Tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và các biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm

CHÖÔNG I: GIÔÙI THIEÄU Ñaëc vaán ñeà: Veä sinh an toaøn thöïc phaåm laø moät trong nhöõng vaán ñeà ñöôïc quan taâm ngaøy caøng saâu saéc treân phaäm vi moãi quoác gia vaø quoác teá, bôûi vì söï lieân quan tröïc tieáp cuûa noù aûnh höôûng ñeán söùc khoûe vaø tính maïng con ngöôøi, söï duy trì noøi gioáng, cuõng nhö quaù trình phaân phoái kinh teá quoác teá. Gaàn ñaây ôû trong nöôùc vaø treân theá giôí caøng hoái thuùc caùc nhaø hoachj ñònh theá giôùi maïnh tay hôn nöõa trong quaù trình an toaøn veä sinh thöïc phaåm. Ñeå ñaûm baûo cho ngöôøi tieâu duøng an toaøn veà vaán ñeà thöïc phaåm, thì ñaàu tieân ngöôøi tieâu duøng caàn ñaûm baûo veä sinh caù nhaân cho chính baûn thaân mình. Ñeå goùp phaàn cho vieäc baûo ñaûm thöïc phaåm saïch toát, vieäc kieåm soaùt vi sinh vaät trong thöïc phaåm cuõng laø ñieàu caàn thieát vaø caáp baùch. Vieäc kieåm tra vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm goùp phaàn giuùp cho ngöôøi tieâu duøng an taâm vôùi caùc saûn phaåm mình chon löïa hôn. Ñeå tìm hieåu vi sinh vaät chæ thò cho thöïc phaåm vaø bieän phaùp kieåm soaùt vi sinh vaät, toâi xin trình baøy nhöõng nghieân cöùu maø mình ñaõ hoïc hoûi vaø tìm hieåu. Muïc ñích khoùa luaän: Ñaùnh giaù möùc ñoä nhieãm taïp cuûa vi sinh vaät trong thöïc phaåm, bieän phaùp kieåm soaùt möùc ñoä an toaøn cuûa vi sinh vaät chæ thò trong thöïc phaåm. Noäi dung khoùa luaän: Toång quan caùc ci sinh vaät chæ thò trong thöïc phaåm. Phöông phaùp kieåm tra caùc vi sinh vaät trong thöïc phaåm vaø bieän phaùp kieåm soaùt. Chöông II. TOÅNG QUAN 2.1. Giôùi thieäu veà vi sinh vaät chæ thò 2.1.1. Khaùi nieäm vi sinh vaät chæ thò Vi sinh vaät chæ thò laø nhöõng ñoái töôïng sinh vaät coù yeâu caàu nhaát ñònh veà ñieàu kieän sinh thaùi lieân quan ñeán nhu caàu dinh döôõng, haøm löôïng oxy, cuõng nhö khaû naêng choáng chòu moät haøm löôïng nhaát ñònh caùc yeáu toá ñoäc haïi trong moâi tröôøng soáng vaø do ñoù söï hieän dieän cuûa chuùng bieåu thò moät tình traïng veà kieàu kieän sinh thaùi cuûa moâi tröôøng soáng naèm trong giôùi haïn nhu caàu vaø khaû naêng choáng chòu cuûa ñoái töôïng sinh vaät ñoù. 2.1.2. Caùc tieâu chí löïa choïn moät vi sinh vaät chæ thò - Chuùng coù maët ôû hieän taïi vaø deã phaùt hieän trong taát caû thöïc phaåm coù chaát löôïng (hoaëc khoâng coù chaát löôïng) ñeå ñöôïc ñaùnh giaù. - Söï taêng tröôûng vaø soá löôïng cuûa chuùng caàn phaûi coù xu höôùng tieâu cöïc töông quan vôùi chaát löôïng. - Chuùng caàn phaûi deã daøng phaùt hieän, lieät keâ vaø coù söï khaùc bieät roõ raøng vôùi caùc vi sinh vaät khaùc. - Chuùng caàn ñöôïc lieät keâ trong moät thôøi gian ngaén, thôøi gian lyù töôûng laø trong voøng moät ngaøy. - Söï taêng tröôûng cuûa chuùng khoâng bò gaây aûnh höôûng baát lôïi do caùc thaønh phaàn khaùc cuûa thöïc phaåm. Baûng 2.1: Moái quan heä giöõa vi sinh vaät gaây hö hoûng vaø thöïc phaåm. Vi sinh vaät Saûn phaåm Acetobacter spp Bia töôi Bacillus spp Boät baùnh mì Byssochlamys spp Traùi caây ñoùng hoäp Clostridium spp Pho – mat raén Flat – baøo töû Rau chua ñoùng hoäp Geotrichum spp Traùi caây ñoùng hoäp Vi khuaån acid lactic Bia, röôïu vang Lactococcus lactic Söõa Leuconostoc mesenteroides Mía ñöôøng (Trong quaù trình loïc) Pectinatus cerevisiiphilus Bia “Pseudomonas putrefaciens” Bô Naám men Nöôùc eùp traùi caây Zygosaccharomyces bailii Mayonnaise, salad ñoùng goùi Nhoùm vi sinh vaät laø nguyeân nhaân cuûa söï hö hoûng, soá löôïng cuûa noù ñöôïc nhaän bieát baèng caùch choïn loïc nuoâi caáy. Caùc toång theå cuûa vi sinh vaät ñaùnh giaù chaát löôïng cuûa caùc saûn phaåm, trong baûng 2.1 neâu leân söï taêng tröôûng vaø soá löôïng cuûa caùc vi sinh vaät trong thöïc phaåm. 2.1.3. Chæ thò veà an toaøn thöïc phaåm Vi sinh vaät chæ thò nhaèm ñaùnh giaù möùc ñoä an toaøn veä sinh thöïc phaåm vaø caùc heä thoáng chaát löôïng. Ñeå ñaùp öùng caùc chæ tieâu quan troïng noù caàn caùc yeáu toá sau: Deã daøng nhaän bieát vaø nhanh choùng phaùt hieän. Deã phaân bieät vôùi caùc nhoùm vsv khaùc trong thöïc phaåm. Söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät laø taùc nhaân gaây neân maàm beänh trong thöïc phaåm. Tyû leä nhu caàu taêng tröôûng vaø phaùt trieån cuûa maàm beänh trong thöïc phaåm ñoù. Loaïi tröø maàm beänh coù maët trong thöïc phaåm. Chæ thò Maàm beänh Soá löôïng Thôøi gian Hình 2.1: Moái quan giöõa vi sinh vaät chæ thò vaø maàm beänh. Caùc tieâu chí naøy aùp duïng cho haàu heát caùc vi sinh vaät trong thöïc phaåm coù taùc nhaân gaây beänh baát keå coù nguoàn goác thöïc phaåm naøo. Tuy nhieân taùc nhaân gaây beänh ñöôïc quan taâm coù nguoàn goác töø ñöôøng ruoät, ñeå phaùt hieän söï oâ nhieãm phaân cuûa nguoàn nöôùc vaø söï hieän dieän cuûa taùc nhaân gaây beänh ñöôøng ruoät. 2.1.4. Caùc yeáu toá aûnh höôûng Toác ñoä haáp thu vaø baøi tieát: Ñaây laø ñaëc tính quan troïng trong quaù trình ñaùnh giaù oâ nhieãm. Ñoái vôùi nhöõng chaát coù theå baøi tieát nhanh chæ coù theå phaùt hieän ñöôïc ôû noàng ñoä cao trong cô theå sinh vaät ngay sau khi chaát ñoù ñöôïc thaûi ra moâi tröôøng. Ñaëc ñieåm sinh lyù: Bao goàm quaù trình trao ñoåi chaát, löôïng môõ döï tröõ, khaû naêng baét moài, khaû naêng sinh saûn… Nhöõng sinh vaät coù quaù trình trao ñoåi chaát maïnh hôn (caù) thì coù khaû naêng tích tuï nhanh hôn ngay caû trong ñieàu kieän nguoàn thöùc aên bò haïn cheá. Tuoåi vaø kích thöôùc: Ñaây laø yeáu toá aûnh höôûng lôùn ñeán keát quaû ñaùnh giaù ñaëc bieät ñoái vôùi caù. Chuùng coù moái quan heä chaëc cheõ vôùi caùc chaát tích tuï trong cô theå. Aûnh höôûng cuûa caùc chaát: + Nhöõng enzyme khöû ñoäc aûnh höôûng ñeán söï haáp thuï vaø baøi tieát cuûa caùc chaát. + Söï thay ñoåi maät ñoä haáp thuï cuûa caùc chaát. + Söï thay ñoåi ñaëc tính beân trong cuûa sinh vaät seõ aûnh höôûng ñeán khaû naêng haáp thuï vaø baøi tieát. + Söï baøi tieát cuûa caùc chaát taïo neân nhöõng hôïp chaát phöùt taïp hôn. Söï bieán ñoåi cuûa moâi tröôøng: Söï thay ñoåi nhieät ñoä, ñoä cöùng, ñoä maën, ñoä ñuïc… + Nhieät ñoä: Khoâng aûnh höôûng ñeán ñoä tan cuûa raát nhieàu chaát maø coøn aûnh höôûng ñeán khaû naêng tích tuï cuûa sinh vaät. + Nöôùc cöùng: Laøm giaûm tính ñoäc cuûa moät soá kim loaïi naëng trong moâi tröôøng. + Ñoä maën vaø ñoä ñuïc: Laø nhaân toá quan troïng aûnh höôûng ñeán möùc ñoä haáp thuï cuûa caùc sinh vaät, ñaëc bieät ôû nhöõng vuøng cöûa soâng. Dinh döôõng: Moät trong soá caùc nhaân toá quan troïng aûnh höôûng ñeán noàng ñoä kim loaïi naëng tích tuï trong cô theå sinh vaät nhaát laø nhöõng sinh vaät haáp thuï qua thöùc aên. 2.1.5. YÙ nghóa cuûa caùc vi sinh vaät chæ thò Vi sinh vaät chæ thi veä sinh thöïc phaåm coù yù nghóa raát lôùn trong vieäc ñaùnh giaù an toaøn veà vi sinh vaø chaát löôïng thöïc phaåm. a. Vi sinh vaät hieáu khí öa nhieät ñoä trung bình Toång löôïng vi sinh vaät hieáu khí öa nhieät ñoä trung bình cho bieát löôïng vi sinh vaät hieáu khí öa nhieät ñoä trung bình maø nguyeân lieäu vaø saûn phaåm thöïc phaåm bò nhieãm. Khi ñoù ngöôøi quaûn lyù vaø saûn xuaát thöïc phaåm phaûi kieåm tra laïi ñieàu kieän veä sinh trong saûn xuaát, ñieàu kieän baûo quaûn vaø phaân phoái. Thöïc phaåm bò phaân huûy trong 1 gam chöùa khoaûng 106 ñeán 108 teá baøo visinh vaät hieáu khí. b. Vi sinh vaät kò khí öa nhieät ñoä trung bình Toång löôïng vi sinh vaät kò khí öa nhieät ñoä trung bình cho bieát khaû naêng thöïc phaåm nhieãm Clotridium. c. Vi sinh vaät öa laïnh Toång löôïng vi sinh vaät öa laïnh cho bieát tröôùc khoaûng thôøi gian caàn thieát ñeå baûo quaûn laïnh nhaèm ñaûm baûo söï an toaøn thöïc phaåm. 