Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS để sản xuất chế phẩm PROBITICS

CHÖÔNG 2 - TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 2.1.. Probiotics 2.1.1. Lòch söû nghieân cöùu Probiotics Vaøo nhöõng naêm ñaàu cuûa theá kyû 19, nhöõng nghieân cöùu ñaàu tieân veà söï töông taùc cuûa vi sinh vaät vôùi cô theå vaät chuû ñaõ bò phuû nhaän. Ñeán ñaàu 1885, Escherich ñaõ mieâu taû veà söï hình thaønh heä vi sinh vaät trong ruoät cuûa treû em vaø neâu ra nhöõng lôïi ích cuûa chuùng trong tieâu hoaù. Doderlein khaúng ñònh raèng söï coù lôïi cuûa vi khuaån trong aâm ñaïo baèng caùch saûn xuaát ra acid lactic, noù coù theå ngaên chaën hoaëc öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån gaây beänh. Caùc vi khuaån saûn xuaát acid lactic trong quaù trình trao ñoåi chaát maø tieâu bieåu laø nhoùm vi khuaån leân men lactic ñaõ ñöôïc söû duïng keát hôïp vôùi caùc saûn phaåm leân men söõa. Cuoán saùch Prolongation of Life cuûa Metschnikoff ñaõ ñöa ra nhöõng lôïi ích cuûa vi khuaån lactic ñeán söùc khoeû cuûa con ngöôøi khi con ngöôøi söû duïng nhöõng saûn phaåm söõa keát hôïp vôùi caùc vi khuaån lactic. OÂng cho raèng ngöôøi Cap-ca coù theå soáng laâu laø do hoï ñaõ söû duïng moät löôïng lôùn caùc saûn phaåm söõa leân men [19]. Henry Tissier laø moät baùc só khoa nhi ôû Phaùp kieåm tra phaân cuûa nhöõng treû em bò tieâu chaûy vaø thaáy raèng chæ chöùa moät löôïng ít caùc vi khuaån “bifi”. Trong khi ñoù vi khuaån naøy laïi toàn taïi moät löôïng lôùn trong phaân cuûa caùc treû em coù söùc khoeû toát. OÂng cho raèng vi khuaån naøy coù theå giuùp beänh nhaân hoài phuïc laïi beänh.[45] Naêm 1900, Tissier cho raèng Bifidobacteria vaø moät soá nhoùm vi khuaån khaùc saûn sinh acid lactic nhöng chuû yeáu laø vi khuaån lactic coù taùc duïng toát ñoái vôùi söùc khoeû [19]. Naêm 1917, tröôùc khi Alexander Fleming khaùm phaù ra ampicilin, giaùo sö Alfred Nissle ngöôøi Ñöùc ñaõ phaân laäp ra moät chuûng thuoäc loaøi E. coli khoâng gaây beänh töø phaân cuûa caùc chieán binh trong chieán tranh theá giôùi thöù nhaát vaø oâng ñaët teân chuûng naøy laø Nissle 1917. Caùc chieán binh naøy bò beänh vieâm ruoät keát vaø chuûng vi khuaån Nissle 1917 ñöôïc söû duïng nhö laø probiotics ñeå trò beänh cho caùc chieán só [46]. 2.1.2. Ñònh nghóa Probiotics Probiotics laø thuaät ngöõ coù nguoàn goác töø Hy Laïp bao goàm coù hai töø: “pro” coù yù nghóa laø vì, “biosis” coù nghóa laø söï soáng. Probiotics ñöôïc ñònh nghóa ñaàu tieân laø do Parker(1974): “ nhöõng sinh vaät vaø caùc chaát maø giuùp caân baèng heä sinh vaät ñöôøng ruoät”. Nhöng 1989, Fuller ñaõ ñònh nghóa laïi Probiotics:” nhöõng vi sinh vaät soáng boå sung vaøo thöùc aên maø chuùng coù taùc ñoäng toát ñeán söùc khoeû cuûa ñoäng vaät chuû baèng caùch taïo caân baèng heä sinh vaät ñöôøng ruoät” [17]. Bifidobacteria vaø lactobacilli laø chi ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát. Naám men (Saccharomyces cerevisiae), moät vaøi chuûng E. coli vaø Bacilllus spp cuõng ñöôïc söû duïng nhö moät probiotics [46]. Havenaar vaø Huis Int Veld, 1992 ñònh nghóa:” probiotics laø moät hoaëc söï keát hôïp cuûa caùc vi sinh vaät soáng, aûnh höôûng coù lôïi ñeán vaät chuû, hoaøn thieän heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät [26]. Theo vieän khoa hoïc quoác teá ( International Life Sciences Institute), nhoùm laøm vieäc taïi chaâu AÂu (1998) ñònh nghóa probiotics: “ laø vi sinh vaät soáng boå sung vaøo thöùc aên taùc ñoäng coù lôïi ñeán vaät chuû” [26]. Theo toå chöùc thöïc phaåm, noâng nghieäp vaø söùc khoûe theá giôùi “ probiotics laø nhöõng vi sinh vaät soáng, khi maø söû duïng moät löôïng ñaày ñuû nhö laø thöùc aên, seõ mang laïi söùc khoûe toát cho vaät chuû ”û [25]. Theo FAO:” Nhöõng vi sinh vaät khi söû duïng vôùi moät löôïng ñuû seõ taùc ñoäng coù lôïi ñeán vaät chuû”. Haàu heát probiotics laø vi khuaån, sinh vaät ñôn baøo [49]. 2.1.3. Cô cheá taùc ñoäng cuûa probiotics Söï töông taùc laãn nhau bình thöôøng cuûa heä vi sinh ñöôøng ruoät laø moät trong caùc yeáu toá quan troïng ñaûm baûo söùc khoûe cuûa vaät chuû, söï töông taùc naøy bò giaùn ñoaïn coù theå daãn ñeán moät soá beänh lyù do maát caân baèng heä vi sinh ñöôøng ruoät laøm taêng nhanh soá löôïng vi khuaån gaây beänh. Probiotics ñöôïc chöùng minh laø coù khaû naêng choáng laïi moät soá taùc nhaân gaây beänh nhö Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, vaø rotavirus. Cô cheá taùc ñoäng cuûa probiotics nhö sau: 2.1.3.1. Sinh toång hôïp ra caùc chaát khaùng khuaån: bao goàm bacteriocins, acid höõu cô, vaø hydrogen peroxide . Bacteriocins laø moät chaát khaùng khuaån, ñöôïc chia laøm 4 lôùp: Lôùp thöù nhaát laø nhöõng phaân töû peptid nhoû (< 5 kDa) Lôùp thöù hai laø nhöõng phaân töû peptid nhoû (< 10 kDa), thöôøng laø nhöõng phaân töû peptid hoaït ñoäng ôû maøng teá baøo. Lôùp thöù 3 laø nhöõng phaân töû protein lôùn (>30 kDa), beàn veà nhieät, goàm caùc enzyme ngoaïi baøo Lôùp thöù tö laø nhöõng bacteriocins phöùc taïp, ngoaøi protein coøn coù caùc thaønh phaàn khaùc nhö lipid vaø cacbohyrate [35]. Bacteriocins ñöôïc saûn xuaát bôûi vi khuaån lactic, khi tieán haønh phaân tích gen cuaû caùc vi khuaån lactobacilus goàm L. plantarum, L. acidophilus NCFM, L. johnsonii NCC 533, vaø L. sakei ñeàu thaáy chuùng laø caùc loaøi coù khaû naêng sinh bacteriocins vaø chuùng thöôøng ñoäc ñoái vi khuaån gram döông nhö Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria, vaø Mycobacteria. Cô cheá hoaït ñoäng cô baûn cuûa bacteriocins chuû yeáu taïo neân nhöõng loã treân maøng teá baøo chaát vaø sau ñoù enzyme ñöôïc tieát ra gaây trôû ngaïi cho quaù trình trao ñoài chaát cuûa vi khuaån gaây beänh. Moät vaøi vi khuaån thuoäc chi Bifidobacteria cuõng coù khaû naêng saûn xuaát ra bacteriocins gaây ñoäc cho caû vi khuaån gram aâm vaø gram döông. Ñaëc bieät probiotics coøn kích thích caùc teá baøo bieåu moâ ruoät saûn xuaát ra caùc chaát khaùng khuaån [25]. Acid höõu cô cuõng coù taùc duïng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån gaây beänh, ñöôïc saûn xuaát bôûi vi khuaån lactic nhö acetic, lactic, acid propionic laøm pH moâi tröôøng haï thaáp xuoáng aûnh höôûng ñeán pH noäi baøo cuûa vi khuaån gaây beänh. Moät vaøi vi khuaån chi Lactobacillus ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa Salmonella enterica baèng caùch saûn xuaát ra acid lactic [25]. Hydrogen Peroxide cuõng laø chaát khaùng khuaån, moät vaøi vi khuaån Lactobacillus trong cô quan aâm ñaïo phuï nöõ ñöôïc tìm thaáy chuùng coù khaû naêng saûn sinh ra hydrogen peroxide ngaên caûn söï phaùt trieån vi khuaån gaây beänh gonococci trong cô quan sinh duïc nöõ. Ngoaøi ra vi khuaån Lactobacillus coøn ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa Gardnerella vaginalis khi coù söï keát hôïp cuûa hydrogen peroxide, lactic acid, vaø bacteriocins [25]. 2.1.3.2. Caïnh tranh vò trí gaén keát Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật cư trú trên ruột, và cũng chính là giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm. Probiotics trong heä tieâu hoùa coù chöùc naêng ngaên chaën khaû naêng baùm dính cuûa taùc nhaân gaây beänh vaø giaûm löôïng chaát ñoäc cuûa chuùng treân bieåu moâ ruoät. Moät vaøi vi khuaån Lactobacilli vaø Bifidobacteria coù khaû naêng caïnh tranh vò trí vôùi vi khuaån gaây beänh bao goàm S. enterica, Yersinia enterocolitica vaø baùm dính treân teá baøo bieåu moâ ruoät. Moät vaøi tröôøng hôïp, vi khuaån probiotics coù theå chieám caû vò trí gaén keát cuûa vi khuaån gaây beänh ngay caû khi nhöõng vi khuaån gaây beänh naøy ñaõ baùm chaët treân teá baøo bieåu moâ neáu ñöôïc xöû lyù vôùi probiotics [25]. Lactobacillus GG vaø Lactobacillus plantarum 299V caïnh tranh vò trí baùm vôùi Escherichia coli 0157H7 vaø HT-29, Lactobacilli fermentum RC-14 caïnh tranh vò trí baùm dính vôùi Staphylococcus aureus do ñoù laøm giaûm söï baùm dính cuûa caùc taùc nhaân gaây beänh [25]. Ngoaøi ra probiotics coøn coù caùc cô cheá khaùc taùc ñoäng leân caùc vi khuaån gaây beänh. Vi khuaån probiotics nhö Treptococcus thermophilus vaø Lactobacillus acidophilus enha hoaït hoùa taïo ra protein bòt kín vuøng bò toån thöông cuûa ruoät. Thöù hai, caùc vi khuaån probiotics khaùc nhö Lactobacillus rhamnosus GG coù khaû naêng ngaên ngöøa beänh vieâm ruoät vaø caùc teá baøo cheát baùm treân bieåu moâ ruoät. Cuoái cuøng laø chöùc naêng ngaên chaën, lactobacillus ñöôïc chöùng minh raèng laø chuûng coù khaû naêng laøm giaûm ñoä thaåm thaáu vaøo maøng nhaày, haïn cheá ñöôïc söï xaâm nhaäp cuûa vi sinh vaät coù kích thöôùc nhoû ôû chuoät [26]. Sinh toång hôïp chaát nhaøy laø moät trong nhöõng cô cheá choáng laïi caùc taùc nhaân gaây beänh, chaát nhaày seõ coâ laäp, baát hoaït vi sinh vaät gaây beänh. MUC2 vaø MUC3 laø hai mRNA laøm taêng kích thích saûn sinh ra chaát nhaày, baûo veä teá baøo bieåu moâ choáng laïi söï baùm dính cuûa vi khuaån gaây beänh. Lactobacillus plantarum 299v ñöôïc chöùng minh raèng coù khaû naêng laøm giaûm taùc ñoäng cuûa E. coli treân teá baøo bieåu moâ ruoät. 2.1.3.3. Caïnh tranh nguoàn dinh döôõng Probiotics coøn coù khaû naêng caïnh tranh caùc chaát dinh döôõng vôùi caùc vi sinh vaät gaây beänh. Baát kyø vi sinh vaät naøo cuõng caàn coù nguoàn dinh döõông ñeå phaùt trieån, chaúng haïn söï phaùt trieån vi khuaån probiotics söû duïng ñöôøng ñôn (glucose, fructose) laøm giaûm söï phaùt trieån cuûa Clostridium difficile (söû duïng ñöôøng ñôn ) [26]. Saét laø yeáu toá quan troïng ñoái vôùi taát caû caùc teá baøo soáng ngoaïi tröø Lactobacillus plantarum vaø Borrelia burgdorferi, noù caàn thieát trong caùc quaù trình sinh hoùa trong teá baøo vaø coù theå gaây ñoäc ôû ngöôõng cao. Söï haáp thu vaø löu tröõ saét ñöôïc ñieàu chænh bôûi teá baøo [19]. Siderophore laù chaát coù khoái löôïng phaân töû thaáp, coù khaû naêng gaén keát caùc ion saét. Siderophore coù theà hoøa tan saét tuûa thaønh daïng deã söû duïng cho vi sinh vaät. Do ñoù taän öùng yeáu toá naøy, coù theå choïn caùc vi sinh vaät voâ haïi coù khaû naêng saûn xuaát siderophore laøm vi khuaån probiotic, noù seõ caïnh tranh ion saét vôùi vi khuaån gaây beänh [9]. Bifidobacteria coù khaû naêng saûn sinh siderophore vaø caïnh tranh ion saét trong ruoät giaø nhö E. coli [19]. Ngoaøi ra probiotics coøn taùc ñoäng ñeán heä thoáng quorum sensing ôû vi khuaån gaây ñoäc, quorum sensing coù lieân quan ñeán quaù trình ñieàu hoøa caùc nhaân toá gaây ñoäc cuûa vi khuaån ñaëc bieät laø Virio. Vi khuaån probiotics seõ phaù vôõ heä thoáng naøy, ñaây cuõng laø moät bieän phaùp môùi ñeå choáng laïi caùc vi khuaån gaây beänh trong thuûy saûn. 2.1.3.4. Kích thích mieãn dòch Maëc duø cô cheá vaãn chöa ñöôïc saùng toû, vieäc söû duïng probiotics coù taùc duïng laøm taêng daùp öùng mieãn dòch, nhaát laø mieãn dòch töï nhieân. Spanhaak et al thí nghieäm söû duïng Lactobacillus casei Shirota ôû 20 ngöôøi ñaøn oâng. Nhöõng ngöøôi ñaøn oâng naøy ñöôïc aên theo cheá ñoä trong 8 tuaàn, 10 ngöôøi ñaøn oâng ñöôïc uoáng söõa leân men boå sung 1x1012 cfu/ml Lactobacillus casei Shirota, 10 ngöôøi coøn laïi uoáng söõa leân men. Keát quaû laøm taêng ñaùp öùng mieãn dòch ôû 10 ngöôøi söû duïng söõa chua coù boå sung Lactobacillus casei Shirota [27]. Nhieàu chuûng Lactobacillus coù khaû naêng hoaït hoùa ñaïi thöïc baøo, kích thích hình thaønh baïch caàu trung tính, kích thích teá beøo tua (dendrit) laøm taêng khaû naêng toång hôïp IgA vaø interferon gamma. 