm (trái) và sấy khơ (phải) Hình 3.8. Chế phẩm enzyme thơ đem bảo quản trong tủ -20 độ C 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thơ Tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.12.3. Chúng tơi thu được số liệu ở bảng 3.15 và đồ thị 3.7 Bảng 3.15: HT của CPE chitinase thơ từ chủng P. citrinum theo nhiệt độ phản ứng Độ pH ∆ OD Lượng HTC HTC (535nm) Glucosamin (µmol/ml) (U/ml) (U/gCPE) pH bền 3,0 0,000 0,793 0,040 1,982 3,5 0,036 1,440 0,072 3,601 4,0 0,035 1,423 0,071 3,556 4,5 0,043 1,553 0,078 3,883 5,0 0,051 1,696 0,085 4,239 5,5 0,113 2,806 0,140 7,016 6,0 0,209 4,511 0,226 11,278 6,5 0,207 4,481 0,224 11,204 7,0 0,202 4,392 0,220 10,981 7,5 0,144 3,365 0,168 8,412 8,0 0,063 1,910 0,095 4,774 8,5 0,033 1,387 0,069 3,467 9,0 0,003 0,840 0,042 2,101 pH tối ưu 3,0 0,075 2,129 0,106 5,323 3,5 0,086 2,319 0,116 5,799 4,0 0,099 2,563 0,128 6,407 4,5 0,101 2,599 0,130 6,496 5,0 0,159 3,632 0,182 9,080 5,5 0,204 4,428 0,221 11,070 6,0 0,268 5,574 0,279 13,936 6,5 0,247 5,200 0,260 13,000 7,0 0,231 4,903 0,245 12,258 7,5 0,194 4,256 0,213 10,639 8,0 0,135 3,199 0,160 7,996 8,5 0,070 2,040 0,102 5,101 9,0 0,060 1,862 0,093 4,655 Nhận xét: Ezyme chitinase do chủng P. citrinum sinh ra cĩ HT cao nhất tại pH= 6, enzyme này bền ở khoảng pH từ 6-7. pH tối ưu này giống với phần lớn chitinase từ các chủng nấm khác được Y. G. Lee, Chung, Wi, Lee và Bae (2009) nghiên cứu, chitinase của nấm hoạt động tốt trong khoảng pH từ 4 – 7 [25][43] Đồ thị 3.7. Sự biến thiên HT CPE chitinase thơ của chủng P. citrinum theo pH của dung dịch đệm Từ kết quả trên chúng tơi rút ra những đặc điểm của CPE thơ: Hoạt tính chung là 11,456U/gCPE, nhiệt độ tối ưu là 60P0PC, bền ở nhiệt độ dưới 50P0PC, pH tối ưu là 6, bền ở pH từ 6-7. 3.5. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thơ để phịng trừ nấm hại cây trồng 3.5.1. Ứng dụng CPE chitinase thơ vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm 9TRhizoctonia solani Tiến hành thí nghiệm như ở mục 2.2.14. Sau khi cân và trừ đối chứng ta thu được kết quả ở bảng 3.16 Bảng 3.16. Số liệu khảo sát sự giảm sinh khối sau khi sử dụng CPE thơ và TTN Số TT Khối lượng trước khi nuơi (đối chứng) (g) Khối lượng sau khi nuơi (g) Tổng sinh khối nấm (g) Sinh khối giảm (g) % sinh khối giảm 1 1,321 1,589 0,268 2 1,540 1,722 0,182 0,086 32,044 3 1,411 1,611 0,201 0,067 25,131 4 1,443 1,597 0,153 0,115 42,838 0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000 16.000 0 2 4 6 8 10 pH H oạ t t ín h ch un g (U /m l) pH bền pH tối ưu Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ % sinh khối nấm Rhizoctonia solani giảm sau khi xử lý bằng TTN và CPE Nhận xét: Sau khi xử lí TTN và CPE riêng thì sinh khối nấm 9TRhizoctonia solani9T giảm 25% đến 30%. Nếu kết hợp cả hai để diệt nấm 9TRhizoctonia solani 9Tgây bệnh cây trồng thì hiệu quả tăng lên 10% 17%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp (2010) về hiệu quả làm giảm sinh khối nấm bệnh ở thực vật của CPE chitinase, cụ thể làm giảm sinh khối từ 14,2-22,6%. Baustista và Dalmacio (2003) cũng đã phịng trừ được nấm bệnh Rhizoctonia solani trong điều kiện phịng thí nghiệm, hạt của cây lúa miến bị nấm bao ngồi được ngâm trong dịch chiết chitinase thơ từ 3 đến 5 giờ, kết quả cĩ một sự giảm đáng kể sự tăng sinh của sợi nấm sau 12 giờ nuơi cấy, các sợi nấm bị ức chế hồn tồn thậm chí được nuơi cấy trong thời gian lâu hơn 48 giờ [20]. Nấm 9TRhizoctonia solani9T cĩ khả năng gây thối rễ cây con; bệnh chết rụi cây con…. Ta cĩ thể sử dụng CPE chitinase phối hợp với TTN để phịng trừ bệnh cho cây trồng do các lồi nấm gây bệnh cĩ cấu tạo vách tế bào bằng chitin. Hình 3.9 Dịch nuơi cấy nấm 9TRhizoctonia solani9T được lọc, sấy khơ và