2.1.6. Caùc vi sinh vaät chæ thò ñieån hình 2.1.6.1. Toång soá vi sinh vaät hieáu khí a. Giôùi thieäu - Chæ soá naøy coøn coù teân goïi khaùc laø: soá vi sinh vaät hieáu khí, toång soá ñeám treân ñóa, toång soá vi sinh vaät soáng. - Chæ tieâu naøy ñöôïc duøng ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä nhieãm taïp cuûa nguyeân lieäu vaø saûn phaåm. Töø ñoù ñaùnh giaù tình traïng veä sinh vaø caùc ñieàu kieän baûo quaûn saûn phaåm vaø döï ñoaùn khaû naêng hö hoûng cuûa saûn phaåm. b. Ñònh nghóa Vi khuaån hieáu khí laø nhöõng vi khuaån taêng tröôûng vaø hình thaønh khuaån laïc trong ñieàu kieän coù söï hieän dieän cuûa oxy phaân töû (O2). Toång soá vi khuaån hieáu khí hieän dieän trong maãu chæ thò möùc ñoä veä sinh cuûa thöïc phaåm. c. Nguyeân taéc - Toång soá vi sinh vaät hieáu khí ñöôïc ñeám baèng caùch ñoå ñóa vaø uû trong ñieàu kieän hieáu khí ôû 30oC/72h ± 6h hoaëc 37oC/48h ± 6h. Chæ soá naøy ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng töø moät löôïng maãu xaùc ñònh treân cô sôû xem moät khuaån laïc laø sinh khoái phaùt trieån töø moät teá baøo hieän dieän trong maãu vaø ñöôïc bieåu dieãn döôùi daïng soá ñôn vò hình thaønh khuaån laïc (colony forming unit, CFU) trong moät ñôn vò khoái löôïng thöïc phaåm. 2.1.4.2. Coliform toång soá a. Giôùi thieäu Coliform ñöôïc xem laø nhoùm vi sinh vaät chæ thò: Soá löôïng hieän dieän cuûa chuùng trong thöïc phaåm. Ñöôïc xem laø vi sinh vaät chæ thò möùc ñoä veä sinh trong quaù trình cheá bieán, baûo quaûn, vaän chuyeån thöïc phaåm, nöôùc uoáng hay trong caùc loaïi maãu moâi tröôøng ñöôïc duøng ñeå chæ thò khaû naêng hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc. b. Nguoàn goác Vaøo cuoái nhöõng naêm 1800 khi Von Fritsch ñöôïc moâ taû Klebsiella pneumoniae vaø Klebsiella rhinoscleromatis nhö laø vi sinh vaät ñaëc tröng ñöôïc tìm thaáy trong phaân cuûa con ngöôøi. (Geldreich 1978) Naêm 1885 Percy vaø Grace Frankland ñaàu tieân thöôøng xuyeân xeùt nghieäm vi khuaån trong nöôùc ôû London. Robert Koch söû duïng chaát keo raén naáu baèng phöông tieän truyeàn thoáng ñeå ñeám vi khuaån (Hutchinson vaø Ridgway 1977). Ñaàu thaäp nieân 1900 (Cabelli, 1977), oâng cho raèng söï vaéng maët cuûa coliform nhö laø moät daáu hieäu cho thaáy khoâng xuaát hieän beänh do vi khuaån gaây neân, vaø sau khi saûn xuaát khí ñoát vôùi vieäc giôùi thieäu oáng Durham (Durham naêm 1893) thì khaùi nieäm veà vi khuaån Coliform vaø caùc vi khuaån khaùc daïng coli ñöôïc söû duïng ôû nöôùc Anh naêm 1901. Naêm 1908 Bergey vaø Deehan xaùc ñònh coù 256 loaøi khaùc nhau cuûa vi khuaån coliform. Naêm 1909 MacConkey coâng nhaän 128 loaøi khaùc nhau cuûa vi khuaån coliform. Ñeán ñaàu thaäp nieân 1920, söï khaùc bieät cuûa caùc daïng vi khuaån coli ñöôïc ñem ra saûn xuaát indole, hoùa loûng gelatin, leân men ñöôøng sucrose vaø Voges – Proskauer nhaèm xaùc ñònh söï oâ nhieãm faecal (Hendricks 1978). Naêm 1938 Parr coù nhöõng phaùt minh leân ñeán ñænh ñieåm trong thöû nghieäm IMVIC (Indole, Methyl ñoû, voges – Proskauer vaø muoái cuûa acid Citric). Vieäc thöû nghieäm cho thaáy söï khaùc bieät cuûa caùc daïng vi khuaån coliform phaân, caùc daïng vi khuaån trong ñaát vaø trung gian, vaø noù ñöôïc söû duïng cho ñeán ngaøy hoâm nay. c.Ñaëc ñieåm Vi khuaån coliform laø nhöõng tröïc khuaån gram aâm, khoâng hình thaønh baøo töû, coù phaûn öùng oxidase aâm tính vaø theå hieän hoaït tính cuûa β - galactosidase. Vi khuaån naøy coù khaû naêng phaùt trieån treân moâi tröôøng coù muoái maät, hoaëc caùc chaát hoaït tính beà maët khaùc coù tính öùc cheá töông töï, coù theå leân men lactose (vôùi β-galactosidase) cho vieäc saûn xuaát acid vaø sinh hôi khi uû ôû 35 – 37oC trong voøng 24 - 48 giôø ôû 36 ± 2oC. Coliforms goàm 4 chi trong hoï Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter vaø Enterobacter (Metcalf vaø Eddy, 1991). Chuùng thöôøng coù maët trong ñöôøng ruoät cuûa ñoäng vaät coù vuù. (ví duï: Escherichia coli phoå bieán trong ñaát, treân cô theå ngöôøi,…). Chuùng bao goàm vi khuaån leân men lactose nhö Escherichia cloacae, Citrobacter freundii coù theå tìm thaáy trong phaân vaø ngoaøi moâi tröôøng (nöôùc giaøu chaát dinh döôõng, ñaát vaø thöïc vaät) cuõng nhö trong nöôùc uoáng coù noàng ñoä coù caùc chaát dinh döôõng töông ñoái cao. Citrobacter freundii Hình 2.2Escherichia cloacae Hình 2.2: Vi khuaån leân men lactose Coliform chòu nhieät coù khaû naêng leân men ñöôøng lactose ôû 44 – 45oC, noù bao goàm Escherichia vaø loaøi Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Citrobacter Kiebsiella Enterobacter Hình 2.3. Coliform chòu nhieät leân men ñöôøng lactose d. Hieän dieän Vi khuaån coliform hieän dieän ôû khaép nôi, keå caû trong ñaát, da, nöôùc soâng, nöôùc ao, rau caûi,… Söï coù maët cuûa chuùng trong nöôùc vaø rau cuû ñöôïc xem laø moät chæ soá veà söï tinh khieát cuûa nöôùc hay rau. Tuy nhieân chæ soá naøy cuõng khoâng ñaùng tin caäy.Vì vi khuaån coliform vaãn coù khaû naêng soáng soùt trong nöôùc aám, Söï hieän dieän cuûa coliform trong nöôùc khoâng haún laø nöôùc bò nhieãm phaân. Coliform chòu nhieät xuaát hieän töø nôi coù nguoàn nöôùc giaøu chaát höõu cô nhö nöôùc thaûi coâng nghieäp töø xaùc thöïc vaät thoái röõa hoaëc ñaát. Baûng 2.2: Tyû leä phaàn traêm vi khuaån giaûm tröôùc vaø sau khi röûa cuûa rau ngoå vaø laù mô. Loaïi rau vaø vi khuaån Tröôùc khi röûa Sau khi röûa Giaûm Rau ngoå Toång soá vi khuaån Coliform 3.300.000 89.000 37.000 2.300 99% 97% Laù mô Toång soá vi khuaån Coliform 190.000 24.000 160.000 4.800 16% 80% Söï coù maët cuûa coliform trong moâi tröôøng chöùng toû moâi tröôøng ñoù nhieãm baãn coù nguoàn goác töø phaân. Baûng 2.3. Chæ tieâu cuûa coliform trong thöïc phaåm Tieâu chuaån Thöïc phaåm Coliform TCVN5289/92 Caù fillet, toâm, möïc 200/g TCVN4381/92 Toâm voû ñoâng laïnh TCVN4380/92 Toâm thòt ñoâng laïnh TCVN4546/94 Toâm muõ ni ñoâng laïnh TCVN5835/94 Toâm thòt IQF TCVN2644/93 Möïc ñoâng laïnh TCVN5649/92 Haøng khoâ TCVN5526/91 Möïc caù khoâ taåm vò 10/g TCVN6175/9 Nöôùc maém 10/ml Baûng 2.4 Giôùi haïn cho pheùp coliform trong thöïc phaåm Thöïc phaåm Giôùi haïn cho pheùp CFU/g hay CFU/ml thöïc phaåm Saûn phaåm töø thòt: pate, xuùc xích,… 50 Saûn phaåm cheá bieán: toâm, caù, möïc,… 10 Thuûy saûn khoâ sô cheá: Caù khoâ 102 Tröùng 102 Saûn phaåm töø tröùng 10 Söõa 10 Saûn phaåm töø nguõ coác, xöû lyù nhieät tröôùc khi duøng(boät, mieán, mì), duøng tröïc tieáp (baùnh boät). 103 10 Nöôùc giaûi khaùt khoâng coàn 10 Nöôùc khoaùng ñoùng chai 0 2.1.4.3. Escherichia Coli: a. Giôùi thieäu: - Escherichia coli (thöôøng ñöôïc vieát taét laø E.coli) laø moät trong nhöõng vi khuaån soáng kyù sinh trong ñöôøng ruoät cuûa ñoäng vaät. - Vi khuaån E. coli caàn thieát trong quaù trình tieâu hoùa thöùc aên vaø laø thaønh phaàn cuûa khuaån laïc. Söï coù maët cuûa vi khuaån trong nöôùc laø moät chæ thò thöôøng gaëp cho oâ nhieãm phaân. - Vi khuaån naøy ñöôïc duøng ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä oâ nhieãm phaân, bôûi vì noù thöôøng taïo khuaån laïc treân thaønh ruoät vaø noù khoâng gaây nguy hieåm cho söùc khoûe. b. Nguoàn goác: - Naêm 1885 Escherichia coli ñöôïc Buchner tìm ra vaø ñeán naêm 1886 taïi Munchen, moät baùc só nhi khoa teân Theodor Escherich nghieân cöùu ñaày ñuû. E.coli thöôøng soáng trong ruoät giaø, trong tieáng LaTinh ruoät giaø laø colum. Vì toân troïng nhaø khoa hoïc neân ngöôøi ta laáy teân oâng gheùp vaøo chöõ ruoät giaø theo ngöõ phaùp sôû höõu caùch tieáng La Tinh neân vi khuaån naøy coa teân Escherichia coli. - Vi khuaån do Escherich phaùt hieän trong taû loùt cuûa treû em ñöôïc coâng boá vôùi teân goïi ñaàu tieân laø Bacterium coli commune. 