Tóm tắt Luận án Khảo sát tính đa dạng di truyền của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải trong ao nuôi cá tra và ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

H HỌC PHÂN LẬP TỪ CHẤT THẢI TRONG AO NUÔI CÁ TRA VÀ ỨNG DỤNG VÀO XỬ LÝ NƢỚC AO NUÔI CÁ TRA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành : 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. HÀ THANH TOÀN PGS. TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG 2015 Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ. Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ 2. Trung tâm học liệu - Trường Đại học Cần Thơ 3. Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Các bài báo đã công bố 1. Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2013. Đa dạng di truyền của vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long. Báo cáo khoa học (Proceedings) hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013; Quyển 1: Công nghệ Gen, Công nghệ Enzyme và Hóa sinh, Công nghệ sinh học Y - Dược, Công nghệ sinh học Động vật: 137-141. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ. 2. Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2014. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long trên môi trường polysaccharide và ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở quy mô phòng thí nghiệm. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn - Kỳ 1- Tháng 4/2014 (số 7/2014): 69-76. 3. Đặng Thị Huỳnh Mai, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2014. Tối ưu hóa và ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học trên môi trường protein vào xử lý nước ao nuôi cá tra ở quy mô phòng thí nghiệm. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 30(2014): 13-21. 1 Chƣơng 1 TỔNG QUÁT VỀ LUẬN ÁN 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu thủy sản là thế mạnh kinh tế đặc biệt hiện nay ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL); trong đó, loài thủy sản có tiềm năng rất lớn là cá tra đã đạt sản lượng xuất khẩu nhiều nhất trong các loài cá nuôi nước ngọt với nhiều mặt hàng chế biến đa dạng, phong phú. Tuy nhiên, bên cạnh lợi ích về kinh tế, việc nuôi cá tra công nghiệp cũng đã có những tác động tiêu cực rất lớn đến môi trường do thức ăn dư thừa, chất thải trong quá trình trao đổi chất, các hóa chất sử dụng lắng xuống, tích tụ lại trong đáy ao và nhanh chóng chuyển hóa thành ammonium, nitrate, phosphate cũng như các hợp chất khác gây ô nhiễm môi trường. Theo các nghiên cứu do Châu Minh Khôi và ctv. (2012) thì hàm lượng N và P hòa tan trong các ao nuôi cá tra cao gấp nhiều lần so với quy chuẩn QCVN 08:2008/BTNMT. Nếu nuôi cá tra với mật độ cao (40-50 con/m2), sử dụng hoàn toàn thức ăn công nghiệp thì lượng chất thải tích tụ trong ao nuôi là rất lớn (Trương Quốc Phú và Trần Kim Tính, 2012). Ngoài ra, theo Quyết định 3885/QĐ-BNN-TCTS (2014) quy hoạch thì đến năm 2020 diện tích nuôi cá Tra của vùng là 7.800 ha và sản lượng khoảng 1,9 triệu tấn. Như thế, áp lực đối với môi trường sẽ rất cao cũng như có nhiều khó khăn hơn về chất lượng nguồn nước cấp và khả năng tiêu thoát. Để xử lý nước, quy trình kết tụ sinh học được đề nghị nhằm giúp loại bỏ tạp chất, tạo thuận lợi cho các công đoạn xử lý sau với lợi điểm là đầu tư cơ sở hạ tầng ít, hiệu quả nhanh và thân thiện với môi trường. Chất kết tụ sinh học có hiệu quả cao, không độc hại, có thể phân hủy sinh học, không gây ô nhiễm thứ cấp, phạm vi ứng dụng rộng và vi khuẩn tạo chất kết tụ cũng dễ phát triển tăng sinh khối. Tuy nhiên, hoạt tính của chất kết tụ sinh học được xác định bởi bản chất di truyền của sinh vật (Salehizadeh và ctv., 2000), cũng như chịu ảnh hưởng của các yếu tố như thành phần chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy, điều kiện của môi trường tạo chất kết tụ Vì vậy, để có được hiệu quả mong muốn, đề tài: “Khảo sát tính đa dạng di truyền của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học phân lập từ chất thải trong ao nuôi cá tra và ứng dụng vào xử lý nƣớc ao nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long” 2 đã được tiến hành nhằm tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ sinh học với tỉ lệ cao nhất để ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước ở ĐBSCL. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ sinh học với tỉ lệ cao, đồng thời khảo sát đa dạng di truyền của các vi khuẩn tuyển chọn. - Xác định được các điều kiện phù hợp về pH, chất dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy... đối với các chủng vi khuẩn tuyển chọn để kết tụ đạt tỉ lệ cao nhất nhằm chọn ra được một số chủng, tổ hợp vi khuẩn có khả năng ứng dụng vào xử lý nuớc ao nuôi cá tra ở ĐBSCL. 1.3. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu các vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học từ các mẫu (nước+bùn đáy) trong các ao nuôi cá tra ở 10 tỉnh/thành phố vùng ĐBCSL. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án Luận án đã phân lập, tuyển chọn được các vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ cao; xác định được các điều kiện phù hợp để kết tụ đạt hiệu quả nhất; đánh giá đa dạng di truyền của các vi khuẩn qua tính đa hình của các nucleotide và thiết lập được giản đồ phả hệ giữa các vi khuẩn tuyển chọn và với các chủng tương đồng di truyền. Các kết quả này đóng góp, bổ sung thông tin cho các tài liệu tham khảo, giảng dạy cũng như cho các nghiên cứu chuyên ngành sâu hơn. Trong thực tiễn, đề tài mở ra hướng ứng dụng vi khuẩn tạo kết tụ giúp giải quyết nhu cầu xử lý nước ao nuôi cá tra, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường nước. 1.5. Những đóng góp mới của luận án - Tuyển chọn được một số vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ cao từ các ao nuôi cá tra ở ĐBSCL. Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn và xác định các chủng tương đồng di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Khảo sát đa dạng di truyền của các vi khuẩn qua tính đa hình của các nucleotide dựa trên dấu phân tử SNP. Thiết lập sơ đồ phả hệ thể hiện mối tương quan giữa các vi khuẩn tuyển chọn và với các chủng tương đồng di truyền. - Xác định được các điều kiện phù hợp giúp các chủng vi khuẩn tuyển chọn đạt tỉ lệ cao nhất. Giới thiệu được một số chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu quả cao có thể ứng dụng vào xử lý nước ao nuôi cá tra. 3 Chƣơng 2 NỘI DUNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Luận án được thực hiện với các nội dung sau: 4 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện với thiết bị, dụng cụ và hóa chất chuyên dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật và Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ. Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được gửi sang công ty MACROGEN ở Hàn Quốc để xác định trình tự đoạn DNA. Ảnh các chủng vi khuẩn tuyển chọn được chụp qua kính hiển vi điện tử quét tại Phòng thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ. Hàm lượng TSS và COD trong mẫu nước ao được phân tích tại Trung tâm Kỹ thuật và Ứng dụng Công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Cần Thơ. Phân tích các chỉ tiêu Sinh-hóa tại Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Thu mẫu và xác định mật số Thu mẫu (nước + bùn đáy) trong các ao nuôi cá tra ở 10 tỉnh ĐBSCL là An Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh, Vĩnh Long. Ở mỗi tỉnh, thu từ 8-25 mẫu tùy theo số lượng ao nuôi cá. Mẫu nước thu cách bờ ao từ 2 m, cách mặt nước 0,5 m; mẫu