đem cân 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 TTN CPE TTN + CCE Các tác nhân xử lí nấm bệnh T ỉ l ệ % s in h kh ối g iả m sinh khối giảm (%) 3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thơ vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm Tiến hành thí nghiệm như ở mục 2.2.15 Số BT trong dịch nấm Fusarium oxysporum sau khi đếm bằng buồng đếm hồng cầu là 625.10P5P BT/1ml. Vậy trong 0,5ml cĩ 312,5.10P5P BT. Tiến hành các nghiệm thức như mục 2.2.14.Thu được kết quả trình bày trong bảng 3.17 Bảng 3.17. Kết quả sử dụng CPE chitinase thơ để ức chế BT Fusarium oxysporum nảy mầm TN Số lượng KL đếm được trên đĩa Tổng số BT nảy mầm được/0,5ml dịch BT nấm Số BT bị ức chế/0,5ml dịch BT nấm Tỉ lệ % BT bị ức chế Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Đối chứng 7 4 5 5,333 533333,3 133333,3 20 Xử lý CPE 10 6 4 6,667 666666,6 Biểu đồ 3.3. Biểu đồ biểu diễn số lượng BT nảy mầm khi khơng và cĩ xử lý CPE 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 Đối chứng CPE Số B T n ảy m ầm Số BT nảy mầm Hình 3.10: KL của nấm Fusarium oxysporum sau 2 ngày cấy (bên trái: đối chứng, bên phải: xử lý bằng CPE) Nhận xét: Qua số liệu trên ta thấy số BT nấm Fusarium oxysporum khơng nảy mầm sau khi xử lý bằng CPE chitinase là 133333,3, tương ứng với tỉ lệ 20% BT bị ức chế khi xử lý bằng chế phẩm enzyme. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp (2010), CPE từ Trichoderma longibrachiatum TD16 cĩ khả năng ức chế 28% BT vi nấm nảy mầm. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lorito, Peterbauer, Hayes, & Harman (1994) về 2 loại enzyme do 9T richoderma harzianum9T và 9TGliocladium virens9T tổng hợp là chitinase và glucanase cĩ khả năng ức chế sự nảy mầm của BT lồi 9TBotrytis cinerea 9T trong vitro. Nếu thêm một trong 5 tác nhân kháng khuẩn gliotoxin, flusilazole, miconazole, captan and benomyl vào hỗn hợp 2 enzyme này sẽ làm tăng đáng kể hiệu quả ức chế BT nảy mầm [46] Như vậy enzyme chitinase cĩ khả năng ức chế sự nảy mầm của BT vi nấm và sự tăng trưởng của sợi nấm. Ta cĩ thể ứng dụng chế phẩm enzyme để phịng bệnh do nấm gây ra. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 1. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase của 60 chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ cho thấy: 49 chủng cĩ hoạt tính yếu chiếm tỉ lệ 81,66%, 1 chủng cĩ hoạt tính trung bình chiếm tỉ lệ 1,66%, 8 chủng cĩ hoạt tính khá chiếm tỉ lệ 13,33%, 2 chủng cĩ hoạt tính mạnh chiếm tỉ lệ 3,35%. 2 chủng này ký hiệu là chủng 10 và 16 được chọn để nghiên cứu tiếp. 2. Kết quả khảo sát đặc điểm sinh học của 2 chủng NS cĩ HT mạnh cho thấy chủng số 10 thuộc lồi Penicillium citrinum, chủng số 16 thuộc lồi Aspergillus protuberus. Đây là 2 chủng du nhập từ đất liền vào RNM. 3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS cho thấy: - Chủng nấm P. citrinum: sinh tổng hợp enzyme chitinase cĩ HT cao khi nuơi trên MT bán rắn cĩ 40% cám, trong thời gian 36 – 40 giờ, pH: 4,5, nhiệt độ 40P0PC, nồng độ muối: 2%, HL chitin 10% - Chủng nấm A. protuberus: 40% bột bắp trích béo, thời gian: 48 giờ, pH: 5,5, nhiệt độ: 30P0PC, nồng độ muối: 0 – 2%, HL chitin 10 – 15% - Kết quả sau khi tối ưu hĩa điều kiện NC bằng qui hoạch thực nghiệm chủng nấm P. citrinum: MT chứa 40% cám, chất cảm ứng là chitin 10%, thời gian nuơi cấy 42 giờ, nhiệt độ MT 38P0PC, độ pH 4,7, HL muối: 2% 4. Đã sử dụng tác nhân tủa enzyme là (NH R4R)R2RSOR4R với HT sau khi tủa là 11,456U/gCPE. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến HT của chế phẩm enzyme chitinase thơ thu được kết quả: nhiệt độ tối ưu: 60P0PC, nhiệt độ bền: dưới 50P0PC, pH tối ưu: Sodium citrate 0,05M pH 6,0; pH bền: Sodium phosphate 0,05M pH 6-7 5. Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm bệnh và ức chế BT nấm bệnh nảy mầm, kết quả là: sau khi xử lí TTN kết hợp với CPE chitinase thì sinh khối nấm Rhizoctonia solani giảm từ 35-40%, khoảng 20% BT nấm Fusarium oxysporum bị ức chế khi xử lý bằng CPE chitinase. 4.2. Kiến nghị Cần tiếp tục hồn thiện qui trình tinh sạch enzyme chitinase từ P. citrinum làm cơ sở cho những ứng dụng tiếp theo TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phạm Gia Cần (2009), Tìm hiểu HT kháng khuẩn của chủng P. citrinum. phân lập từ RNM Cần Giờ Tp. HCM, Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐHSP Tp. HCM, tr.12-34 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi Sinh vật học, NXB Giáo dục. 3. Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lí phịng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.36-66 4. Đinh Minh Hiệp (2010), Nghiên cứu enzyme chitinase và b-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm sốt sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới, TP Hồ Chí Minh 5. Bùi Thị Huỳnh Hoa (2009), Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ, tr.23- 30 6. Phan Nguyên Hồng (1997), Vai trị của RNM Việt Nam, NXB Nơng nghiệp, tr.11-23 7. Phan Nguyên Hồng (2004), Hệ sinh thái RNM vùng ven biển đồng bằng sơng Hồng, NXB Nơng nghiệp, tr.9-35 8. Dương Thị Hương Giang (2008), Hĩa protein – Kỹ thuật tinh sạch protein, Viện nghiên cứu và phát triển Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ, tr.20-39 9. Dương Thị Hương Giang (2005), Thực tập enzyme học, Viện nghiên cứu và phát triển Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ, tr.15-20 10. Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ, Trường ĐHSP Tp. HCM. 11. Nguyễn Đức Lượng (2004), Cơng nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr.27- 108 12. Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 1, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr.200-250 13. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. 14. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục 15. Phan Thị Bích Trâm (2005), Bài giảng Sinh hĩa, Khoa Nơng nghiệp, Đại học Cần Thơ, tr.10-19 16. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ, NXB Nơng Nghiệp, Tp. HCM, tr.9-30 17. Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr.84- 100 Tiếng Anh: 18. Abdel-Naby, M. A., El-Shayeb, N. M. A., & Sherief, A. A. (1992). Purification and some properties of chitinase fromAspergillus carneus. Applied biochemistry and biotechnology, 37(2), 141-154. 19. Abeles, F. B., Bosshart, R. P., Forrence, L. E., & Habig, W. H. (1971). Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves. Plant Physiology, 47(1), 129. 20. Baustista, V. V., & Dalmacio, I. F. (2003). Optimization of chitinase production by Serratia marcescens LPM42 (BIOTECH 1749) and its control of Rhizoctonia solani Kuhn under laboratory conditions. Philippine Agricultural Scientist (Philippines). 21. Bhushan, B. (2000). Production and characterization of a thermostable chitinase from a new alkalophilic Bacillus sp. BG 11. Journal of applied microbiology, 88(5), 800-808. 22. Bingxin, Z. Z. Z. M. Y. (1992). Studies on Chitinase Production by Marine Streptomyces. Journal of Xiamen University (Natural Science), 5. 23. Binod, P., Pusztahelyi, T., Nagy, V., Sandhya, C., Szakacs, G., Pocsi, I., et al. (2005). Production and purification of extracellular chitinases from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solid- state fermentation. Enzyme and microbial technology, 36(7), 880-887. 24. Chae, D. H., De Jin, R., Hwangbo, H., Kim, Y. W., Kim, Y. C., Park, R. D., et al. (2006). Control of late blight (Phytophthora capsici) in pepper plant with a compost containing multitude of chitinase-producing bacteria. BioControl, 51(3), 339-351. 