2.1.4. Vi sinh vaät probiotics: 2.1.4.1.Vi khuaån lactic: Lactobacillus : Haàu heát caùc vi sinh vaät probiotics ñeàu laø caùc vi khuaån saûn sinh ra acid lactic. Töø xöa con ngöôøi ñaõ bieát caùch söû duïng caùc vi khuaån coù lôïi boå sung vaøo caùc saûn phaåm leân men, chuû yeáu thuoäc loaøi L. casein vaø moät vaøi chuûng L. acidophilus. Caùch ñaây khoaûng 40 naêm vaø 30 naêm ôû Ñöùc vi khuaån lactic ñaõ ñöôïc öùng duïng boå sung vaøo trong caùc saûn phaåm söõa leân men. Hai loaøi “Lactobacillus acidophilus” vaø “Bifidobacterium bifidum” ñöôïc giôùi thieäu raát phoå bieán ôû Ñöùc vaøo cuoái 1960 trong caùc saûn phaåm bô söõa bôûi vì noù coù theå giuùp oån ñònh vi khuaån ñöôøng ruoät vaø taïo moät caûm giaùc chua nheï gaây caûm höùng cho ngöôøi tieâu duøng trong caùc saûn phaåm söõa chua. ÔÛ Ñöùc saûn phaåm coù teân thöông maïi laø “mild yogurts” hoaëc “bio-yogurts“. ÔÛ Myõ söõa acidophilus laïi ñöôïc phaùt trieån vaø ñieàu quan troïng ñoái vôùi caùc loaøi naøy laø phaûi ñöôïc chöùng minh laø an toaøn vôùi ngöôøi söû duïng. L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L. acidophilus, vaø L. johnsonii ñaây laø nhöõng loaøi ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát vaø ñaõ ñöôïc chöùng minh laø an toaøn cho ngöôøi söû duïng [19]. Lactobacillus coù khoaûng 60 loaøi bao goàm L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, vaø L. rhamnosus…. Caùch ñaây hôn 100 naêm con ngöôøi ñaõ söû duïng caùc vi khuaån Lactobacillus boå sung vaøo thöïc phaåm nhaèm taêng thôøi gian baûo quaûn, taêng vò ngon, taïo ra caùc caáu truùc khaùc nhau trong thöïc phaåm. Höông vò cuûa saûn phaåm laø do caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa Lactobacillus. Chaúng haïn acetaldehyde coù trong yogurt, diacety coù trong coù trong caùc saûn phaåm söõa leân men [19]. Khaû naêng öùc cheá caùc vi khuaån gaây beänh cuûa lactobacillus ñaõ ñöôïc nghieân cöùu trong ñieàu kieän in vitro, ñaëc bieät khaû naêng baùm dính vaø caïnh tranh vò trí baùm dính cuûa lactobacillus vôùi caùc vi khuaån gaây beänh. Coconnier et al, chöùng minh ñöôïc L. acidophilus ngaên caûn söï baùm dính cuûa E. coli O157:H7, Salmonella enterica, Yersinia pseudotuberculosis vaø Listeria monocytogenes treân teá baøo Caco-2 cells. Töông töï nhö vaäy, Forestier et al. cuõng chöùng minh ñöôïc khaû naêng ngaên caûn baùm dính cuûa L. casei vaø L. rhamnosus Lcr35 ñoái vôùi E. coli vaø Klebsiella pneumoniae treân teá baøo Caco-2 cells. Ngoaøi côù cheá caûn trôû söï baùm dính cuûa vi khuaån gaây beänh thì Lactobacillus coøn öùc cheâ vi khuaån gaây beänh baèng sinh acid laøm pH moâi tröôøng giaûm xuoáng vaø bacteriocins. Theo nghieân cöùu cuûa Vescovo et al, oâng tieán haønh thöû nghieäm khaû naêng khaùng khuaån cuûa naêm chuûng L. casei treân Aeromonas hydrophila, L. monoytogenes, S. typhimurium,vaø S. aureus trong ñieàu kieän invitro. Tuy nhieân ôû nghieân cöùu naøy, L. casei IMPCLC34 laø chuûng coù taùc ñoäng maïnh nhaát ñoái vôùi Aeromonas hydrophila, S. typhimurium, vaø S. aureus, tuy nhieân noù khoâng coù taùc ñoäng khaùng ñoái vôùi L. monocytogenes. Nhöng ngöôïc laïi Lactobacillus spp phaân laäp töø gaø laïi coù khaû naêng khaùng laïi Campylobacter spp trong ñieàu kieän invitro [19]. Döïa vaøo khaû naêng sinh bacteriocins cuûa Lactobacillus, maø Lactobacillus ñöôïc söû duïng raát nhieàu trong caùc saûn phaåm rau quaû, thòt, vaø caù leân men. Khaû naêng sinh bacteriocins cuûa lactobacillus ñöôïc khaùm phaù vaøo 1975, vaø nhieàu loaïi bacteriocins khaùc ñaõ ñöôïc bieát ñeán. Hieän nay lactobacillus ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong caùc saûn phaåm caù, bô söõa, vaø thòt trong vaán ñeà baûo quaûn vaø naâng cao chaát löôïng saûn phaåm. Haàu heát caùc chuûng sinh bacteriocins ñeàu ñaõ ñöôïc bieát, nhö Lactocin 705 bôûi L. casei CRL705 khaùng S. aureus, L. monocytogenes, S. pyogenes, Acidocin CH5 bôûi L. acidophilus CH5 khaùng vi khuaån gram aâm, acidophilin 801 bôûi L. acidophilus IBB 801 khaùng moät soá vi khuaån gram aâm vaø gram döông… [19]. Bifidobacteria: Vi khuaån Bifidobacteria ñöôïc phaùt hieän ñaàu tieân bôûi Henry Tissier (1899, 1900) khi oâng nghieân cöùu vi sinh vaät trong phaân cuûa nhöõng ñöùa treû. Luùc ban ñaàu Tissier xeáp noù vaøo chi Bacillus, nhöng ñeán naêm 1924 xeáp noù vaøo chi Bifidobacteria sau khi quan saùt thaáy nhöõng ñaëc ñieåm khaùc nhau veà maët hình thaùi hoïc vaø caáu taïo vaùch teá baøo so vôùi chi bacillus. Chuùng hình roi, khoâng di chuyeån, khoâng sinh baøo töû, kò khí baét buoät. Trong cô theå ngöôøi coù khoaûng 500 vi khuaån, trong ñoù Bifidobacteria laø moät trong nhöõng vi khuaån chieám soá löôïng ñaùng keå trong ruoät. Möôøi loaøi khaùc nhau cuûa Bifidobacteria ñaõ ñöôïc phaân laëp töø cô theå ngöôøi. Trong soá caùc loaøi ñoù laø B. longum, B. bifidum, vaø B. infantis ñaõ ñöôïc bieát ñeán. Bifidobacteria cuõng nhö lactobacillus coù khaû naêng khaùng laïi caùc vi khuaån gaây beänh baèng acid lactic vaø acetic vaø caùc chaát khaùng khuaån nhö bacteriocins. Moät soá vi khuaån Bifidobacteria ñöôïc söû duïng nhö thuoác khaùng khuaån trong ñieàu kieän in vitro vaø in vivo vôùi Salmonella, Shigella, Clostridium, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Candida albicans, vaø Campylobacter jejuni. Moät nghieân cöùu thöïc tieãn cho thaáy B. bifidum coù khaû naêng khaùng Shigella dysenteriae trong ñieàu kieän in vitro [19]. Nhieàu nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu veà khaû naêng khaùng caùc vi khuaån gaây beänh vaø vi khuaån gaây hoûng thöùc aên. Trong ñoù, Gagnon et al thöû khaû naêng khaùng cuûa naêm loaøi thuoäc chi bifidobacterial ñoái vôùi E. coli O157:H7 trong invitro, vaø keát quaû hai trong naêm loøai theå hieän khaû naêng khaùng E. coli O157:H7. O’Riordan vaø Fitzgerald saøng loïc ñöôïc 22 vi khuaån Bifidobacterium vaø trong ñoù coù 12 loaøi coù khaû naêng khaùng vi khuaån gram aâm vaø gram döông, bao goàm Pseuedomonas spp., Salmonella spp, E. coli,…. Trong nghieân cöùu cuûa Gibson and Wang veà khaû naêng khaùng cuûa 8 vi khuaån bifidobacteria trong ñieàu kieän invitro vôùi Listeria monocytogene, Clostridium perfringens, Salmonella spp, vibrio cholerae, vaø E. coli, haàu heát E. coli vaø C. perfringens bò tieâu dieät bôûi B. infantis va øB. Longum. bifidobacterial coøn ñöôïc öùng duïng boå sung vaøo thöùc aên cho nhöõng ñöùa beù gôùp phaàn laøm giaûm tyû leä maéc beänh tieâu chaûy vaø tieâu chaûy caáp do rotavirus do vôùi nhöõng ñöùa treû bình thöôøng [19]. Khoâng gioáng vôùi Lactobacillus, bifidobacteria raát haïn cheá veà caùc taøi lieäu veà bacteriocins. Bifidin laø moät bacteriocins ñöôïc sinh ra töø B. bifidum NCDC 1452 coù khaû naêng khaùng raát nhieàu vi khuaån : E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus, vaø Pseudomonas fluorescens [19]. 2.1.4.2.Naám men: Lactobacillus, Bifidobacterium ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trong caùc saûn phaåm probiotics, tuy nhieân naám men cuõng ñöôïc söû duïng nhö moät probiotics. Theo nghieân cöùu cuûa H. Kumura, Y. Tanoue, M. Tsukahara, T. Tanaka, vaø K. Shimazaki kieåm tra hoaït tính probiotic cuûa taùm loaøi naám :Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces lodderae, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, vaø Yarrowia lipolytic ñöôïc phaân laäp töø kefir [21]. Saccharomyces boulardii taùc duïng trò tieâu chaûy ôû treû nhoû. Theo baùc só Karpa S. boulardii coù khaû naêng sinh enzyme khöû ñoäc toá cuûa C. difficile. Saccharomyces boulardii, khaùc vôùi lactobacilli hoaëc bifidobacteria noù khoâng taïo heä vi sinh trong ruoät ngöôøi maø noù chæ toàn taïi moät hoaëc hai tuaàn trong ruoät. Chuùng ngaên chaën caùc taùc nhaân gaây beänh vaø sau ñoù ra khoûi ruoät, ñoàng thôøi giuùp lactobacilli vaø bifibacteria phaùt trieån nhanh [55]. Theo keát quaû nghieân cöùu cuûa McFarland vaø Bernasconi Saccharomyces boulardii phaùt trieån toát nhaát ôû 370C vaø coù theå soáng soùt khi traõi qua heä tieâu hoùa cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. S. boulardii coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa naám Candida albicans [19]. Hieän nay caùc saûn phaåm probiotics treân thò tröôøng chuû yeáu söû duïng Lactobacillus vaø bifidobacteria. Probiotics coù theå chæ laø cheá phaåm chi toàn taïi moät loøai hoaëc coù söï keât hôïp vôùi caùc loaøi khaùc nhö Bacillus cereus, B. clausii, B. pumilis, Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. acidopropionici, P. thoenii, vaø Saccharomyces boulardii. Ngoaøi ra naám men cuõng ñöôïc söû duïng nhö moät probiotics boå sung vaøo thöùc aên cho vaät nuoâi. Coù khoaûng 65% caùc saûn phaåm söõa probiotics ñöôïc baùn treân thò tröôøng chaâu AÂu, trong khi ñoù ôû Nhaät thì coù khoaûng 70% trong caùc loaïi thöïc phaåm baùn treân thò tröôøng. ÔÛ Myõ, Canada, Chaâu AÂu ngöôøi ta söû duïng keát hôïp nhieàu chi khaùc nhau ñeå trò caùc beänh treân lôïn vaø gia caàm: Bifidobacterium. Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus, Bacteroides, Pediococcus, Leuconostoc vaø Propionibacterium (Lloyd-Evans, 1989; Tobey, 1992). Nhöng ôû Nhaät vaø moät soá nöôùc phía Ñoâng söû duïng theâm chuûng Clostridium vôùi teân thöông maïi laø Broilact vaø Aviguard söû duïng ñeå phoøng beänh nhieãm Salmonella ôû gia caàm. 2.1.5. Caùc tieâu chuaån choïn vi khuaån probiotics: Caùc vi sinh vaät duøng laøm probiotics phaûi ñaûm baûo caùc ñaëc ñieåm sau: Khoâng gaây beänh, khi söû duïng noù seõ coù taùc ñoäng toát ñoái vôùi vaät chuû Coù khaû naêng toàn taïi khi ñi xuyeân qua daï daøy ( dòch tieâu hoaù, dòch acid, dòch maät) Coù khaû naêng baùm ñính toát treân nieâm maïc ruoät cuûa ñöôøng tieâu hoaù vaät chuû Saûn xuaát caùc khaùng sinh choáng laïi caùc maàm beänh: acid, bacteriocin, H2O2…. Duy trì toát khaû naêng soáng trong quaù trình saûn xuaát, baûo quaûn vaø söû duïng Coù khaû naêng baùm dính vaøo nieâm maïc ñöôøng tieâu hoaù vaät chuû Deã nuoâi caáy Kích thích hoaït ñoäng cuûa gen khaùng vaø sinh ra chaát choáng ung thö. Taêng cöôøng khaû naêng haáp thuï lactose Giaûm huyeát aùp cuûa nhöõng ngöôøi bò chöùng cao huyeát aùp. Ngaên ngöøa vaø giaûm möùc ñoä gaây beänh tieâu chaûy Oån ñònh caáu truùc gen trong quaù trình taïo cheá phaåm 2.1.6. ÖÙng duïng cuûa probiotics 2.1.6.1. Trong thöïc phaåm vaø döôïc phaåm Trong cô theå ngöôøi toàn taïi khoaûng 1014 teá baøo vi sinh vaät vôùi söï ña daïng cuûa caùc loaøi, coù khoaûng 400 loaøi. Caùc vi sinh vaät toàn taïi trong ñöôøng ruoät taùc ñoäng qua laïi giuùp caân baèng heä vi sinh ñöôøng ruoät. Söï toàn taïi cuûa caùc vi sinh vaät trong heä tieâu hoaù coøn phuï thuoäc vaøo cheá ñoä dinh döôõng trong cô theå. Trong cô theå luoân toàn taïi caùc vi khuaån cô hoäi, khi gaëp ñieåu kieän thuaän lôïi noù seõ phaùt trieån ñuû soá löôïng vaø gaây ñoäc cho cô theå. Vi khuaån probiotics ñöôïc roäng raõi trong caùc saûn phaåm khaùc nhau treân khaép theá giôùi, chuùng ñöôïc boå sung vaøo thöïc phaåm, taïo ra caùc cheá phaåm thuoác vaø boå sung vaøo thöùc aên cho vaät nuoâi. Thöïc phaåm probiotics laø thöïc phaåm chöùa caùc vi khuaån soáng coù lôïi vaø khoâng aûnh höôûng ñeán söùc khoûe cuûa con ngöôøi. Chaúng haïn, trong caùc saûn phaåm söõa leân men boå sung Lactobacillus acidophilus coù theå giuùp cho nhöõng ngöôøi khoâng coù khaû naêng haáp thu söõa coù theå haáp thuï toát hôn. Moät soá thöïc phaåm probiotics nhö laø phomat, söõa chua, kifer, döa caûi, giaám… [50] Thöïc phaåm probiotics hieän nay ñöôïc baùn raát phoå bieån ôû Myõ phaàn lôùn laø yogurt. Yogurt ñöôïc laøm töø söõa keát hôïp vôùi caùc loaøi Streptococcus thermophilus vaø Lactobacillus