Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh (panax vietnamensis ha et grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối

ẫn khoa học: 1. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên 2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Nhà nước tại: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học Trang web của Bộ GDĐT MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Sâm ngọc linh là cây dược liệu quý và đặc hữu cho vùng sinh thái nhất định. Thời gian sinh trưởng của cây chậm, cần tới 6 năm mới có thể bắt đầu thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được củ sâm chất lượng tốt. Trong khi đó, việc khai thác bừa bãi và không có phương pháp quản lý hiệu quả đã dẫn đến không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu cho các ngành dược liệu, mỹ phẩm,... Những năm gần đây, cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật cần phải bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn cho các nhà nghiên cứu, do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng. Vấn đề này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ vì rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao; có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục và không bị ảnh hưởng của dư lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Ngoài ra, rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên nuôi cấy rễ tơ có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo. Xuất phát từ các ưu điểm của rễ tơ và do những hợp chất dược liệu quý của sâm ngọc linh chủ yếu thu được từ rễ nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối”. Mục tiêu của đề tài Thu nhận được các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh có khả năng sinh trưởng nhanh, ổn định và chứa hàm lượng saponin thiết yếu của sâm. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có khả năng chuyển gen mong muốn vào cây sâm ngọc linh, loài cây dược liệu quý hiếm và rất khó nhân giống. Mặt khác, kết quả của đề tài cũng tạo ra được nguồn dược liệu quý, giúp giảm khai thác trong tự nhiên và góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm của loài sâm quý giá này. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ nuôi cấy rễ tơ thu nhận hoạt chất saponin, cung cấp nguyên liệu cho các cơ sở nghiên cứu ứng dụng, các công ty mỹ phẩm và dược phẩm, bào chế và sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, thuốc phục vụ sức khỏe cộng đồng. Những đóng góp mới của luận án Nghiên cứu đã tạo được nguồn vật liệu mới cho nuôi cấy sinh khối để thu nhận hợp chất saponin, đó là các dòng rễ tơ sâm ngọc linh sinh trưởng nhanh, ổn định làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối rễ để thu nhận hợp chất saponin. Nghiên cứu cũng mở ra triển vọng mới đầy tiềm năng là nuôi cấy sinh khối rễ tơ ở quy mô thương mại để thu nhận nguồn nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm. Kết cấu của luận án Luận án gồm 154 trang (kể cả tài liệu tham khảo) chia thành các phần: Phần mở đầu 2 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 31 trang; Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 20 trang; Chương 3: Kết quả, 52 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu, 23 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án, 1 trang; Summary, 4 trang; Phần tài liệu tham khảo, 19 trang với 169 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. Luận án có 31 bảng, 34 hình. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Những thành tựu nghiên cứu về cây sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 1.1.1. Giới thiệu về cây sâm ngọc linh Cây sâm ngọc linh (hay sâm Việt Nam) có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv. là cây thuốc giấu của đồng bào dân tộc Xê Đăng sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Loài sâm này xuất hiện ở độ cao 1.500 m trở lên so với mực nước biển. Từ 1.700 - 2.000 m, cây mọc tập trung thành quần thể dọc bờ suối, có độ ẩm trên 80%, đất nhiều mùn hữu cơ, dưới tán rừng hỗn giao giữa lá rộng và lá kim. Theo