Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm

Chương I: Giới thiệu 1.1. Đặt vấn đề Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt Nam là rất cao. Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng. Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây ra. Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong. Hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm thường là do Salmonella, E.coli, Staphylococcus aureus và một số loài khác gây ra. Đặc biệt Staphylococcus aureus là 1 trong những vi sinh vật gây ngộ độc cao nhất. Ngoài ra Clostridium botulium và nấm mốc cũng là những loài gây ngộ độc thực phẩm cho con người. Chính vì vậy chúng ta cần phải tìm hiểu những yếu tố gây bệnh của các vi sinh vật này để có những cách phòng ngừa có hiệu quả hơn. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thục hiện bài khóa luận: “Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lậy nhiễm trên thực phẩm”. Nội dung bài khóa luận này sẽ đáp ứng cho ta một cái nhìn tổng quan về một số độc tố vi sinh vật gây bệnh trên thực phẩm, phương pháp xác định và các biện pháp phòng chống lây nhiễm vi sinh vật trên thực phẩm. 1.2. Mục đích Nghiên cứu về những độc tố vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và đi sâu tìm hiểu, tổng quan về một số loài thường xuyên gây nhiễm trong thực phẩm như: Clostridium botulinum và độc tố botulin, nấm mốc và các độc tố thường gặp của nấm mốc. Quan trong nhất là tìm hiểu tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất một số biện pháp phòng ngừa lây nhiễm vi sinh vật này trên thực phẩm. 1.3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, cấu tạo, di truyền, hoạt động sinh lí, hóa học… của 1 số nhóm vi sinh vật. Nghiên cứu các cơ chế gây độc, độc tính và của 1 số nhóm vi sinh vật gây bệnh cho người và động vật. Nghiên cứu về các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm. Chương II: Tổng quan 2.1. Một số độc tố vi sinh vật trong thực phẩm 2.1.1. Độc tố botulin 2.1.1.1. Giới thiệu về Clostridium botulinum Clostridium botulinum là trực khuẩn, kỵ khí bắt buộc. Clostridium botulinum tồn tại ở trong đất, nước thải, bùn, đầm lầy, hồ và các vùng nước ven biển, thực vật và trong hệ thống đường ruột của cá. Trái cây và rau quả có thể bị nhiễm độc từ đất, cá bị nhiễm độc từ nước. Ngoài ra, các thực phẩm khác nhau có thể bị nhiễm độc từ nhiều nguồn nhất định. Clostridium botulinum phát triển thuận lợi ở 26-280C, chúng tiết ra độc tố toxin botulinum, sinh khí hydro sulfur (H2S) và sinh hơi. Về đặc điểm nuôi cấy các tế bào này nhạy cảm và không phát triển với nồng độ pH thấp (<4,6), nồng độ muối cao trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Clostridium botulinum không thể sử dụng lactose như là một nguồn carbon chính. 2.1.1.2. Giới thiệu về độc tố botulin a. Cấu trúc Độc tố botulin được tổng hợp như là một chuỗi polypeptide duy nhất với trọng lượng phân tử 150000 dalton, ở cấu trúc này phần độc tố có hoạt lực tương đối thấp. Khi bị một số enzyme của vi khuẩn và trypsin tách ra thì độc tố này tạo thành 2 chuỗi nhẹ gồm 1 đầu chứa carboxyl (mảnh A) có trọng lượng phân tử là 50000 dalton và nặng gồm 1 đầu chứa amino (mảnh B) có trọng lượng phân tử là 100000 dalton được nối với nhau bằng cầu nối disulfur có gắn với 1 phân tử Zn. Các đoạn ở điểm cắt A của độc tố trên một trọng lượng phân tử cơ bản trở thành độc tố mạnh nhất trong tự nhiên. Hình 2.1: Cấu trúc của độc tố botulin b. Cơ chế độc tố botulin Tính gây bệnh của Clostridium botulinum phụ thuộc hoàn toàn vào việc sản xuất độc tố thần kinh. Các độc tố hoạt động trên dây thần kinh ngoại vi tiết ra acetylcholine để ngăn chặn sự phóng thích acetylcholine ở đoạn