acidophilus hoaëc Lactobacillus bulgaricus. Söõa coù nguoàn goác töø boø, deâ, cöøu…. Kefir cuõng laø moät saûn phaåm leân men, coù theå ñöôïc laøm töø nhieàu nguoàn goác khaùc nhau: söõa boø, söõa cöøu, söõa deâ. Ngoaøi ra coù theå laøm töø söõa ñaäu naønh, söõa gaïo vaø nöôùc döøa. Khi choïn ñöôïc vi khuaån probiotics thích hôïp seõ caáy vaøo söõa, nhöõng loaøi coù theå duøng laø Lactobacillus kefiri, moät soá chi Leuconostoc, Lactococcus Thöùc uoáng probiotics ñöôïc giôùi thieäu ñaàu tieân vaøo 2007 bôûi New Food, ñöôïc khaùm phaù bôûi Steve Demos, ñaây laø loaïi ñoà uoáng chöùa Lactobacillus plantarum 299v. Ngoaøi ra coøn nhieàu saûn phaåm leân men khaùc mang tính chaát truyeàn thoáng: moùn döa caûi baép ôû Ñöùc, kim chi ôû Haøn quoác, choucroute ôû phaùp[51] Probiotics ñöôïc söû duïng nhö moät loaïi thuoác chöõa beänh, hieän nay treân thò tröôøng ngoaøi caùc saûn phaåm ña daïng veà probiotics ôû daïng thöïc phaåm, coøn coù caùc daïng vieân neùn, daïng dòch, daïng boät duøng ñieàu trò moät soá beänh ñöôøng tieâu hoùa: Tieâu chaûy do khaùng sinh: khoaûng 20% ngöôøi duøng thuoác khaùng sinh, ñaëc bieät laø Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bò maéc beänh tieâu chaûy. Nguyeân nhaân laø do khaùng sinh seõ gieát caùc vi sinh vaät ñöôøng ruoät laøm maát caân baèng heä vi sinh ñöôøng ruoät. Clotridium difficle vaø Kelbsiela oxytoca laø hai taùc nhaân gaây beänh chính, khi heä vi sinh ñöôøng ruoät oån ñònh chuùng vaãn toàn taïi vôùi soá löôïng ít trong ruoät, khi maát caân baèng thì chuùng taêng leân nhanh vaø giaûi phoùng ñoäc toá laø A vaø B gaây beänh tieâu chaûy vaø vieâm ruoät. Coù nhieàu nghieân cöùu söû duïng probiotics ñeå chöõa beänh tieâu chaûy do khaùng sinh vaø keát quaû cho thaáy S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 coù taùc duïng toát. Chuùng laøm giaûm ñaùng keå thôøi gian phuïc hoài khi maéc beänh [39]. Moät nghieân cöùu söû duïng L. acidophilus ñeå trò beänh tieâu chaûy do söû duïng thuoác khaùng sinh erythromycin, nghieân cöùu naøy tieán haønh treân 16 ngöôøi, moät nöõa cho söû duïng 125ml söõa chua chöùa L. acidophilus moãi ngaøy, nöõa nhoùm coøn laïi cho söû duïng söõa chua khoâng coù L. acidophilus. Keát quaû nghieân cöùu, nhoùm söû duïng söõa chua coù chöùa L. acidophilus beänh hoài phuïc trong 2 ngaøy, nhoùm coøn laïi 8 ngaøy [27]. Tieâu chaûy caáp : Nguyeân nhaân do rotavirus, chuû yeáu ôû treû em ôû caùc nöôùc ñang phaùt trieån. Nhieàu nghieân cöùu ñaõ chöùng minh raèng Lactobacillus. rhamnosus GG, Bifidobacterium bifidum vaø Streptococcus thermophilus laøm giaûm löôïng rotavirus trong heä tieâu hoùa [39]. Moät nghieân cöùu ñieàu trò tieâu chaûy caáp tính treû em ôû chaâu AÙ, cho thaáy raèng khi söû duïng Lactobacillus rhamnosus GG coù theå ruùt ngaén moät nöõa thôøi gian chöõa trò. ÔÛ chaâu AÂu, keát quaû nghieân cöùu söû duïng L. rhamnosus ñaõ bò baát hoaït bôûi nhieät cuõng mang laïi keát quaû töông töï nhö L. rhamnosus soáng [9] . Bin vaø Boulloche ñaõ thöïc hieän nghieân cöùu söû duïng Lactocbacillus acidophilus ñeå ñieàu trò tieâu chaûy caáp ôû treû em. Bin tieán haønh nghieân cöùu 50 treû en bò tieâu chaûy caáp ôû Trung Quoác. OÂng laáy ngaãu nhieân 30 ngöôøi ñieàu trò baèng caùch söû duïng L. acidophilus, coøn 20 beù coøn laïi thì ñieàu trò baèng phöông phaùp bình thöôøng. Keát quaû cho thaáy khoâng coù söï khaùc bieät giöõa hai caùch chöõa trò, thôøi gian khoûi beänh cuûa hai phöông phaùp chöõa beänh laø nhö nhau. Nghieân cöùu cuûa Boulloche et al ôû 103 beù coøn buù söõa meï vaø treû em bò tieâu chaûy caáp söû duïng L. acidophilus ñaõ baát hoaït baèng caùch söû duïng nhieät. Keát quaû cuõng cho thaáy khoâng coù söï khaùc bieät giöõa hai nhoùm ñieàu trò. Thôøi gian phuïc hoài beänh nhö nhau [27]. Vieâm ñöôøng tieâu hoùa: do nhieàu taùc nhaân gaây beänh nhö vi khuaån, vi ruùt, kí sinh truøng nhöng nguyeân nhaân chuû yeáu laø do nhieãm rotavirus vaø Helicobacter pylori gaây vieâm loeùt vaø ung thö daï daøy. Chuùng xaâm nhaäp vaøo caùc teá baøo ôû ñænh nhung mao ruoät, phaù huûy nhung mao, laøm maát khaû naêng haáp thuï caùc chaát dinh döôõng. Do khaû naêng haáp thuï chaát dinh döôõng keùm, caùc chaát cacbohydroxit toàn ñoäng trong ruoät, daãn ñeán tieâu chaûy vaø maát nöùôc nghieâm troïng gaây nguy hieåm cho treû sô sinh vaø treû döôùi ba tuoåi vaø treû suy dinh döôõng [9]. Ngöøa ung thö: Moät soá thaønh vieân cuûa vi khuaån ñöôøng ruoät coù khaû naêng tieát ra caùc enzyme nhö glycosidase, azoreductase, nitroreductase vaø b- glucoronidase, chuùng seõ hoaït hoùa caùc chaát tieàn ung thö thaønh caùc chaát ung thö hoaït hoùa. Nhöõng nghieân cöùu treân ngöôøi söû duïng L. acidophilus hoaëc Lactobacillus casei laøm giaûm ñaùng keå hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme treân [36]. Giaûm cholesterol: Cholesterol laø moät chaát beùo steroid, coù ôû maøng teá baøo cuûa taát caû caùc moâ trong cô theå, vaø ñöôïc vaän chuyeån trong huyeát töông cuûa moïi ñoäng vaät. Khi löôïng cholesterol trong maùu cao seõ gaây ra moät soá beänh tim maïch nhö xô vöõa ñoäng maïch, huyeát aùp taêng, beänh lyù ôû heä thoáng maïch vaønh nhö nhoài maùu cô tim, ñoät quî. Trong cô theå, cholesterol coù 2 daïng maø y hoïc goïi laø LDL-C coù troïng löôïng phaân töû thaáp (hay coøn goïi laø cholesterol coù haïi) vaø HDL-C  coù troïng löôïng phaân töû cao(hay coøn goïi laø cholesterol coù lôïi). HDL vaän chuyeån  cholesterol ñeán caùc cô quan, vì vaäy neáu haøm löôïng cuûa HDL trong maùu caøng cao thì caøng giaûm nguy cô maéc beänh maïch vaønh. Ngöôïc laïi LDL-C vaän chuyeån cholesterol töø cô quan ñeán maïch maùu cho neân neáu noàng ñoä LDL-C trong maùu cao laø coù nguy cô maéc beänh cao. LDL-C luoân taïo ra caùc maûng xô vöõa treân thaønh caùc ñoäng maïch noùi chung vaø ñoäng maïch vaønh tim noùi rieâng. Caùc maûng xô vöõa naøy laøm cho loøng caùc ñoäng maïch vaønh bò chít heïp hoaëc coù theå bít taéc, töø ñoù gaây neân tình traïng thieáu maùu ñeán nuoâi döôõng teá baøo cô tim, gaây ra caùc côn ñau thaét ngöïc vaø nhoài maùu cô tim. Nghieân cöùu cuûa Gilliland SE, Nelson CR, Maxwell C trong ñieàu kieän in vitro vi khuaån coù theå laøm giaûm löôïng colesterol trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Moät nghieân cöùu cuûa Lin et al. veà khaû naêng laøm giaûm cholesterol trong maùu cuûa Lactobacillus bulgaricus vaø Lactobacillus acidophilus. OÂng tieán haønh treân 23 ngöôøi cho söû duïng thuoác daïng vieân neùn chöùa 3x107 CFU Lactobacillus bulgaricus vaø Lactobacillus acidophilus trong 16 tuaàn, vaø 15 ngöôøi khoâng söû duïng thuoác. Keát quaû ôû nhoùm cho söû duïng thuoác thì haøm löôïng cholesterol trong maùu giaûm xuoáng töø 5.7 xuoáng 5.4 sau 16 tuaàn [27]. Nghieân cöùu ôû AÁn Ñoä, söû duïng söõa traâu leân men baèng loaøi L. acidophilus laøm giaûm löôïng cholesterol trong maùu 12 - 20% sau moät thaùng söû duïng [27]. Hai nghieân cöùu khaùc söû duïng E. faecium vaø S. thermophilus, caùc nhaø nghieân cöùu tieán haønh thöû nghieäm treân 29 ngöôøi ñaøn oâng, cho söû duïng söõa leân men chöùa 108 - 1011 cfu/ml E. faecium vaø S. thermophilus vaø 28 ngöôøi ñaøn oâng söû duïng söõa bình thöôøng. Keát quaû cho thaáy haøm löôïng cholesterol trong maùu giaûm 0.37 - 0.41 mmol/L sau 6 tuaàn söû duïng, nhoùm söû duïng söõa bình thöôøng thì haøm löôïng cholesterol khoâng ñoåi. Sau ñoù taùc giaû tieán haønh nghieân cöùu laàn hai ôû phaäm vi roäng hôn, oâng tieán haønh töông töï ôû 87 ngöôøi ñaøn oâng vaø phuï nöõ keát quaû cho thaáy haøm löôïng cholesterol giaûm nhieàu sau 4 -12 tuaàn vaø thí nghieäm cuoái cuøng 24 tuaàn vaø 30 tuaàn thì thaáy khoâng coù söï thay ñoåi nhieàu. OÂng ñöa ra keát luaän E. faecium coù khaû naêng laøm giaûm Cholesterol trong maùu nhanh [27]. Taêng cöôøng khaû naêng tieâu hoùa lactose vaø hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme khaùc: Hieän töôïng khoâng coù khaû naêng tieâu hoùa lactose tìm thaáy khaép treân theá giôùi do cô theå khoâng coù enzyme lactase thuûy phaân lactose. Enzyme naøy ñöôïc giaûi phoùng khi vi khuaån bò dung giaûi do taùc duïng cuûa acid maät [9]. Trieäu chöùng cuûa beänh thöôøng gaây phìn buïng, ñaày hôi, tieâu chaûy. The._.o keát quaû nghieân cöùu cuûa Rasstal et al 2000 vi khuaån latobacii vaø bifidobacteria laøm taêng enzyme lactase trong ruoät non [17]. ÔÛ treû sô sinh thöôøng maéc chöùng keùm tieâu hoùa ñöôøng saccarose, khaéc phuïc baèng caùch cho uoáng saccharomycess cerevisiae, trong naám men coù chöùa enzyme saccarase. 2.1.6.2. Noâng nghieäp 2.1.6.2.1. Nuoâi troàng thuûy haûi saûn. UN FAO öôùc tính tôùi naêm 2020 moät nöõa löôïng thuûy saûn cung caáp cho toøan theá giôùi seõ ñöôïc cung caáp nhôø nuoâi troàng thuûy saûn do caùc nguoàn caù khai thaùc töï nhieän bò khai thaùc quaù möùc. ÔÛ Vieät Nam nuoâi troàng thuûy saûn cuõng ñang treân ñaø phaùt trieån, naêm 2002 chính phuû ñaõ quyeát ñònh thuûy saûn laø ngaønh kinh teá öu tieân, trong ñoù nuoâi toâm laø ngaønh muõi nhoïn nhaèm taêng kinh ngaïch xuaát khaåu, chuyeån ñoåi cô caáu kinh teá keùm hieäu quaû, giaûm aùp löïc khai thaùc ven bôø, naâng cao vieäc söû duïng ñaát vaø taïo vieäc laøm cho ngöôøi daân. Naêm 2002 Vieät Nam ñaõ xuaát khaåu treân 2 tæ USD thuûy saûn, trong ñoù toâm chieám 50% ñöùng haøng thöù 5 treân theá giôùi. Hieän nay phoå bieán nhaát laø nuoâi toâm suù vaø caù ba sa, tuy nhieân hieän nay ngaønh nuoâi troàng thuûy saûn ñang maéc phaûi khoù khaên chuû yeáu laø dòch beänh do vi khuaån, viruùt, naám, kyù sinh truøng gaây ra. Khi phaùt hieän beänh noâng daân thöôøng söû duïng khaùng sinh ñoå xuoáng hoà hoaëc boå sung theâm vaøo thöùc aên. Khaùng sinh coù theå ñieàu trò töùc thôøi ñoái vôùi caùc vi khuaån gaây beänh, tuy nhieân khi söû duïng nhieàu laàn vi khuaån seõ trôû neân khaùng thuoác ( khoù trò hôn), maëc khaùc khi söû duïng thöôøng xuyeân seõ ñeå laïi dö löôïng khaùng sinh trong toâm, caù nuoâi gaây aûnh höôûng ñeán con ngöôøi daãn ñeán nguy cô khoù duøng khaùng sinh trò beänh cho con ngöôi vaø khoâng theå nhaäp khaåu sang caùc nöôùc khaùc gaây thieät haïi lôùn. Nhieàu noâng daân söû duïng khaùng sinh nhö moät taùc nhaân phoøng beänh ngay khi vaät nuoâi chöa phaùt beänh. Viruùt laø moät trong nhöõng taùc nhaân gaây beänh nguy hieåm, laø moái ñe doïa haøng ñaàu ñoái vôùi ngaønh nuoâi troàng thuûy saûn. Hieän nay ngöôøi ta phaùt hieän khoaûng 20 virut gaây beänh treân toâm, haàu heát laø thaønh vieân hoï Pavoviridae, Baculoviridae, Piconaviridae, Togaviridae cuøng moät soá hoï khaùc. Beänh ñaàu vaøng ôû toâm ñöôïc phaùt hieän ñaàu tieân ôû Thaùi vaøo 1990 taïi moät hoà nuoâi toâm suù do Yellow Head Virus gaây ra. Beänh ñoám traéng do virut thuoäc chuûng Baculoviru ñöôïc phaùt hieän ñaàu tieân taïi Ñaøi Loan tyû leä cheát raát cao coù theå 100% sau 3 - 5 ngaøy nhieãm beänh [8]. Vi khuaån cuõng laø taùc nhaân gaây beänh nguy hieåm ñaëc bieät laø Virio laøm toâm cheát raát nhanh. Ngoaøi ra naám vaø kí sinh truøng cuõng laø taùc nhaân gaây beänh treân toâm. Toâm thöôøng nhieãm naám laø lagenidium calinectes vaø Sirolpidium spp ôû giai ñoïan aáu truøng neân tyû leä cheát raát cao. Kí sinh truøng laø ñoäng vaät nguyeân sinh coù theå laây nhieãm taát caû caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa toâm nhö Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, anophrys, Acineta ssp, Lagenophrys, Ephelota laø caùc taùc nhaân kí sinh beân ngoaøi [8]. Ngoaøi yeâu toá dòch beänh Ngoaøi yeáu toá dòch beänh oâ nhieãm moâi tröôøng nuoâi troàng cuõng laø vaán ñeà khoù khaên. Vôùi muïc ñích taêng saûn