4 naêm sau vi khuaån naøy ñöôïc giôùi chuyeân moân ñoåi teân thaønh Escherich nhaèm tri aân ngöôøi coù coâng khaùm phaù. - Naêm 1895 ngöôøi ta laïi goïi baèng teân Bacillus coli. - Naêm 1896 goïi thaønh Bacterium coli. - Naêm 1991 vi khuaån ñöôïc thoáng nhaát toaøn caàu laø Escherichia coli. c. Phaân loaïi khoa hoïc: - Giôùi: Bacteria. - Ngaønh: Proteobacteria. - Lôùp: Gamma Proterobacteria. Hình 2.4: Escherichia coli - Boä: Enterobacteriales. - Hoï: Enterobacteriaceae. - Chi: Escherichia. - Loaøi: E.coli d. Ñaëc ñieåm hình thaùi vaø phaân boá: - Escherichia coli thuoäc hoï Enterobacteriaceae, ñöôïc ñaëc tröng bôûi tính chaát enzyme β–galctosidase vaø β-Glucoronidase,laø loaøi tröïc khuaån hình que, kích thöôùc (1.1 – 1.5) x (2 - 6)μm, coù ñoä daøi 3 μm di chuyeån baèng loâng vaø roi, vi khuaån gram aâm vaø yeám khí tuøy tieän. Khoâng hình thaønh baøo töû, nhieät ñoä thích hôïp laø 35 – 37oC, pH thích hôïp 6.4 – 7.5 (toái öu nhaát laø 7.2 – 7.4), sinh saûn trong khoaûng 5 – 12oC, sinh saûn maïnh ôû 5oC. Noù phaùt trieån ôû nhieät ñoä 44 – 45oC treân moâi tröôøng toång hôïp, leân men ñöôøng lactose vaø mannital coù sinh hôi vaø sinh acid, sinh endol töø triptophan. - Escherichia coli laø moät trong soá thaønh vieân cuûa nhoùm vi khuaån Coliform ñöôïc söû duïng ñeå chæ ra nguoàn phaân. Chuùng ñöôïc xeáp vaøo loaïi coù tính khaùng nguyeân, chuû yeáu laø khaùng nguyeân loaïi O vaø H. Tuy nhieân, chuùng khoâng sinh oxidase hoaëc thuûy phaân ure vaø moät soá khoâng sinh hôi, coù theå phaùt trieån ôû 37oC. - Chuùng phaân boá ôû khaép nôi trong moâi tröôøng ñaëc bieät trong thöïc phaåm, nöôùc vaø ruoät giaø. e. Ñaëc ñieåm sinh hoùa vaø nuoâi caáy: - Trong moâi tröôøng loûng, sau 4 – 5 giôø E.coli laøm ñuïc nheï moâi tröôøng, caøng ñeå laâu caøng ñuïc, coù muøi hoâi thoái, sau vaøi ngaøy coù noåi vaùng moûng treân moâi tröôøng. - Treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng, sau 24 giôø hình thaønh nhöõng khuaån laïc daïng S coù maøu xaùm traéng, troøn, öôùt, beà naët boùng, kích thöôùt khoaûng 2 – 3mm. + Treân moâi tröôøng thaïch EMB: E.coli cho khuaån laïc tím aùnh kim. + Treân moâi tröôøng thaïch MacConkey: E.coli cho khuaån laïc ñoû hoàng. + Treân moâi tröôøng thaïch nghieâng TSI: E.coli taïo acid/acid (vaøng/vaøng). Ñeå phaân bieät E.coli vaø caùc vi khuaån ñöôøng ruoät khaùc, ngöôøi ta duøng thöû nghieäm IMViC. E.coli cho keát quaû IMViC laø ++ - - hoaëc - + - - f. Yeáu toá khaùng nguyeân: E.coli coù caáu truùc khaùng nguyeân raát phöùt taïp, heä thoáng phaân nhoùm naøy döïa vaøo vieäc xaùc ñònh khaùng nguyeân beà maët O,H,K. Ÿ Khaùng nguyeân thaân O: Coù baûn chaát laø lipopolysaccharide cuûa maøng ngoaøi teá baøo, beàn vôùi nhieät vaø coàn. Khaùng nguyeân O coù theå phaùt hieän baèng phaûn öùng ngöng keát vaø giöõ vai troø nhaát ñònh ñoái vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa doøng vi khuaån vaø coù tính chaát chuyeân bieät cho töøng loaïi vaät chuû. Ÿ Khaùng nguyeân loâng H: Coù baûn chaát laø Protein, taïo neân khaû naêng di ñoäng cuûa E.coli, keùm chòu nhieät. Coù khoaûng 56 type khaùng nguyeân. Ÿ Khaùng nguyeân giaùp moâ K: Söï hieän dieän cuûa khaùng nguyeân K ôû vi khuaån, neáu vi khuaån chæ ngöng keát vôùi khaùng huyeát thanh O khi bò nung noùng. Döïa vaøo khaû naêng chòu nhieät ngöôøi ta chia khaùng nguyeân K thaønh 3 type A,L,B vaø ngöôøi ta phaân loaïi khaùng nguyeân naøy döïa vaøo tính chaát hoùa hoïc. Moät vaøi E.coli tieát ñoäc toá ruoät coù nhöõng loâng baùm, nhöõng loâng baùm naøy baûn chaát laø protein neân vieäc saép xeáp chuùng vaøo khaùng nguyeân K laø khoâng phuø hôïp vaø sau ñoù chuùng ñöôïc xeáp vaø khaùng nguyeân tieâm mao F. Ÿ Khaùng nguyeân tieâm mao F: Tham gia vaøo söï di chuyeån, ngaén hôn vaø nhieàu hôn flagella, daïng thaúng, xoaén, daøi khoaûng 4μm, ñöôøng kính 2,1 – 7,0nm. Tieâm mao giuùp vi khuaån keát dính vaøo teá baøo nieâm maïc neân raát quan troïng trong khaû naêng gaây beänh cuûa vi khuaån. Ví duï: E.coli coù maõ soá O157:H7 laø vi khuaån thöôøng gaëp nhaát. Chuùng laø nguyeân nhaân gaây beänh tieâu chaûy coù maùu vaø gaây toån thöông thaän ôû ngöôøi. Ngöôøi bò nhieãm truøng vi khuaån STEC thöôøng coù trieäu chöùng ñau thaét bao töû, tieâu chaûy thöôøng coù maùu vaø oùi möûa. Hình 2.5: E.coli O157:H7 – Vieäc söû duïng E.coli laø moät vi sinh vaät chæ thò ñöôïc giôùi haïn bôûi caùc yeáu toá: + E.coli khoâng phaûi laø moät loaøi vi sinh vaät chæ thò duy nhaát. + Noù laø moät trong soá caùc chi cuûa nhoùm Coliform nhö Proteus vaø Aerobacter thöôøng ñöôïc tìm thaáy beân ngoaøi ñöôøng ruoät cuûa con ngöôøi. + Caùc vi sinh vaät khaùc tìm thaáy trong nöôùc nhöng khoâng ñaïi dieän cho phaân oâ nhieãm maø chuùng coù moät soá ñaëc ñieåm gioáng E.coli. g. Tính chaát gaây beänh Khi cô theå bò nhieãm vi khuaån vôùi soá löôïng lôùn keøm theo ñoäc toá cuûa chuùng E.coli gaây tieâu chaûy goàm caùc nhoùm sau: - Nhoùm EPEC (Entreropathaogenic E.coli): Gaây tieâu chaûy cho caùc em döôùi 2 tuoåi. - Nhoùm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): Gaây beänh cho teû em, ngöôøi lôùn tieát ra ñoäc toá ruoät ST vaø LT(Gaây tieâu chaûy traàm troïng vaø keùo daøi). - Nhoùm EIEC (Enteroinvasine E.coli): Gaây vieâm loeùt nieâm maïc gaây tieâu chaûy coù maùu. - Nhoùm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vöøa tieâu chaûy vaø laø nguyeân nhaân gaây vieâm ñaïi traøng xuaát huyeát, laøm toån thöông nieâm maïc gaây söng,.. h. Nguyeân nhaân - Veä sinh khoâng saïch seõ cuûa ngöôøi cheá bieán, chuû yeáu laø töø thöïc phaåm. Ñaây laø moät nguyeân nhaân quan troïng gaây neân beänh vieâm ruoät, vaø caùc trieäu chöùng tieâu chaûy. - Do oâ nhieãm töø phaân ngöôøi vaøo thöïc phaåm, söû duïng caùc saûn phaåm khoâng qua cheá bieán kyõ, khoâng ñöôïc thanh truøng, khöû truøng,… - Vi khuaån E.coli vôùi soá löôïng 106 – 1010 teá baøo seõ gaây beänh. i. Bieän phaùp phoøng ngöøa - Naáu nöôùng kyõ thöïc phaåm, baûo quaûn ñaûm baûo ñuû nhieät ñoä laïnh seõ ngaên chaën ñöôïc söï laây nhieãm, ñaëc bieät laø thao taùc cuûa ngöôøi cheá bieán. - Traùnh ñeå thöïc phaåm laâu trong tuû laïnh vaø caàn naáu kyõ laïi tröôùc khi aên, ñeå traùnh ñöôïc söï laây nhieãm giöõa thöïc phaåm töôi soáng vaø thöïc phaåm chín. 2.1.4.4. Faecal Streptococcus a. Giôùi thieäu - Söï xuaát hieän cuûa Faecal Streptococcus cho thaáy vieäc oâ nhieãm xaûy ra trong nöôùc raát gaàn, vaø moät soá loaøi Streptococcus faecal coù lieân keát vôùi caùc ñoäng vaät maùu noùng khaùc. Ví duï: S.bovis chuû yeáu xaûy ra ôû gia suùc vaø cöøu; S.equinus coù trong ngöïa vaø S.avium coù ôû gia caàm vaø caùc loaøi chim. Vieäc so saùnh soá löôïng E.coli vaø Streptococcus faecal trong nöôùc coù theå ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh oâ nhieãm precisesource. - Trong phoøng thí nghieäm chuùng ñöôïc ñònh nghóa laø taát caû caùc vi sinh vaät saûn xuaát maøu ñoû hoaëc maøu hoàng trong voøng 48 giôø ôû 35 ± 1.0oC (Phöông phaùp Standard, 1989). b. Phaân loaïi - Giôùi: Bacteria - Ngaønh: Firmicutes - Lôùp: Bacilli - Boä: Lactobacillales Hình 2.6: Streptococcus - Hoï: Streptococcaceae - Chi: Streptococcus - Loaøi: S. bovis vaø S. equinus… c. Ñaëc ñieåm - FS ñöôïc ñaïi dieän bôûi caùc nhoùm Enterococcus. spp; Streptococcus bovis vaø S.equinus (WHO 1997). Trong ñoù, chæ tieâu oâ nhieãm phaân laø Enterococci. - Caùc nhoùm lieân caàu khuaån Faecal Streptococcus bao goàm moät soá loaøi cuûa chi Streptococcus. Chuùng laø vi khuaån gram döông, - Chuû yeáu soáng trong ñöôøng ruoät cuûa ñoäng vaät nhö Streptococus bovis vaø S.equinus. Vieäc ñaùnh giaù soá löôïng Fecal streptococci trong nöôùc thaûi ñöôïc tieán haønh thöôøng xuyeân, vaø chuùng raát deã cheát khi coù