25. Cruz, J., Hidalgo Gallego, A., Lora, J. M., Benitez, T., Pintor Toro, J. A., & Llobell, A. (1992). Isolation and characterization of three chitinases from Trichoderma harzianum. European Journal of Biochemistry, 206(3), 859-867. 26. Dahiya, N., Tewari, R., & Hoondal, G. S. (2006). Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Applied microbiology and biotechnology, 71(6), 773-782. 27. Dahiya, N., Tewari, R., Tiwari, R. P., & Hoondal, G. S. (2005). Production of an antifungal chitinase from Enterobacter sp. NRG4 and its application in protoplast production. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(8), 1611-1616. 28. El-Katatny, M. H., Gudelj, M., Robra, K. H., Elnaghy, M. A., & Gübitz, G. M. (2001). Characterization of a chitinase and an endo-ß-1, 3-glucanase from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii. Applied microbiology and biotechnology, 56(1), 137-143. 29. Escott, G. M., Hearn, V. M., & Adams, D. J. (1998). Inducible chitinolytic system of Aspergillus fumigatus. Microbiology, 144(6), 1575. 30. Felse, P. A., & Panda, T. (2000). Submerged culture production of chitinase by Trichoderma harzianum in stirred tank bioreactors-the influence of agitator speed. Biochemical engineering journal, 4(2), 115-120. 31. Fenice, M., Di Giambattista, R., Raetz, E., Leuba, J. L., & Federici, F. (1998). Repeated-batch and continuous production of chitinolytic enzymes by Penicillium janthinellum immobilised on chemically-modified macroporous cellulose. Journal of biotechnology, 62(2), 119-131. 32. Ghanem, K. M., Al-Fassi, F. A., & Farsi, R. M. (2011). Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from shrimp shellfish waste by Alternaria alternata. African Journal of Microbiology Research, 5(13), 1649-1659. 33. Ghanem, K. M., Al-Garni, S. M., & Al-Makishah, N. H. (2010). Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus. African Journal of Biotechnology, 9(32), 5135-5146. 34. Gkargkas, K., Mamma, D., Nedev, G., Topakas, E., Christakopoulos, P., Kekos, D., et al. (2004). Studies on a N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidase produced by Fusarium oxysporum F3 grown in solid-state fermentation. Process Biochemistry, 39(11), 1599-1605. 35. Gooday, G. W. (1995). The dynamics of hyphal growth. Mycological Research, 99(4), 385-394. 36. Gupta, R., Saxena, R. K., Chaturvedi, P., & Virdi, J. S. (1995). Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis. Journal of Applied Microbiology, 78(4), 378-383. 37. Hou, W. C., Chen, Y. C., & Lin, Y. H. (1998). Chitinase activity of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam var. Tainong 57). Botanical Bulletin of Academia Sinica, 39. 38. Kapat, A., Rakshit, S. K., & Panda, T. (1996). Optimization of carbon and nitrogen sources in the medium and environmental factors for enhanced production of chitinase by Trichoderma harzianum. Bioprocess and Biosystems Engineering, 15(1), 13-20. 39. Kawachi, I., Fujieda, T., Ujita, M., Ishii, Y., Yamagishi, K., Sato, H., et al. (2001). Purification and properties of extracellular chitinases from the parasitic fungus Isaria japonica. Journal of bioscience and bioengineering, 92(6), 544-549. 40. Koga, D. (2004). Application of chitinase to agriculture. Bioscience, 62(8), 529-530. 41. Kovacs, K., Szakacs, G., Pusztahelyi, T., & Pandey, A. (2004). Production of chitinolytic enzymes with Trichoderma longibrachiatum IMI 92027 in solid substrate fermentation. Applied biochemistry and biotechnology, 118(1), 189-204. 