giao thần kinh cơ. Điều này ngăn cản cơ hoạt động bình thường và là nguyên nhân gây ra bệnh bại liệt. Hoạt động của độc tố khởi đầu bởi những cách sau: - Nhiễm độc sơ cấp: đây là kết quả của việc tiêu thụ các loại thực phẩm trong đó bị nhiễm các bào tử sản xuất ra các độc tố. - Sự truyền nhiễm sơ cấp đi theo sau bởi nhiễm độc: đây là kết quả từ việc uống thực phẩm có chứa bào tử Clostridium botulinum sản sinh, phát triển và sản xuất độc tố trong ruột. Sau khi ăn phải chất độc được sản xuất trong cơ thể, nó được hấp thụ bởi các phần trên của đường tiêu hóa. Từ đường tiêu hóa nó đi qua máu và hệ thống bạch huyết đến chỗ nối thần kinh cơ ngoại vi. Quá trình nhiễm độc thần kinh này gồm 4 bước: + Độc tố ràng buộc: tại miền ràng buộc của chuỗi nặng các chất độc thần kinh liên kết với các thụ thể protein và lipid gangliosides (một nhóm thuộc các chất glucolipid trong não, gan, lá lách và hồng cầu) trên màng tế bào thần kinh. + Tiếp thu độc tố: độc tố thần kinh được tiếp thu bằng năng lương phụ thuộc vào quá trình thâm nhập nội bào. Độc tố được đưa vào bên trong cơ quan nội bào là trung gian giữa các miền di dời của chuỗi nặng. + Sự di chuyển qua màng tế bào: chất độc thần kinh của chuỗi nhẹ di chuyển theo mạch máu ở cơ quan nội bào đến tế bào thông qua sự tăng giảm pH. Độ pH của cơ quan nội bào được chuỗi nhẹ cho phép di chuyển từng phần thông qua các kênh hình thành bởi chuỗi nặng. Những kênh này điều chỉnh sự chuyển động của chuỗi nhẹ vào trong tế bào chất. Ngoài ra, chuỗi nhẹ sẽ tách ra thông qua sự giảm bớt của mối nối disulphide, đây là liên kết duy nhất của 2 chuỗi. + Gây tắt nghẽn do sự giải phóng acetylcholine: chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh là 1 endoprotease chúng liên kết với các thụ thể N-ethylmaleimide nhạy cảm với các yếu tố thủy phân protein. Những protein này giải phóng các chất truyền thần kinh đặc biệt là acetylcholine. Enzyme thủy phân các protein độc tố ngăn cản sự hợp thành các túi tiết acetylcholine trên bề mặt bên trong của màng tế bào với các màng nơron trước khớp thần kinh (sinap). Điều này dẫn đến việc ức chế để giải phóng acetylcholine tại những khớp thần kinh tiết acetylcholine ngoại vi, đó cũng chính là mục đích hoạt động của độc tố botulin. Đầu tiên các dây thần kinh của não bị ảnh hưởng gây tê liệt sau đó đến các dây thần kinh vận động và các cơ bắp. 2.1.2. Độc tố nấm mốc 2.1.2.1. Giới thiệu chung về nấm mốc a. Hình thái Nấm mốc là vi sinh vật không có diệp lục tố nên không có khả năng tự tổng hợp các chất dinh dưỡng cho chính bản thân. Do đó, chúng chỉ phát triển trên nguồn dinh dưỡng có sẵn. Nấm mốc là loài vi sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh. Những sợi phân nhánh này phát triển thành từng đám, người ta gọi là khuẩn ty. Khuẩn ty khi phát triển trên môi trường đặc thường phân ra 2 loại: khuẩn ty ký sinh và khuẩn ty dinh dưỡng. Hai loại khuẩn ty này đóng vai trò và nhiệm vụ khác nhau, khuẩn ty dinh dưỡng có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng, khuẩn ty ký sinh có vai trò là sinh sản. mỗi sợi nấm thì phát triển thành những bộ phận khác nhau. Nấm mốc không di chuyển được vì không có cơ quan vận chuyển, nấm mốc chỉ phát triển trong điều kiện môi trường thoáng khí. So với vi khuẩn nấm mốc chịu được nhiệt độ và độ acid thấp hơn, đây là 1 trong những đặc điểm cơ bản cần thiết trong quá trình phân lập nấm mốc. Về màu sắc và hình thái khối lượng bào tử cũng có nhiều kiểu khác nhau. b. Cấu tạo Do cấu tạo đặc biệt, nấm mốc hoàn toàn khác với vi khuẩn và nấm men. Dựa vào cấu tạo người ta chia nấm mốc ra làm 2 loại: - Loại nấm mốc có vách ngăn: đây là trường hợp khuẩn ty tạo thành do 1 chuỗi tế bào nối tiếp