bùn dùng gàu/lon múc ở mặt đáy. Chứa riêng mẫu nước và bùn đáy trong lọ nhựa 50 ml có nắp đậy, trữ lạnh 4oC ở phòng thí nghiệm. Khi tiến hành phân tích thì trộn nước và bùn đáy lại, khuấy đều, lấy dung dịch mẫu sử dụng. Mẫu được thu 2 lần: 1 lần vào mùa khô và 1 lần vào mùa mưa để có thể so sánh sự phát triển mật số vi khuẩn theo mùa. 2.3.2. Phân lập vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học Sử dụng mẫu thu vào mùa khô để phân lập vi khuẩn. Vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học được phân lập trên 2 loại môi trường là môi trường kết tụ protein (theo Hazana và ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) và môi trường kết tụ polysaccharide (theo Deng và ctv., 2003, Bùi Thế Vinh, 2012). Các khuẩn lạc của vi khuẩn tạo chất kết tụ có bề mặt trơn, nhầy và ướt. Tái phân lập liên tục nhiều lần đến khi các khuẩn lạc tách rời nhau rõ trên các đường cấy. Sau khi kiểm tra độ ròng trên kính hiển vi, cấy chuyển sang ống, xem như một chủng riêng biệt và trữ lại dùng cho các thí nghiệm sau. 2.3.3. Tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao Mỗi chủng vi khuẩn phân lập được nuôi trong từng môi trường như trên, 5 không bổ sung agar. Chứa 50 ml dịch môi trường trong bình tam giác, lắc đều trên máy với vận tốc 120-150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 27 o C (theo Gong và ctv., 2008; Xia và ctv., 2008) khoảng 4 ngày. Chuẩn bị dung dịch kaolin (5g/L) và CaCl2 (1%) theo tỉ lệ 9:1. Chuẩn pH = 7. Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + CaCl2) và 20µl dịch vi khuẩn nói trên (mật số ≥107 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và ≥108 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn. Khuấy hỗn hợp trong 5 giây trên máy khuấy và giữ yên 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo mật độ quang OD ở bước sóng 550 nm. Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần lặp lại. Tính tỉ lệ kết tụ theo Deng và ctv. (2003). Tỉ lệ kết tụ % = OD đối chứng − OD (mẫu) OD (đối chứng ) x 100 Dựa vào tỉ lệ kết tụ, trên mỗi loại môi trường (kết tụ protein và kết tụ polysaccharide) chọn 1 vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao nhất / tỉnh. Tổng cộng có 10 vi khuẩn kết tụ protein và 10 vi khuẩn kết tụ polysaccharide được chọn. 2.3.4. Nhận diện, dịnh danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn *Quan sát khuẩn lạc qua: màu sắc, hình dạng, độ nổi, kích thước... Hình dạng, chuyển động của vi khuẩn được quan sát qua kính hiển vi quang học. * Định danh vi khuẩn qua phân tích trình tự gen 16S rDNA - Tách chiết DNA theo quy trình của Breugelmans và Uyttebrock (2004) - Khuếch đại chuỗi gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR Sử dụng cặp mồi (primer) theo Gao và ctv. (2006), Gupta và ctv.(1983): Mồi xuôi 37F : 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3’ Mồi ngược 1497R: 5’-ACGGCAACCTTGTTACGAGTT-3’ Tiến trình thực hiện PCR: 6 Thành phần hợp chất dùng trong kỹ thuật PCR: Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) H2O (cất 2 lần) PCR buffer dNTP MgCl2 Đoạn mồi xuôi Đoạn mồi ngược BSA Taq DNA polymerase DNA 10X 1mM 10X 50ng/µl 50ng/µl 5U/µl 5U/µl 25ng/ml 24,0 5,0 8,0 4,0 2,0 2,0 0,5 0,5 4,0 Tổng 50,0 - Điện di sản phẩm PCR trên gel, ước lượng kích thước đoạn DNA Đun nóng 0,5 g agarose trong 40 ml TAE 1X cho tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 50oC, cho 0,8 µl EtBr vào, lắc đều. Đỗ vào khuôn để định hình và tạo giếng, sau 90 phút có thể sử dụng. Trộn 10 µl mẫu DNA (đã qua PCR) với 2 µl dung dịch tải trên giấy paraffin. Cho dịch DNA thang chuẩn vào giếng 1 và các mẫu DNA cần điện di vào các giếng tiếp sau. Tiến hành điện di ở hiệu thế 50-70 volt, khoảng 60 phút, trong dung dịch đệm TAE 