söï thay ñoåi nhieät ñoä. Moät soá loaøi coù phaân boá roäng hôn hieän dieän trong ñöôøng ruoät ngöôøi vaø ñoäng vaät nhö: S.faecalis vaø S. faecium hoaëc coù 2 biotype (S. faecalis var liquefaciens vaø loaïi S. faecalis coù khaû naêng thuûy phaân tinh boät). - Trong thöïc teá, S.faecalis toàn taïi trong moâi tröôøng nöôùc toát hôn E.coli. 2.1.4.5. Enterococcus: a. Giôùi thieäu: - Enterococcus laø vi khuaån aicd lactic cuûa Firmicutes phylum. Caàu khuaån gram döông thöôøng xaûy ra trong caëp hoaëc chuoãi ngaén vaø raát khoù ñeå phaân bieät vôùi Streptococcus veà ñaëc tính. - Naêm 1984 khi phaân tích di truyeàn DNA ngöôøi ta ñaõ tìm ra ñöôïc söï khaùc bieät cuûa chi Enterococcus ñöôïc phaân loaïi nhö Streptococcus. - Noù laø vi sinh vaät kî khí tuøy nghi, khoâng caàn oxi cho quaù trình chuyeån hoùa nhöng noù coù theå soáng trong moâi tröôøng giaøu oxi. Chuùng khoâng coù khaû naêng hình thaønh baøo töû, chòu ñöôïc nhieät ñoä 10 – 45oC, pH = 4.5 – 10.0, vaø noàng ñoä NaCl cao. b. Phaân loaïi: - Giôùi: Bacteria - Ngaønh: Firmicutes Hình 2.7: Enterococcus -Lôùp: Bacilli - Boä: Lactobacillales - Hoï: Enterococcaceae - Chi: Enterococcus - Loaøi: E.avium; E.duans; E.faecalis; E.faecium; E.solitarius… c. Ñaëc ñieåm: - Nhoùm Enterococcus bao goàm hai chuûng laø S.faecalis vaø S faecium (metcalf vaø Eddy, 1991). - Chuùng ñöôïc phaân bieät vôùi Streptococcus bôûi khaû naêng phaùt trieån trong natri clorua 6.5%, ôû pH 9.6 vaø ôû 10oC – 45oC. - Enterococci ñöôïc xem laø vi khuaån chæ thò chaát löôïng nöôùc, ñaëc bieät laø chæ thò cho chaát löôïng nöôùc bieån (Theo tieâu chuaån phöông phaùp nawm; EPA, 1986). - Chieám öu theá trong ñöôøng ruoät nhö E. faecalis enterococci, E.faecium, E.durans vaø E.hirae… Ngoaøi ra cuõng coù moät soá loaøi ñöôïc tìm thaáy trong ñöôøng ruoät nhö S.bovis vaø S. equinus. d. Taêng tröôûng - Enterococci gram döông coù nhieàu khoù tính trong nhu caàu dinh döôõng hôn gram aâm. Gram döông yeâu caàu cung caáp yeáu toá taêng tröôûng nhieàu hôn ñaëc bieät laø vitaminB vaø acid amin nhaát ñònh. - Chuùng phaùt trieån ôû phaïm vi roäng. Maëc duø laø vi sinh vaät öa khí nhöng chuùng khoâng saûn xuaát catalase (tröø pseudonolase bôûi moät soá chuûng tröôûng thaønh trong söï hieän dieän cuûa oxi), vaø ñöôïc phaùt trieån toát ôû ñieàu kieän cuûa quaù trình oxy hoùa thaáp. e. Trieäu chöùng - Gaây nhieãm truøng ñöôøng tieát nieäu vaø nhieãm truøng veát thöông, caùc beänh nhieãm truøng khaùc aûnh höôûng ñeán van tim, vieâm noäi taâm maïc vaø boä naõo. f. Bieän phaùp phoøng beänh - Naáu nöôùng kyõ thöïc phaåm, baûo quaûn ñaûm baûo ñuû nhieät ñoä laïnh seõ ngaên chaën ñöôïc söï laây nhieãm, ñaëc bieät laø thao taùc cuûa ngöôøi cheá bieán. - Traùnh ñeå thöïc phaåm laâu trong tuû laïnh vaø caàn naáu kyõ laïi tröôùc khi aên, ñeå traùnh ñöôïc söï laây nhieãm giöõa thöïc phaåm töôi soáng vaø thöïc phaåm chín. 2.1.4.6. Bifidobacterium Ñöôïc nghieân cöùu treân phaân cuûa treû sô sinh khoaûng naêm 1900 do Tisser ñaët teân noù laø Bacillus bifidus; sau naøy noù ñöôïc ñaëc teân laø Lactobacilius bifidus vaø hieän taïi Bifidobacterium bifidum. Bifidobacteria ñöôïc duøng ñeå chæ thò söï oâ nhieãm phaân. Ñaëc ñieåm hình thaùi vaø yeâu caàu taêng tröôûng Nhöõng vi khuaån gram döông, kî khí coù nhieät ñoä taêng tröôûng toái thieåu vaø toái ña phaïm vi laø 25 – 28oC vaø 43o – 45oC, töông öùng. Chuùng phaùt trieån toát trong khoaûng pH 5 – 8 vaø saûn xuaát acid lactic vaø acetic laø chính saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình chuyeån hoùa carbohydrate cuûa chuùng. Phaân loaïi Ngaønh: Actinobacteria Lôùp: Actinobacteria Boä: Bifidobacteriales Hoï: Bifidobacteriaceae Hình 2.8: . Bifidobacterium Chi: Bifidobacterium Loaøi: Bifidobacterium spp Phaân phoái: Chuùng ñöôïc tìm thaáy trong phaân ngöôøi ôû caáp baäc cao hôn moãi gam (108 - 109) hôn E.coil (106 - 107), vaø ñieàu naøy ñaõ laøm cho chuùng trôû neân caùc chæ soá oâ nhieãm phaân con ngöôøi. Phöông phaùp phaân bieät giöõa gioáng trong phaân ngöôøi vaø phaân ñoäng vaät ñöôïc ñöa ra bôûi Gavinietal vaø chia Bifidobacteria vôùi nhöõng nguoàn goác töø ngöôøi thuoäc nhoùm I, III, VII. Gaàn ñaây chuùng ñöôïc ñeà xuaát nhö chæ thò oâ nhieãm phaân trong nöôùc ngoït nhieät ñôùi khi chuùng cheát giaûm nhanh hôn coliform hoaëc Enterococci. Bifidobacteria thöôøng gaëp trong nguõ coác rau quaû, ñoäng vaät. Hình 2.9: Bifidobacterium 2.1.4.7. Staphylococcus aureus: a. Giôùi thieäu: Hình 2.10: Staphylococcus aureus - S.aureus do Robert Koch (1843 - 1910) phaùt hieän naêm 1878 phaân laäp töø muû ung nhoït vaø Louis Pasteur (1880) ñeàu nghieân cöùu tuï caàu khuaån töø thôøi kyø ñaàu cuûa lòch söû ngaønh vi sinh vaät hoïc. - Ngaøy 9 thaùng 4 naêm 1881, baùc só ngöôøi Scotlsnd Alexander Ogston ñaõ trình baøy taïi hoäi nghò laàn thöù 9 Hoäi Phaåu Thuaät Ñöùc moät baùo caùo khoa hoïc trong ñoù oâng söû duïng khaùi nieäm tuï caàu khuaån (Staphylococcus) vaø trình baøy töông ñoái ñaày ñuû vai troø cuûa vi khuaån naøy trong caùc beänh lyù sinh muû trong laâm saøng. Ñeán naêm 1884 ñöôïc Rosenbach nghieân cöùu tæ mó, noù thuoäc hoï Microccaeae. - Söï hieän dieän cuûa Staphylococcus aureus trong thöïc phaåm chæ thò ñieàu kieän veä sinh vaø kieåm soaùt nhieät ñoä keùm cuûa quaù trình cheá bieán. b. Phaân loaïi khoa hoïc: - Giôùi: Eubacteria - Ngaønh: firmicutes - Lôùp: Bacilli - Boä: Bacillales Hình 2.11: Staphylococcus - Hoï: Staphylococcaceae - Chi: Staphylococcus - Loaøi: S.aureus c. Phaân boá vaø hình daïng teá baøo: - Chuùng phaân boá roäng raõi trong töï nhieân, coù nhieàu trong saûn phaåm ñoäng vaät nhö thòt, söõa,… ÔÛ ngöôøi thöôøng coù treân da, toùc, khoang muõi. - Bò laây nhieãm töø ngöôøi cheá bieán, ñoäng vaät bò nhieãm beänh, ñöôïc xeáp vaøo nhoùm vi khuaån cô hoäi, vì söï coù maët roäng raõi vaø thöôøng xuyeân trong moâ vaø chôø ñôïi ñieàu kieän thuaän lôïi ñeå xaâm nhaäp. - Vi khuaån Staphylococcus aureus hình caàu, ñöôøng kính 0.8 – 1.5μm, gram döông, coù khaû naêng sinh noäi ñoäc toá gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. Caùc teá baøo thöôøng lieân keát thaønh caùc chuøm nho, khoâng taïo baøo töû, khoâng di ñoäng, coù khaû naêng sinh coagulase. - S.aureus hieáu khí hay kî khí yù coù khaû naêng leân men vaø sinh axit töø manitol, trehalose, saccarose. Coù khaû naêng taêng tröôûng treân moâi tröôøng coù ñeán 15% NaCl. Moät soá doøng coù khaû naêng laøm tan maùu treân moâi tröôøng thaïch maùu. Ñöôøng kính voøng tan maùu phuï thuoäc vaøo töøng chuûng nhöng ñeàu nhoû hôn ñöôøng kính cuûa khuaån laïc. - Khi phaùt hieän trong moâi tröôøng, taïo saéc toá vaøng sau 1 – 2 ngaøy nuoâi caáy ôû nhieät ñoä phoøng vaø ñeàu toång hôïp enterotoxin ôû nhieät ñoä treân 150C, nhieàu nhaát laø khi taêng tröôûng ôû 35 – 370C. d. Ñaëc ñieåm sinh hoùa vaø ñieàu kieän sinh tröôûng: - S.aureus coøn ñöôïc goïi laø tuï caàu khuaån gaây beänh, do ñoù caàn xaùc ñònh ñeå bieát maãu saûn phaåm thöïc phaåm phaân tích coù mang moái nguy hieåm cho ngöôøi tieâu duøng hay khoâng. - Staphylococcus aureus ñöôïc xaùc ñònh treân cô sôû caùc ñaëc ñieåm taêng tröôûng vaø phaûn öùng ñoâng huyeát töông cuûa caùc doøng thuaàn töø caùc khuaån laïc ñaëc tröng treân moâi tröôøng phaân laäp. - Phaùt trieån toát ôû moâi tröôøng toång hôïp, ñaëc bieät ôû moâi tröôøng thaïch maùu hoaëc huyeát thanh. Nhieät ñoä toái thích 37oC, pH toái öu = 7.2. - Leân men ñöôøng glucose, lactose, maltose, sacharose, glycerol, manitol. Khoâng leân men salicin,raffinose, inulin. - Coù khaû naêng chòu maên cao, chuùng laøm ñoâng tuï söõa. Sinh beta hemolysis trong moâi tröôøng thaïch maùu. - Phaûn öùng indol - , NH3 - , thuûy phaân gelantine, ñoâng huyeát töông. - Treân moâi tröôøng thaïch khuaån laïc coù daïng hình troøn trôn boùng, ñuïc môø. - Treân moâi tröôøng loûng, teá baøo ôû daïng caën, voøng nha._.