42. Kumari, J. A., & Panda, T. (1994). Intergeneric hybridization of Trichoderma reesei QM9414 and Saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion. Enzyme and microbial technology, 16(10), 870-882. 43. Lee, Y. G., Chung, K. C., Wi, S. G., Lee, J. C., & Bae, H. J. (2009). Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp. LYG 0704. Protein expression and purification, 65(2), 244-250. 44. Lee, Y. S., Park, I. H., Yoo, J. S., Chung, S. Y., Lee, Y. C., Cho, Y. S., et al. (2007). Cloning, purification, and characterization of chitinase from Bacillus sp. DAU101. Bioresource technology, 98(14), 2734-2741. 45. Liu, C. L., Shen, C. R., Hsu, F. F., Chen, J. K., Wu, P. T., Guo, S. H., et al. (2009). Isolation and identification of two novel SDS resistant secreted chitinases from Aeromonas schubertii. Biotechnology progress, 25(1), 124-131. 46. Lorito, M., Peterbauer, C., Hayes, C. K., & Harman, G. E. (1994). Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination. Microbiology, 140(3), 623. 47. Marco, J. L. D., Valadares-Inglis, M. C., & Felix, C. R. (2003). Production of hydrolytic enzymes by Trichoderma isolates with antagonistic activity against Crinipellis perniciosa, the causal agent of witches' broom of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology, 34(1), 33-38. 48. Maria, G. L., Sridhar, K. R., & Raviraja, N. S. (2005). Antimicrobial and enzyme activity of mangrove endophytic fungi of southwest coast of India. Journal of Agricultural Technology, 1, 67- 80. 49. Mauch, F., Mauch-Mani, B., & Boller, T. (1988). Antifungal hydrolases in pea tissue: II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and -1, 3-glucanase. Plant Physiology, 88(3), 936. 50. McCormack, J., Hackett, T. J., Tuohy, M. G., & Coughlan, M. P. (1991). Chitinase production byTalaromyces emersonii. Biotechnology letters, 13(9), 677-682. 51. Mtui, G., & Masalu, R. (2008). Extracellular enzymes from Brown-rot fungus Laetioporus sulphureus isolated from mangrove forests of Coastal Tanzania. Sci. Res. Essay, 3, 154-161. 52. Murao, S., Kawada, T., Itoh, H., Oyama, H., & Shin, T. (1992). Purification and characterization of a novel type of chitinase from Vibrio alginolyticus TK-22. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 56(2), 368-369. 53. Nampoothiri, K. M., Baiju, T. V., Sandhya, C., Sabu, A., Szakacs, G., & Pandey, A. (2004). Process optimization for antifungal chitinase production by Trichoderma harzianum. Process Biochemistry, 39(11), 1583-1590. 54. Nawani, N. N., & Kapadnis, B. P. (2005). Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs. Process Biochemistry, 40(2), 651-660. 55. Ordentlich, A., Elad, Y., & Chet, I. (1988). The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii. Phytopathology (USA). 56. Owhashi, M., Arita, H., & Hayai, N. (2000). Identification of a novel eosinophil chemotactic cytokine (ECF-L) as a chitinase family protein. Journal of Biological Chemistry, 275(2), 1279. 57. Patidar, P., Agrawal, D., Banerjee, T., & Patil, S. (2005). Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation. Process Biochemistry, 40(9), 2962-2967. 58. Pedraza-Reyes, M., & Lopez-Romero, E. (1989). Purification and some properties of two forms of chitinase from mycelial cells of Mucor rouxii. Journal of general microbiology, 135(1), 211. 59. Rattanakit, N., Plikomol, A., Yano, S., Wakayama, M., & Tachiki, T. (2002). Utilization of shrimp shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp. S1-13: Evaluation of a culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation. Journal of bioscience and bioengineering, 93(6), 550-556. 