1X. Kết quả quan sát trên hệ thống máy chụp gel bằng tia UV. Kích thước band DNA của vi khuẩn được ước lượng dựa theo thang chuẩn. - Giải trình tự DNA Sản phẩm PCR được chuyển sang công ty MACROGEN (Hàn Quốc) để xác định trình tự đoạn gen DNA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Định danh vi khuẩn tuyển chọn, xác định chủng tương đồng di truyền Trình tự đoạn DNA của các vi khuẩn được so với trình tự DNA của các vi khuẩn lưu trữ trên ngân hàng gen NCBI và tìm tỉ lệ tương đồng bằng phần mềm BLAST N. Bước đầu định danh các vi khuẩn tuyển chọn và xác định các chủng tương đồng di truyền (2 chủng tương đồng/1 vi khuẩn). 2.3.5. Khảo sát đa dạng di truyền của các vi khuẩn tuyển chọn 2.3.5.1. Tính đa hình của các nucleotide trên các chuỗi trình tự Các phần mềm BioEdit (Hall, 1999), Clustal W (Thompson và ctv., 1994), MEGA 5.1(Tamura và ctv., 2011) được sử dụng để so sánh 10 chuỗi trình tự của các vi khuẩn tuyển chọn (trên từng loại môi trường). Căn cứ vào dấu SNP nhận ra những điểm tương đồng và biến đổi giữa các trình tự. 7 Tính giá trị số Pi và Theta (2 trong các chỉ số giúp ước tính đa dạng nucleotide) bằng phần mềm Dna SP v5 (Rozas và ctv., 2009). Đồng thời sử dụng phần mềm Dna SP Graph vẽ đường biểu diễn của Pi và Theta, xác định vùng có biến động cao trên các chuỗi trình tự, qua đó thấy được đa hình của các nucleotide. Trong khoảng biến động, khảo sát 40 vị trí base bất kỳ có dấu SNP để ước đoán mối liên hệ giữa các chủng vi khuẩn thể hiện qua tỉ lệ biến đổi của các chuỗi trình tự. Sử dụng phần mềm MEGA 5.1 lập giản đồ phả hệ thể hiện tương quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn (10 chủng/1 loại môi trường), kết hợp với phân tích kết quả khảo sát các vị trí base bất kỳ nói trên. 2.3.5.2. Giản đồ phả hệ thể hiện tƣơng quan di truyền giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn và các chủng tƣơng đồng di truyền Dựa trên trình tự DNA của các chủng vi khuẩn đã định danh và các chủng tương đồng di truyền, sử dụng phần mềm MEGA 5.1 thiết lập giản đồ phả hệ (cây di truyền). Phân tích di truyền phả hệ xác định tương quan giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn và với các chủng vi khuẩn tương đồng trên ngân hàng gen NCBI. 2.3.6. Chọn lọc các vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao hơn 70% từ các chủng đã tuyển chọn Từ các chủng vi khuẩn được tuyển chọn nói trên, trên mỗi loại môi trường (môi trường kết tụ protein và môi trường kết tụ polysaccharide), chọn ra 3 chủng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao hơn cả (cao hơn 70%). Căn cứ vào ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) và khóa phân loại Bergey để củng cố kết quả định danh các chủng vi khuẩn này. 2.3.7. Xác định các điều kiện để các vi khuẩn chọn lọc đạt tỉ lệ kết tụ cao nhất. Các chủng vi khuẩn chọn lọc được nuôi trong môi trường lỏng tương ứng (môi trường kết tụ protein và kết tụ polysaccharide) với thành phần tương tự như trước, không bổ sung agar. Lắc đều trên máy với vận tốc 120- 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 27o C trong 4 ngày. 2.3.7.1. pH môi trƣờng (theo Gong và ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) Chuẩn bị 5 bình chứa dung dịch kaolin (5g/L) và CaCl2 (1%) theo tỉ lệ 9:1. Điều chỉnh pH ở từng bình theo các giá trị 5, 6, 7, 8, 9. Cho vào từng 8 ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + CaCl2) và 20 µl dịch vi khuẩn (mật số ≥ 107 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và mật số ≥ 108 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Khuấy hỗn hợp trong 5 giây trên máy khuấy, giữ yên trong 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo chỉ số OD ở bước sóng 550 nm, tính tỉ lệ kết tụ. Mẫu đối chứng ở từng giá trị pH được thực hiện tương tự nhưng không chủng dịch vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Ghi nhận giá trị pH, ở đó tỉ lệ kết tụ cao nhất (theo từng chủng vi khuẩn). 