các nghiên cứu khoa học, sâm ngọc linh có tác dụng chống trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp,... Phân tích các hợp chất hóa học cho thấy sâm ngọc linh có chứa tới 52 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin), trong đó có 26 saponin có cấu trúc đã biết. 1.1.2. Tình hình của loài sâm ngọc linh hiện nay Sâm ngọc linh là loài sâm đặc hữu, chỉ sinh trưởng trong những vùng sinh thái nhất định. Thêm vào đó là thời gian nuôi trồng sâm kéo dài, thường cần tới 6 năm mới có thể thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được củ sâm có chất lượng tốt, đã dẫn tới xảy ra tình trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian được phép thu hoạch. Nhiều chương trình di thực sâm ngọc linh đã được tiến hành từ nhiều năm nay nhưng kết quả vẫn còn những hạn chế nhất định. Do vậy, các chế phẩm từ sâm ngọc linh cũng được sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu. Hiện nay, nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đang được xem là một giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ cộng đồng. Rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy, chuyển gen dễ dàng, có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục và có sự ổn định di truyền hơn so với nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo. Vì vậy, nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh có thể xem như là một giải pháp để thu nhận nguồn nguyên liệu sâm sạch. Do đó các nghiên cứu về chuyển gen thu nhận rễ tơ và nhân nhanh sinh khối rễ tơ cây sâm này là rất cần thiết. 1.2. Agrobacterium rhizogenes và ứng dụng trong nuôi cấy tạo rễ tơ để thu nhận các hợp chất thứ cấp ở thực vật 1.2.1. Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen Agrobacterium rhizogenes thuộc chi Agrobacterium, là vi khuẩn đất hình que, gram âm, gây ra hội chứng rễ tơ, được đặc trưng bởi sự xuất hiện các rễ tại vị trí vết thương của cây bị nhiễm bệnh. A. rhizogenes mang Ri plasmid (Root-inducing), và plasmid này đã được xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm (Chilton et al., 1982). Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ 200 - 800 kp gồm 2 vùng chính là T-DNA và vùng vir (virulence). Các chủng A. rhizogenes khác nhau cũng khác nhau về khả năng chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào bộ gen thực vật và các rễ tơ do các chủng khác nhau đó gây ra cũng biểu hiện các hình thái khác nhau (Giri et al., 2001). Chủng A. rhizogenes thuộc dạng agropine là chủng có độc tính mạnh, được đặc trưng bởi các Ri-plasmid: pRiA4, pRi1855 hoặc pRiLBA9402 (Veena, Taylor, 2007), và các chủng này được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật. Chúng có thể tích hợp một cách độc lập hai vùng T-DNA riêng biệt vào hệ gen thực vật. Một vùng mang các gen rol chịu trách nhiệm về các kiểu hình rễ tơ (gọi là vùng biên trái, TL-DNA), trong khi đó, vùng còn lại mang gen aux1-2 mã hóa các enzyme kiểm soát sự tổng hợp auxin (gọi là vùng biên phải, TR-DNA). TR-DNA đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình cảm ứng khởi tạo rễ vì nó mang gen aux1-2, ngoài ra TR-DNA cũng mang gen mã hóa tổng hợp opine. Trình tự của TL-DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 tương ứng mã hóa cho các gen rolA, B, C và D. Các chủng A. rhizogenes khác bao gồm dạng mannopine, cucumopine và mikimopine tương ứng với các Ri-plasmid là pRi8196, pRi2659 và pRi1724, thì chứa vùng T-DNA đơn có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD, tuy nhiên chúng cũng có khả năng cảm ứng hình thành các rễ tơ bởi các gen rol (Britton, Escobar, 2008). 