Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis

thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới môi trường. II. Lý do chọn đề tài Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng rộng rãi ở qui mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả năng sinh tổng hợp các enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những vi sinh vật khác. Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào từ Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy sản xuất ở qui mô công nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế quốc dân. III. Mục đích của đề tài Để tìm hiểu về một số vấn đề như: Tổng quan về enzyme ngoại bào của vi sinh vật. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis. Các điều kiện hoạt động của enzyme ngoại bào và quá trình sinh tổng hợp các enzyme này ở vi sinh vật. Qui trình tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis. Khả năng ứng dụng chúng vào đời sống cũng như sản xuất ở qui mô công nghiệp. Đó là những cơ sở và tính cấp thiết mà tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”. IV. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn Bacillus subtilis. Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan về enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis. V. Phương pháp nghiên cứu Đọc tài liệu tham khảo các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi khuẩn Bacillus subtilis. Tổng hợp, phân tích các công trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học về vi khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải quyết các mục đích đề ra. Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT 1.1. Khái niệm enzyme ngoại bào 1.1.1. Định nghĩa Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Vì thực tế bên ngoài môi trường xung quanh, các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.1.2. Phân loại Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ: Nhóm 1: Oxydroreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. Nhóm 2: Transpherase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi. Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. Nhóm 6: Lygase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác. Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H α-amylase Ví dụ: Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và pectinase… 1.1.3. Đặc điểm - tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa: Về bản chất enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có phân tử lượng lớn từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do phân tử lượng lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào . Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Kiềm Acid Protein -COOH Protein -COO- + H+ Acid Kiềm Protein -NH2 Protein -NH+ + H+ Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate. Lượng nước hydrate hóa khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hóa. Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110oC như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1… Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+. Là những enzyme chuyên biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu với cơ chất. Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui luật cảm ứng cơ chất. Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất. Muốn sử dụng được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích thước nhỏ hơn để có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế bào. Như vậy, khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng. Là những enzyme cảm ứng với cơ chất nên quá trình tổng hợp enzyme rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ. Cơ chất cảm ứng thường được coi là yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra. Như vậy, muốn điều khiển và kiểm soát quá trình này cần phải chú ý hai điểm: Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nào đó thì phải cho cơ chất mà enzyme đó có thể phân hủy vào môi trường, ví dụ: sinh tổng hợp amylase thì bổ sung vào môi trường tinh bột; protease thì bổ sung protein; pectinase thì bổ sung pectin và cellulase thì bổ sung cellulose… Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều lượng nhất định nào đó. Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm. Do đó, không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao. Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra ở ngoài tế bào. Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam. Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam. Acid Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose Saccharase Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam. Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa. Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng. Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme. Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứng. Có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, trên môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất. 1.2. Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp. 1.2.1. Enzyme amylase Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho phản ứng phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: Amylase Phương trình phản ứng: R.R.’ + H – OH OH – RH + R’OH Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội phân) và exoamylase (enzyme ngoại phân). Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay γ-amylase). Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. 1.2.1.1. Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan glucanhydrolase) α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), acid glutamic (Glu) và acid aspartic (Asp). Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: α-amylase có ít methionine (Met) và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine (Cys). Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống nhau. Trọng lượng phân tử của α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng 45.000 - 60.000 Da, trong khi α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 - 100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher và Stein, 1960). α-amylase có chứa các nhóm -COOH và NH3 trong trung tâm hoạt động. α-amylase kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 25 - 30%, α-amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và tan trong ethanol loãng nhưng kết tủa ở ethanol 60%. Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951). Giá trị pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường là ở vùng acid yếu, giữa 4,8 và 6,9. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ, chẳng hạn như α-amylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu là 3,5 còn của enzyme từ Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60 -70oC, nhưng cũng có thể tới 80 - 90oC đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt. α-amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Trong mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca2+ còn có vai trò duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Theo Wallerstein (1969), các ion Ca2+ có tác dụng ổn định hoạt tính của α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp. Với nồng độ ion Ca2+ 0,1 nguyên tử gam/lít sẽ có tác dụng làm giảm hằng số vận tốc vô hoạt K của malt đại mạch xuống 1500 lần trong điều kiện pH 4,0; còn đối với nấm mốc hằng số này chỉ giảm 13 lần. Khi nồng độ tăng quá 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm rõ rệt. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Người ta cho rằng đặc tính này của α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca2+ trong phân tử (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca2+ hơn nấm mốc khoảng 3 - 4 lần nên nó bền nhiệt hơn). Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ và các ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase theo thứ tự Cl - < Br - < F - < I -. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+ và Sn2+ không ảnh hưởng lắm đến α-amylase. Hình 1.1. Cấu trúc không gian của α-amylase Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn: Giai đoạn dextrin hóa Giai đoạn đường hóa Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen Maltotetrose, maltotriose và maltose Hình 1.2. Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1). Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm nhanh độ nhớt của tinh bột. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase: α-amylase Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra Trimaltose Di & monosaccharide Amylose Oligosacharide Poliglucose Maltose Maltotriose Maltotetrose 1.2.1.2. Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4 glucan-maltohydrolase) Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng. Nhiều nhà khoa học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt động của β-amylase. Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C1 của glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal. Ester này tiếp đó sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải phóng ra β-maltose và nhóm carboxyl của enzyme lại được phục hồi. Phân tử β-amylase chỉ gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 60.000 Da. Enzyme β-amylase có pH hoạt động tối ưu giữa 5 và 6, β-amylase khá bền trong môi trường acid ở pH = 3 - 4, nhiệt độ tố ưu là 50 - 65oC. β-amylase bị bất hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ ở nhiệt độ 70oC. Thường β-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn β-amylase có nguồn gốc từ thực vật. β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên vẹn, chỉ tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca+2. Hình 1.3. Cấu trúc không gian của β-amylase Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase là một enzyme đường hóa, phân cắt được các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử amylose cũng như trong amylopectin, bắt đầu từ bên ngoài đầu không khử giải phóng maltose dưới dạng β. Tác dụng của enzyme này sẽ bị dừng lại khi gặp liên kết α-1,6. Enzyme β-amylase thủy phân hoàn toàn amylose, ngược lại nó chỉ thủy phân được 54 - 58% amylopectin thành β-amylose. Phần amylopectin còn lại là một β-dextrin giới hạn có khối lượng phân tử cao và có chứa toàn bộ các liên kết α-1,6 của phân tử ban đầu. Quá trình này xảy ra ở phần thẳng của mạch và dừng lại ở vị trí phân nhánh. Enzyme β-amylase có thể thủy phân lần lượt nhiều liên kết glucoside của cùng một chuỗi trước khi được giải phóng trở lại vào môi trường. Số lần tác dụng trên một chuỗi α-glucan phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi, thường là 4 lần đối với chuỗi ngắn và nhiều lần đối với chuỗi dài. Theo phương pháp sản xuất truyền thống β-amylase được thu nhận từ malt, tuy nhiên ở các nước phương Đông nó có thể được thu nhận từ đậu tương hoặc khoai lang. Các loại thực vật nói trên không chỉ chứa β-amylase mà còn chứa cả α-amylase. Điều kiện thích hợp của β-amylase malt đại mạch là 60 - 65oC, pH 5,4 - 5,6 (trong dung dịch tinh bột). Vùng pH thích hợp cho β-amylase hoạt động hẹp hơn so với α-amylase. Trước đây, β-amylase được coi là nguồn enzyme chỉ có trong hệ thực vật. Ngày nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra loại enzyme này và ứng dụng vào sản xuất. Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp β-amylase là Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces sp. và Pseudomonas. Đặc biệt là Bacillus cereus và mycoides có thể đồng thời tạo ra cả pullulanase. 1.2.1.3. Đặc tính và cơ chế xúc tác của glucoamylase (α-1,4 glucan-glucohydrolase) Cũng giống như các enzyme khác, glucoamylase từ các nguồn gốc khác nhau có những đặc tính, cấu tạo và tính chất khác nhau. Khối lượng phân tử của chúng thường nằm giữa 27.000 và 112.000 Da. Nói chung khối lượng phân tử glucoamylase của nấm mốc lớn hơn so với nấm mem. Theo Pazur (1959) khối lượng phân tử của glucoamylase từ Aspergillus awamori là 62.000 Da. Trong khi đó khối lượng phân tử của glucoamylase từ Endomycopsis sp. 20-9 là 53.000 Da (Gratrova và Sadova, 1959) và từ Endomycopsis sp. IFO.011 là 55.000 Da. Trong cấu tạo phân tử của các glucoamylase đều chứa gốc Met, Trp và một nửa gốc Cys trong trung tâm hoạt động. Các glucoamylase của nấm mốc là những glucoprotein chứa từ 5 đến 20% glucid cao phân tử của glucose, manose và glucosamin. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ Aspergillus niger là 6,5; từ Aspergillus awamori là 7,5; Rhizopus delemar là 7,4; Endomyces sp.IFO.0111 là 4,8 - 5,5. Hình 1.4. Cấu trúc không gian của glucoamylase Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Vì thế, các nhà nghiên cứu Nhật Bản (Ono và cộng sự, 1961) đề nghị đặt một tên phân loại khác cho nó là α-1,4:1,6 glucan-4:6-glucohydrolase. Nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ đề nghị này (Dobrolinxkai, 1965; Fenikxova và Ruza-kova, 1976). Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katitara và Kurushima, 1966). Sau đó nó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae rồi ở các nhóm vi sinh vật khác. Enzyme này còn có nhiều tên gọi khác nhau như: amyloglucosidase, taka-amylase Bac, g-amylse, matulase,… Glucoamylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside (Sawasaki 1960; Ueyama và cộng sự, 1965; Watanabe và Fukimbara, 1965, 1966). Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose thành glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov và Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia và Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978). Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh như amylopectin, glucogen, b-dextrin) bị glucoamylase thủy phân với tốc độ khá nhanh. Khi thủy phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các cơ chất phân tử thấp. Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”. Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 - 5,5; nhiệt độ tối ưu là 40 - 60oC. So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid và khi có mặt các oligosaccharide trong môi trường sẽ làm cho enzyme bền hơn, nhưng kém bền dưới tác dụng của rượu ethylic, aceton và không được bảo vệ khi có mặt Ca2+ mà sẽ bị Ca2+ ức chế enzyme và làm cho enzyme dễ dàng biến tính. Glucoamylase thường tồn tại ở 2 hoặc 3 dạng đồng phân, trong đó đồng phân AM-1 (HM), AM-2 (LM) có phân tử lượng tương ứng là 82.000 và 70.000 Da. Dạng đồng phân HM cắt mạch nhánh mạnh hơn dạng LM. Cơ chế tác dụng của glucoamylase cũng như cơ chế tác dụng của enzyme amylase khác. Việc phân cắt liên kết glucoside được tiến hành thông qua việc tạo thành một hợp chất Oxycacbonium trung gian, tiếp theo là sự nghịch đảo cấu hình của carbon C1 của phân tử glucose được giải phóng ra. Các nhóm Tyr, Trp, Histidine (His) và amin có vai trò gắn cơ chất vào, còn các nhóm -COOH và COO- thì tham gia vào quá trình xúc tác hóa học. Việc thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 một cách không phân biệt của enzyme là do các nhóm thực hiện việc gắn cơ chất không phải do các nhóm tham gia vào quá trình xúc tác hóa học. Khi nghiên cứu các cơ chế của quá trình thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Barker và cộng sự (1957) thấy rằng quá thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế đa mạch. Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme glucoamylase như sau: Glucoamylase kiểu Rhizopus delemar Tinh bột hay oligosaccharide 100% glucose (có liên kết α-1,4 và α-1,6 ) Glucoamylase kiểu Aspergillus niger khác nhau oligosaccharide Tinh bột hay 80 - 85% glucose + Oligosaccharide 1.2.1.4. Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase) Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen, pululan và các dextrin. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme. Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên kết này. Do đó pullulan chính là cơ chất lý tưởng của pullulanase, vì nó là một phân tử không phân nhánh cấu tạo bởi những đơn vị maltotriose (có hai liên kết α-1,4) liên kết với nhau bằng cầu nối α-,6 glucoside. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-amylase và pullulanase làm dextrin này bị thủy phân hoàn toàn. Pullulanase có pH tối ưu là 5 - 7, nhiệt độ tối ưu là 10 – 50oC. Ion Ca2+ hoạt hóa các enzyme này, trong khi đó các ion Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+ và Co2+ lại có tác dụng kìm hãm. Hình 1.5. Cấu trúc không gian của enzyme pullulanase 1.2.1.5. Đặc tính và cơ chế xúc tác của oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi sinh vật đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy mầm). Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme và dextrin-1,6-glucoside hay amylo-1,6-glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase. Hai loại enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các dextrinase là 40oC và pH tối ưu là 5,1. Theo số liệu của Kirxanov và Pankratov (1969), hoạt tính của enzyme này từ Rhizopus delemar được bảo vệ ở điều kiện nhiệt độ 30oC; pH 5,0 - 6,0 sau 96 giờ. Cũng ở pH này hoạt tính của enzyme này sẽ giảm 15% khi tăng nhiệt độ lên tới 50oC sau 2 giờ. Hình 1.6. Cấu trúc không gian của oligo-1,6-glucosidase 1.2.1.6. Đặc tính và cơ chế xúc tác của transglucosidase Ở nhiều loài nấm sợi Aspergillus, enzyme transglucosidase luôn luôn tương tác với glucoamylase. Transglucosidase có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân. Vì thế sự có mặt của transglucosidase trong dung dịch thường gây nên sự nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase thực hiện việc chuyển gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và oligosaccharide, xúc tác tạo thành liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside. Pazur (1961) đã tách được enzyme này từ Aspergillus niger bằng phương pháp sắc ký hấp phụ trên DEAE - cellulose và cho biết cơ chế tác dụng của nó. Transglucosidase không những chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose; tức là có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α-1,6 để tạo thành panose hoặc izomaltose. Rodzevit và Butova (1965) đã tìm thấy trong canh trường nuôi cấy nấm sợi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và Aspergillus awamori có enzyme transglucosidase, đồng thời cho biết enzyme này xúc tác sự tổng hợp các oligosaccharide với các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose. Các tác giả cho rằng, trong các vi sinh vật trên có hai hệ enzyme transglucosidase. Một hệ tổng hợp các sản phẩm có liên kết α-1,4 glucoside kiểu maltose và chuyển các gốc glucose từ maltose tới vị trí C4 của gốc glucose cuối: n-maltose-(1,4-α-glucose)n + n-glucose. Một hệ chuyển các gốc glucose có vị trí C6 khi tổng hợp các kiểu sản phẩm isomaltose: n-maltose-(1,6-glucose)n + n-glucose. Hệ thứ nhất bền ở pH 8,5 còn hệ thứ hai thì bất hoạt hoàn toàn ở pH này trong 2 giờ. Còn ở pH 3,3 trong thời gian 1 giờ thì hoạt tính transglucosidase của cả hai hệ đều không thay đổi. Transglucosidase của nấm sợi bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 1,9 - 2,0 sau 24 giờ. Ở các chủng nấm sợi khác nhau thì có khác biệt về hoạt tính transglucosidase (Buger, 1956), các loài Rhizopus có ưu thế hơn các loài Aspergillus là không tạo transglucosidase. Sự có mặt của transglucosidase trong các chế phẩm amylase (dùng trong công nghiệp._. sản xuất mật tinh bột, đường glucose và công nghiệp sản xuất rượu...) là điều không mong muốn. Glucoamylase xúc tác sự thủy phân tinh bột, còn transglucosidase lại tổng hợp các isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân này, do đó làm giảm mức độ thủy phân sâu sắc tinh bột và làm cho dịch thủy phân có vị đắng. Hình 1.7. Quá trình thủy phân tinh bột dưới sự xúc tác của một số loại enzyme amylase 1.2.2. Enzyme protease Nhóm enzyme protease (peptide - hydrolase E.C.3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Hình 1.8. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân protein Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (virus, vi khuẩn và nấm) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Hình 1.9. Cấu trúc không gian của enzyme protease 1.2.2.1. Phân loại và đặc tính của protease vi sinh vật Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Căn cứ vào cơ chế phản ứng, dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động, pH hoạt động thích hợp… các nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau: Protease serine: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động. Các protease serine thường hoạt động ở pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng. Tính đặc hiệu thể hiện về phía gốc amino acid chứa nhóm (-CO-) của liên kết peptide bị thủy phân. Nhóm (-OH) này có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Trong nhóm này có enzyme subtilisin là enzyme protease kiềm quan trọng nhất và ứng dụng nhiều nhất trong các ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa. Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của amino acid cystein trong trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động xúc tác của enzyme, vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học như: acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa… Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt khác nhau như tạo thành phức trung gian enzyme - cơ chất, kết hợp giữa cơ chất và cofactor… Các protease thiol thường hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng; chỉ hoạt động khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao vây. Do đó, các chất như Cys, acid ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này. Một số ion kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân và các chất khác như iodoacetamid có tác dụng ức chế enzyme protease thiol và các chất như: iodine, H2O2, EDTA… cũng có tác dụng ức chế enzyme này vì chúng có khả năng gắn với ion kim loại nên thường làm tăng độ bền của ion kim loại. Protease thiol thường là protease của thực vật như papain, bromeline… Protease acid: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động. Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Asp hoặc Glu hay cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptide. Các protease acid thường hoạt động ở vùng pH acid, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và và có tính đặc hiệu đối với các amino acid có vòng thơm hoặc kỵ nước ở hai phía của liên kết peptide bị thủy phân. Protease acid là các enzyme và của vi nấm như renin (renet)… Protease kim loại (metalloprotease): là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại. Các protease kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc amino acid chứa nhóm (-NH2-) của liên kết peptide; chúng có thể tác dụng lên các peptide chứa nhóm (-NH-) của các amino acid kỵ nước có kích thước hoặc các liên kết peptide được tạo thành từ các amino acid có phân tử thấp. Các protease kim loại thường bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA… Protease kim loại carboxylpeptidase A, collagenase và thermolysin… Ngoài ra, protease còn được chia thành 3 nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: Protease acid: hoạt động được ở pH < 3. Protease trung tính: là một metalloenzyme (enzyme cơ kim), chúng có pH hoạt động 6 - 7. Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động từ 9 - 10, trong trung tâm hoạt động có serine. Trong 4 nhóm kể trên, các protease serine và protease thiol có khả năng phân giải các liên kết ester và amide của cả các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại và protease acid thì thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với dẫn xuất của amino acid. Các protease serine có trọng lượng phân tử khoảng 20.000 - 27.000 Da, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease serine khoảng 33.800 - 48.400 Da. Protease thiol và nhiều protease acid cũng có phân tử lượng khoảng 30.000 - 40.000 Da. Protease của vi sinh vật gồm protease ngoại bào và protease nội bào. Mỗi loại có các chức năng khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật như sau: Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật có thể dễ dàng hấp thụ. Một số dẫn liệu cho thấy các đột biến vi sinh vật mất khả năng tiết ra protease ngoại bào không thể sử dụng nguồn protein làm nguồn đạm dinh dưỡng. Trong quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá trình tổng hợp chúng ở nhiều vi khuẩn bị giảm khi trong môi trường chứa một lượng lớn amino acid. Protease nội bào: có thể ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết với ribosome, mặt trong của màng tế bào và chỉ tìm thấy ở môi trường xung quanh sau khi tế bào bị phá vỡ. Cho đến nay, các protease nội bào đang tiếp tục được nghiên cứu và chưa biết rõ hết vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroshi (1976), protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào. Chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau: Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc dùng làm nguồn C, S, N,… giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi của môi trường. Sự phân giải các peptide phân tử lượng thấp còn có vai trò loại trừ tác dụng độc hại của nó đối với tế bào vì một số peptide phân tử lượng thấp có thể là kháng nguyên gây kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật. Các protease nội bào có thể tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein và enzyme. Điều này có ý nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào còn có tác dụng phân hủy protein vô dụng, tổng hợp sai do đột biến hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vách tế bào… 1.2.2.2. Cơ chế xúc tác của protease vi sinh vật a) Cơ chất tác dụng Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein, chúng phân giải các liên kết peptide và sản phẩm tạo thành cuối cùng là các acid amin. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng và đậu tương… Bảng 1.1. Một số nguồn thực phẩm giàu protein Nguồn protein Hàm lượng (%) Nguồn protein Hàm lượng (%) Thịt bò 20 Thịt gà 23,3 Thịt lợn 29 Cá 16 - 17 Đậu tương 34 Trứng gà 12 (tổng hợp từ nguồn internet) b) Cơ chế tác dụng Trong trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật, ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác tham gia. Ví dụ: histidine thường tham gia và cấu tạo trung tâm hoạt động của các protease có serine và protease có nhóm -SH; tyrosine là trung tâm hoạt động của các protease có kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S* + P1 E + P2 Trong đó: E: enzyme. S: cơ chất (substance). E – S: phức chất enzyme - cơ chất. E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme). P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới được tạo thành). P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do được tạo thành). 1.2.3. Enzyme pectinase Enzyme pectinase là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân các polymer pectin thành các hợp phần khác nhau như: galacturonic, arabinose, methanol... Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này có vai trò rất quan trọng trong việc bảo quản trái cây và rau quả. Enzyme pectinase còn được ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm. 1.2.3.1. Đặc điểm và tính chất của pectinase vi sinh vật Trong hệ enzyme pectinase phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzyme khác nhau, chúng có khối lượng phân tử khoảng 40.400 Da. Pectinase cũng như các enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc tác đặc hiệu cơ chất cao. Các enzyme trong phức hệ enzyme pectinase thường có cấu trúc phức tạp, và để đảm bảo hoạt tính xúc tác chúng phải có cấc trúc bậc IV. Trong cấu trúc bậc IV hình thành nên trung tâm hoạt động của enzyme pectinase chứa một vùng 8 - 10 vòng xoắn kép. Người ta nhận thấy rằng trung tâm hoạt động chứa 2 amino acid là aspartate và lysine. Hình 1.10. Cấu trúc không gian của pectinase 1.2.3.2. Phân loại và cơ chế xúc tác của pectinase ngoại bào Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia hệ enzyme này thành các loại sau: a) Pectinesterase (pectin pectylhydrolase) Pectinesterase là các enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin hoặc acid pectinic, kết quả là tạo ra acid pectinic và methanol. Khi toàn bộ các nhóm methoxyl đều bị tách khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là methanol và polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra ở liên kết ester liền kề với nhóm -COOH tự do. Hình 1.11. Sơ đồ tác dụng pectinesterase lên hợp chất pectin Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau thì có pH tối ưu khác nhau. Pectinesterase của vi sinh vật có pH tối ưu từ 4,5 - 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase có pH tối ưu từ 2,0 - 6,5. Trái lại pH tối ưu của polyesterase từ thực vật bậc cao thường cao hơn và vào khoảng 5,0 - 8,0. Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là: 30 - 45oC và bị mất hoạt tính khi ở nhiệt độ 55 - 62oC, nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ thực vật bậc cao thường cao hơn và vào khoảng 55 - 60oC. Pectinesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Na+, K+, Ca2+ và Mg2+. Trái lại các cation hóa trị 3 và 4 từ các chất như: Pb(NO3)3, Al2(SO4)3, FeCl3 sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase. Các enzyme pectinesterase từ vi sinh vật đều có những đặc điểm khác nhau. Pectinesterase của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3 - 9,5 và pH tối ưu là 7,6. Tuy nhiên, pectinesterase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid. Hoạt động của enzyme pectinesterase thu được từ Aspergillus niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC. Các pectinesterase kiềm và acid có thể đề methyl hóa cơ chất pectin theo cùng một kiểu. Các pectinesterase kiềm đề ester hóa các pectin và pectin này có thể tạo gel yếu với Ca2+; pectinesterase acid tạo ra pectin bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh đối với ion Ca2+. Cơ chế đề methyl hóa: pectinesterase loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của enzyme và phóng thích methanol. Tiếp theo sau là phản ứng deacyl hóa, là phản ứng thủy phân các hợp chất trung gian acyl - enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid. b) Polygalacturonase (poly-α-1,4-galacturoniglucanohydrolase) Là enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside trong phân tử pectin. Polygalacturonase ít gặp ở thực vật, polygalacturonase chủ yếu có ở các vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc và vi khuẩn, nó thường có trọng lượng phân tử khoảng 65.000 Da. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu đối với cơ chất. Polygalacturonase chủ yếu bền ở pH từ 4,0 - 6,0. Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng 40 - 45oC. Ở khoảng nhiệt độ đó chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị mất hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50 - 60oC. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng trên cơ chất nên H.Deuel và E.Stutz (1958) đã chia ra 4 loại polygalacturonase: Polymethylgalacturonase hay còn gọi là α-1,4-galacturonite-methylesglucannohydrolase, tác dụng trên acid polygalacturonic đã được methyl hóa (tức là pectin). Các enzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucoside bị cắt đứt dưới xúc tác của enzyme ở đầu mạch hay giữa mạch như: Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu I: còn gọi là enzyme polygalacturonase dịch hóa. Đây là enzyme xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được ester hóa ở mức độ cao. Hoạt tính của enzyme này bị giảm khi có mặt của enzyme pectinesterase trong môi trường. Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu I rất phổ biến ở các vi sinh vật, đặc biệt là ở nấm mốc: Aspergillus niger, Botrylis cinerea và Aspergillus awamori. Hình 1.12. Sơ đồ tác dụng của Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu I lên hợp chất pectin Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III: còn gọi là enzyme polygalacturonase đường hóa. Đây là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside ở đầu mạch để tách dần từng gốc acid polygalacturonic ra khỏi phân tử pectin hay acid pectinic, bắt đầu từ đầu không khử. Enzyme này có ái lực với gốc acid polygalacturonic đã methyl hóa, nghĩa là phân cắt các liên kết α-1,4 ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc acid polygalacturonic có nhóm -COOCH3. Hình 1.13. Sơ đồ tác dụng của Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III lên hợp chất pectin Polygalacturonase: là enzyme tác dụng chủ yếu lên các acid pectic và acid pectinic. Đối với nhóm enzyme này sự có mặt của pectinesterase có tác dụng thúc đẩy khả năng xúc tác của chúng. Các enzyme này cũng được chia thành 2 nhóm nhỏ nhờ vào vị trí liên kết glucoside bị cắt đứt. Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu II: đây là loại enzyme polygalacturonase dịch hóa. Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II thủy phân liên kết α-1,4-glucoside các phân tử acid pectic hay acid pectinic, các enzyme này chỉ tác dụng khi có nhóm -COOH tự do. Vị trí đứt mạch của cơ chất được xử lý sơ bộ bằng pectinesterase. Đa số nấm mốc và vi khuẩn là những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp được enzyme này. Hình 1.14. Sơ đồ tác dụng của Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu II lên hợp chất pectin xo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu IV: enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết glucoside ở đầu mạch của phân tử acid pectic hoặc pectinic. Enzyme này có ái lực với các liên kết glucoside ở đầu mạch gần với nhóm carboxyl tự do. Hình 1.15. Sơ đồ tác dụng của Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu IV lên hợp chất pectin 1.2.4. Enzyme cellulase Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển quá vật chất hữu cơ trong thiên nhiên, có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường. Đây cũng là enzyme được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và protease. Enzyme cellulase là một phức hệ hydrolase gồm các enzyme C1, Cx và b-glucosidase. Chúng tham gia các phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose cuối cùng tạo ra sản phẩm là đường glucose. 