2.3.7.2. Ion kim loại trong môi trƣờng (theo Gong và ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) Chuẩn bị 5 bình chứa dung dịch kaolin (5g/L) và dung dịch 1% từng loại muối kim loại CaCl2, NaCl, KCl, MnSO4, MgSO4 theo tỉ lệ 9:1. Điều chỉnh pH ở giá trị cho tỉ lệ kết tụ cao nhất. Cho vào ống nghiệm 20 ml dung dịch kaolin (kaolin + muối kim loại) và 20 µl dịch vi khuẩn (mật số ≥ 107 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và mật số ≥ 108 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Khuấy hỗn hợp trong 5 giây trên máy khuấy, giữ yên trong 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo chỉ số OD (bước sóng 550 nm) và tính tỉ lệ kết tụ. Mẫu đối chứng của từng loại muối kim loại được thực hiện tương tự nhưng không chủng dịch vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Xác định ion kim loại cho tỉ lệ kết tụ cao nhất đối với từng chủng vi khuẩn. 2.3.7.3. Các nguồn dinh dƣỡng phù hợp nhất (theo Gong và ctv., 2008; Bùi Thế Vinh, 2012) Từ 3 nguồn carbon (glucose, sucrose, tinh bột), 4 nguồn nitrogen (glutamate, yeast extract, urea, (NH4)2SO4) và 4 nguồn khoáng vô cơ (KCl, FeCl3, CaCl2, K2HPO4 + KH2PO4) khác nhau, phối hợp lại để tạo các môi trường có nguồn dinh dưỡng khác nhau, cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả có 48 tổ hợp tức là 48 loại môi trường nuôi vi khuẩn. Vi khuẩn được nuôi trong ống 50 ml, lắc đều trên máy với vận tốc 120- 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 27o C trong 4 ngày (đạt mật số ≥ 107 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ protein và mật số ≥ 108 CFU/ml đối với vi khuẩn kết tụ polysaccharide). Tính tỉ lệ kết tụ với huyền phù kaolin theo các điều kiện cho hiệu quả cao nhất về pH, ion kim loại đã được xác 9 định ở các thí nghiệm trước. Dịch vi khuẩn trong môi trường được sử dụng với liều lượng 0,1% (v/v). Mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Xác định môi trường có nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ tốt nhất cho sự phát triển của từng chủng vi khuẩn. 2.3.7.4. Thời gian nuôi cấy - Liều lƣợng vi khuẩn sử dụng Khả năng tạo kết tụ của từng chủng vi khuẩn ở những liều lượng khác nhau với các tỉ lệ (dịch vi khuẩn:dịch môi trường) 0,08; 0,09; 0,1; 0,11; 0,12; 0,2% được xác định theo từng ngày nuôi cấy. Đồng thời các vi khuẩn cũng được phối hợp lại để tạo từng tổ hợp gồm 2 vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường chứa nguồn dinh dưỡng phù hợp nhất. Chuẩn bị dung dịch kaolin và muối kim loại như các thí nghiệm trên với giá trị pH và ion kim loại thêm vào cho hiệu quả kết tụ cao nhất. Cho vào ống nghiệm dung dịch kaolin (kaolin + muối kim loại) và dịch vi khuẩn với từng liều lượng theo tỉ lệ 0,08; 0,09; 0,1; 0,11; 0,12; 0,2%. Khuấy hỗn hợp trong 5 giây trên máy khuấy, giữ yên trong 5 phút. Lấy phần trong phía trên đo OD và tính tỉ lệ kết tụ. Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng dịch vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí ngẫu nhiên, thực hiện 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện tương tự, liên tục qua các thời điểm: ngày 2, 3, 4, 5 sau nuôi cấy nhằm xác định thời gian nuôi cấy và liều lượng vi khuẩn sử dụng để đạt tỉ lệ kết tụ cao nhất đối với từng chủng vi khuẩn. Bên cạnh đó, theo từng ngày, tỉ lệ kết tụ của các tổ hợp theo liều lượng phù hợp nhất của từng chủng vi khuẩn cũng được khảo sát, từ đó chọn ra được các tổ hợp hiệu quả cao. 2.3.7.5. Khảo sát tƣơng quan giữa mật số vi khuẩn và tỉ lệ kết tụ theo thời gian nuôi cấy Theo từng ngày, tỉ lệ kết tụ và mật số