1.2.2. Ứng dụng Agrobacterium rhizogenes trong nuôi cấy tạo rễ tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp ở thực vật Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn A. rhizogenes đã được nghiên cứu rộng rãi để sản xuất in vitro các chất chuyển hóa thực vật, hàm lượng chất chuyển hoá thu được tương tự hoặc cao hơn hàm lượng chất chuyển hoá có mặt trong rễ cây hoang dại hoặc trong cây trồng (Caspeta et al., 2005). Sự ổn định di truyền của rễ tơ đáp ứng được cho sản xuất ổn định các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng. Tương tự như vậy, các chất chuyển hóa thứ cấp có trong loài hoang dại thường được bảo tồn trong rễ tơ. Ở nước ta, các nghiên cứu chuyển gen để tạo rễ tơ đã được tiến hành thành công trên một số loài cây có giá trị. Tuy nhiên, các nghiên cứu về rễ tơ trong nước cũng chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, mà chưa được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các sản phẩm thương mại hoá. 1.3. Ứng dụng elicitor trong nghiên cứu sinh tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật 1.3.1. Khái niệm về elicitor Elicitor là các nhân tố sinh học hay hóa học từ các nguồn khác nhau có thể dẫn đến các biến đổi hình thái thực vật. Theo nghĩa rộng, đối với thực vật, elicitor có liên quan đến các hợp chất có thể khởi động các phản ứng hình thái và sinh lý dẫn đến sự tích tụ của phytoalexin. 1.3.2. Ứng dụng elicitor để kích thích tăng tích luỹ các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật Elicitor có thể được sử dụng như là một trong những công cụ quan trọng để sản xuất các sản phẩm thứ có cấp hoạt tính sinh học với năng suất cao hơn và giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012). Có nhiều báo cáo cho thấy rằng elicitor đã giúp tăng sản xuất các phytoalexin isoflavonoid, phytoalexin serquiterpenoid, coumarin, podophyllotoxin, azadirachtin, terpenoid, hypericin (hypericin và pseudohypericin) và hyperforin, capsaicinoid, vascicine (Gao et al., 2011, Coste et al., 2011, Gururaj et al., 2012, Bhambhani et al., 2012). Mặt khác, elicitor cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các con đường chuyển hóa phức tạp (Moreno et al., 1996), để mô tả sự tương tác giữa các phản ứng stress sinh học và phi sinh học ở mức độ phân tử (Atkinson, Urwin, 2012). Ngoài ra còn có các nghiên cứu đã được công bố để đánh giá sự ảnh hưởng của elicitor tới enzyme trao đổi chất thứ cấp (Zenk, 1991), các phân tử tín hiệu quan trọng làm trung gian của các phản ứng kháng ở thực vật (Bux et al., 2012), nổ oxy hoá (Davis et al., 1993), tín hiệu dẫn truyền phytoalexin (Preisig, 1994) và các kênh anion (Zimmermann et al., 1998). Bên cạnh đó, elicitor có thể được sử dụng để nghiên cứu các tính chất hóa học và con đường truyền tín hiệu của các chất tự nhiên tiết ra bởi vi sinh vật, động vật ăn cỏ và thực vật trong thời gian nhiễm bệnh, ăn cỏ, cộng sinh và tương tác allelopathic (Maffei et al., 2012) . CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ bất định là các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo của cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro. Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen là các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo, phôi, rễ bất định của cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro. Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu nhân nhanh rễ tơ và các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của elicitor tới khả tăng tích luỹ hoạt chất saponin là dòng rễ tơ chuyển gen có khả năng sinh trưởng nhanh và ổn định. 2.1.2. Các chủng vi khuẩn Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 mang vector PTN289, mang gen chỉ thị là gen gus được sử dụng để tối ưu hoá quy trình chuyển gen. Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 dạng dại được sử dụng để chuyển gen thu nhận các dòng rễ tơ sâm ngọc linh. Cả hai chủng vi khuẩn đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp. 2.2. Các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào sâm ngọc linh thông qua Agrobacterium rhizogenes 2.2.3. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen rol ở các dòng rễ tơ 2.2.4. Phương pháp chiết xuất và xác định các hoạt chất chính từ khối tế bào sâm 2.2.5. Phương pháp giải phẫu hình thái tế bào thực vật 2.3. Bố trí thí nghiệm 2.3.1. Nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro 2.3.1.1. Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận mô sẹo 2.3.1.2. Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận rễ bất định 2.3.2. Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh 2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen 2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen 2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ acetosyringone (AS) tới hiệu quả chuyển gen 2.3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu thực vật tới hiệu quả chuyển gen 2.3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 2.3.2.6. Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh trưởng phát triển của mô sâm ngọc linh 2.3.3. Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen 2.3.3.1. Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh 2.3.3.2. Đánh giá kết quả chuyển gen bằng phương pháp PCR 2.3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh 2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng nhân nhanh rễ tơ 2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ pH của môi trường lên khả năng nhân nhanh rễ tơ 2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh rễ tơ 2.3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng nhân nhanh rễ tơ 2.3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh rễ tơ 2.3.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đặc và lỏng lắc lên sự sinh trưởng của rễ tơ 2.3.5. Nghiên cứu một số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy hoạt chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh 2.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ 2.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ 2.3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid (ABA) lên khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ 2.3.6. So sánh cấu trúc hình thái giải phẫu, khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin giữa rễ tơ và rễ bất định 2.3.6.1. So sánh cấu trúc hình thái bên ngoài và hình thái giải phẫu giữa rễ tơ và rễ bất định 2.3.6.2. So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ và rễ bất định 2.4. Điều kiện nuôi cấy Tất cả các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ phòng: 25 ± 2oC; ẩm độ trung bình 55 - 60%, thí nghiệm nuôi cấy cây sâm ngọc linh và mô sẹo được đặt ở điều kiện chiếu sáng khoảng 2.500 lux, thí nghiệm nuôi cấy tái sinh rễ bất định và rễ tơ được trong điều kiện tối hoàn toàn. 2.5. Địa điểm nghiên cứu Các nghiên cứu được thực hiện tại: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học; Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên; Trung tâm sâm và dược liệu Tp. HCM. 2.6. Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 3 - 5 lần lặp lại. Các số liệu thu nhận được xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan với α ≤ 0,05 (Duncan, 1995). CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro 3.1.1. Nuôi cấy thu nhận mô sẹo Các nguồn mẫu lá, cuống lá và củ của sâm ngọc linh được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l TDZ; 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy nguồn mẫu thích hợp nhất cho sự phát sinh mô sẹo là củ của sâm ngọc linh (tỷ lệ tăng sinh đạt 9,71 lần). 3.1.2. Nuôi cấy thu nhận rễ bất định sâm ngọc linh Các nguồn mẫu lá, cuống lá, củ và mô sẹo của sâm ngọc linh được nuôi cấy trên môi trường SH có chứa 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8 và bổ sung thêm một trong ba loại auxin riêng lẻ (IAA, IBA, NAA) ở các nồng độ khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 mg/l. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy, nồng độ IAA, IBA, NAA tối ưu nhất bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho sự tái sinh rễ bất định lần lượt là 5 mg/l IAA; 5 mg/l IBA, 3 mg/l NAA. Trong 3 loại auxin sử dụng, thì IBA (5 mg/l) cho hiệu quả tái sinh rễ cao nhất. Nguồn mẫu thích hợp nhất cho sự tái sinh rễ bất định là mẫu lá với kích thước 1,5 x 1,5 cm. 3.2. Kết quả tối ưu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh 3.2.1. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen Các mẫu mô sâm ngọc linh được lây nhiễm trong môi trường huyền phù vi khuẩn với mật độ OD600 = 0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9. Thời gian lây nhiễm là 20 phút. Sau đó các mảnh cấy được chuyển lên môi trường đồng nuôi cấy trong 2 ngày. Sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành đánh giá sự biểu hiện tạm thời của gen gus được biến nạp vào trong tế bào. Kết quả thu được cho thấy, nồng độ vi khuẩn thích hợp nhất cho chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh là OD600 = 0,5. 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen Các khoảng thời gian biến nạp khác nhau: 10, 20, 30 phút được chúng tôi khảo sát. Kết quả thu được cho thấy, 20 phút là khoảng thời gian biến nạp thích hợp nhất cho chuyển gen. 3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu quả chuyển gen AS được bổ sung vào môi trường lây nhiễm ở các nồng độ khác nhau: 0, 50, 100, 150, 200 μM để gia tăng hiệu quả chuyển gen. Trong đó, nồng độ AS thích hợp nhất là 100 μM. 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen Các mẫu lá, cuống lá, mô sẹo, phôi sinh dưỡng, rễ bất định và lát cắt củ in vitro được sử dụng làm vật liệu nhận gen chuyển. Kết quả thu được cho thấy, sự biểu hiện tạm thời gen gus ở các loại mẫu mô là khác nhau. Các mẫu mô sẹo có sự biểu hiện gen gus (86%) cao hơn so với các vật liệu chuyển gen còn lại. Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus ở mô rễ là thấp nhất (27%). Khi đánh giá khả năng ra rễ tơ của các nguồn vật liệu chuyển gen, chúng tôi nhận thấy mẫu mô sẹo và mẫu phôi có khả năng tạo rễ cao hơn các mẫu còn lại, trong đó mẫu mô sẹo tạo rễ nhiều nhất. Mẫu rễ bất định sau khi khi lây nhiễm với vi khuẩn thì không có sự tạo thành rễ mới. Ba loại mẫu còn lại là cuống lá, lá và lát cắt củ có sự phát sinh rễ, tuy nhiên các rễ có nguồn gốc từ lá và cuống lá sâm ngọc linh không phát triển tiếp sau khi tạo thành. Vì vậy, mô sẹo là nguồn vật liệu thích hợp nhất để chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh. 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen Các khoảng thời gian đồng nuôi cấy khác nhau: 1 ngày, 2 ngày và 3 ngày được khảo sát. Kết quả thu được cho thấy, thời gian đồng nuôi cấy thích hợp là 2 ngày. 3.2.6. Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sâm ngọc linh Sau thời gian đồng nuôi cấy, các mẫu mô sâm được đặt vào các môi trường SH + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8 và có bổ sung các loại kháng sinh riêng lẻ hoặc kết hợp với nồng độ khác nhau: vancomycin (100 mg/l), carbenicilin (200, 400 mg/l), cefotaxime (250, 300, 500 mg/l). Đối chứng là môi trường không bổ sung kháng sinh. Kết quả thu được cho thấy, cefotaxime với nồng độ 500 mg/l là thích hợp nhất cho các thí nghiệm chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh. 3.3. Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen 3.3.1. Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh Dựa trên kết quả thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes mang vector PTN289 ở nội dung 3.2, chúng tôi đã tiến hành 8 lô thí nghiệm chuyển gen với chủng ATCC 15834 dạng dại, sử dụng vật liệu thực vật là mô sẹo. Kết quả thu được cho thấy, các mô sẹo cảm ứng tạo rễ tơ sau 4 - 6 tuần chuyển gen. Tỷ lệ tạo rễ tơ trung bình của 8 lô thí nghiệm là 39,81%, trong đó tỷ lệ tạo rễ tơ ở mỗi lô thí nghiệm cao nhất là 45% và thấp nhất là 33,75%. 3.3.2. Kết quả đánh giá các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR Tỷ lệ mẫu dương tính với gen rolB và rolC ở các lô thí nghiệm đạt được thấp nhất là 8,61% và cao nhất là 15%. Tỷ lệ mẫu mẫu dương tính với gen rolB và rolC trung bình của cả 8 lô thí nghiệm là 11,90%. 