Tóm tắt Luận án - Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục ulva lactuca và ulva reticulata

khoa học 1: PGS.TS Thành Thị Thu Thủy 2: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ..’, ngày tháng năm 2017. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm. Trên thế giới có khoảng 10 000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophyte), rong nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte). Nước ta có một vùng biển nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km bao bọc hết phía đông và nam đất nước, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa dạng. Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid. Tại Việt Nam nguồn lợi rong lục rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài và phổ biến nhất là Ulva reticulata và Ulva lactuca. Ulvan là sulfate polysaccharide có trong rong lục thuộc chi Ulva và Enteromorpha. Cũng giống như các sulfate polysaccharide có nguồn gốc từ rong biển khác, ulvan có cấu trúc rất phức tạp, nó được cấu tạo bởi các thành phần chủ yếu là các đường rhamnose, xylose, các acid glucuronic, iduronic và nhóm sulfate. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và điều kiện chiết tách. Các ulvan từ rong lục có cấu trúc rất đa dạng làm cho việc nghiên cứu cấu trúc gặp nhiều khó khăn, cản trở sự phát triển của các sản phẩm thuốc chữa bệnh. Do vậy, việc nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide đòi hỏi phải có sự kết hợp một cách hợp lý của nhiều phương pháp. Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt với hoạt tính sinh học của polysaccharide, do vậy việc nghiên cứu một cách tổng thể cấu trúc của polysaccharide là cần thiết. Hiện nay, một hướng 2 nghiên cứu đang được quan tâm là điều chế các dẫn xuất của hợp chất thiên nhiên với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cấu trúc đến hoạt tính sinh học, từ đó có thể tạo ra các chất có hoạt tính sinh học cao hơn mẫu tự nhiên. Ở nước ta, polysaccharide chiết tách từ rong đỏ và rong nâu như carrageenan, alginate và fucoidan đã được nghiên cứu và thu được các kết quả tốt thì cho đến nay chưa có một công bố nào về polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói chung và ulvan từ chi Ulva nói riêng. Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu " Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata”, để nghiên cứu cấu trúc của ulvan-một polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng nhằm góp phần hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án: -Xác định cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ 2 loài rong lục Ulva reticulata và Ulva lactuca phổ biến ở vùng biển Nha Trang của Việt Nam. -Tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Thu thập 2 loài rong lục thuộc chi Ulva là Ulva reticulata và Ulva lactuca - Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục trên. - Nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính tốt. - Nghiên cứu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học (sulfate hóa và acetyl hóa) đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. 3 4. Cấu trúc của luận án: Luận án gồm 130 trang: Đặt vấn đề 2 trang, Chương 1-Tổng quan 35 trang, Chương 2-Thực nghiệm 14 trang, Chương 3-Kết quả và thảo luận 56 trang, Kết luận và kiến nghị 3 trang, Danh mục các công trình đã công bố 2 trang, Tài liệu tham khảo 18 trang, có 17 bảng biểu và 58 hình ảnh và đồ thị. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Trong phần tổng quan, luận án đã giới thiệu chung về rong biển, phân loài rong biển ở Việt Nam và trên thế giới, thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển, các sulfate polysaccharide từ rong biển và tổng hợp về các tính chất hóa lý, phương pháp chiết tách, thành phần, cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan từ rong lục chi Ulva, như sau: Rong biển hay tảo bẹ hay cỏ biển có thế sống ở cả hai môi trường nước mặn và nước lợ, được chia thành 3 ngành chính bao gồm: rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong lục (Chlorophyta). Rong biển chứa hàm lượng đạm rất cao, rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng trong đó nổi bật là iodine, các vitamin (A, E, C, B12 và B1) và chất xơ. Thành phần hóa học của rong biển bao gồm lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó, polysaccharide là thành phần chính của rong biển, rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học. Ulvan là sulfate polysaccharide tan trong nước được phân lập chủ yếu từ 2 chi rong lục Ulva và Enteromorpha thuộc họ Ulvaceae, được biết đến là các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học quý báu như điều chỉnh hệ miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, chống đông tụ và kháng vi sinh vật kiểm định. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa lý và điều kiện xử lý sau thu hái. Cấu trúc của ulvan từ rong lục rất đa dạng và không đồng nhất, được tạo nên bởi các thành phần đường chủ yếu là rhamnose (Rha), xylose (Xyl), các acid 4 là acid glucuronic (GlcA), acid iduronic (IdoA) và nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là acid 3- sulfate ulvanobiuronic dạng A ((β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(→1)) và acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B ((α-L-IdoA-(1→4)-α-L- Rha3S (→1)). Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide bao gồm: Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC, phương pháp phổ IR, phương pháp phổ NMR, phương pháp phổ MS, phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 2.1.1. Thu thập và định danh rong Các mẫu rong lục dùng để chiết ulvan được thu hái tại vùng biển Nha Trang, tỉnh Khánh Họ̀a, tháng 4/2014 gồm 2 loài rong lục Ulva reticulata và Ulva lactuca, được định danh bởi TS. Lê Như Hậu (Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha trang). Tiêu bản của 2 mẫu rong nghiên cứu đang được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang và Viện Hóa học với kí hiệu UR-14 (Ulva reticulata) và UL-14 (Ulva lactuca). 2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong Xác định độ ẩm, hàm lượng tro, protein thô, béo thô và carbohydrate của rong: Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC. 2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục Sau khi nghiên cứu tham khảo các quy trình và điều kiện chiết tách ulvan từ rong lục mà các tác giả đã công bố, chúng tôi đã khảo sát và đưa ra các quy trình để chiết tách ulvan từ 2 loại rong lục thu thập được như sau: 2.1.3.1. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi nước: Ngâm chiết 20g bột rong trong 400ml dung dịch nước ở nhiệt độ 80º-90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở 5 điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, ly tâm lấy dịch trong, sau đó, cô quay cho đến khi thể tích còn 100ml, thêm tiếp cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-N, UL-N với hiệu suất chiết tách tương ứng 8,3 và 6,5 (% w). 2.1.3.2. Quy trình chiết bằng dung môi acid: Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400ml dung dịch acid HCl 0,05- 0,1N ở nhiệt độ 90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa về pH=7 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể tích còn 100ml, thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-H, UL-H với hiệu suất chiết tách tương ứng là 7,2 và 6,4 (% w). 2.1.3.3. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi kiềm: Ngâm chiết 20g bột rong trong 400ml dung dịch kiềm NaOH 0,1N ở nhiệt độ 60ºC, thời gian 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa về pH=7 rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể tích còn 100ml. Thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-K, UL-K với hiệu suất chiết tách tương ứng là 5,1 và 4,1 (% w). Tinh chế ulvan: mẫu ulvan thô được hòa tan trong nước cất và được tinh chế bằng màng thẩm tách MWCO 10000 (Da) của hãng Thermo Scientific – USA dưới vòi nước chảy trong 72h, kết tủa ulvan bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º, sấy tủa ở 60°C đến trọng lượng không đổi thu được ulvan có độ sạch cao. 2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học Các phép thử hoạt tính sinh học được tiến hành thử nghiệm đối với các ulvan tự nhiên và các dẫn xuất. Các phép thử đều tuân theo 6 qui định chung về thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị mẫu thử, mẫu đối chứng, ghi đọc và tính toán kết quả. 2.1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào Xác định hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm bao gồm: HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và HeLa (ung thư cổ tử cung). Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks. 2.1.4.2. Hoạt tính chống đông tụ máu Xác định hoạt tính chống đông tụ máu theo phương pháp của Anderson và CS. 2.1.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp khuyếch tán đĩa thạch tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha trang theo phương pháp của Vanden và CS. 2.1.4.4. Hoạt tính chống oxy hóa - Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Prieto và CS. - Xác định khả năng khử sắt theo phương pháp Zhu và CS. 2.2. Xác định cấu trúc ulvan 2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan - Xác định hàm lượng sulfate: Hàm lượng sulfate trong phân tử ulvan được xác định theo phương pháp của Dodgson và CS. - Xác định hàm lượng acid uronic: Xác định bằng phương pháp của Bitter và CS. - Xác định thành phần đường: Xác định theo phương pháp của Billan và CS. 2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Khối lượng phân tử trung bình của ulvan được xác định bằng GPC, trên máy HPLC Agilent 1100. Pha động 0,1N NaNO3, tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID150. 2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại IR Phổ hồng ngoại của các mẫu ulvan được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU trong vùng số sóng 4000-400cm-1. 7 2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane- 1-sulfonic acid) được dùng làm chất chuẩn nội. 2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng MS Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, Thermo SCIENTIFIC kiểu ion hóa âm với dung môi MeOH : H2O = 1:1. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là 30psi với tốc độ phun khí 650 lít/giờ tại nhiệt độ là 1800C. 2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại BL19B2, SPring-8, Hyogo, Nhật Bản. 2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét SEM Ảnh SEM được chụp trên hệ thiết bị Nova NaNoSEM 450 – FEI tại Khoa Vật lý - Trường ĐH KHTN – Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên - Dẫn xuất sulfate hóa: tổng hợp theo phương pháp của Lihong Fan và CS. Xác định hàm lượng sulfate bằng phương pháp khối lượng - Dẫn xuất acetyl hóa: tổng hợp theo phương pháp của Xiao-xiao Liu và CS. Xác định hàm lượng acetyl của ulvan bằng phương pháp phân tích thể tích theo Luis.A. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu 3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan Kết quả thành phần hóa học của các ulvan ở Bảng 3.1 cho thấy, hàm lượng sulfate trong các mẫu ulvan thu được dao động ở khoảng 13-19%, hàm lượng uronic acid rất lớn nằm trong khoảng 18-23% tính theo trọng lượng rong khô. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu đã công bố trên các loài rong lục khác. 8 Bảng 3.1. Kết quả thành phần hóa học của 6 ulvan Ulvan SO3Na (% khối lượng) Acid uronic (% khối lượng) Thành phần monosaccharide ( % mol) Rha Gal Xyl Man Glu UR-N 17,6 22,5 1 0,03 0,06 0,01 0,06 UR-H 14,3 19,3 1 0,1 0,11 0,01 0,21 UR-K 13,2 19,8 1 0,1 0,14 0,03 0,14 UL-N 18,9 21,5 1 0,03 0,07 0,01 0,06 UL-H 15,1 18,7 1 0,01 0,10 0,01 0,06 UL-K 14,2 18,2 1 0,04 0,09 0,01 0,07 3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan 3.1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan Vi Khuẩn UR-H UR-N UR-K UL-H UL-N UL-K Đối chứng Gram (-) E. coli ++ ++ - ++ +++ - +++ Pseudomonas aeruginosa - + - - + - +++ Vibrio haveyi - - - - - - +++ Gram (+) Bacillus cereus - - - - ++ - +++ Streptococcus faecalis - - - - - +++ Enterobacter cloace - ++ - + ++ - +++ Staphylococcus aureus - - - - - - +++ 3.1.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào Các mẫu ulvan chiết kiềm UL-K và UR-K không thể hiện hoạt tính này. Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan % tế bào sống sót Nồng độ (µg/ml) UR-H Nồng độ (µg/ml) UR-N Nồng độ (µg/m l) Ellipticine HepG 2 HeLa MCF- 7 HepG 2 HeLa MCF- 7 100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 HepG 2 HeLa M CF -7 20 42,26 50,30 44,72 20 50,34 36,29 48,74 4 70,18 69,05 76,84 4 84,22 83,05 89,66 10 1,33 3,31 5,9 3 0,8 83,24 90,44 85,45 0,8 94,90 96,44 95,91 IC50 (µg/ml) 49,10± 1,56 47,75± 2,37 50,69± 1,86 IC50 (µg/ml) 31,31± 1,56 34,75 ±1,38 36,37± 1,73 2 29,14 21,87 28, 86 9 Nồng độ (µg/ml) UL-H Nồng độ (µg/ml) UL-N HepG 2 HeLa MCF- 7 HepG 2 HeLa MCF- 7 0,4 49,42 48,89 48, 58 100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 20 50,21 55,34 48,67 20 60,67 66,24 58,71 0,08 81,59 77,13 76, 92 4 71,46 73,58 79,45 4 78,13 77,0 67,89 0,8 92,42 94,26 95,53 0,8 89,30 88,0 87,41 IC50 (µg/m l) 0,50 0,34 0,4 5 IC50 (µg/ml) 40,74± 2,21 44,25± 2,32 50,93± 1,67 IC50 (µg/ml) 29,67± 2,87 36,33 ±3,84 25,09± 1,36 3.1.2.3. Hoạt tính chống oxy hóa Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan TT Mẫu Hoạt tính khử sắt (mg Fe2+/g ulvan) Hoạt tính chống oxy hóa tổng số (mg AcidAscobic/g ulvan) 1 UL-N 2,51 3,75 2 UL-H 1,93 2,60 3 UL-K 0,01 1,12 4 UR-N 4,86 3,96 5 UR-H 1,34 2,56 6 UR-K 0,22 0,86 Kết luận: Các mẫu được chọn cho mục đích nghiên cứu cấu trúc là: - Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-N) - Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-H) - Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-N) - Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-H) 3.2. Xác định cấu trúc của ulvan Kết quả xác định khối lượng phân tử trung bình Mw và phân bố khối lượng phân tử Mw/Mn chỉ ra rằng, cũng giống như các sulfate polysaccharide tự nhiên khác, ulvan là polymer có độ phân tán cao với Mw/Mn có giá trị từ 2,19 đến 5,16 và khối lượng phân tử Mw từ 8,1x104 g/mol đến 3,47x105 g/mol tùy theo điều kiện chiết tách. 10 3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H) Phổ IR của UR-H có dải hấp thụ ở 848 cm 1 và 761 cm-1: liên kết C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí axial và equatorial, tương ứng; băng sóng hấp thụ tại 1624 cm 1: dao động của nhóm COO của acid uronic, 1078 cm-1: C-O-C của liên kết glycoside, 2927 cm-1: dao động hóa trị của liên kết C-H, dải phổ rộng tại 3315 cm-1: dao động của nhóm OH có liên kết hydro. Phân tích phổ 1H-NMR, vùng anomeric xuất hiện 3 tín hiệu ở δ5,30; δ4,65 và δ5,20 ppm được gán là A, B và C. Tín hiệu ở δ1,17 ppm: proton của C-6 ứng với nhóm CH3 của rhamnose, tín hiệu ở δ3,4-4,3 ppm là các proton của vòng pyranose. Trên phổ 13C-NMR, tín hiệu ở δ94–102 ppm là các carbon anomer, các carbon còn lại trong vòng sẽ ở vùng δ72–80 ppm. Tín hiệu với δ17,0 ppm đặc trưng cho nhóm C-CH3 và tín hiệu điển hình cho nhóm carboxyl của uronic acid với δ167 ppm. Bốn tín hiệu ở δ63,39; 63,32; 63,12; 63,06 ppm là của nhóm CH2 (C-6) của galactose và/hoặc glucose và/hoặc CH2 (C- 5) của xylose. Các proton từ H-1 đến H-6 của A được xác định từ phổ COSY, các carbon từ C-1 đến C-6 cũng lần lượt được gán dựa vào phổ HSQC (Hình 3.6). Tín hiệu ở vùng trường thấp của C-2 (δ79-80 ppm), C-3 (δ75-77 ppm) và C-4 (δ74-76 ppm) chỉ ra rằng liên kết glycoside ở rhamnose của ulvan UR-H có thể là (12,3,4) và/hoặc nhóm sulfate