ãn môø trong oáng nghieäm ôû beà maët moâi tröôøng. e. Caùc yeáu toá ñoäc löïc: - Hyaluronidase: Men naøy coù khaû naêng phaù huûy chaát cô baûn trong cô theå vaø giuùp vi khuaån phaùt taùn trong toå chöùc. - Hemolysine vaø Leukocidine: Phaù huûy hoàng caàu (tan maùu) vaø gaây cheát caùc teá baøo haït cuõng nhö ñaïi thöïc baøo. - exfoliatine: Laø men phaù huûy lôùp thöôïng bì, men naøy gaây toån thöông da taïo boïng nöôùc. Ví duï: hoäi chöùng Lyell do tuï caàu. - Saùu ñoäc toá ruoät: (Enteroxine A,B,C,D,E,F) beàn vôùi nhieät. Caùc ñoäc toá ruoät ñoùng vai troø trong ngoä ñoäc thöïc phaåm. - Ñoäc toá gaây hoäi chöùng soác nhieãm ñoäc: Laø nguyeân nhaân gaây neân hoäi chöùng soác nhieãm ñoäc, moät hoäi chöùng soát traàm troïng. - Haàu heát caùc chuûng tuï caàu khuaån ñeàu saûn xuaát ñöôïc men penicillinase (beta - lactamase). Men naøy phaù huûy voøng beta – lactam, caáu truùc cô baûn cuûa caùc khaùng sinh nhö penicillineG, Ampicilline vaø Uredopenicilline laøm cho khaùng sinh naøy maát taùc duïng. f. Khaû naêng gaây beänh: f.1. Gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm: - Beänh gaây ra do vi khuaån tieát ñoäc toá vaøo thöïc phaåm, ngöôøi aên thöïc phaåm ñoù seõ bò ngoä ñoäc. Khoâng caàn coù söï hieän dieän cuûa vi khuaån coøn soáng trong thöïc phaåm maø chæ caàn coù ñoäc toá cuûa chuùng, vaø ít coù khaû naêng truyeàn nhieãm. - Ñoäc toá gaây vieâm daï daøy, vieâm ruoät. Type A vaø D gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm cho ngöôøi. f.2. trieäu chöùng: - Sau 30’ – 6h ñau thaét buïng, tieâu chaûy, noân möûa keùo daøi töø 6 – 8h, kieät söùc, ñau ñaàu toaùt moà hoâi, buûn ruûn tay chaân. - Laø ñoäc toá beàn nhieät. Con ñöôøng laây nhieãm chuû yeáu thoâng qua tieáp xuùc töø nhaø beáp, quaù trình cheá bieán. f.3. Ñieàu trò: - Söû duïng thuoác khaùng sinh: Tuøy vaøo töøng tröôøng hôïp ngöôøi ta söû duïng thuoác khaùng sinh khaùc nhau cho beänh nhaân, tuy nhieân ngöôøi ta caàn laøm khaùng sinh ñoà cho töøng beänh nhaân vaø duøng gamma- globuline choáng tuï caàu. - Quaù trình thích öùng vaø thôøi gian ñieàu trò. f.4. Phoøng ngöøa: - Thöïc hieän toát veä sinh caù nhaân vaø sinh hoaït haèng ngaøy, aên uoáng hôïp veä sinh, naáu kyõ tröôùc khi duøng. Khoâng laáy söõa töø ñoäng vaät vieâm vuù, tröû laïnh thöïc phaåm < 8oC, ngaên ngöøa khaû naêng sinh ñoäc toá. - Taêng cöôøng uoáng vitamin, naêng cao söùc khoûe, röûa tay baèng nöôùc noùng vaø xaø phoøng, haï pH cuûa thöïc phaåm ñeå öùc cheá vi khuaån phaùt trieån… 2.1.4.8. Clostridium: a. Giôùi thieäu: - Vi khuaån Clostridium ñöôïc Emile van Ermengem phaân laäp vaøo naêm 1895. - Naêm 1896, Emile Van Ermengem tìm ra maàm beänh ngoä ñoäc thòt (vi khuaån Clostridium botulinum).Keâ ûtöø naêm 1953 taát caû caùc loaøi neurotoxins botulinum sinh (loaïi A - G) ñaõ ñöôïc cho raèng C.botulinum, nhöng sau ñoù kieåu hình vaø kieåu gen ñaùng keå toàn taïi ñeå chöùng minh tính khoâng ñoàng nhaát trong caùc loaøi. Ñieàu naøy ñaõ daãn ñeán vieäc phaân loaïi laïi cuûa C.botulinum loaïi G gioáng nhö moät loaøi. - Naêm 2003 boä gen cuûa C.botulinum ñöôïc coâng boá (coâng trình cuûa vieän Sanger vôùi tieán só Roger Huston vaø tieán só M.Peck). b. Phaân loaïi khoa hoïc: - Giôùi: Bacteria Hình 2.12: Clostridium - Ngaønh: Firmicutes - Lôùp: Clostridia - Boä: Clostridiales - Hoï: Clostridiaceae - Chi: Clostridium - Loaøi: Clostridium spp c. Ñaëc ñieåm: - Clotridium laø caùc vi khuaån gram döông, hình que, kî khí, sinh baøo töû, phaàn lôùn di ñoäng, coù theå thuûy phaân ñöôøng vaø protein trong caùc hoaït ñoäng thu nhaän naêng löôïng. Haàu heát nhoùm Clostridium ñeàu öa nhieät tuy nhieân coù moät soá loaøi öa nhieät vaø moät soá loaøi thuoäc nhoùm öa laïnh. Caùc loaøi gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm quan troïng laø C.botulinum vaø C.perfringens. - C.botulinum laø loaøi soáng kî khí baét buoäc, chæ taêng tröôûng ñööïoc trong moâi tröôøng trung tính, khoâng coù söï caïnh tranh vôùi caùc vi sinh vaät khaùc. Caùc doøng trong loaøi naøy coù caùc ñaëc ñieåm nuoâi caáy khaùc nhau vaø coù 6 kieåu khaùng nguyeân ñöôïc kyù hieäu töø A-F. Kieåu kyù hieäu nguyeân A,B vaø F coù hoaït tính thuûy giaûi protein taïo neân moät voøng phaân giaûi xung quanh khuaån laïc treân moâi tröôøng Willin vaø Hobbs, coøn caùc kieåu C,D vaø E khoâng coù khaû naêng naøy. Kieåu A thöôøng thaáy treân caùc maãu thòt trong khi kieåu E chæ ñöôïc phaân laäp treân caùc maãu caù. - C.perfringens laøloaøi kî khí khoâng baét buoäc, raát ít khi taïo baøo töû trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy nhaân taïo, nhöng coù theå quan saùt ñöôïc baøo töû treân moâi tröôøng nuoâi caáy Ellner, moâi tröôøng coù boå sung muoái maät vaø bicarbonate hay quinoline. Loaøi naøy coù 6 kieåu khaùng nguyeân ñöôïc kyù hieäu töø A – F. Kieåu khaùng nguyeân A thöôøng gaây hoaïi töû cho caùc veát thöông vaø gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. - Maät ñoä vi khuaån Clostridium ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch söû duïng moâi tröôøng coù chöùa ferri ammonium citrate vaø disodium sulphate, uû ôû 370C trong 1 -2 ngaøy. Neáu nghi ngôø coù öa nhieät thì uû theâm ôû 500C. Treân moâi tröôøng naøy caùc khuaån laïc Clostridium coù maøu ñen do phaûn öùng giöõa ion sulphite (S2-) vaø ion saét (Fe2+) coù trong moâi tröôøng. d. Caáu truùc teá baøo vaø phaân töû cuûa C.botulinum: d.1. Caáu truùc teá baøo: Kích thöôùc 0.3 – 0.7μm x 3.5 – 7.0μm, coù hình que, khoâng coù roi, laø vi khuaån gram döông, sinh baøo töû. Tuy nhieân baøo töû thöôøng to hôn chieàu ngang cuûa teá baøo. d.2. Caáu truùc phaân töû: Hình 2.13: Caáu truùc phaân töû Toxin ñöôïc toång hôïp töø moät chuoãi polypeptid coù troïng löôïng phaân töû gaàn 150.000 dalton. ÔÛ caáu truùc naøy, phaân töû ñoäc toá coù hoaït löïc töông ñoái thaáp, nhöng khi bò moät soá enzyme cuûa vi khuaån vaø trypsin taùch ra thaønh hai chuoãi naëng (100.000 dalton) vaø nheï (50.000 dalton) noái vôùi nhau baèng caàu noái sulfur coù gaén vôùi moät phaân töû Zn. e. Cô cheá gaây beänh: e.1. Yeáu toá ñoäc löïc: Nhoùm I Nhoùm II Nhoùm III NhoùmIV Caùc loaïi ñoäc toá A,B,F B,E,F C,D G Proteolysis + - Yeáu - Saccharolysis - + - - Beänh chuû Con ngöôøi Con ngöôøi Ñoäng vaät - Ñoäc toá gen Nhieãm saéc theå Nhieãm saéc theå Bacteriophage Plasmid Close relatives C.Sporogens C.putrificum C.butyricum C.beijerinickii C.haemolyticum C.novyi type A C.subterminale C.haemolyticum Baûng 2.5: Caùc ñoäc toá gaây haïi cho ngöôøi vaø ñoäng vaät e.2. Cô cheá gaây beänh cuûa Clostridium botulinum: - Clostridium botulinum seõ tieát ra moät ñoäc toá sinh hoïc maïnh öùc cheá söï phoùng thích hoaït ñoäng cuûa caùc boù cô, taùc ñoäng ñeán nôi tieáp hôïp cholinergic qua trung gian Calcium vaøo khe sinap laøm maát khaû naêng chi phoái hoùa hoïc taïi choå vaø maát hoaït ñoäng thaàn kinh cuûa sôïi nôron vaän ñoäng trong thoi cô. Hoaït chaát naøy taùc ñoäng taïi nôi tieáp hôïp thaàn kinh cô neân ngaên caûn söï phoùng thích Acetylcholine vaø gaây ra lieät. - Ñoäc toá cuûa Clostridium botulinum taùc duïng qua 3 giai ñoaïn: Keát noái, Thaâm nhaäp, ÖÙc cheá söï phoùng thích chaát daãn truyeàn thaàn kinh. Ñoäc toá naøy khoâng aûnh höôûng vaøo söï toång hôïp hay döï tröõ Acetylcholine nhöng aûnh höôûng vaøo söï phoùng thích chaát naøy ôû sôïi taän cuøng tieàn tieáp hôïp. Hình2.14: Cô cheá gaây beänh cuûa ñoäc toá Toxin f. Thöïc phaåm truyeànnhieãm: - Phaùt hieän trong ñoà hoäp (thòt, caù, pate, xuùc xich, rau quaû,…)laïp xöôûng, caù öôùp