1.2.4.1. Phân loại và đặc điểm của cellulase vi sinh vật Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm: Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-b-D-glucan cellobiohydrolase). Endocellulase (endoglucanase; 1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase). b-glucosidase (cellbiase; b-D-glucoside glucohydrolase). Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng từ 40 - 60oC, pH nằm trong khoảng từ 4 - 7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 - 15 phút ở 80oC. Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ. Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase kiểu II. Exocellulase kiểu I chiếm đến 60% lượng protein có trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm đẳng điện là 4,4 (PI = 4,4). Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh. Nhưng chúng lại không tác dụng đến cellulose biến tính như carboxylmethyl cellulose (CMC) hay hydroxyethylcellulose, cellohexaose b-nitrophenyl, b-glucoside hay b-glucan. Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid. Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0. Chúng cũng không tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan. Exocellulase kiểu II chứa khoảng 471 amino acid. Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của Trichoderma reesei. Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino acid. Enzyme này có ba cầu nối disufide. Hai cầu nối disulfide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động. Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 - 75.000 Da. Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei. Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại endoglucanase kiểu I và endoglucanase kiểu II. Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da. Endoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da. Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Ngoài ra endoglucanase còn được tìm thấy ở Clostridium thermocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật khác. Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều. b-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong khoảng pH rất rộng (pH từ 4,4 - 8,4) phân tử lượng 50.000 - 98.000 Da, PI (isoelectric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. b-glucosidase của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340 Da. Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được. b-glucosidase của Clostridium thermocellum được chia ra làm hai loại b-glucosidase A và b-glucosidase B. b-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid và có phân tử lượng 51.482 Da. Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 - 6,5 và ở nhiệt độ 60oC. Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC. 1.2.4.2. Cơ chế xúc tác của cellulase vi sinh vật Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-b-D-glucan cellobiohydrolase). Enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết b-1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết b-1,4-glucoside). Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng. Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase (endoglucanase; 1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase). Enzyme này thủy phân liên kết b-1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như CMC và Hydroxylethyl Cellulose (HEC). Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh. b-glucosidase (cellbiase; b-D-glucoside glucohydrolase) không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D-glucose. Cellulose kết tinh Enzyme cellulase C1 Exocellulase b-glucosidase Oligomer Cellobiose Các oligomer chuỗi ngắn Glucose Cellulose vô định hình Endoglucanase Hình 1.16. Cơ chế chuyển hóa cellullose dưới sự xúc tác của hệ enzyme cellulase Ngoài ra, còn có các loại enzyme khác như: lipase, hemicellulase và lignase... 1.3. Ưu điểm - nhược điểm của enzyme ngoại bào so với enzyme nội bào của vi sinh vật 1.3.1. Ưu điểm Dễ dàng thu nhận được dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy mà không cần dùng các phương pháp phá vỡ tế bào phức tạp. Không lẫn với các vật chất không hòa tan trong tế bào và có thể tách chiết dễ dàng và nhanh chóng. Enzyme ngoại bào được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào với lượng tương đối lớn trong khi enzyme nội bào nằm trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác và có lẫn cả các protein có tính chất lý hóa rất giống enzyme. Do đó, việc tách những phần nhỏ này rất khó. Không bị biến tính enzyme cần thu nhận do không sử dụng các phương pháp phá vỡ tế bào. Các enzyme ngoại bào đa phần ổn định và bền vững hơn so với enzyme nội bào nhờ sự có mặt của liên kết disulfide. Hoạt tính cao hơn so với các enzyme nội bào. Độ bền nhiệt cũng như khả năng chịu acid cũng cao hơn so với các enzyme nội bào. Giá thành chế phẩm enzyme thu nhận được rẻ hơn rất nhiều so với các enzyme nội bào. 1.3.2. Nhược điểm Các enzyme ngoại bào phần lớn là enzyme thủy phân ở dạng hòa tan nên trong quá trình sản xuất công nghiệp chúng thường lẫn vào sản phẩm gây khó khăn và đòi hỏi chi phí khá cao để tách chúng ra khỏi sản phẩm. Ví dụ như sản xuất glucose sử dụng trong y học phải tuyệt đối sạch cả về phương diện hóa học và sinh học. Còn các enzyme nội bào thường không tan (trừ các enzyme nội bào thuộc nhóm hydrolase) nên dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm ở giai đoạn cuối của phản ứng. Sau phản ứng, nếu tách các enzyme ở dạng hòa tan ra khỏi phản ứng để thực hiện phản ứng tiếp theo hoạt tính sẽ giảm dần. Như vậy việc tái sử dụng chúng không có hiệu quả cao, có nhiều trường hợp không thể sử dụng được nữa. Một số enzyme nội bào được ứng dụng trong y học nhằm mục đích điều trị, nghiên cứu, sản xuất kháng sinh bán tổng hợp và dược phẩm được tinh sạch kỹ lưỡng trong khi các enzyme ngoại bào phần lớn ứng dụng trong các ngành sản xuất công nghiệp thực phẩm, sản xuất các chất tẩy rửa, ngành công nghiệp thuộc da… chỉ ở dạng enzyme kỹ thuật thường không được tinh sạch nhất. CHƯƠNG 2: ENZYME NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS 2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy… Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường… 2.1.2. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc: Giới (Kingdom) : Bacteria Ngành (Division) : Firmicutes Lớp (Class) : Bacilli Bộ (Order) : Bacillales Họ (Family) : Bacillaceae Giống (Genus) : Bacillus Loài (Species) : Bacillus subtilis 2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis 2.1.3.1. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 - 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học. Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB). Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại. Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng. 2.1.3.2. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 - 300 năm. Hình 2.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi 2.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose. Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+). Bảng 2.1. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis Phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR (Metyl red) + VP (Voges-Proskauer) + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Manitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005) 2.1.3.4. Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 - 7,4. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 - 5 mm, sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. Trên môi trường giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 - 4cm sau 72 giờ nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone). 2.1.3.5. Bộ gen của Bacillus subtilis Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào. 2.1.3.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử a) Bào tử Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 - 0,9 µm x 1,0 - 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006). b) Khả năng tạo bào tử Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại và nhiệt độ cao…). Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau: Hình thành những búi chất nhiễm sắc. Tạo tiền bào tử. Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ. Tổng hợp các lớp vỏ bào tử. Giải phóng bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003). 2.2. Hệ enzyme của Bacillus subtilis 2.2.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có những enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp và nằm trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển ._.thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám, nấm men tự phân, pepton và protein. Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đối thấp. Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006). Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác. Kết quả là sự phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là 0,038 UI/ml so với các nguồn khác. Bảng 2.5. Hoạt tính protease của chủng Bacillus subtilis 61 khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau trong môi trường nuôi cấy Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (UI/ml) KNO3 0,038 (NH4)2SO4 0,026 NH4Cl 0,021 NH4NO3 0,019 Cao thịt 0,010 Cao nấm men 0,008 (trích Ngô Thị Thanh Nhàn, 2008) Ảnh hưởng của khoáng: phosphore và sulphur có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Nói chung, phosphore vô cơ có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó. Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: các yếu tố vi lượng như NaCl và vitamin… cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các muối chloride, nitrate, amonium có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Ảnh hưởng của amino acid: các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Gly, Ala, Met và Leu có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251 - 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132 - 63 tới 7- 24%. Nhiều amino acid có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme là Val, Glu và isoleucine trong đó Val ức chế tổng hợp enzyme ở Bacillus megaterium 60%. Còn đối với Bacillus subtilis các amino acid ức chế trong quá trình này là Gly, Met, Glu, Ala, Leu… Theo Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng của các amino acid lên khả năng sinh enzyme protease của vi khuẩn Bacillus subtilis cho thấy các amino acid làm giảm khả năng sinh enzyme. Trong đó, khả năng làm giảm của Met là ít nhất (0,084 HP/ml), sau đó là proline (0,080 HP/ml), Ala (0,072 HP/ml), ornithine và arginine (0,064 HP/ml). Công bố của D.J. Fairbain và cộng sự cho kết quả ngược lại khi tác giả này nghiên cứu sự ảnh hưởng của amino acid lên khả năng sinh protease của Pseudomonase Fluorescens. 2.2.3. Thu nhận và tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis Chúng ta đều biết rằng để nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzyme thì có 2 phương pháp: phương pháp nuôi cấy chìm và phương pháp nuôi cấy bề mặt. Ngày nay bằng phương pháp cố định tế bào người ta cũng có thể sinh tổng hợp được enzyme. Tuy nhiên phương pháp này còn tồn tại nhiều nhược điểm và đòi hỏi công nghệ, thiết bị hiện đại. Các chế phẩm enzyme trong môi trường nuôi cấy thu được ở các phương pháp nói trên còn chứa rất nhiều tạp chất. Nồng độ enzyme ở trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt khoảng 0,5 - 1%, còn trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp chìm thì tốt hơn, khoảng 0,01%... Thông thường công nghệ tách chiết enzyme từ chế phẩm nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề mặt phải bao gồm các thao tác chủ yếu sau đây: tách các thành phần của môi trường nuôi cấy và sinh khối để nhận được dịch nuôi cấy cô đặc công nghiệp này làm khô và kết tủa enzyme. Tùy từng lĩnh vực đòi hỏi độ tinh khiết của enzyme mà đặt ra nhu cầu thu nhận enzyme sao cho kinh tế nhất. Ngày nay thường tồn tại hai loại chế phẩm enzyme. Đó là chế phẩm enzyme kỹ thuật và chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao hơn. Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm đã được tách tạp chất, nhưng ngoài enzyme chủ yếu còn có enzyme khác và protid không có hoạt tính sinh học (nồng độ enzyme khoảng 15 - 20%). Chế phẩm enzyme có độ tinh khiết cao thì ngoài enzyme các chất khác chiếm tỉ lệ không đáng kể. Chế phẩm enzyme kỹ thuật có thể là dịch cô đặc có nồng độ chất khô 35 - 50% hoặc dạng bột có hàm lượng chất khô khoảng 90%. 2.2.3.1. Thu nhận và tách chiết enzyme α-amylase của Bacillus subtilis Trong một số ngành công nghiệp nhiều khi đòi hỏi phải có những chế phẩm có độ tinh khiết cao. Trong thập kỷ 70 của thế kỷ này đã xuất hiện lĩnh vực khác nhau sử dụng các chế phẩm enzyme tinh khiết. Trong quá trình sinh tổng hợp amylase đồng thời cũng xảy ra quá trình sinh tổng hợp protease. Trong trường hợp cần loại bỏ protease ra khỏi chế phẩm amylase người ta cho amylase hấp phụ lên tinh bột, công trình này đã được nêu trong chế phẩm Patent của Mỹ. Trong Patent người ta cũng đã nêu lên việc ứng dụng calci acetate với tỷ lệ từ 2 - 10% (W/V) vì calci acetate đã góp phần hoạt hóa enzyme. Sau đó bổ sung dung môi hữu cơ với nồng độ khoảng từ 0,6 - 1,0 Vdung môi/Vban đầu khi đó amylase bị kết tủa khi bổ sung dung môi. Theo Molodova (1966) để loại bỏ protease ra khỏi α-amylase của nấm mốc Aspergillus và Rhizopus sử dụng hạt trao đổi anion, có thể sử dụng nhựa phenolformadehyde, polystiren và các dẫn xuất của cellulose… Người ta đã thu nhận được trên 90% α-amylase. Quá trình thu nhận và làm sạch như sau: Chế phẩm enzyme thô thu được sau lên men phải xử lý sơ bộ bằng các phương pháp hóa học như điều chỉnh pH, thêm các chất ổn định 0,1% CaCl2 so với dịch lên men để tạo kết tủa dẫn đến lắng cặn hoạt hóa enzyme và lọc để loại bỏ tạp chất. Việc này làm mất hoạt tính của enzyme khoảng 2%. Quá trình lọc bỏ tạp chất cũng gặp những khó khăn vì sinh khối tế bào lớn bịt kín các lỗ loc khiến tốc độ lọc chậm dần và thời gian lọc dài dẫn đến tổn thất enzyme rất lớn, cho nên khi lọc người ta còn bổ sung bột trợ lọc, hoặc lọc bằng màng hoặc sử dụng máy li tâm có tốc độ cao 5000 - 6000 vòng/phút, 96 - 97% sinh khối được tách. Bổ sung các chất trợ lọc như: diatomit của Nhật, filtroperlit của Liên Xô (cũ). Sau khi có chế phẩm enzyme khá sạch ở dạng lỏng người ta tiến hành cô đặc. Thông thường người ta hay cô chân không ở nhiệt độ thấp 28 – 30oC để tránh hiện tượng bất hoạt enzyme đây là giai đoạn rất thuận lợi đối với các chế phẩm nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt vì chế phẩm này có nồng độ chất khô cao hơn so với chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương pháp chìm. Trong trường hợp thực hiện cô đặc chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương pháp chìm thường hay dẫn đến một số biến đổi hóa học, bất lợi cho hoạt động của enzyme làm ảnh hưởng đến tính bền vững của enzyme. Trong vấn đề này Vexelov (1970) đã có nhiều thành tựu, ông cô đặc enzyme bằng phương pháp đóng băng nhiều lần. Ngày nay với thành tựu của công nghệ màng siêu lọc, phương pháp cô đặc dịch lên men đã được thực hiện đơn giản hơn, hiệu quả hơn. Để ứng dụng được phương pháp này có hiệu quả người ta làm sạch enzyme, chọn nguyên liệu và kích thước màng sao cho phù hợp. Phương pháp này không những chỉ cô đặc enzyme mà còn làm cho chế phẩm sạch hơn, hoạt tính của enzyme bị giảm không đáng kể trong quá trình lọc. Sau khi có được chế phẩm enzyme cô đặc người ta tiến hành sấy phun để thu enzyme khô ở nhiệt độ 120 - 130oC rồi giảm nhiệt độ xuống khoảng 60 - 65oC. Trước khi sấy phun có thể thêm các chất như NaCl nồng độ 200 mg/l hoặc CaSO4, MgSO4 nồng độ 30 - 60 mg/l. Trong quá trình sấy phun hoạt tính enzyme giảm khoảng 10%. Đây hiện là một phương pháp hữu hiệu nhất để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật. Tuy nhiên để sấy phun có hiệu quả thì việc xử lý chế phẩm trước sấy phun là việc quan trọng. Độ ẩm của chế phẩm thu được là yếu tố quyết định tác dụng và độ bền vững của enzyme. Chế phẩm thu được có thể bảo quản được 2 năm, sấy phun đơn giản hơn và hạ giá thành sản phẩm. Để thu nhận được chế phẩm có độ tinh khiết cao người ta có thể tiến hành như sau: kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, muối trung tính để tách enzyme ra khỏi dung dịch, sau đó tách α-amylase ra khỏi hỗn hợp enzyme đã được kết tủa bằng màng siêu lọc, hoặc phương pháp hấp phụ enzyme trên tinh bột. Sắc ký trao đổi ion hoặc dùng phương pháp đẳng điện, rồi kết tinh và sấy khô. Kvesitadze (1984) đã đưa ra bảng quá trình làm sạch và kết tinh α-amylase của Bacillus subtilis như sau: Lọc chế phẩm Hấp phụ tinh bột Muối tách M/30 Na2HPO4 Tẩy màu trên nhựa Đayrut A2 Kết tủa bằng (NH4)2SO4 đến 70% bão hòa Hòa tan kết tủa trong calci acetate M/500 Thêm aceton ở 00C đến 60% bão hòa Hòa tan kết tủa trong calci acetate 0,01M Chỉnh pH đến 6,0 Bảo quản trong lạnh Kết tinh Tuy nhiên, theo các nghiên cứu gần đây, quá trình kết tủa enzyme lại dùng cồn 96%. Theo Nguyễn Thanh Thủy (2007) khi khảo sát tỷ lệ tủa enzyme α-amylase bằng cồn 96% và tủa bằng (NH4)2SO4 đã cho kết quả như sau: Bảng 2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Tỷ lệ enzyme/cồn 96% Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) Theo bảng 2.6 thì ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn thấp chỉ tủa được một lượng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt tính α-amylase thấp. Nhưng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lượng protein thu nhận được cao hơn, song hoạt tính thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt tính α-amylase giảm. Bảng 2.7. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,683 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72.29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 (trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007) Theo bảng 2.7 thì tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α-amylase có hoạt tính cao nhất. Ở độ bão hòa 70%, hoạt tính α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein. Từ các kết quả trên, tác giả đã kết luận kết tủa bằng cồn 96% ở tỷ lệ enzyme/cồn 1:3 hoạt tính của α-amylase thu hồi được cao hơn khi kết tủa bằng (NH4)2SO4. Như vậy, quá trình tách và làm sạch enzyme là một quá trình phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất tinh khiết và rất tốn kém. Người ta đã đề nghị một số ngành sử dụng enzyme nếu không cần tinh khiết thì có thể sử dụng enzyme thô như công nghệ thuộc da và sản xuất rượu bia… Ngày nay trên thị trường tồn tại khá nhiều chế phẩm enzyme. Trong ngành công nghiệp sản xuất bia người ta đã sử dụng khá nhiều loại enzyme kỹ thuật. Hãng Novo - Nordish của Đan Mạch đã đưa vào thị trường Việt Nam một loại chế phẩm enzyme cho khá nhiều ngành công nghiệp trong đó có ngành công nghệp sản xuất bia. 2.2.3.2. Thu nhận và tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis a) Thu nhận enzyme protease của Bacillus subtilis Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được dịch enzyme protease thô. Để đảm bảo cho dịch enzyme protease thô không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô dịch bằng máy sấy chân không. Độ ẩm cần đạt được sau quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10%. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38 - 40oC. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người phải tiến hành như sau: Toàn bộ khối lượng enzyme protease thô được nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Khi nghiền người ta thường sử dụng các chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh. Đây là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và tăng khả năng ma sát, trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật. b) Tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch. Quá trình kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa như: cồn 96%, sulphate ammon, muối (NH4)2SO4… Khi tiến hành tủa, phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Khi đổ chất kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải tiến hành từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulphate ammon với liều lượng như sau: cứ một phần dung dịch enzyme thô cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulphate ammon. Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là từ 4 - 7oC) theo thời gian, các enzyme sẽ được kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận tủa (độ ẩm lớn hơn 70% trọng lượng). Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, sấy kết tủa enzyme protease ở 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 - 8% trọng lượng (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài enzyme khác lẫn vào. CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS 3.1. Ứng dụng trong thực phẩm 3.1.1. Trong công nghệ sản xuất bia Bia là một loại giải khát mát bổ, có nồng độ cồn thấp, có độ mịn xốp và có hương vị đặc trưng. Hương liệu của bia là do các chất chiết từ nguyên liệu, cồn và CO2 và sản phẩm lên men khác nhau tạo nên. Đặc biệt, CO2 bão hòa trong bia có tác dụng giải khát rất tốt. Nhờ những ưu điểm này mà bia được sản xuất khắp nơi trên toàn thế giới. Hiện nay trên thế giới có khoảng 25 nước sản xuất bia với sản lượng trên 1 tỷ lít mỗi năm. Trong đó có Mỹ, Cộng Hòa Liên Bang (CHLB) Đức, Trung Quốc mỗi năm sản xuất trên 10 tỷ lít, sản lượng tính theo đầu người năm 1984 ở Đan Mạch là 182 lít/năm, ở CHLB Đức, Hà Lan 146 lít/năm. Ở Việt Nam, mấy năm gần đây, sản lượng bia đã tăng lên nhanh chóng. Nếu 10 năm trước, nước ta chỉ có 2 nhà máy bia ở Hà Nội và Sài Gòn thì nay ước tính có hàng trăm nhà máy, xí nghiệp và phân xưởng sản xuất bia lớn, nhỏ có quy mô công nghiệp. Năm 1994, theo thống kê thì bình quân đầu người là 5 lít/năm. Từ xa xưa trong công nghệ sản xuất bia ở hầu khắp các nước trên thế giới đều dùng malt, nhưng khác với sản xuất rượu, malt chủ yếu là tác nhân đường hóa thì trong sản xuất bia malt vừa là tác nhân đường hóa, vừa là nguyên liệu sản xuất. Sản xuất bia theo sơ đồ công nghệ thông thường các hệ enzyme được tạo ra trong quá trình nảy mầm cần thiết để xử lý nguyên liệu bột chuyển các chất chiết sang trạng thái hòa tan ở giai đoạn nấu. Các enzyme tạo ra trong quá trình nảy mầm và có ý nghĩa quan trọng nhất trong công nghệ sản xuất bia là enzyme amylase dịch hóa và đường hóa tinh bột. Enzyme protease phân giải protein của đại mạch đến các polysaccharide không phải là tinh bột, hòa tan màng nội nhũ hạt ngũ cốc, làm cho các enzyme amylase và protease dễ dàng tác dụng đến cơ chất tương ứng. Mỗi quá trình kể trên cần tiến hành đến mức độ xác định để ổn định việc lọc dịch đường hóa, lên men dịch đường, làm trong và lọc bia; cũng như tạo ra những tính chấ,t mùi vị và lý hóa xác định cho bia. Những enzyme có nguồn khác nhau dùng thay thế enzyme của malt cần phù hợp với enzyme của malt về đặc tính tác dụng và phải trội hơn về hoạt lực, do đó cho phép giảm quy mô sản xuất chế phẩm enzyme, so với quy mô sản xuất malt. Ở Liên Xô (cũ) những công trình nghiên cứu có hệ thống về ứng dụng chế phẩm enzyme từ vi sinh vật với mục đích thay thế một phần đáng kể malt bằng đại mạch chưa nảy mầm được tiến hành sớm hơn ở các nước khác. Người ta có thể thay thế 86 - 100% malt bằng đại mạch chưa nảy mầm. Có sử dụng hỗn hợp enzyme α-amylase của Asp. oryzae và Bacillus subtilis. Trên thế giới có rất nhiều nước quan tâm đến việc sản xuất bia từ đại mạch chưa nảy mầm và các nguyên liệu khác thay thế như gạo, ngô, khoai tây và sắn… Nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này đã được báo cáo ở hội nghị quốc tế lần thứ 13 và 14 Hiệp hội ngành bia châu Âu EBC năm 1971 và 1973. Khi phân tích thành tựu công nghiệp bia người ta đã dự báo việc thay thế hoàn toàn malt bằng Đại mạch chưa nảy mầm và enzyme vi sinh vật. Từ những năm 1960, Liên Xô đã sản xuất ở quy mô công nghiệp các chế phẩm enzyme đã ứng dụng trong sản xuất bia Jigulevxkoe, như Amilorizin Px, Xitorozenin Px và amilosubtilin G10x. Bia Jigulevxkoe đã thay thế 50% malt bằng đại mạch chưa nảy mầm. Giá trị của công nghệ mới này là ở chỗ trong khi đảm bảo khả năng thu được bia phẩm chất cao do lượng lớn nguyên liệu chưa nảy mầm và các enzyme từ vi sinh vật. Mục đích đầu tiên người ta sử dụng chế phẩm α-amylase (chủ yếu là amylase từ vi khuẩn) để dịch hóa tinh bột làm tăng khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường, đặc biệt là khi dùng các loại hạt mầm để thay thế malt đại mạch. Loại α-amylase thường dùng hiện nay là từ Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis và Baciillus liquefaciens. Dịch đường hóa trong sản xuất bia cần đảm bảo về tỉ lệ thành phần maltose và dextrin, không phải đơn thuần tích lũy nhiều đường đơn. Do vậy, người ta còn dùng bổ sung cả nguồn enzyme β-amylase của nấm mốc Asp. oryzae trong giai đoạn đường hóa. Ngoài ra, các chế phẩm này còn được sử dụng trong sản xuất một số bia cho người mắc bệnh tiểu đường hay những người cần ăn kiêng. Người ta còn sử dụng cả enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa, nhằm giảm lượng đường trong sản phẩm cuối cùng. Chế phẩm dùng trong sản xuất bia là hỗn hợp enzyme chứa α-amylase và β-amylase (hay α-amylase có khả năng đường hóa cao) các enzyme protease và pentosanase, β-glucanase. Amylase của Bacillus subtilis tốt hơn của nấm mốc vì có độ bền nhiệt và khả năng dịch hóa cao hơn. Đồng thời sử dụng bổ sung một cách hợp lý α-amylase của nấm mốc nâng cao mức độ lên men của dịch đường. Protease phải có khả năng proteinase lẫn peptidase để khi tác dụng lên polypeptide đại mạch thì chuyển vào dịch đường các hợp chất đạm khó tan, polypeptide và amino acid với khối lượng đủ đảm bảo của hoạt động sống bình thường của nấm men, cho sự hoàn chỉnh vị bia và cho sự tạo bọt. Protease được sử dụng trong công nghiệp bia, phần lớn là các enzyme trung tính. Các enzyme β-glucanase và pentosanase, hòa tan màng tế bào của nội nhũ đại mạch và có khả năng lên men nhanh dịch đường. Neutrase là chế phẩm protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Neutrase chỉ chứa các protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại khác đều chứa lẫn protease kiềm. Neutrase không chứa α-amylase. Loại enzyme này có nhiệt độ thích hợp nhất trong vùng 45 – 55oC và pH 5,5 - 7,5. 