nhau. Ngăn cách 2 tế bào là một màng ngăn. Tế bào nấm thường có đủ cơ quan của 1 tế bào, trong đó quan trọng là có nhân thường thấy ở Aspergillus và Penicillium - Loại nấm mốc không có vách ngăn: đây là những nấm mốc nhiều hạch, giữa các hạch không có màng ngăn, hầu hết các tế bào nấm không có lớp vỏ cellulose như ở thực vật mà có lớp vỏ kitin như ở lớp vỏ cứng của sâu bọ. Tế bào nấm rất giàu các hoạt tính sinh học và giàu kháng sinh nên đã được con người sử dụng nấm mốc sản xuất những sản phẩm phục vụ cho đời sống. Hình 2.2: Nấm mốc Aspergillus Hình 2.3: Penicillium chrysogenum c. Hình thức sinh sản +, Sinh sản sinh dưỡng Nấm mốc có thể sinh sản phát triển bằng khuẩn ty, trong lòng khuẩn ty có sự xuất hiện của một hay nhiều tế bào hình cầu, có màng dầy bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ. Gặp điều kiện thuận lợi thì các tế bào hình cầu này sẽ phát triển thành một sợi nấm mới. Nấm mốc còn có thể sinh sản bằng hạch nấm, đây là 1 khối hình tròn đều, bên trong là một tổ chức sợi xốp và thường có màu trắng. khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát triển bình thường. +, Sinh sản vô tính Đây là kiểu sinh sản chủ yếu bằng bào tử, các bào tử có thể được tạo thành từ những phương pháp sau: - Bào tử được tạo thành do sự cắt đoạn của các sợi nấm - Bào tử có thể được tạo thành từ tế bào sinh bào tử bằng cách nảy chồi - Bào tử được tạo thành bằng cách ngăn vách với tế bào ngay khi bào tử mới hình thành. Ngoài ra nấm mốc còn có thể sinh sản bằng hữu tính bằng cách sinh sản bằng bào tử tiếp hợp. 2.1.2.2. Giới thiệu về mycotoxin Có đến 30-40% số nấm mốc đã được phân loại để có thể sản sinh ra độc tố với liều lượng và độc tính khác nhau, nhiều loại nấm mốc khác nhau có thể sản sinh ra cùng một loại độc tố. Một loài nấm mốc có thể sản sinh ra các loại độc tố khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường và cơ chất. Các loại độc tố này được gọi chung là mycotoxin. Mycotoxin là các hợp chất trao đổi bậc 2 có độc tính và do một số vi nấm tổng hợp trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào trong các điều kiện xác định Mycotoxin là độc tố có khả năng gây độc cấp và mãn tính trên động vật và con người. Hội chứng độc do ăn phải mycotoxin được gọi chung là mycotoxicoses. Sự sinh trưởng của nấm mốc trên thực phẩm rất phổ biến ở khí hậu ấm và ẩm. có hàng trăm loại mycotoxin được sản sinh từ các giống Aspergillus, Penicillium và Fusarium Mycotoxin có thể được phân loại theo bản chất và cấu trúc hóa học, theo tác nhân tổng hợp mycotoxin hoặc theo bệnh lý do mycotoxin gây nên Những mycotoxin thường gặp trong chuỗi thực phẩm là: - Aflatoxin B1, B2, G1 và G2 - Ochratoxin A - Fumonisin B1, B2 và B3 - Patulin 2.1.2.3. Aflatoxin Có thể tìm thấy aflatoxin trong các loại thực phẩm khác nhau như: ngô, gạo, bánh mì và các loại hat chứa dầu. Aflatoxin là một sản phẩm trao đổi thứ cấp bậc hai trong quá trình phát triển của vi nấm, nó không phải là chất dự trữ và cũng không phải là chất cặn bã. a. Nguồn gốc Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc Aspergillus flavus, A.parasiticus, A.nomius. Loài Penicillium puberulum có thể sản sinh ra các aflatoxin nhưng với số lượng ít. Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sản sinh ra aflatoxin, chỉ có 71% các chủng là có khả năng sản sinh ra aflatoxin, trong đó 23% các chủng sản sinh aflatoxin ở mức cao nhất. Loài Aspergillus flavus có ở khắp mọi nơi: đất, các hợp chất hữu cơ, các loại hạt nhưng chủ yếu là các loại hạt có dầu. A. flavus thường gặp trên lúa mì, trên các phế phẩm bột sống và trong bánh mì. Ngoài ra, A. flavus còn được tìm thấy trên ngô, gạo, trên các sợi bông và hạt bông. A. flavus rất dễ nhận biết, A. flavus có các bào tử tương đối lớn màu vàng nâu đến hơi lục. Chủng này thích hợp phát triển trong điều kiện khí hậu ẩm và nóng, nhiệt độ thích hợp để sản sinh A. flavus là từ 250C-280C, ở nhiệt độ trên 450C A. flavus sẽ bị ức chế. Trong nuôi cấy độc tố aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất, sau đó là aflatoxin G1, tiếp sau là aflatoxin B2, độc tố aflatoxin G2 rất ít xuất hiện và ít nguy hiểm hơn. Aflatoxin B1 phát triển ở nhiệt độ 250C-280C còn aflatoxin G1 phát triển ở nhiệt độ 300C. b, Cấu trúc của aflatoxin Các aflatoxin B1, B2, G1, G2 đã được nghiên cứu và xác định cấu tạo hóa học. Công thức của aflatoxin B1 là C17H12O6, công thức của aflatoxin G1 là C17H12O7. Trong cấu trúc phân tử của 2 aflatoxin B1 và G1 có nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hydroxyl tự do. Aflatoxin B1 chứa 1 vòng lacton còn aflatoxin G1 chứa 2 vòng lacton. Sau đó, hai aflatoxin B2, G2 cũng được phát hiện. Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1 chỉ khác là nối đôi trong vòng hydrofuran đã bị khử. Công thức của aflatoxin B2 là C17H14O6, còn công thức của aflatoxin G2 là C17H14O7 Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của aflatoxin B1, B2, G1 và G2 Năm 1963 trong nghiên cứu chất độc ở sữa và thịt bò đã ăn phải thực phẩm có aflatoxin. Alicroft và Carnaghan đã nhận thấy trong 2 loại thực phẩm này có dẫn xuất của aflatoxin B1 và B2. Độc tố này được gọi là “độc tố sữa”, là các chất hydroxyl hóa của aflatoxin B1 và B2 tại vị trí 9a lần lượt được gọi là aflatoxin M1 và M2. Công thức nguyên của aflatoxin M1 là: C17H12O7, công thức nguyên của aflatoxin M2 là: C17H14O7. Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M1 Hình 2.6: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M2 c. Cơ chế gây độc của aflatoxin Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào, sự liên kết này gây ức chế enzyme polymerase của RNA làm hạn chế sự tổng hợp RNA và gây ức chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân làm giảm sự tổng hợp protein trong tế bào. Ngoài ra, vòng a-lacton, b-lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho chất này có hoạt tính gây ung thư, đồng thời vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào và làm rối loạn sự tăng trưởng bình thường của tế bào. Các quá trình gây độc của aflatoxin lên tế bào qua 5 giai đoạn: - Tác động qua lại với DNA ức chế các polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp DNA và RNA - Ngưng tổng hợp DNA - Giảm tổng hợp DNA và ức chế tổng hợp RNA truyền tin - Biến đổi hình thái nhân tế bào - Giảm tổng hợp protein. d. Độc tính của aflatoxin Độc tính của aflatoxin có hai loại đó là độc tính cấp và độc tính mãn - Độc tính cấp là sự ngộ độc cấp tính thể hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm trong những khoảng thời gian thay đổi tùy theo khả năng chịu đựng của từng loài. Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu ở phổi. gan dần mất màu còn thể tích thì tăng lên. Khi không có nối đôi ở vòng furan đầu thì độc tính giảm đi 4,5 lần. Như vậy B1 độc hơn B2 và G1 độc hơn G2. Và độc tính cũng giảm khi có hai vòng lacto (G1 và G2) do đó aflatoxin loại B độc hơn loại G. Độc tính của aflatoxin rất cao và làm tổn thương đến tế bào. - Độc tính mãn là những triệu chứng do nhiễm độc mãn tính. Biểu hiện đầu tiên là ăn kém ngon và chậm lớn, thậm chí xuống cân, gan là nơi chịu ảnh hưởng nặng nhất của chất độc. Ảnh hưởng về mặt hóa sinh lên tế bào đã có nhiều nghiên cứu về sự tác động của aflatoxin trên các acid nucleic và sự tổng hợp protein. 