muoái hoaëc phôi khoâ… thöùc aên cheá bieán saün, maät ong. - Thöïc phaåm nhieãm Clotridium botulinum raát khoù nhaän bieát baèng caûm quan. Chæ nhaân bieát ñöôïc sau khi söû duïng qua nhöõng daáu hieäu laâm saøng. g. Trieäu chöùng vaø bieän phaùp ñieàu trò phoøng ngöøa: - Thôøi gian uû beänh 6 – 24h, bieåu hieän sau 12 – 36h, beänh keùo daøi 4 – 8 ngaøy, tyû leä töû vong tôùi 60% - 70%. Noân möûa, meät moûi, nhöùc ñaàu, maét môø khoâng nhìn roõ, ñau hoïng, khoâ muõi, khoù nuoát, suïp mí maét. - Khoâng duøng ñoà hoäp maø naép bò phoàng hoaëc chaûy nöôùc. - Caån thaän vôùi moùn rau caûi, toûi ngaâm daàu, khoâng duøng thöïc phaåm hö, noåi boït, thuùi, boùt muøi laï luùc naáu. - Giöõ veä sinh saïch seõ, röõa tay baèng xaø phoøng vaø giöõ thöïc phaåm ôû nhieät ñoä thích hôïp. 2.1.4.9. Bacillus cereus: a. Giôùi thieäu: - B.cereus ñöôïc phaùt hieän laàn ñaàu tieân trong moät ca nhieãm ñoäc thöïc phaåm vaøo naêm 1955. Noù laø loaøi vi khuaån hieáu khí, baøo töû daïng hình oval, coù khaû naêng sinh nha baøo. Laø tröïc khuaån gram döông. b. Phaân loaïi: - Giôùi: Bacteria - Ngaønh: Firmicutes - Lôùp: bacilli Hình 2.15: Bacillus cereus - Boä: Bacillales - Hoï: Bacillaceaem - Chi: Bacillus - Loaøi: Cereus Ngoaøi loaøi cereus coøn coù moät soá loaøi nhö: Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, bacillus thuringiensis, Bacillus natto, Paenibacillus larvae. c. Ñaëc ñieåm vaø phaân boá: - Tröïc khuaån gram döông, taïo noäi baøo töû, kích thöôùc (0.5 – 1.5) x (2 – 4)μm, khoâng taïo giaùp moâ, khoâng coù khaû naêng di ñoäng. Nhieät ñoä thích hôïp 35 – 40oC, pH = 4.5 – 9.3. - Treân moâi tröôøng TSA sau 24h taïo khoùm lôùn, nhaên nheo, xuø xì, Ñoái vôùi moâi tröôøng MYP ()Mannitol Egg Yolk Polymixin: khoùm hoàng xung quanh coù maøu hoàng saùng, treân moâi tröôøng Mosel (thaïch cereus selective agar): Khoùm to hoàng xung quanh coù voøng saùng. - Phaân boá nhieàu trong töï nhieân, chuùng nhieãm vaøo caùc loaïi thöùc aên qua ñeâm hay tröõ laïnh laâu thöôøng gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. d. Tính chaát sinh hoùa: - Treân moâi tröôøng ñöôøng: leân men glucose trong ñieàu kieän hieáu khí, khoâng leân men mantose, khöû nitrat thaønh nitrit, coù khaû naêng phaân giaûi Tyroxin, Catalase(+), Citrate(+). Hình 2.16: Caáu truùc sinh hoùa cuûa Bacillus cereus e. Cô cheá gaây beânh: e.1. Ñoäc toá: - Ñoäc toá gaây tieâu chaûy (Diarrhoed toxin): Vi khuaån saûn sinh ñoäc toá trong thòt, rau quaû, gia vò. Laø moät loaïi protein gaây huûy hoaïi bieåu bì maïc ruoät, gaây tieâu chaûy. - Ñoäc toá gaây noân möûa emetic toxin: coù maët trong gaïo, côm nguoäi, ñaäu caùc loaïi. Baûn chaát laø phospholipit coù tính oån ñònh vaø khoâng bò phaân huûy ôû nhieät ñoä cao vaø dòch daï daøy. - Ngoaøi ra chuùng coøn gaây cheát ngöôøi bôûi enzyme hemolyzin, gaây nhieãm truøng, vieâm maøng naõo,… e.2. Cô cheá: Baøo töû cuûa B.cereus baùm vaøo caùc teá baøo Caco – 2 (treân caùc teá baøo bieåu moâ cuûa ngöôøi). Sau khi baùm vaøo caùc baøo töû naûy maàm moät caùch nhanh choùng trong voøng 1h, hình thaønh teá baøo B.cereus dinh döôõng treân ñænh cuûa caùc bieåu moâ, tieáp ñoù seõ saûn sinh ra ñoäc toá. Ñoäc toá xuaát hieän trong ñöôøng ruoät seõ taäp trung ôû vuøng ngoaïi bieân cuûa oáng ruoät seõ taêng cao hôn trong lumen gaây ra beänh moät caùch traàm troïng. f. Trieäu chöùng vaø bieän phaùp phoøng ngöøa: - Thöùc aên chöùa maät ñoä vi khuaån 105/g thöïc phaåm seõ gaây ñoäc. Daãn ñeán ñau buïng, buoàn noân sau 1 – 5h beänh keùo daøi 24h. - Phoøng: Khoâng aên thöùc aên ñeå nguoäi qua ñeâm, thöùc aên luoân ñöôïc haâm noùng treân 80oC tröôùc khi aên. 2.1.4.10. Streptococcus faecalis: a. Giôùi thieäu: Hình 2.17: Streptococcus - Tröôùc naêm 1984, enterococci laø thaønh vieân cuûa Streptococcus nhö vaäy E.faecalis ñöôïc goïi laø Streptococcus faecalis. - Streptoccus laø lieân caàu khuaån, coù daïng hình caàu hoaëc hình ovan keùo daøi. Laø vi khuaån gram döông, khoâng di ñoäng, khoâng sinh baøo töû, moät soá doøng coù taïo voû nhaøy. - Laø vi khuaån hieáu khí tuøy tieän nhöng phaùt trieån toát trong ñieàu kieän kò khí. Khuaån laïc coù maøu hoàng ñeán maøu ñoû ñaäm, khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng azide tetrazolium chöùa TTC. Coù phaûn öùng catalase vaø oxidase aâm tính, chuùng chòu ñöôïc noàng ñoä muoái 6.4%, pH= 4.5 – 10, nhieät ñoä 10 – 45oC. b. Ñaëc ñieåm vaø phaân boá: - Laø chæ tieâu ñeå xaùc ñònh möùc ñoä oâ nhieãm phaân cuûa thöïc phaåm. - Thuoäc nhoùm lieân caàu khuaån phaân, ñöôøng kính < 2μm. Nhieät ñoä thích hôïp cho sinh tröôûng vaø phaùt trieån laø 30 – 35oC. Enterococcus faecalis coù theå soáng soùt treân caùc beà maët moâi tröôøng. - Khoâng chòu ñöôïc nhieät ñoä thanh truøng, pH<6.3, chaát khaùng sinh vaø chaát saùt truøng. Khoâng taïo ñoäc toá, leân men glucose, sinh acid laøm giaûm pH moâi tröôøng. Chuùng thuûy phaân esculine khi coù maët cuûa 40% caùc muoái maät taïo 6,7-hydroxycoumarin (chaát naøy keát hôïp vôùi Fe3+ taïo hôïp chaát maøu naâu ñen). Noù cuõng coù theå saûn xuaát moät phaûn öùng pseudocatalase neáu troàng treân thaïch maùu. - Laø caàu khuaån gram döông noù coù khaû naêng taêng sinh maïnh meõ ñöôïc söû duïng laøm acid lactic ñieàu trò roái loaïn ñöôøng ruoät, laø thaønh phaàn chính cuûa moät soá Probiotic. Tuy nhieân, noù phaùt trieån maïnh treân veát thöông vaø veát boûng. c. Caáu truùc teá baøo: Coù boán phaân töû DNA vaø ba plasmid troøn ñöôïc xaùc ñònh: Plasmid – 1 chöùa 66.320bp. Plasmid – 2 chöùa 17.963bp. Plasmid – 3 chöùa 57.660bp. Caùc plasmid maõ hoùa moät soä gen bao goàm: transposases, protein khaùng ña thuoác vaø söï phaùt trieån cuûa moät chaát öùc cheá ppGpp. E.faecalis nhieãm saéc theå laø 37.38%. Ngoaøi ra e.faecalis cuõng chöùa gen 3Ebp(maõ hoù cho maøng sinh hoïc vaø pili) quy ñònh OG1RF operons gaây vieâm noäi taâm maïc cuûa E.faecalis. Söû duïng operons ñeå saûn xuaát pili beà maët. Caùc pili beà maët ñöôïc söû duïng ñeå baùm vaøo beà maët teá baøo vaø laø khaùng nguyeân cuûa con ngöôøi trong quaù trình vieâm noäi taâm maïc. d. Trieäu chöùng vaø bieän phaùp phoøng ngöøa: - Vieâm hoïng, vieâm haïch coù muû, vieâm khôùp, vieâm thaän caáp tính, vieâm caùc van tim. Gaây ñau daï daøy vaø muøi hoâi ôû coå hoïng. - Trieäu chöùng: Ñau hoïng, soát, maån ñoû da, tieâu chaûy vaø noân möûa. Xuaát hieän sau 12 – 14h keùo daøi 2 – 3 ngaøy. - Naáu chín kyõ vaø laøm laïnh saâu, veä sinh saïch seõ, veä sinh caù nhaân saïch seõ. CHÖÔNG III. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP XAÙC ÑÒNH VI SINH VAÄT TRONG THÖÏC PHAÅM 3.1. Caùc phöông phaùp truyeàn thoáng phaân tích caùc chæ tieâu vi sinh vaät: 3.1.1. Ñònh löôïng vi sinh vaät baèng phöông phaùp ñeám tröïc tieáp: a. Ñeám tröïc tieáp baèng buoàng ñeám hoàng caàu treân kính hieån vi: Soá löôïng vi sinh vaät ñöôïc xaùc ñònh baèng buoàng ñeám treân kính hieån vi. Thöôøng aùp duïng ñeå xaùc ñònh maät ñoä vi sinh vaät ñôn baøo coù kích thöôùc lôùn nhö naám men, naám moác, taûo vaø protozoa. Ÿ Öu ñieåm: Quy trình naøy cho pheùp xaùc ñònh nhanh choùng maät ñoä vi sinh vaät cöùa trong maãu. Ÿ Nhöôïc ñieåm: Khoâng phaân bieät ñöôïc teá baøo soáng vaø teá baøo cheát. Deã nhaàm laãn teá baøo vi sinh vaät vôùi caùc vaät theå khaùc trong maãu. Khoù ñaït ñöôïc ñoä chính xaùc cao. Khoâng thích hôïp vôùi huyeân phuø vi sinh vaät coù maät ñoä thaáp Ñôn vò tính: teá baøo/ml teá baøo/g CFU/ml CFU/g MPN/ml MPN/g Hình 3.1 : Caùch ñeám teá baøo trong buoàng ñeám hoàng caàu Ÿ Caùch tieán haønh: - Pha loaõng maãu caàn ñeám sao cho trong moãi oâ nhoû cuûa buoàng ñeám coù khoaûng 5 – 10 teá baøo vsv. Maãu phaûi ñöôïc pha loaõng baèng dung dòch pha loaõng chöùa 