60. Rattanakit, N., Yano, S., Plikomol, A., Wakayama, M., & Tachiki, T. (2007). Purification of Aspergillus sp. S1-13 chitinases and their role in saccharification of chitin in mash of solid-state culture with shellfish waste. Journal of bioscience and bioengineering, 103(6), 535-541. 61. Rodriguez, J., Copa Patiđo, J. L., & Pérez Leblic, M. I. (1995). Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolysates. Letters in applied microbiology, 20(1), 46-49. 62. Samson, R. A., Hoekstra, E. S., & Frisvad, J. C. (2004). Introduction to food-and airborne fungi: Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). 63. Stoyachenko, I. A., Varlamov, V. P., & Davankov, V. A. (1994). Chitinases of Streptomyces kurssanovii: purification and some properties. Carbohydrate polymers, 24(1), 47-54. 64. Swiontek-Brzezinska, M., Lalke-Porczyk, E., & Donderski, W. (2007). Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons. Oceanological and Hydrobiological Studies, 36(3), 101-111. 65. Takahashi, M., Tsukiyama, T., & Suzuki, T. (1993). Purification and some properties of chitinase produced by Vibrio sp. Journal of fermentation and bioengineering, 75(6), 457-459. 66. Tao, Y., Long, Z., Xie, J., Jin, H., Ran, H., Tao, K., et al. (2005). Identification of a chitinase producing bacterium C4 and histopathologic study on locusts. Pest management science, 61(2), 159-165. 67. Vyas, P., & Deshpande, M. (1991). Enzymatic hydrolysis of chitin by Myrothecium verrucaria chitinase complex and its utilization to produce SCP. Journal of General and Applied Microbiology, 37(3), 267-275. 68. Wang, S. L., & Hwang, J. R. (2001). Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of chitinases. Enzyme and microbial technology, 28(4-5), 376-382. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE Bảng P.1. Đường chuẩn Glucosamine cĩ nồng độ từ 0 – 4 µmol/ml ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ Gucosamin (µmol/ml) 0 0.5 1,0 1.5 2 2,5 3,0 3,5 4,0 ODR535nm 0,121 0,198 0,342 0,477 0,610 0,767 0,956 1.094 1,174 ∆OD 0 0,077 0,221 0,356 0,489 0,646 0,835 0,973 1.053 Đồ thị P.1. Đưởng chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa ∆OD và HL Glucosamine y = 0.2806x-0,0447 R2 = 0.997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 1 2 3 4 5 hàm lượng Glucosamine (µmol/ml) ∆O D y Linear (y) PHỤ LỤC 2 – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD Bảng P.2. Đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thu (OD) ở bước sĩng 595nm Ống..nghiệm Hĩa chất 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ BSA (µg/ml) 0 5 10 20 30 40 50 ∆OD 0 0,0705 0,187 0,354 0,5095 0,654 0,7575 Đồ thị P.2. Đường chuẩn BSA thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thu (OD) ở bước sĩng 595nm y = 0.0026x + 0.0174 R2 = 0.9921 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (ug/ml) O D 5 95 n m PHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM pH đệm Thể tích (ml) V đệm 0,1M Citric 0.1M Na2HPO4 0.2M NaH2PO4 0.2M Glycin 0.2M NaOH 0,2M H20 3 39.4 10.2 50.4 100 3.5 33.9 16.1 50 100 4 30.7 19.3 50 100 4.5 26.7 23.3 50 100 5 24.3 25.7 50 100 5.5 21 30.3 50 100 6 12.3 87.7 100 200 6.5 31.5 68.5 100 200 7 61 39 100 200 7.5 84 16 100 200 8 94.7 5.3 100 200 8.5 50 4 146 200 9 50 12 138 200 9.5 50 22.4 127.6 200 PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH Hình P.4.1. Dịch huyền phù bào tử NS P. citrinum Hình P.4.2. Dịch enzyme thơ trước khi ly tâm của P. citrinum nuơi trong các MT khác nhau Hình P.4.3. Hiện màu thuốc thử DNS trên 1 ống thử khơng và 11 ống thử thật trong TN tối ưu hĩa MTNC NS P. citrinum (từ trái sang phải) Hình P.4.4. Hiện màu thuốc thử Bradford trên 1 ống đối chứng và 6 ống mẫu trong TN khảo sát nhiệt độ MTNC nấm A. protuberus (từ trái sang phải) PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU ._.