3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh 3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên sự sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ Môi trường khoáng Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) SH½ 54,00b* 6,10c 5,00b 2,00a ½SH 50,70b 5,60d 5,00bf 2,50a SH 77,30a 8,80a 9,00a 2,80a SH + 2VTM 71,70ab 8,10b 5,33b 2,50a *Các chữ cái khác nhau (a, b, c) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α ≤ 0,05 trong phép thử Duncan Môi trường khoáng thích hợp nhất là SH. 3.4.2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ Độ pH Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) 4,1 44,00cd* 5,20e 3,33c 1,13c 4,8 48,30cd 5,50d 4,67bc 1,17c 5,1 62,30bc 6,80c 5,33bc 2,20ab 5,8 79,30ab 8,20b 7,33ab 2,90a 6,1 87,30a 9,40a 8,67a 2,80a 6,8 50,70cd 5,10e 4,00bc 1,70bc 7,1 38,70d 4,30f 4,00bc 1,30c pH thích hợp cho sự sinh trưởng của các dòng rễ tơ là trong khoảng từ 5,8 – 6,1. 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh chuyển gen Nhiệt độ Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) 22°C 74,30b* 8,10c 6,67b 1,87b 25°C 102,30a 12,70a 11,33a 3,33a 28°C 81,00b 8,70b 6,00b 2,33b Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh là 25oC. 3.4.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của rễ tơ Sucrose (g) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) 0 33,33d* 4,00g 2,00b 1,67c 10 41,70d 4,60f 2,67b 2,20bc 20 66,00c 7,10e 7,67a 2,47bc 30 81,33ab 8,20c 8,33a 2,67ab 40 86,33a 9,30b 8,00a 2,67ab 50 96,33a 10,50a 9,00a 3,30a 60 70,30bc 7,60d 7,67a 2,33bc Nồng độ sucrose thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ là 50 g/l. 3.4.5. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ Giá thể Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) Agar 80,00a* 9,10a 8,00a 2,93a Gelrite 73,30a 8,00b 4,67b 2,07b Bông gòn 57,30b 5,40c 3,33b 1,80b Agar là giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ. 3.4.6. Sự sinh trưởng của rễ tơ ở tổ hợp các điều kiện nuôi cấy tối ưu trên môi trường đặc và môi trường lỏng lắc Quan sát về mặt hình thái và tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ trong thời gian cấy chuyền ở môi trường nhân nhanh tối ưu, chúng tôi ghi nhận được sự phát triển mạnh nhất của 4 dòng rễ tơ có kiểu hình đặc trưng như ở hình 3.1. Hình 3.1: Hình thái của 4 dòng rễ tơ sâm ngọc linh điển hình sau 12 tuần nuôi cấy. a: Dòng 1: rễ tơ dạng mảnh, phát triển theo chiều dài, phân nhánh chủ yếu ở dọc rễ chính; b: Dòng 2: rễ tơ dạng nhỏ, phân nhánh nhiều, phát triển mạnh; c: Dòng 3: rễ tơ dạng hình răng lược phân nhánh kém, phát triển chậm; d: Dòng 4: rễ tơ dạng sợi ngắn, phân nhánh ít, phát triển chậm. Sau đó, rễ tơ tiếp tục được nhân nhanh trên môi trường thạch và môi trường lỏng lắc. Kết quả thu được cho thấy, rễ tơ nuôi cấy trên môi trường đặc không bị đứt gãy, trong khi nuôi cấy lỏng lắc, rễ tơ có thể bị đứt gãy trong quá trình chuyển động. Do đó, rễ tơ nuôi cấy trên môi trường thạch có tính ổn định di truyền hơn so với nuôi cấy lỏng lắc, nên môi trường đặc thích hợp để duy trì sự sinh trưởng và bảo tồn các dòng rễ tơ gốc làm nguyên vật liệu cho các nuôi cấy thu nhận sinh khối. Ngược lại, rễ tơ cảm ứng tăng sinh nhanh và mạnh ở môi trường lỏng lắc, nên môi trường lỏng lắc thích hợp để nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ. 3.5. Kết quả nghiên cứu một số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy hoạt chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh 3.5.1. Ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh đã ức chế sự sinh trưởng của rễ. Tuy nhiên, bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy lại gia tăng khả năng tích luỹ hoạt chất của rễ tơ, và đạt cao nhất là 150 µl/l MeJA. Tại nghiệm thức 150 µl/l MeJA tổng hàm lượng saponin chính thu được cao nhất và cao gấp 2 lần so với đối chứng (Bảng 3.7), tuy nhiên khối lượng khô của rễ thu được lại giảm 2,2 lần so với đối chứng (Bảng 3.6), nên nếu xét về tổng hàm lượng saponin chính thu được trên toàn bộ sinh khối chất khô rễ tơ sâm thu được thì việc bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy là không hiệu quả. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ Nồng độ MeJA (µl/l) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Đặc điểm rễ 0 247,33a* 63,33a Trắng 50 203,33b 43,00b Vàng nhạt 100 165,67c 33,67c Vàng nhạt 150 137,33d 29,33d Vàng 200 106,00e 22,00e Vàng đậm 250 82,67f 19,33f Vàng đậm Bảng 3.7. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ Nồng độ MeJA (µl/l) Rg1 (‰) Rb1 (‰) MR2 (‰) Tổng saponin chính (‰) 0 0,162560 0,062567 4,633008 4,858135 50 0,291539 0,061573 7,511306 7,864417 100 0,261945 0,040760 7,332454 7,635159 150 0,615370 0,096196 9,033344 9,744910 200 0,410978 0,072151 3,771409 4,254538 250 0,374705 0,073269 3,357971 3,805945 3.5.2. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ Tương tự như MeJA, khi bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy cũng ức chế sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh, nhưng lại gia tăng khả năng tích luỹ hoạt chất của rễ. Tại nghiệm thức 20 µl/l SA, tổng hàm lượng saponin chính đạt được cao nhất và cao gấp 4,7 lần so với nghiệm thức đối chứng (Bảng 3.9). Nếu xét về tốc độ sinh trưởng của rễ tơ tại nghiệm thức 20 µl/l SA, thì khối lượng khô của rễ thu được tại nghiệm thức này chỉ giảm 2,3 lần so với đối chứng (Bảng 3.8). Do đó, nếu tính toán hàm lượng saponin chính thu được trên toàn bộ sinh khối khô của rễ thì việc bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ 20 µl/l giúp tăng tích luỹ hoạt chất lên gấp 2 lần so với đối chứng. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của SA lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ Nồng độ SA (µ/l) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Đặc điểm rễ 0 247,33a* 63,33a Trắng 10 174,00b 32,00b Vàng nhạt 20 145,00c 27,33c Vàng nhạt 30 118,67d 24,33d Vàng nhạt 40 96,67d 21,00e Vàng 50 71,33e 20,00e Vàng đậm Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ Nồng độ SA (µl/l) Rg1 (‰) Rb1 (‰) MR2 (‰) Tổng saponin chính (‰) 0 0,162560 0,062567 4,633008 4,858135 10 0,282477 - 8,707754 8,990231 20 0,394336 0,137013 22,202239 22,733588 30 0,886188 0,081438 20,078275 21,045901 40 0,288974 0,053910 6,660902 7,003786 50 0,413222 0,048578 5,513122 5,974923 3.5.3. Ảnh hưởng của abscisic acis (ABA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ Bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh cũng ức chế sự sinh trưởng của rễ, nhưng thúc đẩy mạnh mẽ khả năng tích luỹ saponin ở rễ nuôi cấy. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của ABA lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ Nồng độ ABA (mg/l) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Đặc điểm rễ 0 247,33a* 63,33a Trắng 1 217,00b 51,67b Trắng 2 195,67c 39,33c Vàng nhạt 3 153,00d 34,67d Vàng nhạt 4 113,33e 28,00e Vàng 5 87,67f 24,33f Vàng Bảng 3.11. Ảnh hưởng của ABA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ Nồng độ ABA (mg/l) Rg1 (‰) Rb1 (‰) MR2 (‰) Tổng saponin chính (‰) 0 0,162560 0,062567 4,633008 4,858135 1 0,554781 0,061413 22,275852 22,892046 2 0,682291 0,081027 8,414319 9,177637 3 0,392558 0,033090 8,452148 8,877796 4 0,732950 0,070097 8,518925 9,321972 5 0,265778 0,061413 3,727937 4,055129 Tại nghiệm thức môi trường nuôi cấy có bổ sung 1 mg/l ABA, khối lượng khô của rễ thu được giảm 1,2 lần (Bảng 3.10), nhưng hàm lượng saponin chính thu được lại tăng gấp 4,7 lần so với đối chứng (Bảng 3.11). Do đó, nếu tính tổng hàm lượng saponin chính thu được trên toàn bộ sinh khối khô của rễ, thì bổ sung 1 mg/l ABA vào môi trường nuôi cấy giúp gia tăng tích luỹ hoạt chất lên 3,9 lần. 3.6. Kết quả so sánh hàm lượng saponin và cấu trúc hình thái giữa rễ tơ và rễ bất định 3.6.1. So sánh cấu trúc hình thái bên ngoài và hình thái giải phẫu giữa rễ tơ và rễ bất định Rễ tơ và rễ bất định sâm ngọc linh có nhiều điểm tương đồng nhau về hình thái và cấu trúc giải phẫu và tương tự với rễ thông thường, tuy nhiên chúng cũng có những đặc trưng riêng. Rễ tơ phân nhánh nhanh, mạnh và mật độ phân nhánh dày đặc. Ở rễ tơ có hiện tượng phân nhánh đối xứng nhau qua trục và tính hướng động bất thường. Hệ mạch ở rễ chính của rễ tơ xốp và có nhiều lỗ rỗng. Trong khi đó, ở rễ bất định không có các đặc điểm này. 3.6.2. So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ và rễ bất định Khả năng tích luỹ saponin của rễ tơ và bất định là tương đương nhau. Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của rễ tơ cao hơn rễ bất định