Tóm tắt Luận án - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên

Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Bùi Văn Lai 1. PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn 2. PGS.TS. Bùi Văn Lai Phản biện 1: .................................................................................................... Phản biện 2: .................................................................................................... Phản biện 3: .................................................................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ..’, ngày tháng năm 201. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á, là một trong những nơi có mức độ đa dạng sinh học heo rừng cao nhất trên thế giới. Hai loài heo rừng được xác định tồn tại ở Việt Nam là Sus bucculentus và Sus scrofa. Tuy nhiên, loài Sus bucculentus đã tuyệt chủng, hiện chỉ còn loài heo rừng Sus scrofa được nuôi phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là khu vực Tây Nguyên. Đến nay, các nghiên cứu về quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên còn hạn chế, đặc biệt là các đặc điểm hình thái và di truyền. Một trong những lý do đó chính là việc thu nhận và thuần hóa heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên còn gặp rất nhiều khó khăn. Ở khu vực Tây Nguyên, các giống heo rừng mà người dân địa phương đang nuôi hầu hết đều là heo lai được nhập từ các nước Thái Lan, Malaysia Các dòng heo lai này có đặc điểm di truyền không đồng nhất, không thuần chủng. Việc phát triển chăn nuôi tự phát các giống heo rừng lai này sẽ làm tăng khả năng xâm lấn của heo rừng lai (sinh vật ngoại lai), làm tăng nguy cơ đe dọa tới các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên. Do đó, các nghiên cứu về việc thu nhận, thuần hóa và nhân rộng các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có vai trò rất quan trọng trong việc bảo tồn loài heo rừng đặc chủng của Việt Nam. Việc bảo tồn dựa trên sự phân biệt những nét đặc trưng của heo rừng thuần Việt Nam về mặt kiểu hình và kiểu gen. Việc phân biệt các loài heo rừng được dựa trên các trình tự đặc trưng trong các vùng bảo tồn của ADN nhân hoặc ADN ty thể. Các loài heo rừng khác nhau có các vị trí đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) tạo nên các haplotype đặc trưng cho loài heo đó. Trên cơ sở đó xây dựng cây phát sinh loài, từ đó chúng ta biết được nguồn gốc và sự khác biệt của heo rừng Việt Nam với các giống heo rừng nhập nội. Xuất phát từ những tình hình trên, 1 2 chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên Sus scrofa”. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng cây phát sinh loài và đánh giá một số đặc điểm sinh học heo rừng Tây Nguyên. - Góp phần bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên ở mức tế bào và trong tự nhiên. 3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc xác định nguồn gốc di truyền của heo rừng khu vực Tây Nguyên. Các kết quả đạt được giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm của heo rừng khu vục Tây Nguyên. Hơn nữa, kết quả của đề tài này có thể được ứng dụng trong sản xuất heo rừng bằng phương pháp thụ tinh nhân tạo với nguồn tinh heo thu được từ heo rừng đực của khu vực Tây Nguyên. 4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Xác định được vị trí phân loại của heo rừng bản địa khu vực Tây Nguyên trong mối quan hệ phát sinh loài của heo rừng trên thế giới. - Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gen cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt giữa heo rừng Tây Nguyên và các nhóm heo rừng khác. - Đánh giá một số đặc điểm sinh học (sinh học sinh sản) của heo rừng khu vực Tây Nguyên. - Đánh giá đặc điểm sinh học của tinh heo rừng khu vực Tây Nguyên. 