2.1.2.4. Ochratoxin Có thể tìm thấy ochratoxin trong lúa mì, ngô, lúa mạch, bột mì, gạo, hạt cà phê và các thức ăn gia súc hỗn hợp khác nhau. Các mẫu thực phẩm chứa ochratoxin A (OTA) như nho, ngũ cốc, cà phê. Sự nhiễm OTA phụ thuộc rất nhiều vào xuất xứ địa lý của nguyên liệu. a. Nguồn gốc Các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp ochratoxin chưa được xác định, nhưng một số nghiên cứu gần đây lại cho thấy các chủng nấm mốc có thể rất khác nhau trên các đối tượng khác nhau và thuộc vào giống nấm mốc phổ biến Aspergillus và Penicillium. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phát triển của nấm mốc sản sinh ra ochratoxin khác nhau và việc hình thành ochratoxin từ chúng phụ thuộc rất khác nhau về nhiệt độ, độ ẩm, hoạt động nước của sản phẩm và bản chất sản phẩm. Các chủng sinh ochratoxin khác nhau theo khu vực địa lý, khí hậu và bản chất của sản phẩm bi nhiễm. Các chủng tổng hợp ochratoxin cũng có thể tổng hợp đồng thời nhiều loại mycotoxin như acid penicillic hoặc citrinin. b. Cấu trúc của ochratoxin Cấu tạo hóa học thì ochratoxin A là hợp chất của izocumarin liên kết với 1 nhóm L-phenylalamin. Độc tính của achratoxin khác nhau liên quan tới việc nhóm hydroxyl phenol được tách ra khó hay dễ. Hình 2.7: Cấu trúc phân tử của ochratoxin A, B và C c. Cơ chế gây độc của ochratoxin Ochratoxin gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tRNA) và các axit amin. Ochratoxin còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine-tRNA ở gan. Sự ức chế cạnh tranh phenylalanine làm đảo lộn các axit amin còn dư, các phenylalanine dư cũng tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể. Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ức chế tế bào lympho. Hợp chất tương tự của OTA trong đó các phenylalalanine được thay thế bởi các axit amin khác có tác dụng ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza tRNA tương ứng cụ thể. 4P-hydroxyochratoxin A, 1 chất chuyển hóa của OTA cũng có những hoạt dộng tương tự trong khi a-ochratoxin và OTB không có những hoạt động này. Ochratoxin có thể hoạt động trên các enzyme khác như 1 chất nền phenylalanine. OTA gây ức chế hydroxylase phenylalanine, 1 nửa phenylalanine của OTA là 1 phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể. Ochratoxin ức chế sự tổng hợp RNA làm ảnh hưởng đến các protein trong vòng tuần hoàn, làm giảm mức độ hoạt động của phosphoenol pyruvate carboxykinase, 1 enzyme quan trọng trong sự hình thành gluoza trong động vật, ức chế này là do sự phân hủy của mRNA. Ochratoxin còn tác động đến các tế bào màng ty thể và gây ra các hiệu ứng khác nhau trên ti thể. Kích thích sự hình thành DNA trong thận, gan và lá lách. Các DNA này là các sợi đơn bị phá vỡ. d. Độc tính của ochratoxin Độc tính của ochratoxin A (OTA) là cao nhất. Đây là hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicabonat, hòa tan hạn chế trong nước. OTA là độc tố nấm mốc liên quan tới bệnh thận cấp tính của lợn, gây quái thai cho chuột và phôi gà. OTA còn gây chứng bệnh suy thận ở người. Những trường hợp gây ngộ độc OTA cấp tính có thể gây tử vong. Ngoài ra OTA còn bị nghi ngờ là chất có thể gây nhiễm độc thần kinh. Bên cạnh đó ochratoxin còn gây ra bệnh grout trên gia cầm. 2.1.2.5. Fumonisin Trong số các mycotoxin, mối quan tâm về fumonisin ngày càng cao. Fumonisin là độc tố mới phát hiện gần đây do Fusarium moniliforme tổng hợp nên. Đây là nhóm các mycotoxin có độc tính cao với động vật và người. Việc nhiễm fumonisin trong thức ăn cho người và gia súc ở quy mô trên toàn thế giới. a. Nguồn gốc Fumonisin chủ yếu do các nấm mốc thuộc giống Fusarium tổng hợp nên, loại điển hình nhất trong nhóm này là Fusarium moniliforme. Các chủng nấm mốc của loài này khá phổ biến trong môi trường và thường nhiễm vào lương thực đặc biệt là