löôïng, ngöôøi daân nuoâi vôùi maät ñoä cao vaø khoâng coù bieän phaùp xöû lyù thích hôïp gaây hieän töôïng thieáu oxy trong ao daãn ñeán toâm bò ngaït. Thöùc aên dö thöøa daãn ñeán hieän töôïng phuù döôõng hoùa laøm taûo phaùt trieån, caùc chaát höõu cô trong ao trích luõy ngaøy moät taêng seõ laøm giaûm löôïng oxy hoøa tan. Lôùp buøn laéng ñoäng laâu ngaøy taïo ñieàu kieän cho caùc vi khuaån kò khí phaùt trieån sinh khí H2S vaø CH4. Amoni toàn taïi döôùi daïng NH3 hoaëc NH4+ tuøy thuoäc vaøo pH cuûa moâi tröôøng. NH3 ñoäc tính cao hôn NH4+ do NH3 khoâng mang ñieän tích deã thaám qua maøng teá baøo mang caù vaø hoøa tan toát trong chaát beùo, NH4+ coù kích thöôùc lôùn hôn, mang ñieän vaø keát hôïp vôùi nöôùc neân khoù thaám qua teá baøo mang caù. Khi noàng ñoä NH3 cao toâm seõ bò ngoä ñoäc caáp tính vaø cheát nhanh. Caùc hôïp chaát chöùa nitô daïng oxy hoùa goàm nitrite vaø nitrate khi vöôït qua noàng ñoä 0.3mg/l seõ gaây ngoä ñoäc cho toâm [9]. Cô cheá taùc ñoäng cuûa probiotics trong thuûy saûn: caïnh tranh vò trí gaén keát vôùi vi khuaån, saûn xuaát ra caùc chaát öùc cheá, caïnh tranh nguoàn naêng löôïng, taêng cöôøng khaû naêng haáp thuï caùc chaát dinh döôõng, naâng cao ñaùp öùng mieãn dòch, can thieäp vaøo heä thoáng quorum sensing cuûa vi khuaån gaây beänh, naâng cao chaát löôïng nöôùc ao Hieän nay coù moät soá bieän phaùp khaéc phuïc nhö duøng khaùng sinh ñoå tröïc tieáp hoaëc boå sung vaøo thöùc aên cho toâm, phöông phaùp naøy hieän nay khoâng ñöôïc chaáp nhaân. ÔÛ toâm heä mieãn dòch khoâng ñaëc hieäu, noù khoâng coù khaû naêng ghi nhôù ñöôïc caùc beänh neân söû duïng vacine moät maët khoâng ñaït ñöôïc keát quaû cao, maëc khaùc chi phí cao, toán nhieàu thôøi gian. Do ñoù bieän phaùp toát nhaát laø söû duïng probiotics trong phoøng vaø chöõa beänh ôû toâm. Probiotics ñöôïc duøng vôùi nhieàu hình thöùc nhö tieâm tröïc tieáp, bom vaøo ñöôøng ruoät, nhuùng vaøo dung dòch probiotics, boå sung vaøo thöùc aên. Phöông phaùp höõu hieäu nhaát laø nhuùng toâm vaøo dung dich probiotics ( toâm ôû giai ñoaïn aáu trung hoaëc boå sung vaøo thöùc aên haøng ngaøy cho toâm). Vi khuaån vaø naám ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát coù vai troø nhö probiotics. Bacillus spp laø vi khuaån gram döông ñöôïc söï duïng phoå bieán trong caûi taïo moâi tröôøng nöôùc trong caùc ao nuoâi, chuùng chuyeån hoùa caùc chaát höõu cô thaønh CO2 vaø sinh khoái, giaûm vi khuaån gaây beänh trong ao [40]. Một nghiên cứu của Watchariya Purivirojkul, Nontawith Areechon, Prapansak Srisapoome và Monchan Maketon phaân laäp Bacillus spp töø ruoät cuûa toâm goàm 3 chuûng B. pumilus NW01, B. sphaericus NW02 vaø B. subtilis NW03, sau ño söû duïng ba chuûng treân kieåm tra khaû naêng khaùng vôùi V. harveyi trong ñieàu kieän in vitro vôùi maät ñoä 102 CFU/ml, keát quaû löôïng vi khuaån V. harveyi töø möùc 4.23x10 2 ôû 0 giôø sau ñoù taêng 1.40±0.21 × 10 7 cfu/ml ôû 24 giôø roài tieáp tuïc giaûm 7.80±1.90 × 10 5 cfu/ml ôû 120 giôø [31]. - Caùc vi khuaån sinh acid lactic cuõng ñöôïc söû duïng roäng raõi, Gatesoupe(1991) chöùng minh ñöôïc Lactobacillus giuùp loaøi caù bôn phaùt trieån nhanh [48]. Moät thí nghieäm khaû naêng khaùng cuûa vi khuaån dò döôõng ñöôøng tieâu hoùa cuûa caù hoài vaø caù bôn vôùi taùc nhaân gaây beänh laø A. samodicida, keát quaû cho thaáy vi khuaån taïo voøng khaùng vaø bao phuû leân A. samodicida [48]. J Brunt and B Austin tieán haønh thí nghieäm treân caù hoài, oâng tieán haønh phaân laäp vi khuaån trong ruoät caù hoài vaø test vôùi hai chuûng Lactococcus garvieae 29-99 vaø Streptococcus iniae 00-318. Vi khuaån ñöôïc phaân laäp treân moâi tröôøng MRS vaø ñònh danh baèng sinh hoc phaân töû, teân laø Aeromonas sobria GC2. Khi tieán haønh test hai Aeromonas sobria GC2 vôùi Lactococcus garvieae 29-99 vaø Streptococcus iniae 00-318 keát quaû cho thaáy Aeromonas sobria GC2 coù khaû naêng khaùng Lactococcus garvieae 29-99 vaø Streptococcus iniae 00-318 ( laø hai chuûng gaây beänh cheát ôû caù hoài vaø ñöôïc phaân laäp Vieän Nghieân Cöùu Thuûy Saûn ). Sau ñoù tieán haønh thöïc nghieäm, boå sung thöùc aên caù hoài bò beänh vôùi lieàu löôïng 5x10-7 teá baøo/ gam thöùc aên, keát quaû thieät haïi 75% ñeán 100% khi khoâng boå sung probiotics vaøo thöùc aên, nhoùm ñieàu trò thì thieät haïi töø 0- 6% [13]. Moät nghieân cöùu veà khaû naêng soáng soùt cuûa toâm Litopenaeus vannamei sau khi bò nhieãm Virio harveyi, taùc giaû phaân laäp vi khuaån lactic töø ruoät toâm tröôûng thaønh taïi tröôøng ñaïi hoïc Santa Catarina, Brazil, choïn caùc khuaån laïc hình caàu vaø xaùc ñònh hình thaùi baèng phöông phaùp nhuoäm gram. Caùc vi khuaån phaân laäp ñöôïc traõi treân moâi tröôøng MRS uû 24h vaø 350C, sau ñoù ñuïc loã thaïch ñöôøng kính 1cm, V. harveyi ñöôïc traõi treân moâi tröôøng Marine Agar, ñaët thaïch leân uû cuøng moâi tröôøng Marine Agar uû 24h ôû 300C. Keát quaû cho thaáy voøng khaùng cuûa hai chuûng C2 vaø B6 coù voøng phaân giaûi lôùn nhaát laø 8.0 ± 0.5mm vaø 6.0 ± 0.6 [13].Theo nghieân cöùu cuûa Lara-Flores et al. (2003), oâng söû duïng hai chuûng probiotics laø naám ( Saccharomyces cerevisiae) boå sung vaøo thöùc aên cho caù boät Nile tilapia (Oreochromis niloticus), keát quaû nghieân cöùu giaûm tyû leä cheát ôû caù boät, caù taêng tröôûng nhanh hôn [15]. 2.1.6.2.2. Chaên nuoâi. Söï phaùt trieån cuûa khoa hoïc kyõ thuaät, con ngöôøi ñaõ caûi bieán di truyeàn taêng naêng suaát gia caàm. Khi ñieàu naøy laø toát cho ngaønh chaên nuoâi gia caàm, con ngöôøi baét ñaàu taêng maät ñoä nuoâi, laøm taêng nguy cô nhieãm caùc beänh nguy hieãm cho vaät nuoâi, ñaëc bieät laø vi khuaån nhö E. coli, Salmone spp, Clostridium perfringens vaø Campylobacter spp. Moät thôøi gian raát daøi con ngöôøi ñaõ söû khaùng sinh trong ñieàu trò caùc loaïi beänh naøy. Nhieàu quoác gia ñaõ nghieâm caám söû duïng khaùng sinh bôûi vì chuùng seõ taïo ra caùc vi khuaån khaùng thuoác seõ khoù chöõa trò cho con ngöôøi hôn khi bò nhieãm. Do ñoù moät bieän phaùp thay theá toát nhaát vaø kinh teá nhaát laø söû duïng caùc cheá phaåm probiotics boå sung vaøo thöùc aên trong chaên nuoâi. Probiotics ñöôïc söû duïng trò caùc beänh roái loaïn heä vi sinh ñöôøng ruoät vaø taêng khaû naêng thaåm thaáu cuûa ruoät. Trong heä tieâu hoùa vi khuaån di chuyeån qua daï daøy ñeán ruoät non vaø baùm chaët vaøo bieåu moâ, chuùng giuùp taêng toác ñoä phaùt trieån vaø khaû naêng chuyeån hoùa thöùc aên ôû heo, gaø vaø thuù con. Probiotics giuùp trung hoøa löôïng ñoäc toá trong ruoät do E. coli gaây ra ( ñaây laø vi khuaån gaây beänh chuû yeáu ôû heo). Vi khuaån probiotics caïnh tranh vò trí baùm dính vôùi vi khuaån gaây beänh nhö Clostridium perfringens, giaûm khaû naêng hoaït ñoäng cuûa vi khuaån phaân huûy ureâ, toång hôïp vitamin, kích thích heä thoáng mieãn dòch, duy trì heä vi sinh ñöôøng ruoät, hoøan thieän heä tieâu hoùa [43]. Nhöõng saûn phaåm probiotics ñaõ ñöôïc bieät ñeán raát nhieàu qua caùc saûn phaåm söõa leân men vaø saûn phaåm bô söõa. Caùc saûn phaåm probiotics ñöôïc öùng duïng trong chaên nuoâi ôû caùc noäng traïi chæ ñöôïc giôùi thieäu caùch nay khoaûng hai thaäp nieân vôùi mong ñôïi laø giuùp naâng cao heä thoáng mieãn dòch choáng laïi caùc taùc nhaân gaây beänh. Vieäc söû duïng probiotics ñaõ ñöôïc quan taâm raát nhieàu ñaëc bieät ôû caùc quoác gia phaùt trieån nhö chaâu AÂu ñaõ ngaên caám söû duïng khaùng sinh ngaên ngöøa vaø trò beänh cho ñoäng vaät nuoâi [43]. Gia caàm: Saûn xuaát gia caàm thu laõi raát cao, do lôïi nhuaän maø caùc chuû trang traïi khoâng quan taâm ñeán söùc khoûe con ngöôøi maø söû duïng khaùng sinh moät caùch böøa baõi, do ñoù vieäc caám söû duïng thöoác khaùng sinh ôû chaâu AÂu vaøo ngaøy 1 thaùng 1 naêm 2006 ôû caùc trang traïi chaêng nuoâi gia caàm ñaõ ñöôïc ban haønh. Moät trong nhöõng thaønh coâng cuûa cheá phaåm probiotics söû duïng trong chaên nuoâi gia caàm laø Bacillus subtilis vôùi teân thöông maïi laø CloSTATM. Cheá phaåm naøy giuùp hoaøn thieän khaû naêng phaùt trieån cuûa vaät nuoâi. B. subtilis coøn ñöôïc bieát ñeán coù khaû naêng ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån gaây beänh trong heä tieâu hoùa cuûa gaø. B. subtilis PB6, Streptococcus pneumonia ñaõ ñöôïc chöùng minh raèng coù khaû naêng gieát Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni,. Caùc cheá phaãm cuûa B. subtilis thöôøng ñöôïc baûo quaûn ôû caùc daïng vieân neùn. Caùc cheá phaåm probiotics coù theå chæ chöùa moät loaøi nhö Enterococcus faecium vôùi teân thöông maïi laø Protexin® , nhöng ñoàng thôøi cuõng coù theå laø söï keát hôïp cuûa nhieàu loaøi thuoäc caùc chi nhö Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus. Cô cheá baûo veä cuûa probiotics ôû gia caàm chuû yeáu caïnh tranh vò trí baùm dính vôùi vi khuaån gaây beänh. Söï baùm dính cuûa vi khuaån probiotics treân ruoät cuûa gia caàm laø moät trong nhöõng ñaëc ñieåm quan troïng cho vieäc tuyeån choïn caùc vi khuaån probiotics. Caùc nghieân cöùu ñöôïc bieát ñeán roäng raõi nhö vi khuaån latic, B. subtilis, Enterocuccus faecium laø nhöõng loaøi coù söùc soáng toát nhaát trong heä tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät. Nhieàu taùc ñoäng coù lôïi cuûa probiotics nhö hoaøn thieän heä thoáng mieãn dòch, hoøan thieän heä vi sinh ñöôøng ruoät, giaûm caùc taùc nhaân gaây vieâm, giaûm löôïng amoniac vaø ureâ thaûi ra, giaûm löôïng cholesterol, taêng khaû naêng baùm dính. Hieän nay coù nhieàu nghieân cöùu xa hôn söû duïng probiotics naâng cao khaû naêng phaùt trieån vaø taêng chaát löôïng tröùng gaø [43]. Salmonella laø taùc nhaân chính gaây beänh thöông haøn, phoù thöông haøn, baïch lî ôû gia caàm, chuùng thöøông toàn taïi trong ñöôøng tieâu hoùa cuûa gaø vaø coù theå gaây beänh cho con ngöôøi qua thöùc aên. Nghieân cöùu cuûa J. Vicente, S. Higgins, L. Bielke, G. Tellez,D. Donoghue, A. Donoghue, and B. Hargis ôû gaø taây bò nhieãm salmonela, tieán haønh hai thí nghieäm vôùi baûy loaøi, chia laøm hai nhoùm: nhoùm thöù nhaát naêm loaøi: :Escherichia coli, Kluyvera ascorbata, Klebsiella travesanii, Lactobacillus casei, vaø Lactobacillu cellobiosus, nhoùm thöù hai hai loaøi: L. casei vaø L. cellobiosus. Ôû thí nghieäm thöù nhaát söû duïng probiotics ôû maät ñoä 108 vaø 106 ñoàng thôøi keát hôïp vôùi phun acid höõu cô. Keát quaû cho thaáy söû duïng probiotics ôû noàng maät ñoä cao(108) thì salmonella giaûm tôùi 90%. Trong khi ñoù khi xöû lyù vôùi maät ñoä probiotics thaáp( 106) coù söï keát hôïp vôùi xöû lyù vôùi acid höõu cô thì hieäu quaû xöû lyù ñeán 100%, khoâng coøn söï xuaát hieän cuûa Salmonella. Ôû thí nghieäm thöù hai chæ söû duïng probiotics rieâng leû vôùi maät ñoä töông töï thí nghieäm thöù nhaát hoaëc söû duïng acid höõu cô. Keát quaû thí nghieäm ñaït keát quaû khoâng cao, chæ ñaït töø 75 - 85% [41]. Do ñoù vieäc veä sinh chuoàng traïi cuõng khoâng keùm phaàn quan troïng trong chaên nuoâi. Heo: Heo ôû giai ñoaïn cho buù, raát deã bò xaâm nhieãm bôûi caùc vi khuaån gaây beänh do heä vi sinh vaät ñöôøng tieâu hoùa cuûa heo chua hoaøn chænh, do ñoù vieäc söû duïng khaùng sinh trong trò beänh vaø phoøng beänh heo con raát phoå bieán, tuy nhieân vieäc söû duïng khaùng sinh laïi aûnh höôûng ñeán söùc khoûe con ngöôøi. Caám söû duïng thuoác khaùng sinh trong chöõa beänh hoaëc ñöa ra nhöõng quy ñònh nghieâm ngaëc trong söû suïng khaùng sinh ñeå trò beänh cho ñoäng vaät nuoâi ôû chaâu AÂu ñaõ ñöôïc ban haønh. Söû duïng probiotics giuùp hoaøn thieän söï phaùt trieån vaø taêng khaû naêng khaùng caùc vi sinh vaät gaây beänh ôû heo ñaõ ñöôïc nghieân cöùu roäng