0.1% pepton vaø 0.1% laurylsulphat vaø 0.01% methyl blue, taát caû caùc dung dòch pha loaõng ñeàu phaûi loïc tröôùc khi söû duïng. - Ñaët moät gioït maãu ñaõ ñöôïc pha loaõng vaøo buoàng ñeám, duøng naép kính ñaäy laïi vaø lau thaät saïch vaät kính vaø buoàng ñeám. Theå tích maãu chöùa trong buoàng ñeám laø khoaûng khoâng gian giöõa ñóa ñeám vaø vaät kính, sau ñoù ñeå oån ñònh trong 5 phuùt. Ñeám ngaãu nhieân 50 – 100 oâ nhoû. Tính trung bình soá löôïng vi khuaån trong caùc oâ nhaân vôùi 20.000 vaø doä pha loaõng maãu tröôùc ñoù ta ñöôïc soá löôïng teá baøo trong 1ml. b. Ñeám tröïc tieáp baèng kính hieån vi huyønh quang: Caùc chaát nhuoäm phaùt huyønh quang: Acridin cam (AODC) 4’,6-dianodino-2-phenyl-indol (DAPI) Fluorescein isothiocyanate (FTTC) Ÿ Öu ñieåm: Loaïi boû sai soá do caùc chaát vaån. Keát quaû phaûn aùnh ñuùng vôùi sinh khoái Khoâng söû duïng nöôùc caát vaø nöôùc muoái sinh lyù ñeå pha loaõng maãu thöïc phaåm. Caùc dung dòch pha loaõng maãu: + Saline peptone water (SPW) NaCl:1g Peptone: 8.5g Nöôùc caát vöøa ñuû:1 lít + Buffered peptone water (BPW) NaCl: 5g Peptone: 10g Nöôùc caát vöøa ñuû: 1 lít Hình 3.2: Pha loaõng maãu Ñoái vôùi caùc maãu raén hay baùn loûng: 10g + 90ml dung dòch pha loaõng = ñoä pha loaõng 101 , laøm töông töï cho caùc böôùc tieáp theo. Sau ñoù caáy vaøo moâi tröôøng Hình 3.3: Caáy vaøo moâi tröôøng 3.1.2. Ñònh löôïng Coliform baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc 3.1.2.1. Nguyeân taéc Maãu ñaõ ñöôïc ñoàng nhaát ñöôïc caáy moät löôïng nhaát ñònh leân moâi tröôøng thaïch choïn loïc thích hôïp chöùa lactose. Sau khi uû 370C + 10C trong 24 – 48 giôø, ñeám soá löôïng khuaån laïc Coliforms ñieån hình. Xaùc ñònh laïi baèng caùc phaûn öùng ñaëc tröng. Moâi tröôøng choïn loïc Coliforms laø moâi tröôøng chöùa lactose, ñaây laø nguoàn carbon duy nhaát, ñoàng thôøi moâi tröôøng coøn chöùa muoái maät nhö moät taùc nhaân choïn loïc vaø caùc taùc nhaän chæ thò nhö neutral red, crystal violet. Khaúng ñònh caùc doøng khuaån laïc ñaëc tröng baèng moâi tröôøng canh choïn loïc nhö canh BGBL. Ñeå traùnh caùc tröôøng hôïp khoâng phaùt hieän ñöôïc Coliforms do bò toån thöông hay suy yeáu do trong quaù trình cheá bieán, baûo quaûn hay tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng choïn loïc laøm chuùng khoâng phaùt trieån thaønh khuaån laïc, chuùng ta phaûi phuïc hoài khaû naêng hoaït ñoäng cuûa Coliforms baèng moät moâi tröôøng chöùa nguoàn carbon khaùc nhö moâi tröôøng tryptone soya agar. Soá löôïng Coliforms ñöôïc xaùc ñònh baèng soá löôïng khuaån laïc ñieån hình ñeám ñöôïc, heä soá khaúng ñònh vaø noàng ñoä pha loaõng tröôùc khi caáy maãu vaøo ñóa. 3.1.2.2. Moâi tröôøng vaø hoùa chaát Moâi tröôøng Tryptone Soya Agar (TSA) Violet Red Bile Agar (VRB) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) EC broth 3.1.2.3. Quy trình phaân tích Chuaån bò maãu Quaù trình chuaån bò maãu töông töï nhö phaàn ñònh löôïng toång soá vi sinh vaät hieáu khí. Nhöng quaù trình pha loaõng maãu sao cho trong 1ml dung dòch pha loaõng maãu chöùa khoaûng <100 khuaån laïc Caáy maãu vaø ñoå moâi tröôøng Caáy chuyeån 1ml dòch pha loaõng maãu ñaõ choïn vaøo ñóa petri, moãi noàng ñoä caáy ít nhaát vaøo 2 ñóa vaø choïn 2 noàng ñoä pha loaõng lieân tieáp ñeå caáy sao cho sau khi moãi ñóa xuaát hieän töø 10 – 100 khuaån laïc. Cho vaøo moãi ñóa ñaõ caáy maãu 5ml moâi tröôøng TSA ñaõ ñöôïc ñun chaûy vaø laøm nguoäi ñeán 450C, troän ñeàu dòch maãu vôùi moâi tröôøng baèng caùch xoay troøn ñóa petri xuoâi vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà. Ñeå oån ñònh ôû nhieät ñoä phoøng trong 1 – 2 giôø ñeå phuïc hoài khaû naêng cuûa Coliforms. Ñoå theâm 10 – 15ml moâi tröôøng VRB. Chôø moâi tröôøng ñoâng ñaëc, laät ngöôïc ñóa vaø uû ôû 37 + 10C trong 24 – 48 giôø. Ñoïc keát quaû Choïn caùc ñóa coù soá ñeám töø 10 – 100 khuaån laïc Coliforms ñeå tính. Khuaån laïc Coliforms coù maøu ñoû ñeán ñoû ñaäm vaø ñöôøng kính >0,5mm, xung quanh khuaån laïc coù vuøng tuûa muoái maät Hình 3.4: Khuaån laïc Coliforms treân moâi tröôøng VRB Khaúng ñònh Trong tröôøng hôïp maãu coù chöa caùc nguoàn carbon khaùc khoâng phaûi lactose, ñeå traùnh caùc tröôøng VSV söû duïng caùc nguoàn carbon trong maãu ñeå leân men vaø taïo khuaån laïc töông töï nhö Coliforms, giai ñoaïn khaúng ñònh laø caàn thieát. Quy trình khaúng ñònh thöïc hieän nhö sau: choïn 5 khuaån laïc nghi ngôø treân ñóa ñaõ ñeám ñöôïc vôùi caùc hình daïng khaùc nhau caáy chuyeån sang moâi tröôøng canh BGBL vaø uû ôû 370C trong 24 – 48 giôø. Phaûn öùng döông tính khi vi sinh vaät sinh khí trong oáng Durnham. Tyû leä xaùc nhaän laø tyû soá giöõa soá khuaån laïc cho keát quaû döông tính vôùi soá khaån laïc khaúng ñònh Hình 3.5: Keát quaû khaúng ñònh Coliforms treân moâi tröôøng BGBL Caùch tính keát quaû Döïa vaøo soá khuaån laïc ñeám ñöôïc vaø tyû leä xaùc ñònh, tính maät ñoä cuûa Coliforms theo coâng thöùc: N A (CFU/g hay CFU/ml) = x R n1vf1 + … + nivfi Trong ñoù: N: toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc ni: soá ñóa coù soá khuaån laïc ñöôïc choïn taïi moãi ñoä pha loaõng v: theå tích caáy vaøo moãi ñóa fi: ñoä pha loaõng coù soá khuaån laïc ñöôïc choïn taïi caùc ñóa ñeám R: tyû leä xaùc nhaän Keát quaû Coliforms ñöôïc laøm troøn chaün chuïc vaø ñöôïc bieåu dieãn ôû daïng soá muõ coù cô soá thaäp phaân. 3.1.3. Xaùc ñònh toång soá vi sinh vaät hieáu khí baèng phöông phaùp ñoå ñóa Nguyeân taéc Toång soá vi sinh vaät hieáu khí ñöôïc ñeám baèng caùch ñoå ñóa vaø uû trong ñieàu kieän hieáu khí ôû 300C/72h + 6h hoaëc 370C/48h + 6h Moâi tröôøng vaø thieát bò nuoâi caáy Moâi tröôøng Dung dòch pha loaõng maãu: Saline Pepton Water (SPW) hoaëc Buffer Pepton Water (BPW) Moâi tröôøng nuoâi caáy: Plate Count Agar (PCA) Thieát bò - Tuû aám 300C + 10C Quy trình phaân tích Chuaån bò maãu Caân chính xaùc 10 g (hoaëc 25 g) maãu cho vaøo bao PE voâ truøng, sau ñoù theâm vaøo 90ml (hoaëc 225 ml) dung dòch pha loaõng maãu. Tieán haønh ñoàng nhaát maãu baèng maùy daäp maãu (stomacher). Thôøi gian daäp maãu tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi maãu nhöng khoâng quaù 2,5 phuùt. Taát caû caùc thao taùc treân phaûi thöïc hieän trong ñieàu kieän voâ truøng. Khi ñoù, ta seõ coù ñöôïc dung dòch pha loaõng laø 10-1. Dich pha loaõng seõ ñöôïc pha loaõng theo daõy thaäp phaân baèng caùch duøng micropipette (pipetman) voâ truøng chuyeån 1ml vaøo oáng nghieäm chöùa 9ml dung dòch pha loaõng à ñoàng nhaát, ta seõ coù ñöôïc dòch pha loaõng 10-2. Tieáp tuïc thöïc hieän töông töï ñeå coù ñöôïc caùc ñoä pha loaõng caàn thieát. Ñoå ñóa Choïn 2 hay 3 ñoä pha loaõng lieân tieáp döï kieán chöùa töø 25 – 250 teá baøo vi sinh vaät. Duøng micropipette vôùi caùc ñaàu tip voâ truøng ñeå chuyeån 1ml dòch pha loaõng vaøo giöõa ñóa petri voâ truøng. Töông öùng vôùi moãi ñoä pha loaõng caáy töø 2 – 3 ñóa. Sau khi caáy, ñoå vaøo moãi ñóa 10 – 15ml moâi tröôøng PCA ñaõ naáu chaûy vaø laøm nguoäi ñeán 45 – 500C. Troän ñeàu maãu vaøo moâi tröôøng baèng caùch xoay troøn ñóa petri xuoâi vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà töø 3 – 5 laàn. Ñaët ñóa leân maët phaúng ngang cho thaïch ñoâng ñaëc Nuoâi uû Caùc ñóa ñöôïc laät ngöôïc laïi vaø nuoâi uû ôû 300C trong 72 giôø Ñoïc keát quaû Hình 3.6. Toång soá vi sinh vaät hieáu khí Ñeám taát caû caùc khuaån laïc xuaát hieän treân caùc ñóa sau khi uû. Choïn caùc ñóa coù soá ñeám töø 25 – 250 teá baøo vi sinh vaät ñeå tính. Maät ñoä toång vi sinh vaät hieáu khí trong 1g maãu ñöôïc tính nhö sau: N A (CFU/g) = n1Vf1 + … + niVfi Trong ñoù: A: soá teá baøo vi khuaån (khuaån laïc) trong 1g maãu N: Toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc treân caùc ñóa ñaõ choïn n: soá löôïng ñóa caáy taïi ñoä pha loaõng thöù i V: theå tích dòch maãu (ml) caáy vaøo moâi tröôøng f: ñoä pha loaõng töông öùng Ví duï: trong moät tröôøng hôïp phaân tích 1g maãu cuï theå thu ñöôïc keát quaû sau: Noàng ñoä pha loaõng 10-3 10-4 Keát quaû Ñóa 1 235 26 Ñóa 2 246 21 235 + 246 + 26 A = = 2,4.105 cfu/g 2 x 1 x 10-3 + 1 x 1 x 10-4 Caùc keát quaû toång soá vi sinh vaät hieáu khí thöôøng ñöôïc bieåu dieãn döôùi daïng soá muõ cuûa cô soá thaäp phaân. 