ngô. Các chủng khác thuộc Fusarium cũng tham gia tổng hợp nên độc tố này bao gồm: F. proliferatum, F. anthophilum, F. subglutinans, F. annulatum, F. succisae, F. beomiforme, F. diamini, F. napiforme và F. nygamai. F. moniliforme tổng hợp fumonisin B1 tối đa ở nhiệt độ 200C. Hàm lượng độc tố giảm mạnh khi nhiệt độ tăng lên 250C, 300C hoặc giảm xuống 150C, 100C. Tại 350C F. moniliforme phát triển mạnh nhất trên môi trường nuôi cấy phòng thí nghiệm và trên lương thực, tuy nhiên lượng fumonisin được tổng hợp là không nhiều. Trong điều kiện yếm khí, nấm mốc phát triển rất yếu và không có khả năng sinh độc tố. b. Cấu trúc phân tử của fumonisin Fumonisin là nhóm hợp chất dieste của acid tricacboxylic với các rượu bậc cao khác nhau, fumonisin chứa nhóm amin bậc nhất, tan trong nước và bền vững với nhiệt độ. Trong số các fumonisin, chỉ số fumonisin B1, B2 và B3 được phát hiện với một hàm lượng đáng kể trong tự nhiên. F. moniliforme không chỉ tổng hợp fumonisin B1 mà còn tổng hợp các dẫn xuất khác của độc tố này. Các dẫn xuất này chỉ khác nhau ở nhóm hydroxyl đính với nguyên tử carbon ở vị trí thứ 10 của mạch chính fumonisin B. Trong đó, các dẫn xuất B1, B2 và B3 của fumonisin là các độc tố phổ biến nhất trong tự nhiên. Hình 2.8: Cấu trúc các độc tố của fumonisin B1, B2, B3 c. Cơ chế gây độc của fumonisin Cấu trúc của fumonisin gần giống với cấu trúc của sphingosin, điều này cho phép giả định là fumonisin có thể ảnh hưởng tới trao đổi chất của sphingosin trong cơ thể. Sphingosin là các tiền chất của mọi sphingolipid, bao gồm sphingomyelin, ceramid và gangliosid. Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm các quá trình sinh tổng hợp mới, tích lũy các sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingolipid phức tạp, tăng cường phân giải các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các lipid và sphingosin. Các hiệu ứng này dẫn đến hàng loạt các phản ứng sinh hóa gây ra các sự nhiễm độc khác nhau. Các fumonisin có tính đặc hiệu tới sự tổng hợp các sphingosin, thể hiện ở sự ức chế serin. Không phát hiện các hiệu ứng tương tự của fumonisin đến sự tổng hợp các phosphatidylserin, phosphatidylcholin và các acid béo. Vị trí hoạt động của fumonisin là sphingosin và sphingosin N. transacetylase trong phản ứng kết hợp của thiolase với sphingosin và sphingosin để tạo thành dihydroceramid và ceramid. Do sự ức chế của fumonisin, số lượng tế bào gan giảm xuống 25% sau 24 giờ và 50% sau 4 ngày, các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận. Sự nhiễm fumonisin lâu dài ở nồng độ cao có thể gây ra các ảnh hưởng ở mức tế bào hoàn toàn khác với sự ảnh hưởng của sphingolipid. Do các tế bào não rất giàu sphingolipid nên các tổn thương thần kinh có thể do sự nhiễm độc fumonisin B1 gây nên. Hoạt tính gây ung thư của fumonisin B1 cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp sphingolipid gây nên vì các độc tố này kìm hãm các hoạt động của sphingosin thể hiện vai trò của tác nhân chống khối u nội bào. d. Độc tính của fumonisin Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất, fumonisin B1 có thể gây ra các triệu chứng nhũn não, suy gan, mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa, ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà và suy tim cấp ở khỉ. Fumonisin B1 được xếp vào nhóm 2B, nhóm các hợp chất gây ung thư cho người. Nghiên cứu ảnh hưởng fumonisin ở người, người ta thấy có sự liên quan đến bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng lương thực nhiễm fumonisin của các bệnh nhân. Ngoài ra fumonisin còn có những tác động đến cơ tim, độc tố này ngăn cản dòng ion canxi và gây ngưng trệ hoạt động của tim. Fumonisin thường được tổng hợp