raõi vaø khuyeán khích söû duïng. Keá hoaïch HEALTHYPIGUT cuûa EU ñeà ra vaøo giöõa 2001 vaø 2004, trong nghieân cöùu naøy coù söï keát hôïp giöõa naám vaø Pediococccus acidilactici boå sung vaøo trong cheá ñoä aên cuûa heo con, keát quaû giuùp hoøan thieän chöùc naêng moâ cô trong heä tieâu hoùa heo con [43]. Baird (1977) ñaõ nghieân cöùu thaønh coâng boå sung lactobacillus vaøo thöùc aên giuùp taêng troïng löôïng trung bình cuûa heo, töông töï Pollman (1986) cuõng ñaõ thaønh coâng trong nghieân cöùu cuûa mình giuùp taêng troïng löôïng heo baèng boå sung lactobacillus [16]. Ñoäng vaät nhai laïi: Trong daï coû cuûa ñoäng vaät nhai laïi xaûy ra quaù trình phaân huûy cabohydrat vaø protein. Trong daï coû pH töø 5.8 - 6.5, thieáu oxy, ñaây laø ñieàu kieän thuaän lôïi cho ñoäng vaät nguyeân sinh, vi khuaån kò khí vaø naám. Moät trong nhöõng öùng duïng sôùm nhaát cuûa probiotics trong xöû lyù taêng acid trong daï coû ñoäng vaät nhai laïi baèng naám. Taêng acid trong daï coû laø do saûn xuaát thöøa löôïng acid höõu cô deã bay hôi nhö acid probionic, acetates trong thöùc aên cuûa chuùng. Neáu khoâng chöõa trò daãn ñeán giaûm söï ngon mieäng, tieâu chaûy, giaûm thaønh phaàn chaát beùo trong söõa. Do ñoù vieäc boå sung naám vaøo trong thöùc aên seõ laøm giaûm vaán ñeà taêng acid trong daï daøy, taïo ñieàu kieän cho caùc vi khuaån phaân huûy cellulose phaùt trieån, hoøan thieän heä tieâu hoùa [43]. Moät phaàn söû suïng naám ñeå giaûm bôùt haøm löôïng acid trong daï coû, ngoaøi ra coøn söû suïng vi khuaån cuõng ñöôïc söû duïng vôùi nhieàu thaønh coâng töø nhöõng naêm 1970 laøm taêng khaû naêng saûn xuaát söõa vaø troïng löôïng, hoaøn thieän söùc khoûe vaø taêng khaû naêng khaùng beänh Trong daï coû cuûa ñoäng vaät nhai laïi khi tröôûng thaønh seõ chöùa moät löôïng lôùn caùc vi khuaãn, naám, chuùng coù khaû naêng ngaên caûn söï xaâm nhaäp caùc vi sinh vaät beânh ngoaøi. Heä vi sinh vaät trong ruoät non vaø ruoät giaø cuûa nhöõng ñoäng vaät nhai laïi coøn non thì vaéng maët caùc ñoäng vaät nguyeân sinh, vaø söï roái loaïn heä tieâu hoùa ôû thuù con coù theå söû duïng probiotics ñeå chöõa trò. Heä vi sinh daï coû cuûa thuù con ban ñaàu chuû yeáu laø vi khuaån cellulose vaø vi khuaån leân men metan vaø vi khuaån leân men lactate vaø maät ñoä vi khuaån leân men lactate seõ giaûm daàn ñeán tuaàn thöù 13, sau ñoù heä vi sinh vaät trong daï coû cuûa beâ seõ gioáng vôùi heä vi sinh cuûa caùc ñoäng vaät nhai laïi tröôûng thaønh. Ñoäng vaät nguyeân sinh cuõng ñöôïc tìm thaáy trong daï coû sau tuaàn thöù 13. Muïc ñích chuû yeáu cuûa vieäc söû duïng thöùc aên boå sung probiotics laø giaûm bôùt tyû leä cheát vaø nhöõng nguyeân nhaân gaây cheát vôùi beänh ñöôøng tieâu hoùa vaø hoâ haáp. Söû duïng S. cerevisiae vaø A. oryzae ñöôïc söû duïng troän laãn vôi nhau trong thöùc aên laøm taêng löôïng söõa tieát ra ôû boø caùi. Moät soá nghieân cöùu söû duïng probiotics boå sung vaøo thöùc aên laøm taêng löôïng chaát khoâ, naêng suaát söõa vaø moät soá thaønh phaàn quan troïng trong söõa. Tuy nhieân moät khuynh höôùng toát ñeå hoøan thieän khaû naêng phaùt trieån vaø tieát nhieàu söõa baèng caùch keát hôïp giöõa probiotics vaø prebiotic, chaúng haïn keát hôïp giöõa caùc vi khuaån lactic vaø mannanoligosaccharide ôû boø [43]. 2.2. Coâng ngheä saûn xuaát cheá phaåm probiotics: Hieän nay probiotics ñöôïc öùng duïng vaø nghieân cöùu roäng khaép theá giôùi. Cheá phaåm probiotics raát ña daïng vaø daàn daàn thay theá phöông phaùp trò lieäu caùc beänh ñöøông tieâu hoùa baèng khaùng sinh, naâng cao heä thoáng mieãn dòch, cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät nuoâi, giuùp vaät nuoâi taêng tröôûng nhanh vaø taêng cao chaát löôïng saûn phaåm. Moät cheá phaåm probiotics vôùi teân “YEASTURE-W” chöùa chuûng naám Saccharomyces cerevisae do coâng ty “Cenzone” cuûa Myõ saûn xuaát , ñöôïc söû duïng cho gia caàm, giuùp gia caàm taêng troïng nhanh vaø taêng chaát löôïng thòt [23]. All - Lac Denka laø cheá phaåm probiotics do coâng ty denka Pharmaceutial Nhaät baûn saûn xuaát, chöùa hai chuûng Lactobacillus acidophilus vaø Enterococcus faecium chöùa 5x109 cfu/g [33]. Health Plus First Probiotics 90 Vcapsules ñaây laø probiotics cung caáp cho treû em, chöùa 40 tyû vi khuaån Lactobacillus acidophilus, söû duïng boå sung vaøo thöùc aên cho treû. Giuùp treû duy trì caân baèng heä vi sinh ñöôøng ruoät, taêng khaû naêng haáp thuï thöùc aên… [54]. Hieän nay treân thò tröôøng Vieät Nam cuõng xuaát hieân nhieàu saûn phaåm daïng probiotics nhö saûn phaåm Probio thuoác daïng ñoâng khoâ chöùa khoaûng 1 tyû teá baøo Lactobacillus acidophilus trò moät soá beänh ñöôøng ruoät. Saûn phaåm do coâng ty döôïc phaåm IMEXPHARM saûn xuaát. Moät nghieân cöùu raát thaønh coâng cuûa TS. Voõ Thò Haïnh saûn xuaát hai cheá phaåm Probiotics Bio I vaø Probiotics Bio II. Bio I söû duïng cho gia suùc, gia caàm, kích thích tieâu hoùa cho, taêng troïng, giaûm tieâu toán thöùc aên, öùc cheá caùc vi khuaån gaây beänh trong ñöôøng ruoät, phoøng trò caùc chöùng roái loaïn tieâu hoùa, caùc chöùng tieâu chaûy do söû duïng khaùng sinh laâu daøi, naâng cao söï haáp thu caùc chaát dinh döôõng. Cheá phaåm Bio II söû duïng trong nuoâi troàng thuûy saûn, goùp phaân huûy nhöõng thöùc aên thöøa vaø caùc khí thaûi ôû ñaùy ao, oån ñònh pH vaø maøu nöôùc ao, kìm haõm söï taêng tröôûng cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh cho toâm, caù nhö caùc vi khuaån Vibrio spp, taêng naêng suaát nuoâi troàng. Quy trình saûn xuaát cheá phaåm Probiotics raát phöùc taïp vaø traõi qua nhieàu giai ñoïan, sô ñoà toång quaùt nhö sau: Gioáng thuaàn Test vôùi vi khuaån gaây beänh Gioáng goác Leân men Chuaån bò moâi tröôøng Taêng sinh Haáp khöû truøng Thu hoài sinh khoái Taïo cheá phaåm probiotic Phaân laäp gioáng Sô ñoà 2.1: Coâng ngheä saûn xuaát cheá phaåm probiotics. Giai ñoaïn choïn gioáng raát quan troïng, phaûi ñaûm baûo gioáng coù ñaày ñuû nhöõng chöùc naêng nhö treân, ñaëc bieät coù khaû naêng khaùng laïi caùc vi sinh vaät gaây beänh treân caùc ñoái töôïng maø ta söû duïng chöõa trò. Chaúng haïn, choïn loaøi Lactobacillus acidophillus coù khaû naêng khaùng laïi E.coli gaây beänh tieâu chaûy cho ngöôøi. Vaán ñeà thöù hai laø moâi tröôøng ñeå nhaân sinh khoái, moâi tröôøng chuaån duøng ñeå leân men thu sinh khoái vi sinh vaät thöôøng raát ñaéc tieàn, neáu söû duïng thì chi phí taïo thaønh phaåm raát cao, giaù thaønh cao, saûn phaåm khoù tieâu thuï, do ñoù chuùng ta caàn tìm nhöõng moâi tröôøng thay theá thích hôïp, cung caáp ñaày ñuû chaát dinh döôõng cho vi sinh vaät. Ñaëc bieät, ta coù theå taän duïng nguoàn pheá thaûi cuûa ngaønh coâng nghieäp khaùc, giaûm bôùt giaù thaønh saûn phaåm. Chuùng ta coù theå taän duïng ræ ñöôøng ( pheá thaûi ngaønh coâng nghieäp mía ñöôøng) thay theá cho nguoàn ñöôøng caàn boå sung trong moâi tröôøng leân men. Trong quaù trình leân men caàn phaûi theo doõi suoát quaù trình leân men, ñoái vôùi vi khuaån lactic, trong quaù trình leân men chuùngseõ taïo acid lactic laøm pH moâi tröôøng giaûm öùc cheá ngöôïc trôû laïi söï phaùt trieån cuûa chuùng. Cheá phaåm probiotic coù theå ñöôïc baûo quaûn ôû daïng dòch hoaëc daïng boät sau khi ñaõ saáy phun, tuøy theo coâng ngheä, ñaëc tính cuûa töøng loaïi vi khuaån, vaø nhöõng phuï gia thích hôïp maø choïn caùc phöông phaùp thích hôïp nhaát sao cho giaù thaønh toát nhaát maø vaãn ñaûm baûo chaát löôïng. 2.3. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Phân loại Loaøi Lactobacillus acidophilus thuoäc giôùi vi khuaån, ngaønh Firmicute, lôùp Bacilli, boä Lactobacillales, hoï Lactobacillaceae, gioáng Lactobacillus. Noù thöôøng ñöôïc söû duïng vôùi Streptococcus salivarius vaø Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus trong caùc saûn phaåm leân men nhö söõa chua. Lactobacillus acidophilus laø vi khuaån gram döông khoâng sinh baøo töû, hình que, leân men hieáu khí laãn kò khí. Ñaëc ñieåm hình thaùi vaø sinh lyù Hình 2.1 Lactobacillus acidophilus döôùi kính hieån vi Lactobacillus acidophilus laø tröïc khuaån, kích thöôùc 0.6-0.9 m m. daøi 1.5-6mm. Trong töï nhieân chuùng toàn taïi rieâng leû, ñoâi khi taïo thaønh chuoãi ngaén coù khaû naêng ñoäng [7]. Lactobacillus acidophilus toàn taïi trong heä tieâu hoùa, mieäng, aâm ñaïo cuûa ngöôøi [52]. Nhieät ñoä phaùt trieån toái öu laø 370C 2.3.3. Ñaëc tính sinh hoùa Lactobacillus acidophilus leân men trong ñieàu kieän yeám khí. Lactobacillus acidophilus thieáu cytochromes, porphyrin, nhöõng enzyme hoâ haáp, do ñoù noù khoâng coù hieän töôïng hoâ haáp. Trong quaù trình leân men töø phaân töû glucose thoâng quaù trình ñöôøng phaân, töø moät phaân töû glucose Lactobacillus acidophilus chæ taïo ra naêng löôïng laø 2ATPs, do ñoù vi khuaån caàn phaûi chuyeån hoùa moät löôïng cô chaát lôùn ñeå ñaûm baûo löôïng naêng löôïng caàn thieát cho hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa chuùng. Lactobacillus acidophilus thöôøng toàn taïi trong moâi tröôøng nhieàu ñöôøng nhö ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. Glucose laø nguoàn carbon öa thích nhaát cuûa Lactobacillus acidophilus, tuy nhieân noù vaãn coù khaû naêng söû duïng maltose, lactose, galactose, sucrose ….[14]. L. acidophilus leân men ñoàng hình, saûn phaåm leân men chuû yeáu laø acid lactic. Leân men ñoàng hình phaân giaûi ñöôøng theo con ñöôøng EMP. Töø moät phaân töû glucose seõ chuyeån thaønh hai phaân töû acid lactic vaø 2ATP. Hình 2.2 : sô ñoà nguyeân chuyeån hoùa glucose côû L. acidophilus Lactobacillus acidophilus coù nhu caàu dinh döôõng raát phöùc taïp, chuùng coù khaû naêng söû duïng cacbohydrate, protein, moät soá vitamin nhö vitamin B, acid nucleic, khoaùng nhö Mg, Mn, Fe, caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa chuùng [7]. 2.3.4. Hoaït tính probiotic Lactobacillus acidophilus ñöôïc bieát ñeán nhö moät probiotics. Chuùng ñöôïc söû duïng phoå bieán trong caùc saûn phaåm söõa leân men, ñaëc bieät laø yogurt. Raát nhieàu nghieân cöùu ñaõ chöùng minh raèng Lactobacillus acidophilus mang laïi lôïi ích cho con ngöôøi. Lactobacillus acidophilus coøn ñöôïc boå sung vaøo thuoác trò moät soá beänh thay cho thuoác khaùng sinh. Caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng Lactobacillus acidophilus giuùp laøm giaûm löôïng cholesterol trong maùu, vaø loaïi cholesterol ra khoûi moâi tröôøng nuoâi caáy (Gilliland et al. 1985, Rasic et al. 1992, Lin and Chen 2000, Saito 2004). Sinh ra caùc chaát khaùng khuaån, ñaây laø moät trong nhöõng öu ñieåm cuûa vi khuaån probiotics. Lactobacillus acidophilus cuõng coù chöùc naêng treân, noù coù khaû naêng taïo ra caùc acid höõu cô, diacetyl, β-hydroxypropionaldehyde, bacteriocins ( Acidophilucin A, Acidocin J1132) [35]. Theo nghieân cöùu cuûa Gilliland vaø Speck, Lactobacillus acidophilus NCFM coù khaû naêng choáng laïi caùc vi khuaån gaây beänh Staphylococcus aureu, salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, E.coli gaây beänh ñöôøng ruoät vaø Clostridium perfringens [34]. Lactobacillus acidophilus söû duïng boå sung cho nhöõng ngöôøi khoâng coù khaû naêng tieâu hoùa ñöôøng lactose. Lactobacillus acidophilus taäp hôïp ôû ñöôøng tieâu hoùa. Khi söû duïng vôùi moät löôïng ñaày ñuû seõ laøm giaûm trieäu chöùng khoâng dung naïp söõa[7]. Do Lactobacillus acidophilus coù khaû naêng toång hôïp b galactosidase. Lactose seõ ñöôïc thaám qua maøng teá baøo vi khuaån vaø döôùi taùc duïng cuûa b galactosidase seõ bieán ñoåi lactose thaønh glucose vaø D-galactose [7]. Lactobacillus acidophilus coù khaû naêng taùc ñoäng ñeán enterocytes, caïnh tranh vò trí baùm dính treân bieåu moâ ruoät [34]. 