ở vị trí C-2, C-3 và C-4. Kết quả này được khẳng định một lần nữa thông qua mối tương quan giữa H-1(A) và C-2(A), C-3(A), C-4(A) trên phổ HMBC (Hình 3.7). Đối với gốc B, proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR với δ4,65 ppm, đây là giá trị cộng hưởng đặc trưng cho proton anomer H. Phân tích phổ HSQC cho thấy: C-1(B) ở δ98,39 ppm và δ98,52 ppm có liên hệ với H-1(B) tại δ4,65 ppm. Dựa vào tín hiệu của H-1(B), phổ COSY và HSQC các tín hiệu tại δ3,2 ppm và δ3,8 ppm lần lượt được gán cho H-2(B) và C-3 (B) tương ứng. Tín hiệu C-2 của acid uronic bị đẩy về 11 vùng trường thấp, chứng tỏ C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside (Bảng 3.8). Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 A →2)--L-Rha →4)--L-Rha 102-103 /5,30 79-80 /3,63 75-77 / 3,95 74-76 /3,85 75-76 /3,65 17-18 /1,17 B →2)--D-GlcA 98,52; 98,39 /4,65 77,0 /3,20 74,0 /3,75 74,0 / 3,85 - 167 C →2)--L-IdoA 94,70; 94,51 /5,20 77,5 /3,60 76,0 /3,95 74,0 /3,85 - 167 Đối với gốc C, proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR ở δ5,2 ppm là điển hình cho H. Kết hợp các phổ 1D và 2D, gán được H-1(C) tại δ5,2 ppm ứng với C-1(C) tại δ94,51 ppm và δ94,70 ppm. Tương tự như vậy, lần lượt gán được H-2(C) ở δ3,6 ppm, và C-2(C) ở δ77 ppm. Tín hiệu của C-2 của acid uronic bị đẩy về vùng trường thấp chứng tỏ C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside, vậy liên kết glycoside của C trong phân tử ulvan là kiểu liên kết (12) (Bảng 3.8). Như vậy, bằng kết quả phân tích phổ NMR, có thể kết luận rằng phân tử ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata được cấu thành bởi 2 loại disaccharide tạo thành chuỗi như sau: [→2)--D-GlcA- (1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-(1→], phân nhánh ở vị trí C-2 của acid uronic và Rha bị sulfate hóa ở 3 vị trí C-2, C-3 và C-4 (Bảng 3.8). 12 Phổ ESI-MS của UR-H, xuất hiện disaccharide dạng [RhaUroASO3]- biểu hiện qua peak ion mảnh [M-H]- tại m/z 419. Các monosaccharide là monosulfate rhamnose [RhaSO3] - và acid uronic [UroA] cho các peak m/z 243 và m/z 195 tương ứng, peak có số khối m/z 503 là của ion mảnh [Rha3SO3] -. Peak có m/z 339 được gán cho ion mảnh [RhaUroA]- , ion mảnh tại m/z 401 là của [RhaUroASO3- H2O] -. Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 Hình 3.9 là phổ ESI-MS/MS của ion mảnh ứng với m/z 243. Peak tại m/z 183 là của nhóm sulfate ở vị trí C-4 và mảnh với m/z 139 là do nhóm sulfate tại vị trí C-2 của α-L-Rha. Một peak có cường độ yếu tại tại m/z 169 là do ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 3 của rhamnose. Vậy, ulvan chiết acid (UR-H) có rhamnose bị sulfate ở cả 3 vị trí: chủ yếu ở C-2 và C-4, một phần nhỏ ở C-3. Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên. Kết hợp với việc phân tích phổ NMR ở trên, chúng tôi đưa ra cấu trúc mạch chính của ulvan chiết tách bằng dung môi acid từ rong lục Ulva reticulata Việt Nam là [→2)--D-GlcA-(1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-(1→], phân nhánh ở vị trí C-2 của acid uronic và Rha bị sulfate hóa ở 3 vị trí C-2, C-3 và C-4. Đây là một ulvan có cấu trúc mới vì các ulvan đã được công bố thì chưa thấy xuất hiện liên kết (1→2) ở mạch chính. 3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N) Cấu trúc hóa học của mẫu ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata cũng được nghiên cứu bằng các phương pháp phổ IR, 13 NMR, MS như mẫu UR-H ở trên. Phổ IR của UR-N cũng cho các dải hấp thụ điển hình của ulvan như: 1595cm 1, 1028cm 1, 844cm 1 và 783cm-1. Phân tích các thông tin thu được từ phổ NMR cho kết quả ở Bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-N Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 A →4)α-L-Rha3S 1→ 100,51/ 4,82 69,71/ 4,20 78,91/ 4,59 78,86/ 3,79 68,89/ 4,13 17,60/ 1,30 B →2,4)β-D-GlcA 1→ 103,83/ 4,63 74,58/ 3,35 74,83/ 3,64 79,48/ 3,65 76,70/ 3,82 177,60 Phổ ESI-MS của UR-N xuất hiện peak mảnh [M-H]- tại m/z 419 là của disaccharide dạng [RhaUroASO3]-. Monosulfate rhamnose [RhaSO3] - và acid uronic [UroA]- cho các peak tại m/z 243 và m/z 195 tương ứng. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 có peak ion mảnh với cường độ mạnh tại m/z 169 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate ở vị trí C-3. Như vậy, UR-N có rhamnose bị sulfate ở C-3. Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên. Từ việc phân tích các phổ IR, NMR và MS, chúng tôi có thể kết luận cấu trúc mạch chính của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata Việt Nam có dạng A3s [→4-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S- (1→] và bị phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của acid glucuronic với nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha. Cấu trúc không gian của phân tử UR-N ở kích thước cỡ nano được nghiên cứu bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Các biểu đồ Kratky [Hình 3.22 bên trái] và Guinier [Hình 3.22 bên phải] của dung dịch 1% ulvan UR-N trong nước và trong NaCl 0,5M có dạng đặc trưng cho các phân tử có cấu trúc không gian dạng hình que (rod-like). Qua biểu đồ Kratky, cho thông tin về sự có mặt của các nhóm sulfate trong phân tử ulvan. Từ biểu đồ Guinier bán kính từ hồi chuyển của UR-N được xác định là Rgc = 1,35-1,37 nm, đối với các polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh như carrageenan hay heparin thì giá trị Rgc khoảng 14 0,4-0,5 nm, điều này cho thấy UR-N có mạch nhánh tương đối dài, giống như fucoidan chiết tách từ các loài rong nâu. Kết quả nghiên cứu về cấu trúc không gian cũng phù hợp với cấu trúc hóa học xác định được theo các phương pháp phổ IR, NMR và ESI-MS ở trên là ulvan có cấu trúc mạch nhánh. 7x10 -3 6 5 4 3 2 1 0 q2 I(q ) 543210 q, nm -1 Ulva reticulata Forsskål 1% in water in 0.5 M NaCl aq -8 -7 -6 -5 -4 -3 ln (q I( q) ) 6543210 q 2 Ulva reticulata Forsskål 1% in water, Rgc=1.35nm in 0.5 M NaCl aq, Rgc=1.37nm Hình 3.22. Kết quả đo SAXS từ dung dịch UR 1% nước và trong NaCl 0,5 M: biểu đồ Kratky và biểu đồ Guinier của mẫu UR-N Phương pháp SAXS không những cung cấp thông tin về cấu trúc không gian của phân tử mà còn giúp đưa ra các thông tin chi tiết hơn về cấu trúc hóa học như độ dài mạch nhánh và sự phân bố của mạch nhánh trên mạch chính. Để làm được điều này, một mô hình phân tử của UR-N được xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học đã xác định bằng các phương pháp phổ, sau đó, đường tán xạ tính toàn từ mô hình phân tử được so sánh (fitting) với đường tán xạ thực nghiệm nhận được từ phép đo SAXS. Kết quả cho thấy mô hình cấu trúc phân tử xây dựng với n = 5 và m =4 (Hình 3.24) thì biểu đồ tán xạ Kratky thu được từ thực nghiệm SAXS và tính toán dựa trên mô hình cấu trúc phân tử có độ trùng nhau (fitting) khá tốt (Hình 3.25). Hình 3.24. Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học 15 Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ mô hình cấu trúc phân tử. 3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N) Phân tích phổ IR của UL-N, cung cấp những thông tin về sự có mặt của nhóm sulfate ở 845 cm 1 và 789 cm-1, dao động ở 1599 cm 1 là của nhóm COO- của acid uronic trong phân tử ulvan, dải hấp thụ ở 1026 cm 1 là đặc trưng cho liên kết glycoside C-O-C. Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N 16 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 A →2)-α-D-Xyl-(1→ 100,27/ 5,36 77,92 3,65 73,82/ 3,95 71,87/ 3,82 61,20/ 3,80; 3,88 - B →2,4)-α-L-Rha-(1→ 89,65; 101,50/ 4,90 79,21/ 4,06 71,74/  3,71 76,88/  3,82 68,40/  4,0 17,12/ 1,31 C →4)-α-L-Rha3S-(1→ 100,40/ 4,82 69,46/ 4,23 78,68/ 4,61 78,68/ 3,80 68,65/ 4,13 17,35/ 1,31 D →4)-β-D-GlcA-(1→ 103,65/ 4,64 74,40/ 3,35 74,58/ 3,65 79,40/ 3,68 76,88/ 3,81 177,76 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm: 1H và 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC của ulvan UL-N được tóm tắt ở Bảng 4.10. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 thấy có hai peak ứng với m/z 183 và m/z 169 là đặc trưng cho sự có mặt của nhóm sulfate ở vị trí carbon C-4 và C-3 của α-L-Rha tương ứng. [UroA]- [XylUroA] - [RhaUroA]- [RhaSO3] - [XylRhaSO3] - [UroARhaSO3] - [Rha3SO3] - Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3] - với m/z 243 Kết quả từ việc phân tích phổ IR, NMR và MS có thể khẳng định rằng, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca có cấu trúc mạch chính chủ yếu là disaccharide dạng [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L- Rha3S-(1→] và phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của rhamnose. Ngoài ra, trong phân tử ulvan còn có lượng nhỏ disaccharide ở dạng liên kết GlcA-(12)-Xyl, GlcA-(12)-Rha. Như vậy, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca Việt Nam mà chúng tôi nghiên cứu có cấu trúc hóa học giống với các kết quả nghiên cứu trước ở mạch chính nhưng khác nhau ở mạch nhánh và đa dạng ở mạch phụ. 17 3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H) Phổ IR của UL-H có những dao động đặc trưng của ulvan với tín hiệu ở 850 cm 1 và 786 cm-1 là dao động của liên kết C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí axial và equatorial, tương ứng. Dải hấp thụ ở 1014 cm 1 đặc trưng cho liên kết C-O chứa O-H. Tín hiệu dao động ở 1599 cm 1 là do dao động của nhóm COO của acid uronic. Từ những kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ NMR bao gồm: 1H và 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC của ulvan UL-N (Bảng 3.11), chúng tôi có thể kết luận rằng ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca có cấu trúc tạo thành từ disaccharide, tạo thành chuỗi [→4)-β- D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của rhamnose. So sánh với các nghiên cứu trước đây về ulvan từ rong lục Ulva lactuca cho thấy bằng các phương pháp chiết tách khác nhau, các ulvan thu được đều có thành phần mạch chính giống nhau, chúng chỉ khác nhau ở mạch nhánh. Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 D 4)-L-Rha3S 1 102,45/ 4,82 71,62/ 4,22 80,80/ 4,58 80,70/ 3,78 70,79/ 4,11 ~19,56/ ~1,3 E 1)-D-GlcA 4 105,69/ 4,65 76,44/ 3,35 76,72/ 3,60 81,52/ 3,65 78,49/ 3,86 D’ 1)-L-Rha 3(4) ~103,6/ 4,89 71,62/ 4,22 81,34/ 4,05 ~74,10/ 3,86 ~73,2/ 3,71 ~19,48/ ~1,29 18 Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 Trên phổ ESI-MS của ulvan xuất hiện mảnh khối của disaccharide [RhaUroASO3] - tại m/z 419. Các monosaccharide là monosulfate rhamnose [RhaSO3] - và acid uronic [UroA] cho các peak m/z 243 và m/z 195 tương ứng. Phổ ESI-MS/MS của disaccharide với m/z 243 được đưa ra ở Hình 3.35, trên phổ, có peak ion mảnh với cường độ mạnh tại m/z 169 là của nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha. Một paek có cường độ yếu tại tại m/z 139 là do ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 2 của rhamnose. Như vậy, UL-H có rhamnose bị sulfate ở cả 2 vị trí: chủ yếu ở vị trí carbon C-3 một phần nhỏ ở vị trí carbon C-2. Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên. Vậy UL-H có cấu trúc chuỗi disaccharide chủ yếu dạng [→4)β-D- GlcA-(1→4)α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của rhamnose. 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học của ulvan Các nghiên cứu trước cho thấy nhóm sulfate là yếu tố cấu trúc có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của sulfate polysaccharide nhất là hoạt tính chống đông tụ máu. Mặt khác, sự acetyl hóa có thể làm tăng hoạt tính chống oxi hóa hoặc kháng vi sinh vật kiểm định của chúng. Nhằm mục đích tìm hiểu sự thay đổi cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của ulvan khi chúng bị sulfate hóa hoặc acetyl hóa 19 chúng tôi đã điều chế các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của mẫu ulvan tự nhiên, ở đây cụ t