cùng với aflatoxin, do vậy độc tính của độc tố này còn có thể cao hơn nữa. Cho đến nay tương tác của các độc tố này vẫn chưa được biết rõ. 2.1.2.6. Patulin a. Nguồn gốc Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do nấm mốc Penicillium, Aspergillus và Byssochlamys tạo nên. Các chủng tổng hợp patulin chủ yếu là các loài thuộc Aspergillus như A. clavatus và A. giganteus. Trong số các Penicillium thì loài tổng hợp patulin nhiều nhất là P. expansum, P. urticae, P.griseofulvum, các loài nấm mốc này thường gặp trong đất, trên bề mặt của một số loài hoa quả như táo… Tùy thuộc vào khí hậu các hệ vi sinh vật này có thể bị thay đổi. Đặc biệt là A. clavatus thường ưa thích môi trường có hàm lượng đạm cao, trên các chất đang thối rữa. Vì vậy rất hay gặp A. clavatus ở các trại chăn nuôi, trên phân gia súc, gia cầm. b. Cấu trúc phân tử của patulin Patulin hay còn gọi là clavaxin là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của nấm mốc được biết tới trước tiên như là một loại thuốc có thể chữa bệnh cảm lạnh. Trong quá trình sử dụng người ta mới nhận biết độc tính của nó. Nó là hợp chất vòng lacton không no hoạt động với công thức hóa học 4-hydroxy-4-furo [3,2] pyran-2(6H)-1. Patulin là hợp chất không màu, kết tinh được, tan trong nước và các dung môi phân cực. Patulin có thể được tổng hợp trên rất nhiều nông sản thực phẩm cũng như trên thức ăn gia súc. Người ta đã phân lập được patulin trên ngũ cốc, trên các sản phẩm dạng hạt, trên hoa quả. Thực phẩm có khả năng nhiễm patulin cao nhất là táo và các sản phẩm từ táo. Hình 2.9: Cấu trúc phân tử của patulin c. Cơ chế gây độc của patulin Patulin là một độc tố gây tổn hại cho DNA hoặc các NST trong 1 thời gian ngắn. Ngoài ra, patulin còn ngăn cản sự hô hấp hiếu khí, làm giảm sự hoạt động của triphosphatase adenosine. Patulin kích thích các sợi DNA gây vỡ các tế bào Hela và làm NST bị sai lệch dẫn đến DNA, protein và sự tổng hợp RNA đều bị ảnh hưởng. Nghiên cứu cơ chế của các tế bào liên kết với độc tính đường ruôt của patulin, người ta nhân thấy 2 tế bào biểu mô ruột ở người (HT-29-D4 và CaCO-2-14) đã tiếp xúc với mycotoxin, dẫn đến các chịu trứng viêm ruột do patulin gây ra. d. Độc tính của patulin Patulin ảnh hưởng đến hoạt động của một số enzym như ATPase, alkaline phosphatase, aldolase, hexokinase, đồng thời kích hoạt enzym glycogen phosphorylase làm cho nồng độ glucose trong máu tăng 60%. Patulin ức chế sự tổng hợp của các protein, được coi là chất độc có khả năng gây ung thư cho người. Hoạt tính suy giảm miễn dịch của patulin củng đã được phát hiện. Patulin có liên quan tới các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột. 2.2. Tổng quan về Staphylococcus aureus 2.2.1. Lịch sử phát hiện Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt Năm 1880 Louis Paster cũng đã thực hiên tiến hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm, đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S.aureus sau này Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi khuẩn này. Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus aureus Năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi. 2.2.2. Phân loại 2.2.2.1. Phân loại khoa học Về phân loại khoa học Staphylococcus aureus được xếp vào: Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Staphylococcaceae Giống: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus Tên khoa học là: Staphylococcus aureus Rosenbach 1884 2.2.2.2. Phân loại theo kháng nguyên Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic của vách. Nhưng dựa vào kháng nguyên thì việc định loại rất khó khăn. Dưới đây là một số kháng nguyên trên bề mặt tế bào được quan tâm nghiên cứu: - Acid teichoic: là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác dụng hoạt hóa bổ thể. Đây còn là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này gắn vào polysaccharide vách tụ cầu vàng. Đây là thành phần đặc hiệu của kháng nguyên O. - Protein A: là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng. Tất cà các chủng tụ cầu vàng có protein này. Sở dĩ kháng nguyên này mang tên protein A, vì protein này gắn được phần Fc của IgG. Điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu là mất đi sự opsonin hóa (opsonisation), nên làm giảm thực bào. - Vỏ và biofilm: vỏ cấu tạo bởi polysaccharide có ít nhất 11 serotyre. Trong đó các serotyre 1, 2, 5, 8 đã được nghiên cứu về cấu trúc phân tử. Gây bệnh cho người thường là những chủng tụ cầu vàng có vỏ mỏng và thường là serotyre 5 hoặc 8. Chỉ một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát được bằng phương pháp nhuộn vỏ. Lớp vỏ này bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên và có thể chứng minh được bằng phương pháp huyết thanh học. Biofilm là những lớp mỏng, sền sệt và nhờn do S. aureus tiết ra và bao bên ngoài tế bào vi khuẩn. Nó có tác dung cho S. aureus bám và xâm nhập vào niêm mạc. - Kháng nguyên adherin (yếu tố bám): giống như nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc hiệu, có tác dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào. Adherin có thể là các protein: laminin, fibronectin, collagen. 2.2.2.3. Phân loại bằng phage (phage typing) Các phương pháp phân loại dựa trên kháng nguyên của tụ cầu là rất khó khăn, vì vậy việc phân loại tụ cầu vàng chủ yếu dựa trên phage. Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính đặc hiệu rất cao. Do vậy phương pháp này rất có ý nghĩa trong phân loại vi khuẩn Căn cứ vào sự nhạy cảm của phag, người ta chia tụ cầu thành typ phag. Những bộ phage cho phép xếp loại phần lớn các chủng tụ cầu thành bốn nhóm phag chính. Định typ phage tụ cầu để xác định các nhóm tụ cầu khác nhau. 2.2.3. Hình thái Staphylococcus aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, gram (+), đường kính 0,8 – 1mm và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường thường họp lại từng đôi một hay tạo thành những đám nhỏ. Vi khuẩn này không di động, không có lông, không sinh nha bào và thường không có vỏ. Hình 2.10: Hình thái đặc trưng của Staphylococcus aureus 2.2.4. Đặc điểm 2.2.4.1. Tính chất nuôi cấy Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Phát triển được ở nhiệt độ 10 - 450C, mọc tốt ở 370C nhưng tạo sắc tố tốt ở 200C Ở môi trường canh thang thì sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh, đường kính khoảng 1 - 2 mm, có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra năm loại dung huyết tố (hemolysin): a, b, g, d, e. 2.2.4.2. Tính chất sinh hóa Tụ cầu có hệ thống enzyme phong phú, những enzyme được dùng trong chuẩn đoán là: - Coagulase có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác. Coagulase có ở tất cả các chủng tụ cầu vàng. - Coagulase có 2 loại: một loại tiết ra môi trường (coagulase tự do), một loại bám vào vách tế bào (coagulase cố định). - Catalase dương tính. Enzyme này thủy phân H2O2, catalase có ở tất cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu. - Lên men đường mannitol. - Desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. 2.2.4.3. Khả năng đề kháng Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 800C trong một giờ. Có thể sống ở môi trường có nồng độ NaCl cao (9%) Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà vi khuẩn có thể phát triển. tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường Nhạy cảm thay đổi với kháng sinh, nhiều chủng đề kháng sinh với penicillin và các._.