2.4. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men: Moâi tröôøng chuaån vi khuaån Lactic noùi chung, Lactobacillus acidophilus noùi rieâng laø moâi tröôøng MRS, thaønh phaàn MRS/l goàm: glucose 20g, Peptone 10g, Beef extract 8g, Sodium acetate.3H2O 5g, Yeast extract 4g, K2HPO4 4g, Triammonium citrate 2g, MgSO4·.7H2O 0.2g, MnSO4·.4H2O 0.05g. tween 1ml. Trong moâi tröôøng glucose cung caáp nguoàn carbon cho vi khuaån. Naám men, peptone, beef ectrack cung caáp nguoàn nitô, ñaëc bieät trong cao naám men raát giaøu nguoàn vitamin nhoùm B raát caàn thieát cho vi khuaån L. acidophilus phaùt trieån. Theo nghieân cöùu cuûa Sunhoon Kwon, Pyung Cheon Lee, Eun Gyo Lee, Yong Keun Chang, Nam Chang taïi vieän khoa hoïc vaø kyõ thuaät Haøn Quoác tieán haønh khaûo saùt söï phaùt trieån cuûa L. rhamnosus treân baûy vitamin: d-biotin, pyridoxine, p-aminobenzoic acid, nicotinic acid, thiamine, pantothenic acid, vaø riboflavi boå sung vaøo dòch dòch ñaäu naønh thuûy phaân. Keát quaû cho thaáy pantothenic acid, vaø riboflavi coù aûnh höôûng maïnh nhaát ñoái vôùi söï phaùt trieån cuûa L. rhamnosus, khi khoâng boå sung hai vitamin naøy trong moâi tröôøng thì löôïng teá baøo khoâ chæ ñaït 0.029 vaø 0.05 g/l[ ]. Vi khuaån lactic noùi chung vaø L. acidophilus noùi rieâng caùc thaønh phaàn trong moâi tröôøng laø yeáu toá quan troïng giuùp toãng hôïp caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc. Theo nghieân cöùu cuûa Marco J. van Belkum, Darren J. Derksen, Charles M. A. P. Franz moät vaøi bacteriocins ñöôïc toång hôïp nhôø caûm öùng cuûa moät soá peptide[24]. MgSO4·.7H2O, MnSO4·.4H2O cung caáp Mn, Mg cho vi khuaån. Trong saûn xuaát vôùi quy moâ coâng nghieäp neáu söû duïng moâi tröôøng MRS thì giaù thaønh saûn phaåm raát cao, do ñoù ñeå giaûm bôùt giaù thaønh, chuùng ta tìm nhöõng nguoàn thay theá thích hôïp. Chuû yeáu döïa vaøo nguoàn carbon vaø nitô maø coù theå thay theá baèng caùc nguyeân lieäu khaùc vaø reû hôn maø vaãn ñaûm baûo cung caáp ñuû nguoàn carbon vaø nitô vôùi muïc ñích giaûm giaù thaønh vaø taän duïng caùc pheá thaûi cuûa ngaønh coâng nghieäp khaùc. 2.4.1.Nguoàn carbon Baát cöù vi sinh vaät naøo cuõng caàn nguoàn carbon. Trong teá baøo nguoàn C traûi qua moät loaït quaù trình bieán hoaù hoaù hoïc phöùc taïp seõ bieán thaønh vaät chaát cuûa baûn thaân teá baøo vaø caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát. C coù theå chieám ñeán khoaûng moät nöûa troïng löôïng khoâ cuûa teá baøo. Ñoàng thôøi haàu heát caùc nguoàn C trong caùc quaù trình phaûn öùng sinh hoaù coøn sinh ra trong teá baøo nguoàn naêng löôïng caàn thieát cho hoaït ñoäng soáng cuûa vi sinh vaät. Chaúng haïn, qua quaù trình ñöôøng phaân töø moät phaân töû glucose seõ giaûi phoùng naêng löôïng döùôi daïng ATP, moät glucose giaûi phoùng 38 phaân töû ATP, nguoàn naêng löôïng naøy ñöôïc duøng toång hôïp caáu truùc teá baøo, toång hôïp caùc cao phaân töû sinh hoïc, sinh tröôûng vaø sinh saûn … coù raát nhieàu saûn phaåm cung caáp nguoàn carbon cho vi sinh vaät phaùt trieån nhö: huyeát thanh söõa, ræ ñöôøng, tinh boät saén, dòch chieát döùa… Huyeát thanh söõa Huyeát thanh söõa: Laø dung dòch sau khi ñaõ tuûa protein söõa, laø pheá thaûi cuûa ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát phomaùt, chöùa khoaûng 60-75 % lactose. Huyeát thanh söõa coù hai loaïi, loaïi thöù nhaát goïi laø huyeát thanh ngoït, khi pH khaûng 5.6 duøng rennet tuûa protein söõa. Loaïi thöù hai laø huyeát thanh chua pH thaáp hôn 5.1 duøng acid ñoâng tuï, coù theå duøng acid acetic hoaëc acid citric. Thaønh phaàn chuû yeáu cuûa huyeát thanh söõa laø ñöôøng lactose. Baûng sau theå hieän thaønh phaån cuûa huyeát thanh söõa [30]. Bảng 2.1: Thaønh phaàn hoùa hoïc huyeát thanh Teân huyeát thanh Protein (g/l) Lactose (g/l) Khoaùng (g/l) Huyeát thanh ngot 6–10 46–52 2.5–4.7 Huyeát thanh chua 6–8 44–46 4.3–7.2 Hieän nay ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát phomaùt phaùt trieån khaép theá giôùi, moãi naêm saûn xuaát khoaûng 15x106 taán chieám 35% toång caùc saûn phaåm söõa, saûn xuaát chuû yeáu ô ch._.acidophilus trong moâi tröôøng döùa ñaït möùc teá baøo cöïc ñaïi taïi thôøi ñieåm 16 giôø ( 18 x107 cfu/ml). Trong khi ñoù moâi tröôøng ræ ñöôøng thôøi gian sinh tröôûng daøi hôn vaø keùo daøi ñeán hôn 20 giôø vaø ñaït maät ñoä cöïc ñaïi 13.5 x 107 cfu/ml taïi thôøi ñieåm 20 giôø. Keát quaû choïn moâi tröôøng dòch chieát döùa laø moâi tröôøng duøng toái öu cho söï phaùt trieån vi khuaån L. acidophilus. Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng vi khuẩn L. acidophilus trong hai môi trường dịch chiết dứa và rỉ đường 4.2.2. Keát quaû toái öu hoùa moâi tröôøng 4.2.2.1. Keát quaû thöïc nghieäm theo keá hoaïch ñaày ñuû caùc yeáu toá : Trong thí nghieäm toái öu hoùa moâi tröôøng cho L. acidophilus choïn ba yeáu toá : cao naám men cung caáp nguoàn nitô, ñaëc bieät coøn cung caáp nguoàn vitiamin nhoùm B caàn thieát cho söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån ; triamonium hydrogen citrate laø chaát giuùp khaùng viruùt ñoàng thôøi cuõng cung caáp nguoàn nitô voâ cô cho vi khuaån ; K2HPO4 giöõ vai troø laø chaát ñeäm trong moâi tröôøng, ñoàng thôøi cung caáp photpho caàn thieát cho söï taêng tröôûng L. acidophilus Môi tröôøng sau khi nuoâi caáy 18 giôø tieán haønh ño OD 11 moâi tröôøng, ôû thí nghieäm thöù 9, 10, 11 laø ba thí nghieäm taïi taâm. Maãu ño OD ñöôïc pha loaõng 10 laàn vaø chưa nhân hệ số pha loãng. Keát quaû trình baøy baûng 4.1 : Baûng 4.1 : Keát quaû thöïc nghieäm vaø ñaày ñuû caùc yeáu toá Moâi tröôøng Z1 Z2 Z3 Z1Z2 X1Z3 Z2Z3 yj (OD) 1 + + + + + + 0.6300 0.625 2 - - + + - - 0.7215 0.721 3 + - + - + - 0.7090 0.700 4 - + + - - + 0.6325 0.633 5 + + - + - - 0.6255 0.633 6 - - - + + + 0.7500 0.753 7 + - - - - + 0.7300 0.720 8 - + - - + - 0.6700 0.665 9 0 0 0 0 0 0 0.652 10 0 0 0 0 0 0 0.656 11 0 0 0 0 0 0 0.657 Tính toaùn caùc heä soá hoài quy : b1 = -9.9*10-3, b2 = -0.044, b3 = -0.01, b12 = -1.8*10-3, b13 = 6.18*10-3, b23 = 2*10-3 b0 = 0.6835 = 6.55 S2th = 7*10-6 Sbj = 9.4*10-4 t1=10.53, t2 = 46.8, t3 = 10.6, t12 = 1.9, t13 = 6.5, t23 = 2.1, t0 = 727.12 Tra baûng student t0.05(2) = 4.3 Töø keát quaû cho thaáy t0, t1, t2, t13, t3 > t0.05(2) Phöông trình hoài quy coù daïng : = 0.6835 - 0.0099Z1 - 0.044Z2 - 0.01Z3 + 0.00618Z1Z3 4.2.2.2. Keát quaû kieåm tra söï töông thích cuûa phöông trình hoài quy vôùi thöïc nghieäm theo tieâu chuaån Fisher : S2dö = 7.15*10-5F = 7.15*10-5 / 7*10-6 = 10.21 Tra baûng Fisher F0.05(3,2)= 19.2 F < F0.05(3,2), phöông trình hoài quy treân laø ñuùng vôùi thöïc nghieäm. 4.2.2.3. Keát quaû toái öu hoùa thöïc nghieäm baèng phöông phaùp leân doác Töø phöông trình hoài quy cho thaáy, caû ba yeáu toá: cao naám men, Triamonium hydrogen citrate, K2HPO4 ôû möùc cao, khi ta taêng haøm löôïng cuûa ba yeáu toá leân thì seõ laøm sinh khoái giaûm. Do ñoù trong böôùc leo doác ta choïn böôùc chuyeån ñoäng ñi xuoáng, giaûm daàn haøm löôïng cuûa ba yeáu toá treân. Choïn böôùc chuyeån ñoäng taïi Z1 vôùi böôùc chuyeån ñoäng d 1 = - 0.2, vaø böôùc chuyeån ñoäng cho caùc yeáu toá coøn laïi ñöôïc tính toaùn ghi trong baûng 4.2 Baûng 4.2: Keát quaû tính böôùc chuyeån ñoäng cuûa caùc yeáu toá: Caùc chæ tieâu Z1 (%) Z2(%) Z(%) Möùc cô sôû 2.2 1 0.2 Khoaûng bieán thieân () 1 0.3 0.1 Heä soá bj -0.0099 -0.044 -0.01 bj -0.0099 -0.0132 -0.001 Böôùc chuyeån ñoäng () -0.2 -0.26 -0.02 Laøm troøn böôùc chuyeån ñoäng () -0.2 -0.3 -0.02 Töø keát quaû baûng 3.4, toâi tieán haønh thí nghieäm leo doác, choïn möùc xuaát phaùt töø taâm, caáy gioáng vôùi tyû leä 3%, uû 370C, sau 18 giôø ño OD, keát quaû trình baøy trong baûng 4.3. Baûng 4.3 keát quaû OD ñöôïc pha loaõng 10 laàn vaø chöa nhaân heä soá pha loaõng: Baûng 4.3: Keát quaû thí nghieäm theo höôùng leo doác Thí nghieäm Z1(%) Z2(%) Z3(%) Y(OD) 1(TN taïi taâm) 2.2 1 0.2 0.65 2 2 0.7 0.18 0.77 3 1.8 0.4 0.16 0.68 4 1.6 0.1 0.14 0.65 5 1.4 0 0.12 0.65 6 1.2 0 0.10 0.63 Treân baûng 4.3 cho thaáy ôû moâi tröôøng ôû moâi tröôøng thöù hai coù OD ñaït möùc cao nhaát 0.77, teá baøo ñaït 6.3*108 cfu/ml. Keát quaû choïn thaønh phaàn moâi tröôøng toái öu: cao naám men ( 2%), Triamonium hydrogen citrate( 0.7%), K2HPO4 ( 0.18%). Trong moâi tröôøng dòch chieát döùa coù haøm löôïng ñöôøng khaù cao ( 50 mg/ml) ñuû cung caáp nguoàn carbon cho vi khuaån vaø chöùa moät haøm löôïng protein thaáp, do ñoù vôùi haøm löôïng cao naám men, triamonium hydrogen citrate, K2HPO4 boå sung nhö treân laø thích hôïp. Mỗi vi sinh vật đều có một ngưỡng chịu đựng nhất định đối với thành phần môi trường, do ñoù caùc chaát khi ôû noàng ñoä cao seõ aûnh höôûng ñeán aùp suaát thaåm thaáu cuûa teá baøo, aûnh höôûng ñeán khaû naêng haáp thuï caùc chaát dinh döôõng cuûa vi khuaån. Theo keát quaû nghieân cöùu cuûa Sejong oh, Sunggue Rheem, Jaehun sim, Sangkyo Kim vaø Youngjin Baek thuoäc ñaïi hoïc Haøn Quoác toái öu hoùa moâi tröôøng cho söï phaùt trieån cuûa vi khuaån L. Casei YIT 9018 vôùi haøm löôïng cao naám men 0.892% keát hôïp vôùi löôïng tryptone 3.04% ñeå cung caáp nguoàn nitô vaø moät soá vitamin nhoùm B. Trong nghieân cöùu naøy taùc giaû toái öu löôïng cao naám men raát thaáp nhöng löôïng nitô ñöôïc boå sung bôûi tryptone gôùp phaàn giaûm chi phí cho moâi tröôøng [37]. Trong moâi tröôøng MRS thì nguoàn nitô ñöôïc cung caáp töø cao naám men, cao thòt, peptone. Löôïng cao naám men boå sung raát ít chæ 0.2% coøn löôïng peptone vaø cao thòt laïi cao. Trong khi ñoù moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu chæ cao naám men laø nguoàn cung caáp nitô höõu cô vaø vitamin B. Maëc duø haøm löôïng cao naám men boå sung töông ñoái thaáp hôn so vôùi caùc nghieân cöùu ñaõ baùo cao nhöng löôïng nitô vaãn ñöôïc ñaûm baûo baèng nguoàn nitô voâ cô (triamonium hydrogen citrate). Qua keát quaû thí nghieäm cho thaáy coù theå vi khuaån L. acidophilus sinh tröôûng vaø phaùt trieån raát toát, löôïng sinh khoái töông ñöông vôùi moâi tröôøng MRS. Döôøng nhö L. acidophilus söû duïng ñöôïc nguoàn nitô voâ cô laãn nitô höõu cô. Theo nghieân cöùu Lim, C.H., Rahim, R.A.,Ho, Y.W. vaø Arbakariya, B.A. cuûa Ñaïi Hoïc Putra cuûa Malaysia toái öu hoùa thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån Lactobacillus salivarius i24 vôùi haøm löôïng cao naám men cao 4.31 %, glucose 3.32%. Trong thí nghieäm naøy taùc giaû chæ söû duïng cao naám men laø nguoàn duy nhaát ñeå cung caáp nitô vaø vitamin cho vi khuaån [12]. Keát quaû nghieân cöùu cuûa A. Laitila vaø coäng söï, taùc giaû söû duïng MSE_ extra vaø maät ñoä teá baøo ñaït 109 cfu/ml. Trong thí nghieäm naøy taùc giaû khoâng boå sung löôïng cao naám men nhöng boå sung theâm khoaùng vaø vitamin (niacin vaø pantothenic acid) [22]. Moâi tröôøng toái öu ñaûm baûo caùc thaønh phaàn dinh döôõng cho vi khuaån sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát nhaát. Nhöng vaán ñeà kyõ thuaät cuõng laø yeáu toá quan troïng goùp phaàn giuùp taêng naêng suaát vaø duy trì naêng suaát toát. Hieän nay coù caùc phöông phaùp sau: Leân men lieân tuïc vaø leân men coù maøng laø hai phöông phaùp leân men tieán boä vaø phoå bieán hieän nay trong coâng nghieäp. Trong phöông phaùp leân men lieân tuïc, vi khuaån ñöôïc cung caáp dinh döôõng lieân tuïc vaø luoân ôû traïng thaùi pha log, hoøan toaøn töï ñoäng nhöng khaû naêng nhieãm cao. Leân men coù maøng, vi khuaån ñöôïc giöõ coá ñònh treân maøng vaø dinh döôõng ñöôïc cung caáp lieân tuïc, vi khuaån luoân toàn taïi pha log, khoâng bò öùc