3.1.2. Trong công nghệ chế biến thủy sản Đã có những nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng enzyme protease của Bacillus subtilis trong chế biến thủy sản như: sản xuất bột đạm thủy phân từ cơ thịt cá mối. Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme protease của Bacillus subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease của Bacillus subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50oC, pH tự nhiên của cơ thịt cá thì hỗn hợp thủy phân có các chỉ tiêu cảm quan và hóa học tốt nhất. Ðể ức chế quá trình gây thối của vi sinh vật trong quá trình thủy phân có thể bổ sung vào hỗn hợp thủy phân muối ăn với nồng độ 3% hoặc sorbitol với nồng độ 4% hay ethanol với nồng độ 8%. Sản xuất nước mắm ngắn ngày cũng được nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất bằng các chế phẩm protease thu nhận từ vi khuẩn. Để tăng quá trình thủy phân rút ngắn thời gian chế biến nước mắm người ta đã tiến hành tạo nhiệt độ thích hợp cho protease hoạt động là khoảng 50oC và giảm độ mặn ban đầu của khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease với cá bằng cách xay nhuyễn cá… Khi cho muối vào chượp cá thì nhiệt độ thủy phân là 43 - 45oC và sẽ làm giảm hoạt độ của protease thủy phân cá. Ở điều kiện thích hợp, việc bổ sung protease giúp rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm từ 6 - 9 tháng xuống còn 30 - 40 ngày. Nước mắm ngắn ngày có hàm lượng đạm khá cao, tuy nhiên về hương vị, độ ngon thì kém nước mắm dài ngày. Người ta khắc phục nhược điểm này bằng cách pha trộn nước mắm ngắn ngày với nước mắm dài ngày hoặc bổ sung thêm hương vị vào nước mắm ngắn ngày. Ngoài nhiệt độ thích hợp, độ xay nhuyễn cá và bổ sung muối phù hợp cũng làm giảm đáng kể thời gian lên men sản xuất nước mắm và đảm bảo chất lượng nước mắm thành phẩm. Ngoài ra, enzyme α-amylase còn được sử dụng trong sản xuất siro fructose, sản xuất bánh kẹo, bổ sung α-amylase và protease vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số sử dụng thức ăn… 3.2. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Enzyme protease có khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis), nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus) và xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng. 3.3. Ứng dụng trong công nghiệp dệt Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serine đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. 3.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzyme vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra. Một tiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩy rửa là hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần của chất tẩy rửa. Tham số đóng vai trò chìa khóa cho việc bổ sung protease nào vào chất tẩy rửa là pI của chúng. Một protease phù hợp khi pI của nó trùng với pH của dung dịch chất tẩy rửa. Subtilisin đáp ứng được đầy đủ những yêu cầu khắt khe trên. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus (Rao và cộng sự, 1998; Thangam, 2002), và chủ yếu là từ Bacillus subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease (Gupta và cộng sự, 2002). 3.4. Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường Việc ứng dụng các enzyme ngoại bào của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus subtilis nói riêng đã và đang được nghiên cứu với nhiều triển vọng và có những ứng dụng nhất định trong việc xử lý ô nhiễm môi trường. Phương pháp xử lý bằng enzyme là trung gian giữa hai phương pháp truyền thống, nó bao gồm các quy trình hoá học trên cơ sở hoạt động của các chất xúc tác có bản chất sinh học. Enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành dạng khác. Ngoài ra chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Phương pháp xử lý bằng enzyme so với phương pháp xử lý thông thường có những ưu điểm sau: Được áp dụng đối với các hợp chất sinh học khó xử lý. Tác dụng ở cả vùng nồng độ chất ô nhiễm cao và thấp. Một số enzyme riêng biệt có tác dụng trên phạm vi pH rộng, nhiệt độ và độ mặn. Không gây ra những biến động bất thường. Không gây ra các cản trở phá vỡ cân bằng sinh thái. Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà protease được sử dụng, một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, mặt khác để xử lý. Các phế thải protein tồn đọng trong các dạng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối. Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được coi như là nguồn protein cao trong tạo nên cấu trúc keratin cứng được phá huỷ hoàn toàn. Lông có thể được hoà tan sau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng các enzyme thuỷ phân, như protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, màu xám với hàm lượng protein cao có thể được sử dụng làm thức ăn. Các enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô khoai, sắn ... Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylase có thể dùng để sản xuất ethanol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylase và glucoamylase, từ các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền, quy trình chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và sinh học. α-amylase trước tiên được dùng để phá vỡ các phân tử tinh bột mạch dài để tạo thành những mảnh nhỏ. Tiếp theo glucoamylase tác dụng tạo thành glucose thông qua quá trình đường hoá (hơn 90% tinh bột được chuyển thành đường). Glucose được lên men thành acid lactic nhờ chủng vi sinh vật sản sinh acid lactic. Acid lactic cuối cùng được thu lại, tinh sạch và dùng để sản xuất màng bao gói kiểu này. Sản phẩm cuối cùng chứa 95% acid lactic và 5% các chất thải an toàn với môi trường. Ở nước ta, việc nghiên cứu sử dụng các enzyme vi khuẩn như amylase để xử lý nước thải của các làng nghề làm bún, bánh đa đã có những kết quả đáng kể. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài này, tôi rút ra một số kết luận như sau: Bacillus subtilis có nhiều ưu điểm hơn các loài vi sinh vật khác như dễ nuôi cấy, sinh trưởng tốt, phát triển nhanh, không sinh độc tố và an toàn khi đưa vào sản xuất và sử dụng các chế phẩm từ loài vi khuẩn này, có khả năng kháng khuẩn cao và chịu được những ảnh hưởng bất lợi từ môi trường. Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào nhưng các enzyme được chú ý và ứng dụng vào đời sống và sản xuất công nghiệp là các enzyme amylase và protease. Bacillus subtilis có khả năng sinh lượng enzyme ngoại bào lớn. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis có những đặc tính vượt trội hơn hẳn các enzyme của vi sinh vật khác như khả chịu được nhiệt độ tương đối cao, pH hoạt động từ trung tính đến kiềm, khả năng thủy phân các cơ chất mạnh mẽ... Qui trình tách chiết và thu nhận các enzyme ngoại bào cũng tương đối dễ dàng, tận dụng được nguồn cơ chất từ các phế thải phụ phẩm làm giảm giá thành chế phẩm, tăng lợi nhuận, làm giảm đáng kể việc thải bỏ các chất thải hữu cơ vào môi trường. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong ngành công nghiệp thực phẩm điển hình là ngành công nghiệp sản xuất bia, sản xuất nước mắm và bột đạm thủy phân từ cá...; trong ngành công nghiệp dệt; ngành công nghiệp thuộc da; trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa và và ứng dụng trong lĩnh vực xử lý ô nhiễm môi trường. 4.2. Kiến nghị Cần nghiên cứu và làm thực nghiệm khi nghiên cứu về Bacillus subtilis như: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme ngoại bào. Khảo sát hoạt tính và khả năng thủy phân các cơ chất khác nhau từ các chủng phân lập và tuyển chọn được. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để thu nhận các enzyme ngoại bào có hoạt độ cao hơn. Đưa vào sản xuất các enzyme ngoại bào từ các chủng Bacillus subtilis và ứng dụng vào thực tiễn vào sản xuất và đời sống. Nghiên cứu các điều kiện bảo quản tối ưu để các chế phẩm enzyme không bị giảm hoạt tính trong quá trình bảo quản và sử dụng được lâu. ._.