3.1.4. Phöông phaùp maøng loïc vi sinh vaät: - Kích thöôùc loã loïc 0.47μm hay 0.22μm. Ñöôøng kính vaø maøng loïc phuï thuoäc vaøo ñöôøng kính pheãu loïc thöôøng laø 45mm. Hình 3.7; Maøng loïc - Pheãu loïc, giaù ñôõ maøng loïc phaûi ñöôïc voâ truøng sau moãi laàn loïc. - Maät ñoä VSV trong dòch loïc thích hôïp : < 150 khuaån laïc/ maøng. - Theå tích dòch loïc trong 1 laàn: 50 – 10ml - Neáu theå tích dòch loïc nhoû hôn thì phaûi pha loaõng baèng dung dòch pha loaõng hay nöôùc caát voâ truøng. Hình 3.8 : Caùc boä phaän cuûa thieát bò loïc vi sinh vaät Öu ñieåm: Xaùc ñònh ñöôïc maät ñoä VSV cuï theå trong moät theå tích maãu lôùn: 10ml, 100ml… Nhöôïc ñieåm: Khoâng thích hôïp cho vieäc phaân tích caùc maãu thöïc phaåm raén. 3.1.5.Phöông phaùp MPN (phöông phaùp toái khaû) : 3.1.5.1.Nguyeân taéc: Maãu ñöôïc pha loaõng thaønh moät daõy thaäp phaân, 2 noàng ñoä keá tieáp nhau khaùc nhau 10 laàn. Maãu ñöôïc uû trong moâi tröôøng thích hôïp coù oáng durham. Moãi noàng ñoä pha loaõng ñöôïc laëp laïi 3 oáng. Theo doõi söï sinh hôi trong töøng oáng nghieäm. Xaùc ñònh oáng döông tính ôû moãi noàng ñoä pha loaõng vaø döïa vaøo baûng MPN ñeå suy ra soá löôïng nhoùm vi sinh vaät töông öùng hieän dieän trong 1g hoaëc 1ml maãu ban ñaàu. 3.1.5.2.Sô ñoà quy trình kieåm nghieäm: 1ml (10-1) + 9ml nöôùc voâ truøng 1ml(10-2) + 9ml nöôùc caát voâ truøng Stormacher 10-1 10-2 10-3 Hình 3.9: Sô ñoà quy trình kieåm nghieäm Böôùc 1: 10gr thöïc phaåm + 90ml Nacl 0.85% hoaëc laø nöôùc voâ truøng, Stormacher thu ñöôïc noàng ñoä 10-1, muïc ñích ñoàng nhaát ñeå phaân boá ñeàu vi sinh vaät. Böôùc 2: Pha loaõng maãu ñeå giaûm soá löôïng vi sinh vaät coù trong maãu ban ñaàu. Laáy 1ml maãu ôû noàng ñoä 10-1 cho vaøo oáng nghieäm thöù nhaát, sau ñoù cho 9ml nöôùc voâ truøng, ta ñöôïc oáng nghieäm coù noàng ñoä 10-2. Sau ñoù laáy 1ml maãu ôû noàng ñoä 10-2 cho vaøo oáng nghieäm thöù hai, cho theäm 9ml nöôùc caát voâ truøng thu ñöôïc oáng nghieäm coù noàng ñoä 10-3. Laøm töông töï nhö treân ta ñöôïc oáng nghieäm coù noàng ñoä 10-4, 10-5… Böôùc 3:Nuoâi caáy dòch maãu trong moâi tröôøng Laury Tryptose (LT) ôû 3 noàng ñoä lieân tieáp (10-1, 10-2, 10-3) nhö sau: Moãi noàng ñoä laáy 3 oáng nghieäm cho vaøo moãi oáng nghieäm 1 oáng durham, cho moâi tröôøng LT vaøo 9 oáng nghieäm sao cho nghaäp oáng durham. Ghi 3 noàng ñoä lieân tieáp beân ngoaøi oáng nghieäm (moãi noàng ñoä 3 oáng nghieäm). Tieáp ñeán cho 1ml dung dòch maãu ôû noàng ñoä 10-1 vaøo 3 oáng nghieäm coù ghi noàng ñoä 10-1 (chöùa moâi tröôøng LT), töông töï cho caùc noàng ñoä ôû caùc noàng ñoä tieáp theo. (hình) uû ôû 37oC/24h. Nhöõng löu yù khi tieán haønh nuoâi caáy vi khuaån leân moâi tröôøng Laury Trytose (LT): Tieán haønh gaàn ngoïn löûa ñeøn coàn ñeå traùnh nhieãm khuaån. Nhôù laéc maãu tröôùc khi tieán haønh nuoâi caáy vi khuaån treân moâi tröôøng Laury Trytose. Khoâng laéc nhöõng oáng coù durham Böôùc 4: Ñoïc keát quaû caùc oáng Laury trytose. Coù 3 tröôøng hôïp xaûy ra: + OÁng durham khoâng thay ñoåi. + OÁng durham noåi leân treân. + OÁng durham sinh hôi. Ñoïc keát quaû trong caùc oáng LT döông tính, sau ñoù caáy chuyeån caùc oáng LT döông tính naø vaøo caùc oáng moâi tröôøng BGBL 2% baèng caáy caáy que caáy voøng nhuùng vaøo moâi tröôøng LT döông tính ôû treân, roài cho vaøo oáng coù moâi tröôøng BGBL. Ghi noàng ñoä teân saûn phaåm, uû 37oC/24h. OÁng LT +: moâi tröôøng ñuïc vaø oáng durham noåi hoaëc coù boït khí trong oáng (theå tích boït khí trong oáng = 1/10 theå tích oáng durham). OÁng LT -: Khoâng coù hieän töôïng gì xaûy ra. Böôùc 5: Ñoïc keát quaû oáng BGBL döông tính, laäp tye leä caùc oáng BGBL döông tính ôû 3 noàng ñoä lieân tieáp. Tra baûng Mac Crady tìm soá MPN töông öùng. + OÁng BGBL döông tính: Moâi tröôøng vaån ñuïc vaø oáng durham noåi, coù boït khí. + OÁng BGBL aâm tính: Khoâng coù hieän töôïng gì xaûy ra. Böôùc 6: Tính keát quaû Toång soá coliform (cfu/g hoaëc cfu/ml) = Soá MPN x 10n n laø soá nguyeân döông cuûa noàng ñoä pha loaõng ñaàu tieân ñöôïc nuoâi caáy. Böôùc 7: Töø keát quaû tính ñöôïc, so saùnh vôùi tieâu chuaån veà an toaøn veä sinh thöïc phaåm. Caùc phöông phaùp hieän ñaïi: Caùc phöông phaùp khoâng truyeàn thoáng tuy ñöôïc coâng nhaän roäng raõi nhöng laïi coù moät soá nhöôïc ñieåm nhö: toán nhieàu thôøi gian, chaäm thu keát quaû, maát nhieàu coâng söùc, toán keùm,… Ñeå khaéc phuïc caùc nhöôïc ñieåm naøy, nhieàu phöông phaùp nhanh vaø töï ñoäng ñöôïc phaùt trieån vaø thöông maïi hoùa. Caùc phöông phaùp naøy ñöôïc goïi chung laø caùc phöông phaùp khoâng truyeàn thoáng vaø coù ñaëc ñieåm chung laø cho keát quaû nhanh hôn phöôn phaùp truyeàn thoáng. Phöông phaùp phaùt quang sinh hoïc ATP trong giaùm saùt veä sinh: Adenosin triphotphat (ATP) ñöôïc tìm thaáy trong taát caû caùc teá baøo soáng neân söï phaùt hieän ATP laø daáu hieäu nhaän bieát vaät chaát soáng ñang toàn taïi. ATP coù theå ñöôïc phaùt hieän moät caùch nhanh choùng bôûi löôïng aùnh saùng phaùt ra thoâng qua söï keát hôïp vôùi enzume luciferase nhôø moät maùy ño aùnh saùng. Kyõ thuaät naøy coù theå phaùt hieän ñöôïc 1pg(10-15g) töông öùng vôùi khoaûng 1000 teá baøo vi khuaån (10-15gATP/teá baøo). Ñoä nhaïy naøy coù ñöôïc khi söû duïng caùc hoùa chaát thöông maïi ñaét tieàn, söï phaân tích thöôøng chæ dieãn ra vaøi phuùt vaø vì theá phöông phaùp naøy ñöôïc xem laø nhanh hôn vaø thuaän lôïi hôn so vôùi phöông phaùp ñeám khuaån laïc. Vieäc duøng phöông phaùp ño haøm löôïng ATP ñeå xaùc ñònh roõ soá vi sinh vaät ñang hieän dieän ñaõ ñöôïc bieát ñeán vaøo naêm 1960. Tuy nhieân, phöông phaùp naøy ñoøi hoûi nhieàu söï caûi tieán trong vieäc thieát keá maùy ño löôïng aùnh saùng phaùt ra ( giaûm giaù thaùnh vaø coù theå mang ñi ñöôïc ) vaø nhöõng hoùa chaát oån ñònh söï phaùt sang. Phöông phaùp naøy öùng duïng trong 3 lónh vöïc: giaùm saùt veä sinh, kieåm tra nhöõng chaát loûng nhö nöôùc röûa laø saïch heä thoáng, ñaùnh giaù chaát löôïng vi sinh cuûa thöïc phaåm. Ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng vi sinh cuûa thöïc phaåm baèng ATP thì ATP cuûa vi sinh vaät caàn phaûi ñöôïc taùch chieát ra khoûi teá baøo vi sinh vaät vaø ñöôïc ñònh löôïng giöõa cöôøng ñoä aùnh saùng phaùt ra. Phaûn öùng phaùt saùng sinh hoïc ôû ñom ñoùm traûi qua hai giai ñoaïn: E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1) E – LH2 AMP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2) Phản ứng coù theå ñöôïc viết lại như sau: E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi (E: Luciferase; LH2: Luciferin) Phaûn öùng phaùt saùng cuûa ñom ñoùm laø coù hieäu quaû nhaát, ñöôïc bieát ñeán nhö phaûn öùng phaùt saùng sinh hoïc ñeå xaùc ñònh haøm löôïng ATP. Phaûn öùng naøy ñoøi hoûi D-Luciferin vaø ion Mg2+ ñeå hoaït ñoäng, ñaây laø thaønh phaàn cô baûn trong boä kit thöông maïi. Chaát dioxetanone thì ñöôïc hình thaønh bôûi söï taïo phöùc hôïp cuûa luciferase vôùi oxy vaø phöùc hôïp Mg – ATP. Sau ñoù, aùnh saùng vaøng – xanh ( böôùc soùng cao nhaát laø 562nm) ñöôïc phaùt ra. Ñeå kieåm tra tình traïng veä sinh beà maët thieát bò trong saûn xuaát, cheá bieán thöïc phaåm, toång vi khuaån hieáu khí trong thaønh phaåm, ngöôøi ta xaùc ñònh toång löôïng._.