cheá bôûi caùc chaát maø do chính baøn thaân chuùng sinh ra, deã thu hoài saûn phaåm. Trong thí nghieäm naøy toâi tieán haønh leân men theo meû, dinh döôõng ñöôïc caáp chæ moät laàn, do ñoù vi khuaån seõ traõi qua caùc pha sinh tröôûng bò öùc cheá bôùi acid do chính noù sinh ra. Nghieân cöùu cuûa Liew Siew Ling vaø coäng söï, trong nghieân cöùu naøy taùc giaû söû duïng phöông phaùp leân men lieân tuïc söû duïng thaønh phaàn moâi tröôøng (g/l) goàm Glucose, 50.1; yeast extract, 60; KH2PO4, 2.7; MgSO4.7H2O, 0.2; MnSO4.H2O, 0.05; Tween-80, 1ml/L; dung dòch vitamin 12.8 ml/L. Vitamin goàm (g/l): yridoxine.HCl, 2.0; pantothenic acid, 1.0; niacin, 1.0; riboflavin, 1.0 and folic acid, 1.0. ÔÛ thí nghieäm naøy taùc giaû cung caáp ñaày ñuû löôïng carbon vaø nitô cho L. rhamnosus, ñaëc bieät laø cung caáp ñaày ñuû caùc vitamin caàn thieát cho söï sinh tröôûng cuûa L. rhamnosus sinh khoái ñaït möùc cao nhaát laø 1.3 x10 10 cfu/ml [23]. Keát quaû xaùc ñònh ñöôøng cong sinh tröôûng vi khuaån L. acidophilus trong hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu. Caû hai moâi tröôøng tyû leä caáy gioáng ban ñaàu 3% vaø ñaït maät ñoä teá baøo khoaûng 0.2 x 108 cfu/ml. Moâi tröôøng MRS voán laø moâi tröôøng ñaëc tröng cho vi khuaån L. acidophilus neân phaùt trieån raát nhanh. Sinh khoái vi khuaån taïi giôø thöù 5 thì sinh khoái vi khuaån trong moâi tröôøng MRS ( 0.6 x 108 cfu/ml) cao hôn so vôùi moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu ( 0.4 x 108 cfu/l). Caû hai moâi tröôøng pha lag ñieàu traõi qua khoaûng 8 giôø, so vôùi moâi tröôøng MRS thì moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu vi khuaån phaùt trieån chaäm hôn, do laø moâi tröôøng hoaøn toaøn môùi vaø khaùc haún so vôùi moâi tröôøng nhaân gioáng cuûa L. acidophilus. Sau 8 giôø thì vi khuaån trong caû hai moâi tröôøng ñieàu chuyeån sang pha log, ñaây laø giai ñoaïn vi khuaån phaùt trieån vôùi toác toä phaùt trieån cöïc ñaïi. Trong moâi tröôøng MRS thì vi khuaån ñaït maät ñoä cöïc ñaïi ( 6.8 x 108 cfu/ml) ôû 16 giôø. Moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu vi khuaån traõi qua pha log daøi hôn, maát 18 giôø vaø ñaït maät ñoä teá baøo 6.3 x108 cfu/ml. Keát quaû treân cho thaáy söï cheânh leäch maät ñoä teá giöõa hai moâi tröôøng laø khoâng ñaùng keå, moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu coù theå thay theá cho moâi tröôøng MRS trong leân men thu sinh khoái vi khuaån L. acidophilus. Theo nghieân cöùu cuûa Leâ Haø Vaân Thö, taùc giaû söû duïng moâi tröôøng söõa gaày 12% khaûo saùt söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån L. acidphilus, keát quaû maät ñoä teá baøo ñaït 1.2 x 108 cfu/ml [7]. Trong quaù trình leân men tuøy theo muïc ñích thu saûn phaåm maø ngöôøi ta choïn thôøi gian thu hoài sinh khoái thich hôïp. Chaúng haïn, ñeå thu acid lactic thì ngöôøi ta seõ choïn cuoái pha caân baèng vì trong suoát pha caân baèng vi khuaån vaãn tieáp tuïc sinh acid lactic, coøn ñoái vôùi thu sinh khoái vi khuaån thöôøng choïn thôøi gian maø vi khuaån ñaït toác ñoä sinh tröôûng cöïc ñaïi ( thöôøng trong pha log) . Do ñoù trong moâi tröôøng dòch chieát nöôùc döùa toái öu thôøi gian thu sinh khoái toát nhaát laø taïi thôøi ñieåm 18 giôø. Theo nghieân cöùu cuûa Dr Roslina Rashid, taùc giaû söû duïng moâi tröôøng dòch nöôùc döùa thaûi leân men thì maät ñoä teá baøo ñaït 7.3 x 106 cfu/ml. Trong thí nghieäm naøy taùc giaû chæ söû duïng dòch nöôùc döùa thaûi maø khoâng boå sung theâm nguoàn nitô naøo [32]. Hình 4.5: Ñoà thò bieåu dieãn ñöôøng coâng sinh tröôûng cuûa vi khuaån L. acidophilus nuoâi trong hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu Keát quaû xaùc ñònh söï thay ñoåi pH theo thôøi gian cuûa hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu. L. acidophilus laø vi khuaån lactic leân men ñoàng hình, do ñoù saûn phaåm chính sinh ra laø acid lactic laøm pH moâi tröôøng haï thaáp xuoáng, pH moâi tröôøng thaáp laø moät côù cheá öùc cheá hoaëc tieâu dieät caùc vi khuaån gaây beänh. Tuy nhieân khi pH moâi tröôøng thaáp hôn 4 noù seõ öùc cheá söï phaùt trieån cuûa chính baûn thaân noù. Keát quaû trình baøy hình 4.6. Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu pH caû hai moâi tröôøng baét ñaàu giaûm nhanh töø giôø thöù 5 ñeán giôø thöù 16, giai ñoaïn naøy vi khuaån ñang ôû pha log neân toång hôïp nhieàu acid. Moâi tröôøng MRS thì pH giaûm xuoáng tôùi möùc thaáp nhaát laø 3.8 vaø khoâng giaûm nöõa sau 16 giôø. Moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu pH giaûm chaäm hôn so vôùi MRS, taïi thôøi ñieåm 16 giôø pH chæ 4, ñeán 18 giôø pH ñaït giaù trò thaáp nhaát 3.91 vaø khoâng giaûm sau 18 giôø. Do söï cheânh leäch sinh khoái cuûa vi khuaån trong caû hai moâi tröøông khoâng nhieàu neân söï khaùc bieät veà giaù trò pH cuûa hai moâi khoâng ñaùng keå. Töø keát quaû treân cho thaáy pH<4 coù theå öùc cheá söï phaùt trieån cuûa L. acidophilus Keát quaû xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng giaûm theo thôøi gian cuûa hai moâi tröøông leân men MRS vaø dòch chieát döùa toái öu Keát quaû döïng ñöôøng chuaån gluocse: y : OD x : Nồng độ đường (mg/ml) R : hệ số tương quan Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường và OD Moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu ñöôïc leân men vaø laáy ra xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng toång coøn laïi trong moâi tröôøng taïi caùc thôøi ñieåm 5, 8, 16, 18, 20, 24 giôø. Ta döïa vaøo ñöôøng chuaån glucose ñeå xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng. Keát quaû trình baøy ôû hình 4.8. Hình 4.8: Ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng ñöôøng toång thay ñoåi theo thôøi gian leân men cuûa hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu Kết quả treân hình 4.8 cho thấy giai đoạn từ giờ thứ 5 đến giờ thứ 16 hàm lượng đường giảm rất nhanh do đây là giai đoạn pha log của vi khuẩn. Trong môi trường MRS vi khuẩn sử dụng đường rất tốt, tại thời điểm 20 giờ thì hàm lượng đường còn rất thấp (0.97 mg/ml). Trong dòch chieát döùa thaønh phaàn ñöôøng chuû yeáu laø fructose vaø sucrose. Theo keát quaû toâi phaân tích haøm löôïng ñöôøng toång trong dòch döùa ñaït 50 mg/ml, haøm löôïng ñöôøng naøy cao hôn gaáp ñoâi so vôùi moâi tröôøng MRS( 20 g glucose). Sinh khoái vi khuaån sau 18 giôø trong moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu khoâng taêng nöõa, pH laø 3.91, löôïng ñöôøng coøn laïi vôùi noàng ñoä 23.9mg/ml. Vi khuaån chæ söû duïng moät nöõa löôïng ñöôøng trong moâi tröôøng dòch chieát döùa. Muïc ñích cuûa ñeà taøi höôùng ñeán vieäc taän duïng dòch nöôùc döùa thaûi ra sau quaù trình xöû lyù döùa ( taùch voû vaø cuøi) vôùi haøm löôïng ñöôøng trong dòch nöôùc döùa thaûi 31.3 g/l. [32], ñaây laø löôïng ñöôøng ñuû cung caáp nguoàn carbon cho vi khuaån taêng tröôûng. Theo keát quaû nghieân cöùu Lim, C.H vaø coäng söï thì haøm löôïng ñöôøng glucose toái öu cho söï taêng tröôûng cuûa vi khuaån Lactobacillus salivarius i 24 laø 33.2 g/l[12]. Theo nghieân cöùu cuûa Dr Roslina Rashid söû duïng nöôùc döùa thaûi leân thu acid lactic baèng vi khuaån Lactobacillus delbrueckii keát quaû haøm löôïng ñöôøng ñöôïc vi khuaån söû duïng raát hieäu quaû, löôïng ñöôøng coøn laïi sau 72 giôø laø 0.16g/l [32]. Do ñoù trong nghieân cöùu naøy dòch chieát döùa toái öu neân ñöôïc pha loaõng ra ñeå traùnh laõng phí löôïng ñöøông coøn laïi sau khi leân men. 4.6. Keát quaû So saùnh khaû naêng öùc cheá vi sinh vật chỉ thị cuûa dòch nuoâi cấy L. acidophilus trong moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu. 4.6.1. Keát quaû xaùc ñònh khaû naêng öùc cheá toång quaùt cuûa nuoâi caáy: E. coli uû cuøng vôùi dòch li taâm cuûa moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu sau leân men (khoâng chænh pH), nhieät ñoä 370C, hieáu khí vaø ñöôïc ño OD sau 21 giôø. Keát quaû trình baøy hình 4.10. E. coli haàu nhö khoâng phaùt trieån. Sinh khoái E. coli giaûm 99.5% vaø 99.1% khi nuoâi vôùi dòch moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu li taâm. Keát luaän vi khuaån L. acidophilus coù hoaït tính probiotics. 4.6.2. Keát quaû xaùc ñònh khaû naêng öùc cheá cuûa bacteriocins. Keát quaû ñònh löôïng H2O2 : Dòch leân men trong moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu ñöôïc thu taïi thôøi ñieåm 16 giôø vaø 18 giôø ñeå xaùc ñònh haøm löôïng H2O2. Keát quaû: dòch leân men sau khi boå sung caùc hoùa chaát nhö treân, cuoái cuøng boå sung chæ thò hoà tinh boät thì khoâng thaáy xuaát hieän maøu xanh ñaäm (keát hôïp giöõa hoà tinh boät vaø iode). Keát luaän vi khuaån L. acidophilus khoâng sinh H2O2. L. acidophilus khoâng sinh H2O2 trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh. Maãu ñoái chöùng thay dòch moâi tröôøng sau leân men baèng nöôùc caát boå sung 3 gioït H2O2. Dòch chieát döùa leân men. Maãu ñoái chöùng Hình 4.9: Moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu khoâng sinh H2O2 Keát quaû ñònh löôïng acid: khoâng ñònh löôïng ñöôïc haøm löôïng acid, do chæ thò maøu khoâng theå phaân bieät ñöôïc böôùc chuyeån maøu. Keát quaû xaùc ñònh khaû naêng öùc cheá cuûa bacteriocins : L. acidophilus khoâng sinh H2O2 trong quaù trình leân men trong caû hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu, do ñoù yeáu toá öùc cheá sinh tröôûng coøn laïi ñoái vôùi E. Coli coù theå laø acid höõu cô vaø bacteriocins. Keát quaû ñònh löôïng acid khoâng thaønh coâng neân toâi xaùc ñònh khaû naêng öùc cheá cuûa bacteriocins baèng caùch ñieàu chænh pH dòch leân men veà 6.0 ñeå loaïi boû taùc ñoäng cuûa acid. Dòch leân men caû hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu sau khi leân men ñöôïc chænh pH 6.0 baèng NaOH 1N, tieán haønh töông töï muïc 3.2.6.1 , keát quaû sinh khoái E.coli giaûm ñöôïc bieåu dieãn treân hình 4.10: Hình 4.10 : Đồ thị biểu diễn khả năng öùc chế vi sinh vật chỉ thị (E.coli) của dịch nuôi cấy L. acidophilus trên môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Keát quaû treân hình 4.10 cho thaáy khi khoâng chænh pH thì gaàn nhö 100% vi khuaån E.coli bò öùc cheá taêng tröôûng khi uû chuùng vôùi dòch nuoâi caáy L. acidophillus trong caû MRS laãn nöôùc chieát döùa toái öu sau li taâm. Traùi laïi, khi loaïi boû taùc ñoäng cuûa acid höõu cô baèng caùch chænh pH veà 6,0, E.coli uû vôùi dòch ly taâm L. acidophilus nuoâi trong moâi tröôøng MRS bò öùc cheá 27,5%; trong khi giaù trò naøy chæ laø 13,3 % neáu nuoâi caáy L. acidophilus trong moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu. Ñieàu ñoù cho thaáy vi khuaån L. acidophilus toång hôïp bacteriocins trong caû hai moâi tröôøng, nhöng trong moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu thì löôïng bacteriocin thaáp hôn so vôùi moâi tröôøng MRS. Gaàn ñaây, ngöôøi ta khaùm phaù ra raèng chaát caûm öùng Bacteriocin laø moät soá peptide [24]. Coù theå raèng trong moâi tröôøng MRS nguoàn nitô phong phuù hôn (ngoaøi cao naám men coøn coù peptone, cao thòt) cung caáp nhieàu daïng peptide trong ñoù coù chaát caûm öùng bacteriocins. Chaát caûm öùng naøy coù leõ khoâng nhieàu trong moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu (chæ chöùa cao naám men laø nguoàn nitô höõu cô duy nhaát). Nhö vaäy, khaû naêng khaùng vi sinh vaät chæ thò E. coli cuûa dòch nuoâi caáy L. acidophilus li taâm chuû yeáu laø do taùc ñoäng cuûa acid höõu cô. Tính toaùn kinh teá cho moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öùu Giaù thaønh saûn phaåm tính cho 1 lít moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu: Baûng 4.4: Tính