5. KẾT CẤU CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 91 trang (kể cả Tài liệu tham khảo) chia thành các phần: Phần mở đầu 2 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 29 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 15 trang; Chương 3: Kết quả và thảo luận, 32 trang; Chương 4: Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên 2 3 quan đến luận án, 1 trang; Tài liệu tham khảo, 10 trang với 123 tài liệu tham khảo bằng Tiếng Việt, Tiếng Anh. Luận án có 28 hình và 16 bảng. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo 5 tài liệu Tiếng Việt, 118 tài liệu Tiếng Anh với các nội dung liên quan đến: Các đặc điểm sinh học của heo rừng, tiến hóa và phát sinh loài, đông lạnh tế bào 1.1. Giới thiệu về heo rừng 1.1.1. Vị trí phân loại 1.1.2. Sự phân bố của heo rừng 1.1.3. Đặc điểm chung của heo rừng 1.1.4. Phương thức tìm kiếm thức ăn 1.1.5. Phạm vi sống và mật độ quần thể của heo rừng 1.1.6. Đặc điểm của heo rừng Việt Nam 1.2. Tiến hóa và phát sinh loài 1.2.1. Chọn lọc nhân tạo trong tiến hóa 1.2.2. Phát sinh loài và tiến hóa 1.2.3. Các khái niệm về phát sinh loài 1.3. Một số marker phân tử 1.3.1. ADN ty thể (mtADN) 1.3.2. Gen cytochrome b 1.3.3. Vùng kiểm soát (control region) 1.3.4. Gen 16S rRNA 1.3.5. Intron vùng nhân 1.3.6. Protein kinase C 1.3.7. Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng 3 4 1.4. Bảo tồn heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 1.4.1. Bảo tồn giao tử heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 1.4.2. Bảo tồn tế bào sinh dưỡng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên, heo rừng lai và heo bản địa khu vực Tây Nguyên – Việt Nam. Các khái niệm heo rừng thuần, heo rừng lai, heo bản địa được trình bày dưới đây: - Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây nguyên là heo rừng thu được trong tự nhiên khu vực Tây Nguyên - Heo rừng lai là heo đang được người dân nuôi tại khu vực Tây Nguyên, có nguồn gốc không rõ ràng, có thể từ heo rừng Thái Lan, Malaysia,... - Heo bản địa là các giống heo đã được thuần hóa lâu đời và được người dân địa phương chăn nuôi: heo Móng Cái, heo Sóc, heo đen địa phương... 2.2. Phương pháp 2.2.1. Điều tra các giống heo rừng bản địa đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên Lập phiếu điều tra và tiến hành phỏng vấn các hộ chăn nuôi theo các câu hỏi đã đặt sẵn trên cơ sở tìm hiểu trước về thông tin của các hô ̣ chăn nuôi nổi bâṭ từ Sở Khoa hoc̣ và Công nghê,̣ người dân , ghi chép số liêụ và dùng máy chup̣ ảnh ghi laị hình ảnh các giống heo rừng đang nuôi của từng hô,̣ trang traị cu ̣ thể. Đánh giá sơ bô ̣ về nguồn gốc, chất lươṇg giống heo rừng đang nuôi. 2.2.2. Đánh giá hình thái và phân tích ADN 2.2.2.1. Đánh giá hình thái Các chỉ tiêu về mặt cơ thể: Hình thái heo rừng được đánh giá qua các chỉ tiêu như: chiều dài thân, chiều dài chân sau, chiều dài đuôi, chiều dài tai, chiều dài mõm, chiều cao vai 4 5 Phân tích hộp sọ: các số đo của hộp sọ được sử dụng để phân tích được mô tả như trong. Các chỉ số hộp sọ được phân tích bao gồm: chiều dài hộp sọ, chiều dài hàm trên, chiều dài đường cơ bản, bề rộng gò má, bề rộng chẩm, chiều dài hàm ếch, chiều dài hàng răng trên, chiều dài hàng răng hàm ở phía trên, bề rộng thái dương, khoảng cách 2 hốc mắt, chiều dài đỉnh trán, chiều dài mũi 2.2.2.2. Phân tích ADN Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích ADN ty thể 2.2.3. Thu thập, nuôi thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên- Việt Nam thu nhận được Quá trình thu thập và nuôi dưỡng thuần hóa được tóm tắt trong hình 2.2 5 6 Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt quá trình thuần hóa. 2.2.4. Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên Hình 2.6. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm bảo tồn nguồn gen heo rừng 6 7 2.2.5. Phương pháp thống kê Dữ liệu được xử lý và phân tích bằng chương trình Sigma Plot 11.0. Giá trị P ≤ 0,05 được đánh giá là có ý nghĩa thống kê. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên Bảng 3.1. Nguồn gốc giống heo rừng đang nuôi trên điạ bàn Tây Nguyên TT Nguồn gốc giống heo Số lươṇg đã điều tra (con) 1 Heo rừng thuần Tây Nguyên thu từ tư ̣nhiên 12 (0,53%) 2 Heo lai với heo rừng Tây Nguyên 40 (1,77%) 3 Heo rừng Thái Lan hoăc̣ Malaysia 56 (2,48%) 4 Heo lai với heo rừng Thái Lan hoăc̣ Malaysia 2150 (95,22%) Tổng số 2258 Từ kết quả điều tra cho thấy công thức lai tạo không đồng nhất, không ổn định, con giống không có lý lịch rõ ràng, chất lượng không cao. 3.2. Đánh giá hình thái và phân tích ADN. 3.2.1. Đánh giá hình thái heo rừng thuần có nguồn gốc Tây nguyên 3.2.1.1. Phân tích thông số cơ thể Bảng 3.2. Thông số đo cơ thể của heo. Thông số đo Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên Heo nhà Đực cái Chiều dài cơ thể (A) 142,8±4,8a 126,3±4,2b 115,8±1,8c Chiều dài đuôi (B) 25,8±0,8a 19,2±0,6b 22,0±0,44c Chiều dài chân sau (C) 29,0±1,0a 25,2±0,7b 25,8±0,5b Chiều cao vai (D) 72,8±0,8a 71,1±1,6a 71,4±2,5a Chiều dài tai (E) 11,5±0,5a 11,2±0,7a 21,8±0,4b Chiều dài mũi (F) 24,0±0,5a 23,2±0,2a 21,0±0,3b a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) 7 8 Các thông số cơ thể của heo rừng thuần Tây Nguyên hầu hết đều lớn hơn so với heo nhà, tuy nhiên, thông số chiều cao vai là bằng nhau và chiều dài tai của heo nhà lại lớn hơn so với heo rừng thuần Tây Nguyên. 3.2.1.2. Phân tích hộp sọ Bảng 3.3. Thông số đo hộp sọ của heo. Thông số đo Heo rừng Heo nhà Đực Cái A 350,3±4.4a 324,0±8,2b 235,9±7,6c B 303,3±7,9a 273,1±0,6b 237,6±3,2c C-C’ 296,3±6,3a 269,8±2,2b 228,1±1,4c D 136,9±2,1ab 131,6±4,2a 143,1±1,3b E 65,5±2,2a 67,7±0,7a 71,5±0,9a F-C’ 177,6±3,4a 168,8±1,4a 128,1±1,1b G 116,9±2,0a 107,5±0,4b 73,9±1,5c H 75,3±4,7a 59,8±1,0ab 41,8±1,3b I 34,0±2,9a 30,0±1,2a 41,1±3,6a J 94,9±1,6a 93,4±1,7a 93,9±1,0a L 341,0±4,8a 298,7±3,0b 220,2±4,4c M 103,9±1,3a 102,9±0,6ab 97,2±2,0b N 217,1±5,9a 196,4±0,2b 171,0±3,9c O 130,1±1,6a 106,6±11,3b 89,9±2,6c P 41,1±0,6a 45,7±3,5a 42,8±0,8a a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) Các thông số hộp sọ của heo rừng thuần Tây Nguyên đực hầu hết lớn hơn heo rừng cái và heo nhà. Tuy nhiên, thông số chiều rộng xương gò má của heo rừng thuần Tây Nguyên lại nhỏ hơn heo nhà và các thông số bề ngang chẩm, bề rộng thái dương, khoảng cách giữa 2 hốc mắt, chiều cao chẩm và chiều dài răng cửa trên của 2 nhóm heo này là gần như nhau. 3.2.2. Phân tích ADN 3.2.2.1. Kết quả phân tích trình tự D-loop 9 trong 19 cá thể heo rừng Tây Nguyên-Việt Nam có các vị trí nucleotide biến đổi giống với heo rừng Thái Lan và nhóm này được gọi là heo rừng lai (VWB12-VWB20). Các cá thể còn lại được gọi là nhóm heo 8 9 rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên (VWB1-VWB5, VWB7-VWB11). 18 điểm đa hình được xác định ở 10 ở các cá thể heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên, trong đó có 3 điểm là các điểm đa hình mới. Các vị trí biến đổi đặc trưng của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên được tìm thấy tại các vị trí 127, 220 và 246. Các vị trí này khác biệt hoàn toàn so với các cá thể heo rừng lai cũng như heo rừng châu Á khác Hình 3.1. Các vị trí biến đổi trong vùng D-loop ty thể của các cá thể heo rừng. Dấu chấm “.” thể hiện các vị trí nucleotide giống nhau. 9 10 Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên khác biệt về mặt di truyền so với heo rừng vùng Sansai (d = 0.025 ± 0.006) và vùng Mae Sariang (d = 0.023 ± 0.006) của Thái Lan. Trong khi đó, khoảng cách di truyền của heo rừng lai so với heo vùng Sansai (d = 0.009 ± 0.003) và Mae Sariang (d = 0.009 ± 0.003) của Thái Lan nhỏ hơn so với heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên. Khoảng cách di truyền của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên so với Indonesia là lớn nhất (d = 0.046 ± 0.009). Bảng 3.4. Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng dựa trên trình tự D-loop. Vùng ma trận phía dưới là khoảng các di truyền trung bình, vùng ma trận phía trên là sai số chuẩn. Quần thể 1 2 3 4 5 6 1. Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 0.006 0.006 0.006 0.006 0.009 2. Heo rừng lai 0.025 0.003 0.003 0.005 0.008 3. Heo rừng Thái Lan Sansai 0.025 0.009 0.004 0.006 0.008 4. Heo rừng Thái Lan Mae Sariang 0.023 0.009 0.013 0.005 0.008 5. Heo rừng Hàn Quốc 0.024 0.023 0.027 0.020 0.009 6. Heo rừng Indonesia 0.046 0.044 0.044 0.040 0.050 3.2.2.2. Kết quả phân tích trình tự cytochrome b Những biến đổi trong trình tự cytochrome b Việc phân tích các trình tự cytochrome b của 37 cá thể heo Tây Nguyên - Việt Nam (bao gồm 20 cá thể heo rừng và 17 cá thể heo bản địa) với các trình tự của heo rừng châu Á và châu Âu cho thấy có 46 điểm đa hình (Hình 3.2), chiếm 4,4% tồng số nucleotide trong tự cytochrome b phân tích (1040 bp). Vùng có sự biến đổi cao nhất nằm từ vị trí 15000 đến 15100 với tỉ lệ biến đổi là 11%, cao gấp 2,5 lần so với tỉ lệ biến đổi chung là (4,4%). Heo rừng Tây Nguyên - Việt Nam chia thành 2 nhóm là heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên (bao gồm các haplotype VWB1-VWB11) và nhóm heo rừng lai (bao gồm các haplotype VWB12-VWB20) dựa trên 8 10 11 vị trí biến đổi (14428, 14464, 14482, 14780, 14855, 14963, 15002 và 15036). Do đó, có ít nhất 2 quần thể heo rừng phân biệt về mặt di truyền ở vùng Tây Nguyên của Việt Nam. Ba vị trí biến đổi của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên được tìm thấy, chúng khác biệt hoàn toàn so với heo rừng Châu Á và Châu Âu ở các vị trí 14482, 14780 và 14963. Kết quả này cho thấy, ba vị trí này có thể được dùng để phân biệt heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên với các cá thể heo rừng khác của Châu Á và Châu Âu. Gen cytochrome b chứa 4 vị trí đa hình tại các vị trí 15036 (T/C), 15038 (G/A), 15041 (C/T) và 15045 (G/A) của ADN ty thể heo. Các haplotype Châu Âu bao gồm E1 (TGCG) và E2 (TGTG). Các haplotype Châu Á bao gồm A1 (CATA) và A2 (CATG) [39]-[52]. Trong nghiên cứu này, không có sự phân bố của các haplotype Châu Âu trong heo rừng và heo bản địa Việt Nam ở khu vực Tây Nguyên. Trong khi đó, 10 cá thể heo bản địa Tây Nguyên - Việt Nam mang haplotype A1 Châu Á và 7 cá thể heo bản địa Tây Nguyên - Việt Nam mang haplotype A2 Châu Á. 4 haplotype A1 Châu Á và 5 haplotype A2 Châu Á được tìm thấy trong nhóm heo rừng lai. 11 12 Hình 3.3. Các vị trí biến đổi trong vùng cytochrome b ty thể của các cá thể heo rừng. Dấu chấm “.” Thể hiện các vị trí nucleotide giống nhau. 12 13 Khoảng cách di truyền giữa các nhóm được tính toán dựa trên phương pháp maximum-likelihood cho thấy, khoảng cách trung bình của các haplotype của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên là 0.0002 ± 0.0002, của heo rừng lai là 0.0008 ± 0.0004 và của heo bản địa khu vực Tây Nguyên - Việt Nam là 0.0042 ± 0.0011. Sự khác biệt này tạo nên 3 cụm khác biệt nhau của heo Việt Nam khu vực Tây Nguyên Bảng 3.5. Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng dựa trên trình tự cytochrome b. Vùng ma trận phía dưới là khoảng các di truyền trung bình, vùng ma trận phía trên là sai số chuẩn Nhóm heo rừng Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên Heo rừng lai Heo bản địa TN Heo rừng châu Á (A1) Heo rừng châu Á (A3) Heo rừng châu Âu (E1) Heo rừng châu Âu (E2) Heo rừng châu Á (A2) Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 0.0034 0.0034 0.0034 0.0029 0.0032 0.0026 0.0038 Heo rừng lai 0.0095 0.0006 0.0000 0.0016 0.0037 0.0037 0.0015 Heo bản địa TN 0.0101 0.0007 0.0006 0.0017 0.0037 0.0037 0.0017 Heo rừng châu Á (A1) 0.0095 0.0000 0.0008 0.0016 0.0035 0.0037 0.0016 Heo rừng châu Á (A3) 0.0073 0.0026 0.0034 0.0024 0.0032 0.0033 0.0021 Heo rừng châu Âu (E1) 0.0095 0.0119 0.0125 0.0111 0.0091 0.0026 0.0040 Heo rừng châu Âu (E2) 0.0059 0.0107 0.0113 0.0107 0.0085 0.0059 0.0040 Heo rừng châu Á (A2) 0.0119 0.0021 0.0032 0.0024 0.0049 0.0143 0.0131 Các cá thể heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên nằm chung một nhóm tách biệt so với các nhóm khác. Điều đó chứng tỏ heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên tách biệt di truyền so với nhóm heo rừng lai và heo bản địa Tây Nguyên - Việt Nam. 3.2.2.3. Kết quả phân tích trình tự 16S 13 14 Kết quả điện di cho thấy sự khuếch đại thành công vùng trình tự 16S ở các cá thể heo rừng với chiều dài của sản phẩm là 701 bp. Các vùng nhiễu hai đầu được xóa bỏ, đoạn trình tự 16S được phân tích có độ dài 664 bp. Có 23 điểm đa hình nucleotide đơn (SNP) tương đương với 3,74 % tổng số trình tự ADN được phân tích (664 bp). Tuy nhiên, không có vị trí nào đặc trưng trong 23 vị trí biển đổi này giúp phân biệt được giữa heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên và heo rừng lai. Vì vậy, trong nghiên cứu này vùng trình tự 16S có thể không là một marker hữu hiệu để phân biệt giữa heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên và heo rừng lai (Hình 3.5) Hình 3.5. Các vị trí biến đổi trong trình tự 16S của các cá thể heo được thu thập. Dấu “.” mô tả vị trí các nucleotide giống nhau. 14 15 3.3. Thuần hóa heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 3.3.1. Điạ điểm thu nhâṇ heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên Bảng 3.6. Điạ điểm và số lươṇg heo rừng thu nhâṇ trong tư ̣nhiên TT Điạ điểm thu nhâṇ Số heo rừng thu nhâṇ (con) Đưc̣ Cái Tổng 1 Huyêṇ Tánh Linh, Đức Linh (tỉnh Bình Thuâṇ) 4 4 8 2 Huyêṇ Bảo Lâm, TP. Bảo Lôc̣ (tỉnh Lâm Đồng) 3 2 5 3 Huyêṇ Đức Troṇg, Đơn Dương (tỉnh Lâm Đồng) 9 10 19 4 Đà laṭ, Bidoup-Núi bà (tỉnh Lâm Đồng ) 3 2 5 5 TP. Buôn Mê Thuôṭ, huyêṇ Ea Kar tỉnh Đắk Lắk 3 3 6 6 Thu nhâp̣ từ các nguồn khác (heo nhỏ dưới 10kg) 6 5 11 Tổng côṇg 28 26 54 Đối với heo rừng lớn, tỷ lê ̣ thuần hóa thành công sau 6 tháng là 58,14%, trong khi đó tỷ lê ̣ thành công sau 6 tháng thuần hóa đối với heo rừng nhỏ là 81,82%. Bảng 3.7. Tỷ lê ̣thuần hóa thành công TT Các chỉ tiêu Số lươṇg Tỷ lê ̣(%) 1 Sống sau 1 tháng nuôi thuần hóa (heo lớn) 30/43 69,77 2 Sống sau 6 tháng nuôi thuần hóa (heo lớn) 25/43 58,14 3 Sống sau 6 tháng đối với heo rừng nhỏ 9/11 81,82 15 16 3.3.2. Đặc điểm về tập tính sinh sản heo rừng trong quá trình thuần hóa Trong quá trình thuần hóa, con đực thành thục về tính sau 7 - 8 tháng tuổi và thành thục sinh dục, có khả năng giao phối để sinh con sau 8 - 10 tháng tuổi. Trong quá trình nuôi nhốt để thuần hóa, chúng tôi nhận thấy heo rừng đực chỉ giao phối vào ban đêm. Quá trình giao phối diễn ra 2-4 lần/đêm. Trường hợp nuôi nhốt với thời gian trên 1,5 năm mới phát hiện thấy chúng giao phối với heo bản địa hoặc heo rừng cái thuần vào ban ngày. Số liệu ở bảng 3.8 mô tả quá trình động dục của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên trong điều kiện thuần dưỡng nhân tạo. Trong điều kiện này, heo có thời gian sinh sản quanh năm, dài hơn thời gian sinh sản của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên trong điều kiện tự nhiên. So với các giống khác, mức độ biểu hiện động dục của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên thấp hơn và thời gian động dục ngắn hơn. Tuy nhiên, trọng lượng heo con mới sinh ra từ heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên lớn hơn nhiều so với trọng lượng heo con được sinh ra bởi các giống khác (Bảng 3.6). Bảng 3.8. Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên trong giai đoạn sinh con Giống heo Thời gian đẻ trong năm Mức độ biểu hiện động dục Thời gian động dục Thời gian giao phối Trọng lượng heo con (g) Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên Quanh năm + + 1,5-2,0 18h 700±7.1a Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên tự nhiên Tháng 6- tháng 11 - - - 550±10.4b Lai Thái Lan Quanh năm + + + 1,5-2 16-24 600±2.5c Bản địa RagLey Quanh năm + + + + + 2-2,5 18-24 395±1.7d 16 17 Bản địa Lang Hanh (LĐ) Quanh năm + + + + + 2-2,5 18-24 410±1.8de Heo Bản địa Đạ Oai (LĐ) Quanh năm + + + + + 2-2,5 18-24 420±2.4e Bảng 3.9 cho thấy, thời gian mang thai của heo rừng heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên giống như thời gian mang thai của các nhóm heo khác. Thời gian nuôi con của heo rừng thuần Tây Nguyên trong điều kiện nuôi nhốt ngắn hơn so với nhóm heo rừng thuần Tây Nguyên trong tự nhiên, nhưng dài hơn các nhóm còn lại. Số lượng heo con trong một lần đẻ tương đương với số con của các nhóm heo rừng khác. Tuy nhiên, nhóm heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có số lứa đẻ trong năm cao hơn so với nhóm thuần trong điều kiện tự nhiên. Bảng 3.9. Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng thuần Tây Nguyên sau giai đoạn sinh con Giống heo Trọng lượng heo con (g) Thời gian mang thai (ngày) Thời gian nuôi con (ngày) Thời gian chờ phối sau tách con (ngày) Số lượng heo con/lứa Số lứa đẻ trong năm Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 700±7.1a 110-120 65-75 10-30 4 – 8 1,6-1,7 Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên tự nhiên 550±10.4b - 80-90 - 3 – 8 1,0 Lai Thái Lan 600±2.5c 110-120 60-65 10-20 4 – 8 1,8-1,9 Bản địa RagLey 395±1.7d 112-116 50-55 5-10 6 – 12 2,0-2,1 Bản địa Lang Hanh 410±1.8de 112-116 50-55 5-10 6 – 12 2,0-2,1 Bản địa Đạ Oai 420±2.4e 112-116 50-55 5-10 6 – 10 2,0-2,1 17 18 3.4. Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên- Việt Nam 3.4.1. Tinh trùng heo rừng 3.4.1.1. Đánh giá một số đặc điểm tinh heo rừng Giá trị pH: Giá trị pH của tinh heo từ các giống Landrace khoảng bằng 7, trong khi đó tinh heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có giá trị pH bằng 6 (Bảng 3.10). Kết quả này cho thấy, giá trị pH của tinh dịch thu từ mào tinh nhỏ hơn so với giá trị pH của tinh dịch khi xuất ra bên ngoài. Bảng 3.10. Các thông số của tinh dịch Giống Landrace ST: 3350 Công ty Greenfeed (đánh giá tinh trùng trong tinh dịch) Giống Landrace Đại học Nông Lâm (đánh giá tinh trùng trong tinh dịch) Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên pH 7 7 6 Mật độ tinh trùng 23,93 ± 3.18 x 106 (a) 36,40 ± 7.77 x 106 (b) 498,67 ± 9,30 x 106 (c) Tỉ lệ sống chết 68,46 ± 2,49 % (a) 68,99 ± 1,29 % (b) 91,20 ± 1,17 % (c) Dạng kết dính C,d C,d A,b,c,d a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) Mật độ tinh trùng: Với lượng mật độ lớn, nguồn tinh trùng thu từ mào tinh của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên này có thể được lưu trữ cho các mục đích bảo tồn, chúng có thể được sử dụng cho tạo phôi bằng phương pháp vi tiêm tinh trùng vào trứng. Tỉ lệ sống của tinh trùng: tỉ lệ tinh trùng sống cao của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên là điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu đông lạnh để bảo quản nguồn tinh trùng. Đánh giá sự kết dính tinh trùng (Aggregation): Các tinh trùng bất động có thể bám dính vào các tinh trùng di động tạo thành cụm, ngoài ra các mảnh mô hay tế bào cũng có thể bám vào tinh trùng di động. Tinh trùng 18 19 heo Giống Landrace ST: 3350 Công ty Greenfeed và Giống Landrace Đại học Nông Lâm có dạng 3 là chủ yếu, tức là tinh trùng có bám dính vào các tế bào biểu mô hay mảnh mô, trong khi đó tinh trùng heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có cả 3 dạng bao gồm các dạng trên và dạng tinh trùng tự do. Kỳ hình tinh trùng heo rừng: Trong quá trình quan sát, chúng tôi nhận thấy tinh trùng heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên chủ yếu có những dạng kì hình xảy ra ở vùng đuôi tinh trùng, chúng tôi không nhận thấy những bất thường xảy ra ở vùng đầu tinh trùng. 3.4.1.2. Đông lạnh tinh trùng Ảnh hưởng của tiến trình hạ nhiệt Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát thời gian hạ nhiệt độ trong quá trình đông lạnh tinh trùng heo rừng theo các nghiệm thức sau:  Nghiệm thức 1: 20cm (5 phút) + 15cm (5 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 2: 20cm (5 phút) + 15cm (15 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 3: 20cm (5 phút) + 10cm (5 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 4: 20cm (5 phút) + 10cm (15 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 5: 20cm (5 phút) + 5cm (5 phút) + Nitơ lỏng  Nghiệm thức 6: 20cm (5 phút) + 5cm (15 phút) + Nitơ lỏng Sau khi đông lạnh, tinh trùng đông lạnh sẽ được giải đông và đánh giá tỉ lệ sống chết dựa trên phương pháp nhuộm eosin-nigrosin. Số tinh trùng sống chết sẽ được đếm trong 200 tinh trùng. Bảng 3.11. Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông ở các nghiệm thức khác nhau. Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 Tỉ lệ tinh trùng sống 23,67%a 30,67%b 24,67%a 37,83%c 35,33%d 40,67%e 19 20 Kết quả cho thấy nghiệm thức 1, nghiệm thức 3 có tỉ lệ tinh trùng sống thấp nhất. Nghiệm thức 6 có tỉ lệ tinh trùng sống cao nhất là 40,67%, trong khi đó nghiệm thức 4 có tỉ lệ tinh trùng sống là 37,83% và nghiệm thức 5 có tỉ lệ tinh trùng sống là 35,33% và nghiệm thức 2 có tỉ lệ tinh trùng sống là 30,67% (Bảng 3.11). So với nghiên cứu khác, kết quả của chúng tôi có tỉ lệ tinh trùng sống cao hơn sau khi giải đông. Trong nghiên cứu của Panida và cộng sự năm 2011, tỉ lệ tinh trùng sống là 38,10% [80]. Tỉ lệ sống của tinh trùng sau giải đông trong nghiên cứu này có tỉ lệ cao nhất là 40,67%. Như vậy, nghiệm thức 4, nghiệm thức 5 và nghiệm thức 6 có tốc độ làm lạnh phù hợp cho quá trình đông lạnh tinh trùng heo rừng, trong đó quá trình đông lạnh theo nghiệm thức 6 (20cm (5 phút) + 5cm (15 phút) + Nitơ lỏng) là phù hợp nhất cho đông lạnh tinh heo rừng thuần Tây Nguyên. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol Tỷ lê ̣ sống của tinh trùng đông laṇh đươc̣ đánh giá sau thời gian đông laṇh 1 tháng. Trong quá trình đông lạnh tinh trùng, chúng tôi sử dụng môi trường đông lạnh bổ sung glycerol ở các nồng độ khác nhau là 5%, 10%, 15% và 20%. Bảng 3.12. Tỷ lê ̣sống của tinh trùng thu từ mào tinh đông laṇh Nồng độ glycerol (%) 5 10 15 20 Tỉ lệ tinh trùng sống 13,66%a 12,94%a 25,59%b 19,71%c Tỉ lệ sống chết trong môi trường đông lạnh có nồng độ glycerol 15% là cao nhất trong khi đó, các môi trường đông lạnh có nồng độ glycerol khác có tỉ lệ sống/chết thấp hơn như nồng độ 5%, 10% và nồng độ 20% (Bảng 3.12). Đây là lần đầu tiên, quy trình đông lạnh tinh heo từ mào tinh được nghiên cứu. Kết quả thu được là rất khả quan. 20 21 3.4.2. Đông lạnh tế bào Trong nghiên cứu này, tế bào từ mô tai heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên được phân lập và nuôi cấy sau đó tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng. Trong quá trình nuôi cấy, mảnh mô bắt đầu dính vào đĩa nuôi cấy ở ngày thứ 3. Ngày thứ 5 – 6, các tế bào nuôi cấy bắt đầu phát triển và mọc xung quanh miếng mô tai heo. Sau 10 ngày nuôi cấy, tế bào mọc kín khoảng 90-95% bề mặt đĩa nuôi (Hình 3.12). Hình 3.12. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy sơ cấp. A: Tế bào sau 4 ngày nuôi (x 20). B: Tế bào sau 10 ngày nuôi (x 10). C: Tế bào sau 10 ngày nuôi (x 20). D: Tế bào lan tỏa đaṭ cấy chuyền (x 10). 21 22 Hình 3.13. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy chuyền trong phòng TN. A: Tế bào sau khi tách bằng trypsin/edta 0,25% (X20). B: Tế bào sau 24h cấy chuyền lần 1 (X10). C: Tế bào sau 48h cấy chuyền lần 1 (X10). D: Tế bào sau 48h cấy chuyền lần 2 (X20). E: Tế bào sau 48h cấy chuyền lần 2 (X20). F: Tế bào sau 72h cấy chuyền (X10). Sau khi cấy chuyền, tế bào sẽ được tách bằng trypsin và được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng. Sau khi đông lạnh một tháng, tế bào được giải đông và nuôi cấy để kiểm tra sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào. Kết quả cho thấy, sau khi giải đông tỉ tệ sống của tế bào là 60%. Tế bào tăng sinh và phát triển mạnh sau 3-4 ngày sau giải đông và đạt mật độ nuôi cấy 90-95% sau 5-6 ngày (Hình 3.14). Hình 3.14. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông. A, B, C: tế bào nuôi cấy sau khi giải đông 1 ngày. A1, B1, C1: tế bào nuôi cấy sau khi giải đông 3 ngày. 22 23 KẾT LUẬN - Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên thu nhận được là loài heo Sus scrofa Linnaeus, 1758. - Quá trình thu thập, nuôi thuần dưỡng heo rừng Tây Nguyên đạt tỉ lệ thuần hóa thành công sau 6 tháng cao nhất 81,82% là những cá thể có trọng lượng nhỏ (dưới 10 kg). - Quá trình động dục của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên trong điều kiện thuần dưỡng xảy ra quanh năm, dài hơn thời gian sinh sản của heo rừng Tây Nguyên thuần trong điều kiện tự nhiên. Các thông số cơ thể và thông số hộp sọ của heo rừng thuần Tây Nguyên hầu hết đều lớn hơn so với heo nhà. - Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gene cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt giữa heo rừng Tây Nguyên và các nhóm heo rừng khác. - Tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên thu từ mào tinh có giá trị pH = 6, mật độ là 498,67 ± 9,3 x 106, tỉ lệ sống chết đạt trung bình là 91,20% ± 1,17. Tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên có các dạng kết dính vào các tế bào biểu mô, mảnh mô, kết dính với nhau và bao gồm cả dạng tinh trùng tự do. Các dạng kì hình của tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên là bình thường, chỉ có vài dạng kì hình xảy ra ở vùng đuôi, không nhận thấy bất thường xảy ra ở vùng đầu tinh trùng. - Tỉ lệ sống của tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông là 40,67%. Tỉ lệ sống của tế bào sau giải đông là 60%, tế bào tăng sinh và phát triển mạnh đạt mật độ nuôi cấy 90-95% sau 5-6 ngày. 23 24 ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục có các nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học của heo rừng thuần Tây Nguyên trong điều kiện tự nhiên và thuần hóa. - Phân tích các trình tự còn lại của ADN ty thể để có thể xây dựng được bộ trình tự ADN ty thể của heo rừng thuần Việt Nam. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Xác định được vị trí phân loại của heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên trong mối quan hệ phát sinh loài của heo rừng trên thế giới. - Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gen cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên, g