của vi khuẩn cũng được khảo sát để ghi nhận mối tương quan giữa sự phát triển mật số vi khuẩn và hiệu quả tạo kết tụ (căn cứ vào tỉ lệ kết tụ) theo thời gian nuôi cấy. 2.3.8. Kiểm tra hiệu quả của các chủng, tổ hợp vi khuẩn chọn lọc Các chủng vi khuẩn, tổ hợp vi khuẩn được kiểm tra qua 2 lần: - Lần 1: Kiểm tra tỉ lệ kết tụ trong huyền phù kaolin của các chủng vi khuẩn và tổ hợp vi khuẩn theo các điều kiện về pH môi trường, ion kim loại 10 thêm vào môi trường, các nguồn dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy và liều lượng vi khuẩn sử dụng đã được xác định ở trên. Chọn 2 tổ hợp có tỉ lệ kết tụ cao nhất đưa vào kiểm tra lần 2 cùng với 6 chủng vi khuẩn chọn lọc. - Lần 2: Lặp lại thí nghiệm tương tự nhưng thay dung dịch kaolin bằng nước ao cá tra ở 2 địa điểm khác nhau (ao cá ở Ô Môn và ao cá ở Trà Vinh) để khẳng định các chủng, tổ hợp vi khuẩn hiệu quả cao. Chọn ra các vi khuẩn, tổ hợp vi khuẩn đạt tỉ lệ kết tụ cao hơn cả đưa vào ứng dụng. 2.3.9. Ứng dụng xử lý nƣớc ao nuôi cá ở quy mô phòng thí nghiệm Thí nghiệm ứng dụng vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học vào xử lý nước ao nuôi cá tra được thực hiện bước đầu ở quy mô phòng thí nghiệm với thể tích 100 L. Ba ao nuôi cá tra được chọn thu mẫu nước thực hiện thí nghiệm là Cần Thơ 1, Cần Thơ 2 và Cần Thơ 3 thuộc cồn Khương, phường Cái Khế, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ. - Ao Cần Thơ 1: ngưng cho cá ăn từ 10 ngày trước, chờ thu hoạch cá. - Ao Cần Thơ 2: cá tra nuôi được 4,5 tháng tuổi. - Ao Cần Thơ 3: cá được 6,5 tháng tuổi. Mẫu nước thu về được bảo quản trong thùng 100L và sử dụng trong ngày. Các chủng, tổ hợp vi khuẩn sử dụng được chọn ở kết quả kiểm tra; các bước thực hiện tương tự những thí nghiệm trước theo các điều kiện phù hợp đã xác định. Khuấy đều nước ao trong thùng chứa bằng tay với cây gỗ cứng hoặc tre (đường kính ≈ 4 cm, dài ≈ 150 cm) với tần số 60 vòng/phút trong 5 phút và để lắng sau 30 phút. Mỗi lần xử lý nước ở 1 ao đều kiểm tra giá trị pH và tỉ lệ kết tụ trong nước ao của các chủng vi khuẩn và tổ hợp vi khuẩn. Khả năng tạo kết tụ của các chủng, tổ hợp vi khuẩn được kiểm tra bằng cách đo lượng TSS và COD trong nước ao trước và sau xử lý nước với vi khuẩn để thấy được tỉ lệ TSS và COD giảm đi sau xử lý, từ đó đánh giá được hiệu quả của chúng. * Các số liệu ghi nhận trong các thí nghiệm được phân tích phương sai (ANOVA) và hệ số tương quan với phần mềm phân tích thống kê Minitab 16, phương pháp Fisher, để so sánh các trung bình của các nghiệm thức, có tính đến độ lệch chuẩn. Các biểu đồ, sơ đồ thể hiện tương quan giữa các nghiệm thức được xử lý bằng phần mềm Excel 2007. 11 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mật số vi khuẩn trong mùa khô và mùa mƣa Các kết quả ghi nhận được cho thấy trong mùa khô cũng như mùa mưa, trung bình mật số vi khuẩn kết tụ protein và vi khuẩn kết tụ polysaccharide đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Như thế cả 2 nhóm vi khuẩn đều phát triển tương đương nhau trong cùng điều kiện môi trường theo mùa trong năm (Hình 3.1). Ghi chú: TB: trung bình; VK: vi khuẩn; P: kết tụ protein; S: kết tụ polysaccharide Những số theo sau cùng một chữ khác biệt không ý nghĩa với độ tin cậy 95% Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện các trung bình mật số vi khuẩn theo mùa 3.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn tạo kết tụ sinh học 3.2.1. Số liệu tổng quát kết quả phân lập Từ 155 mẫu thu thập trong các ao nuôi cá tra ở 10 tỉnh ĐBSCL đã phân lập được 389 chủng vi khuẩn tạo chất kết tụ. Có 304/389 chủng có tỉ lệ kết tụ > 50% (117 chủng kết tụ protein và 187 chủng kết tụ polysaccharide). Bảng 3.1. Số liệu kết quả phân lập vi khuẩn Ghi chú: TS: tổng số; P: vi khuẩn kết tụ protein; S: vi khuẩn kết tụ polysaccharide 12 3.2.2. Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Phần lớn tế bào có dạng que ngắn, rời rạc; một số là que dài, hình cầu. Các tế bào cũng có thể kết thành nhóm 2 hay nhiều tế bào hoặc kết thành chuỗi dài. Hầu hết đều chuyển động trong môi trường nước. Khuẩn lạc có thể trắng trong, đục, kem ngà hoặc xám, vàng, cam Đa số khuẩn lạc có dạng tròn, bìa nguyên, mô cao, đường kính 1,0-1,5 mm. Các khuẩn lạc có thể nhầy ướt ít, trung bình hoặc rất nhầy. Nhìn chung, các đặc điểm này đều tương tự với những nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tụ ở các tác giả trước (Gong và ctv., 2008; Zaki và ctv, 2011; Arafa và ctv., 2014) và tất cả đều có chung đặc điểm cơ bản nổi bật là khuẩn lạc đều nhầy ướt, láng. 3.3. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao Trên mỗi loại môi trường, có 10 chủng vi khuẩn được tuyển chọn để định danh và khảo sát đa dạng di truyền (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn Môi trường Protein Môi trường Polysaccharide TT Vi khuẩn Tỉ lệ kết tụ % TT Vi khuẩn Tỉ lệ kết tụ % 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 AG08P BT24P CT04P DT07P HG06P KG15P ST05P TG03P TV05P VL02P 72,00±1,64 67,50±0,50 65,00±0,66 74,25±0,43 73,00±0,66 55,75±1,56 64,00±1,32 67,50±0,43 62,50±1,56 65,50±0,90 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 AG19S BT36S CT27S DT45S HG09S KG50S ST37S TG09S TV35S VL22S 71,95±0,40 69,66±0,60 69,20±0,82 56,78±1,80 65,75±0,69 57,70±0,83 71,03±0,61 70,57±0,80 60,00±1,05 67,82±0,83 3.4. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ DNA của các vi khuẩn Phổ điện di cho thấy các vi khuẩn đều có band ở vị trí khoảng 1500 bp. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tụ ở các tác giả trước như Methylobacterium sp. Obi (Ntsaluba và ctv., 2011), Bacillus sp. Gilbert (Nontembiso và ctv., 2011), Bacillus velezensis 40B (Zaki và ctv., 2012), Bacillus thuringiensis (Arafa và ctv., 2014).... 3.4.2. Kết quả phân tích trình tự, xác định chủng tƣơng đồng di truyền, định danh các chủng vi khuẩn (VK) tuyển chọn Kết quả ở Bảng 3.3, 3.4 cho thấy chi Bacillus chiếm tỉ lệ cao (16/20 13 chủng) phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả (Shih và ctv., 2001; Deng và ctv., 2003; Haleem và ctv., 2008 ...). Bên cạnh đó, tương tự với các nghiên cứu trước, các Staphylococcus, Arthrobacter sp. và Agrobacterium tumefaciens lần lượt đều được ghi nhận có khả năng tạo kết tụ (Qiang và ctv., 2007; Su và ctv., 2011; Li và ctv., 2011). Bảng 3.3. Mười vi khuẩn kết tụ protein và các chủng tương đồng Bảng 3.4. Mười vi khuẩn kết tụ polysaccharide và các chủng tương đồng 14 Trên cơ sở này, bước đầu định danh 20 chủng vi khuẩn như sau: Vi khuẩn tạo kết tụ protein Vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide 1. Bacillus megaterium AG08P 2. Bacillus subtilis BT24P 3. Bacillus amyloliquefaciens CT04P 4. Bacillus megateirum DT07P 5. Bacillus sp. HG06P 6. Bacillus subtilis KG15P 7. Staphylococcus xylosus ST05P 8. Bacillus amyloliquefaciens TG03P 9. Staphylococcus xylosus TV05P 10. Bacillus methylotrophicus VL02P 1. Bacillus megaterium AG19S 2. Bacillus megaterium BT36S 3. Bacillus sp. CT27S 4. Arthrobacter sp. DT45S 5. Bacillus megaterium HG09S 6. Bacillus megaterium KG50S 7. Agrobacterium tumefaciens ST37S 8. Bacillus subtilis TG09S 9. Bacillus megaterium TV35S 10. Bacillus megaterium VL22S 3.5. Đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn. 3.5.1. Tính đa hình của các nucleotide 3.5.1.1. Các chủng vi khuẩn (VK) tạo kết tụ protein * Với Pi và Theta là 2 trong các chỉ số giúp ước tính đa hình nucleotide, đường biểu diễn Pi và Theta trên 10 chuỗi trình tự cho thấy vùng biến động nucleotide cao