toaùn giaù thaønh cho 1 lít moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu Thaønh phaàn moâi tröôøng Khoái löôïng Giaù caû (VND) Döùa 5 traùi 17500 Triamonium hydrogen citrate 7 g 1190 K2HPO4 1.8g 180 Cao naám men 20g 20000 Tween 80 1ml 160 Toång coäng thaønh tieàn: 39000 Trong 1 lít moâi tröôøng MRS löôïng sinh khoái thu ñöôïc laø 6.8 x 1011 cfu, trong khi ñoù sinh khoái thu ñöôïc ôû moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu laø 6.3. x 1011 cfu. Xeùt veà maët kinh teá moät lít moâi tröôøng MRS khoaûng 314000 (VND) vaø moâi tröôûng dòch chieát döùa toái öu laø 39000 (VND).Nhö vaäy khi söû duïng moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu thì chi phí giaûm 88% so vôùi giaù thaønh khi söû duïng moâi tröôøng MRS, löôïng sinh khoái thu ñöôïc cuûa hai moâi tröôøng laø töông ñöông nhau. Ñeå giaûm giaù thaønh vaø taän duïng löôïng ñöôøng coøn laïi sau khi thu sinh khoái thì dòch chieát döùa caàn ñöôïc pha loaõng ½ ñeå haøm löôïng ñöôøng ñaït 25 mg/ml, moâi tröôøng chæ coøn 30000 (VND)/l moâi tröôøng. Giaù thaønh giaûm 90 % so vôùi moâi tröôøng MRS. CHÖÔNG 5 - KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 5.1. Keát luaän 1. Trong hai nguoàn carbon reû tieàn laø ræ ñöôøng vaø dòch chieát döùa ñeå thay theá glucose trong moâi tröôøng MRS, dòch chieát döùa cho sinh khoái lôùn hôn. 2. Moâi tröôøng nuoâi caáy L. acidophilus toái öu vôùi dòch chieát döùa laø nguoàn carbon theo phöông phaùp keá hoaïch thöïc nghieäm ñaày ñuû caùc yeáu toá vaø phöông phaùp leo doác bao goàm caùc thaønh phaàn boå sung sau: Cao naám men : 2% Triamonium hydrogen citrate :0.7% K2HPO4: 0.18% Vôùi phöông phaùp nuoâi caáy tónh, tyû leä caáy gioáng 3%, nhieät ñoä nuoâi caáy 370C, sau 18 giôø, sinh khoái L. acidophilus thu ñöôïc ñaït 6.3 x10 8 cfu/ml So saùnh ñoäng hoïc nuoâi caáy L. acidophilus treân hai moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu cho thaáy: - Sinh khoái cöïc ñaïi ñaït 6,8 x 108 cfu/ml sau 16 giôø nuoâi caáy treân moâi tröôøng MRS, khoâng lôùn hôn ñaùng keå so vôùi sinh khoái thu ñöôïc treân moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu sau 18 giôø. - Giaù trò pH giaûm sau thôøi gian nuoâi caáy cuõng khoâng khaùc bieät ñaùng keå giöõa hai moâi tröôøng so saùnh (3,8 sau 16 giôø ñoái vôùi MRS vaø 3,9 sau 18 giôø nuoâi caáy vôùi dòch chieát döùa toái öu). - Toác ñoä söû duïng ñöôøng toång laø töông töï nhau giöõa moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu. Tuy nhieân, ôû moâi tröôøng dòch chieát döùa toái öu löôïng ñöôøng toång chæ giaûm moät nöûa so vôùi noàng ñoä ban ñaàu. 4. So saùnh hoaït tính khaùng vi sinh vaät chæ thò (E. coli) cuûa L. acidophilus nuoâi caáy treân moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu cho thaáy: - Trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh, H2O2 khoâng sinh ra trong caû hai moâi tröôøng khaûo saùt. - Taùc duïng khaùng vi sinh vaät chæ thò laø do acid höõu cô vaø bacteriocin daãn ñeán öùc cheá treân 99% taêng tröôûng vi sinh vaät chæ thò; trong ñoù taùc nhaân gaây öùc cheá chính laø acid lactic. - Taùc ñoäng öùc cheá vi sinh vaät chæ thò cuûa bacteriocin (neáu coù) laø 27,5% vaø 13,3% khi nuoâi L. acidophilus treân moâi tröôøng MRS vaø dòch chieát döùa toái öu töông öùng. Kieán nghò Sau khi hoaøn thaønh ñoà aùn toát nghieäp, toâi coøn muoán tieáp tuïc coù nhieàu nghieân cöùu saâu vaø môû roäng hôn nöõa veà toái öu hoùa moâi tröôøng cho söï phaùt trieån cuûa L.acidophilus ñoàng thôøi taêng tính khaùng cuûa L.acidophilus ñoái vôùi vi khuaån gaây beänh. Toâi coù moät soá ñeà nghò nhö sau: - Dòch nöôùc döùa caàn pha loaõng ñeå giaûm giaù thaønh saûn phaåm hoaëc söû duïng pheá thaûi nhaø maùy saûn xuaát döùa ñoùng hoäp hay nöôùc traùi caây. - Khaûo saùt ñoäng hoïc söû duïng nitô trong quaù trình nuoâi caáy. - Tieáp tuïc tìm nguoàn carbon, nitơ vaø vitamin reû tieàn cho L.acidophilus noùi rieâng vaø vi khuaån lactic noùi chung nhö dòch chieát malt, dòch chieát ñaäu naønh, dòch chieát gaïo löùc... - Nghieân cöùu söû duïng enzyme bromelin trong dòch chieát döùa: thuûy phaân protein ñaäu naønh cung caáp nguoàn nitô cho vi khuaån phaùt trieån. - Môû roäng vi sinh vaät chæ thò, khaûo saùt aûnh höôûng moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån lactic leân khaû naêng öùc cheá cuûa caùc taùc nhaân gaây beänh khaùc nhö : Salmonella spp, Listeria monocytogenes , Helicobacter pylori ...vaø rotavirus. Taøi lieäu tham khaûo [1]. Nguyeãn caûnh (2004), Quy hoaïch thöïc nghieäm, NXB Ñaïi Hoïc Quoác Gia TP.HCM. [2]. Buøi Aùi (2005), Coâng ngheä leân men öùng duïng trong coâng ngheä thöïc phaåm, NXB Ñaïi Hoïc Quoác Gia TP.HCM. [3]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng vaø coäng söï ( 1996), Vi sinh vaät coâng nghieäp - taäp 2, Tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa TP.HCM [4]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Nguyeãn Chuùc, Leâ Vaên Vieät Maãn (2006), Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm, Tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa TP.HCM [5]. Leâ Thanh Mai vaø coäng söï ( 2007), Caùc phöông phaùp phaân tích ngnaøh coâng ngheä leân men, NXB Khoa Hoïc vaø Kyõ Thuaät, Haø Noäi. [6]. Nguyeãn Baù Muøi (2002), Nghieân cöùu phuï phaåm döùa uû chua laøm thöùc aên gia suùc - luaän aùn Tieán só Noâng Nghieäp, Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Nghieäp 1. [7]. Leâ Haø Vaân Thö (2008), Nghieân cöùu quy trình taïo ñoà uoáng leân men töø gaïo löùc , Luaän vaên thaïc só, Tröôøng Ñaïi Hoïc Baùch Khoa TP.HCM [8]. Buøi Quang Teà (2006), Beänh cuûa toâm nuoâi vaø bieän phaùp phoøng trò, NXB Noâng Nghieäp, Haø Noäi. [9]. Phaïm Vaên Ty, Vuõ Nguyeân Thaønh ( 2007), Coâng ngheä sinh hoïc - taäp 5, NXB Giaùo Duïc. [10]. ALTIOK D ( 2004), Kinetic Modelling of Lactic Acid Production from Whey, Izmir Institute of Technology, Turkey [11]. Amed T vaø coäng söï ( 2006), Influence of Temperature on Growth Pattern of Lactococcus lactis, Streptococcus cremoris and Lactobacillus acidophilus Isolated from Camel Milk, Biotechnology 5 (4): 481-488. [12]. Arbakariya, B.A vaø coäng söï ( 2007), Optimization of Growth medium for Efficient Cultivation of Lactobacillus salivarius i 24 using Response Surface Method, Malaysian Journal of Microbiology, Vol 3(2) 2007, pp. 41-47 . [13]. Brunt. J vaø Austin. B ( 2005), Use of a probiotics to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), Journal of Fish Diseases 2005, 28, 693–701. [14]. Dworkin M vaø coäng söï ( 2006)ï, The Prokaryotes, Springer. [15]. Farzanfar A ( 2006), The use of probiotics in shrimp aquaculture, Willem van Leeuwen, Iran [16]. FULLE R (1989), Probiotics in man and animals, Journal of Applied Bacteriology 1989, 66, 365-378. [17]. Glenn R. Gibson vaø coäng söï ( 2007), Probiotics and prebiotics in infant nutrition, Proceedings of the Nutrition Society (2007), 66, 405–411. [18]. Gokhale D vaø coäng söï ( 2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan. 2008, p. 333–335. [19]. Goktepe I vaø coäng söï ( 2006), Probiotics in Food Safety and Human Health, Taylor & Francis. [20]. Inamoto T vaø Watanabe T ( 1998), Effect of a comercial preperation of lactobacilli and steptococclli on the performane weand piglets, Bull.Akita Pref. Coll. Agr. 24:69 - 72. [21]. Kumura. H vaø coäng söï ( 2004), Screening of Dairy Yeast Strains for Probiotics Applications, J. Dairy Sci. 87:4050–4056. [22]. Laitila. L vaø coäng söï ( 2004 ), Malt sprout extract medium for cultivation of Lactobacillus plantarum protective cultures, Letters in Applied Microbiology 2004, 39, 336–340. [23]. Liew Siew Ling vaø coäng söï ( 2006), Improved Production of Live Cells of Lactobacillus rhamnosus by Continuous Cultivation using Glucose-yeast Extract Medium, The Journal of Microbiology, August 2006, p.439-446. [24]. Marco J. van Belkum vaø coäng söï (2007), Structure–function relationship of inducer peptide pheromones involved in bacteriocin production in Carnobacterium maltaromaticum and Enterococcus faecium, Microbiology (2007), 153, 3660–3666. [25]. Michail S vaø Philip M. Sherman, Probiotics in Pediatric Medicine, Humana press, Totowa [26]. Michail S (2005), The Mechanism of Action of Probiotics, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Dayton, Ohio [27]. Nicole M de Roos vaø Martijn B Katan (2000), Effects of probiotics bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 19981–3, Am J Clin Nutr 2000;71:405–11. [28]. OMAR S vaø SORAYA SABRY (1991), Microbial biomass and protein production from whey, Journal of Islamic Academy of Sciences 4:2, 170-172. [29]. Parrondo J vaø coäng söï ( 2003), A Note – Production of Vinegar from Whey, Journal of the institute of brewing, 09(4), 356–358. [30]. Peter J. Huth, Charles I. Onwulata, (2008), Whey Processing, Functionality and Health Benefits, Wiley - Black well. [31]. Purivirojkul W vaø coäng söï ( 2006), Competition on Using Nutrient for Growth between Bacillus spp. and Vibrio harveyi, Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40 : 499 - 506. [32]. Rashid R ( 2008 ), Optimization and modeling of lactic acid production from pineapple waste, Universiti Teknologi Malaysia. [33]. Raceâvičiūtė-Stupelienė A vaø coäng söï (2007), Influence of probiotics preparation yeasture-w on the productivity and meat quality of broiler chickens, Biotechnology in Animal Husbandry 23 (5-6), p 543 - 550. [34]. Sanders ME vaø Klaenhammer† TR (2001 ), Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic, J. Dairy Sci. 84:319–331 [35]. Salminen S vaø coäng söï, Lactic Acid Bacteria, Marcel Dekker, New York. [36]. Senok A. C vaø coäng söï, Probiotics: facts and myths, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, College of Medicine and Medical Science, Arabian Gulf University. [37]. Sejong OH vaø coäng söï ( 1995 ), Optimizing Conditions for the Growth of Lactobacillus casei YIT 9018 in Tryptone-Yeast Extract-Glucose Medium by Using Response Surface Methodology, Applied and environmental microbiology, Nov. 1995, p. 3809–3814. [38]. Soo Kee Lee vaø coäng söï ( 2006), Aspergillus oryzae as Probiotic in Poultry - A Review, International Journal of Poultry Science 5 (1): 01-03. [39]. Tamime A (2005), Probiotic Dairy Products, Blackwell Publishing Ltd, USA [40]. VERSCHUERE L vaø coäng söï ( 2000), Probiotic Bacteria as Biological Control Agents, Microbiology and molecular biology reviews, Dec. 2000, p. 655–671. [41]. Vicente J vaø coäng söï (2007), Effect of Probiotic Culture Candidates on Salmonella Prevalence in Commercial Turkey House, epartment of Poultry Science, Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas. [42]. Universitaø Urbaniana ( 2005 ), Probiotic and prebiotic new food, Rome [43]. YUAN KUN LEE vaø SALMINEN S ( 2009), Handbook of probiotics and prebiotics, Wiley [44]. Wang Y vaø coäng söï ( 2005), Fermentation pH and Temperature Influence the Cryotolerance of Lactobacillus acidophilus RD758, J. Dairy Sci. 88:21–29. [45]. World Health Organization (WHO) (2001), Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, [46]. World Gastroenterology Organisation (2008), Probiotics and prebiotics. [47]. Zaazou. M.H. vaø coäng söï ( 2007), A Study of the Effect of Probiotic Bacteria on Level of Streptococcus Mutans in Rats, Journal of Applied Sciences Research, 3(12): 1835-1841.. [48]. Ye cherng industrial products, co., LTD, Probiotics in aquaculture. [49]. [50]. [51]. [52]. [53]. [54]. [55]. 4. Vi sinh vaät probiotic Lactobacillus: ._.