nằm trong khoảng các vị trí base 124-693 (Hình 3.2). Hình 3.2. Đường biểu diễn Pi và Theta (trên 10 chuỗi trình tự của vi khuẩn tạo kết tụ protein) π = 0,09484. Đây là giá trị số thể hiện đa dạng nucleotide khá cao vì thông thường thì π < 0,02 ở phần lớn các acid nhân (Nei, 1987). θ = 66,102±23,366. Chỉ số này cũng là khá cao, thể hiện rõ đa hình của các nucleotide. * Kết quả khảo sát 40 vị trí base bất kỳ có dấu SNP cho thấy vi khuẩn có nhiều dấu SNP nhất là Bacillus methylotrophicus VL02P (26/40); 2 Staphylococcus xylosus ST05P và TV05P có 14-15 dấu SNP; 2 chủng 15 Bacillus megaterium AG08P, DT07P và Bacillus sp. HG06P đều có số dấu SNP là 11. Cuối cùng, 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens TG03P, CT04P và 2 chủng Bacillus subtilis BT24P, KG15P đều cùng có 6 dấu SNP. * Giản đồ phả hệ dựa trên 10 chuỗi trình tự của vi khuẩn kết tụ protein, kết hợp với kết quả khảo sát các vị trí base trong vùng biến động nêu trên cho thấy tương quan giữa các vi khuẩn và với khoảng cách di truyền của chúng. Theo đó, chủng vi khuẩn có nhiều dấu SNP nhất, có sự khác biệt nhất và tách thành nhánh riêng; các chủng có ít dấu SNP có khoảng cách di truyền ngắn hơn và các chủng tương đồng xếp vào chung nhóm (Hình 3.3) Hình 3.3. Giản đồ phả hệ mô tả mối tương quan giữa các VK kết tụ protein 3.5.1.2. Các chủng vi khuẩn (VK) tạo kết tụ polysaccharide * Hai đường biểu diễn Pi và Theta căn cứ trên chuỗi trình tự của các vi khuẩn kết tụ polysaccharide cũng có dạng tương tự nhau; vùng biến động cao nằm trong khoảng các vị trí base 233-903 (Hình 3.4). Hình 3.4. Đường biểu diễn Pi và Theta (trên 10 chuỗi trình tự của vi khuẩn tạo kết tụ polysaccharide) π = 0,08914. Đây cũng là giá trị số thể hiện đa dạng nucleotide khá cao vì theo Nei (1987) thông thường thì π < 0,02 ở phần lớn các acid nhân. θ = 81,655±28,864. Chỉ số này cũng là khá cao, thể hiện rõ đa hình của các nucleotide. 16 * Kết quả khảo sát 40 vị trí base bất kỳ có dấu SNP cho thấy vi khuẩn có nhiều dấu SNP nhất là Arthrobacter sp. DT45S (21/40), kế tiếp là Agrobacterium tumefaciens ST37S với 16/40 dấu, rồi đến Bacillus subtilis TG09S có 13/40 dấu SNP. Các chủng còn lại như Bacillus sp. CT27S, các B. megaterium BT36S, HG09S, KG50S, TV35S chỉ có 6-1 dấu SNP. Riêng Bacillus megaterium VL22S và B. megaterium AG19S đều không có biến đổi trên chuỗi trình tự và tại 40 vị trí khảo sát các base đều giống nhau. * Giản đồ phả hệ dựa trên 10 chuỗi trình tự (Hình 3.5) của vi khuẩn kết tụ polysaccharide cũng cho thấy tương quan giữa các vi khuẩn và với khoảng cách di truyền của chúng. Theo đó, các chủng vi khuẩn có nhiều dấu SNP (nhóm 2, 3, 4) có sự khác biệt rõ rệt và tách thành nhánh riêng; các chủng có ít dấu SNP có khoảng cách di truyền ngắn hơn và các chủng tương đồng xếp vào chung nhóm và có vị trí gần nhau (nhóm 1). Hình 3.5. Giản đồ phả hệ mô tả mối tương quan giữa các VK kết tụ polysaccharide 3.5.2. Giản đồ phả hệ thể hiện tƣơng quan giữa vi khuẩn tạo kết tụ đƣợc tuyển chọn và các chủng vi khuẩn tƣơng đồng di truyền Giản đồ phả hệ ở Hình 3.6 cho thấy các vi khuẩn tạo kết tụ protein và các chủng tương đồng được xếp thành 5 nhóm. Các chỉ số bootstrap cao (99-100) ở các node của nhánh thể hiện mối liên hệ mật thiết giữa các chủng vi khuẩn trong nhóm cũng như mối tương quan gần gũi giữa các nhóm. Giản đồ cho thấy 2 chi Staphylococcus và Bacillus có mối quan hệ rất gần nhau: chúng đều là vi khuẩn gram dương thuộc Firmicutes. Đặc biệt Bacillus methylotrophicus VL02P được xếp thành 1 nhóm riêng, không chung nhóm với 2 chủng tương đồng (được xếp vào nhóm 4) mặc dù có tỉ lệ tương đồng 98%. Có thể đây là 1loài mới, tương tự cách nhận định trong nghiên cứu của Shcherbakova và ctv. (2011) trên chủng M2T của tác g