Tobramycin

PhÇn 1: Tæng quan 1.1. Tæng quan vÒ Tobramycin 1.1.1. C«ng thøc cÊu t¹o C18H37N5O9 PTL: 467.5 Tªn khoa häc: 4-O-(3-Amino-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21]. 1.1.2. TÝnh chÊt lý hãa Bét mµu tr¾ng hoÆc tr¾ng ngµ. DÔ tan trong n­íc, rÊt khã tan trong ethanol, thùc tÕ kh«ng tan trong cloroform vµ ether. Gãc quay cùc riªng [a]D20 : +1380 ®Õn +1480[7] 1.1.3. Nguån gèc ChiÕt xuÊt tõ m«i tr­êng nu«i cÊy Streptomyces tenebrarius, cã thÓ b¸n tæng hîp tõ kanamycin B [7]. 1.1.4. D­îc ®éng häc Tobramycin hÇu nh­ kh«ng hÊp thu qua ®­êng tiªu ho¸ nh­ng hÊp thu tèt qua ®­êng tiªm b¾p, tiªm tÜnh m¹ch. Thuèc Ýt liªn kÕt víi protein huyÕt t­¬ng. Do ph©n tö ph©n cùc m¹nh nªn khã ®i vµo c¸c m« kÓ c¶ n·o. Thuèc ®¹t nång ®é cao trong vá thËn. Khi sö dông cho phô n÷ mang thai, thuèc tÝch lòy trong thai g©y ®éc cho c¶ mÑ vµ con. Tobramycin ®µo th¶i chñ yÕu qua thËn nªn ph¶i gi¶m liÒu khi suy thËn, th­êng dùa vµo creatinin huyÕt thanh ®Ó tr¸nh ®éc tÝnh. HiÖn nay, tobramycin ®­îc dïng víi chÕ ®é mét liÒu cao vµ duy nhÊt trong ngµy. C¸ch dïng nµy cho thÊy hiÖu qu¶ ®iÒu trÞ cao h¬n vµ Ýt ®éc tÝnh h¬n so víi dïng liÒu nhá vµ nhiÒu lÇn trong ngµy nh­ tr­íc ®©y. §èi víi c¸c ca nÆng (nhiÔm Pseu. aeruginosa ë ng­êi gi¶m neutrophile vµ c¸c ca suy thËn) cÇn kho¶ng c¸ch liÒu dµi h¬n 24 giê. Thêi gian b¸n th¶i cña tobramycin: 2 - 5 giê [6] 1.1.5. T¸c dông vµ c¬ chÕ t¸c dông Tobramycin lµ mét kh¸ng sinh nhãm aminoglycosid cã t¸c dông trªn nhiÒu vi khuÈn Gr (-) hiÕu khÝ vµ mét sè vi khuÈn Gr (+) hiÕu khÝ. Thuèc kh«ng cã t¸c dông víi Chlamydia, nÊm, virus vµ ®a sè c¸c vi khuÈn yÕm khÝ. Tobramycin rÊt gièng gentamycin vÒ tÝnh chÊt sinh häc vµ ®éc tÝnh: chóng cã cïng nöa ®êi th¶i trõ, nång ®é ®Ønh trong huyÕt thanh, Ýt liªn kÕt víi protein, thÓ tÝch ph©n bè vµ sù bµi tiÕt chñ yÕu qua läc ë cÇu thËn. §iÓm quan träng nhÊt cña tobramycin lµ cã ho¹t tÝnh ®èi víi phÇn lín c¸c chñng Pseudomonas aeruginose, m¹nh h¬n c¶ gentamycin. C¬ chÕ t¸c dông: Tobramycin øc chÕ sù tæng hîp protein ë c¸c vi khuÈn nhËy c¶m b»ng c¸ch g¾n kh«ng thuËn nghÞch víi c¸c tiÓu ph©n 30S cña ribosom [2], [11]. 1.1.6. ChØ ®Þnh §­îc chØ ®Þnh trong c¸c bÖnh nhiÔm khuÈn nÆng ®e däa tíi tÝnh m¹ng, ®Æc biÖt víi c¸c bÖnh mµ nguyªn nh©n ch­a râ rµng hoÆc bÞ nhiÔm khuÈn huyÕt do vi khuÈn Gr (-). Trong ®iÒu trÞ c¸c bÖnh nhiÔm khuÈn nÆng, hoÆc trong c¸c bÖnh nhiÔm khuÈn nÆng toµn th©n do Pseudomonas sp. g©y ra, tobramycin cã thÓ dïng phèi hîp víi mét kh¸ng sinh nhãm beta-lactam. Trong bÖnh viªm néi t©m m¹c do Streptococcus faecalis hoÆc alpha - Streptococcus g©y ra, cã thÓ dïng tobramycin phèi hîp víi ampicilin hoÆc benzylpenicilin nh­ng ph¶i tiªm riªng rÏ. [2] 1.1.7. Chèng chØ ®Þnh Ng­êi cã tiÒn sö dÞ øng víi c¸c kh¸ng sinh lo¹i aminoglycosid, ng­êi nghe kÐm vµ ng­êi cã bÖnh thËn. [2] 1.1.8. D¹ng bµo chÕ vµ liÒu l­îng Tobramycin sulphat: Dung dÞch tiªm b¾p, tiªm tÜnh m¹ch 40 mg/ml (ng­êi lín), 10 mg/ml (trÎ em). Bét pha tiªm 30 - 40 mg/lä. Lä 5 ml 0,3 % ®Ó nhá m¾t. Tuýp 3,5 g mì tra m¾t 0,3 %. D¹ng thuèc hÝt qua ®­êng miÖng b»ng m¸y khi dïng ®Ó ®iÒu trÞ nhiÔm P. aeruginosa ®­êng h« hÊp ë bÖnh nh©n bÞ x¬ nang hãa. [11] 1.2. Mét sè ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Tobramycin 1.2.1. §Þnh l­îng tobramycin b»ng ph­¬ng ph¸p vi sinh 1.2.1.1. Ph­¬ng ph¸p 1 [15] - Chñng vi khuÈn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung dÞch ®Öm phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - M«i tr­êng ®Þnh l­îng: Pepton : 5,0 g Cao thÞt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Th¹ch : 15,0 - 20,0 g N­íc cÊt : 1000 ml pH sau khi tiÖt trïng : 7,8 ± 0,2 - ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn vµ thö sau ®ã tiÕn hµnh thö vµ tÝnh kÕt qu¶ theo [15] 1.2.1.2. Ph­¬ng ph¸p 2 [3] - Chñng vi khuÈn: Bacillus pumilus NCTC 8241. - Dung dÞch ®Öm phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - M«i tr­êng ®Þnh l­îng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thÞt : 1,5 g Th¹ch : 15,0 g N­íc cÊt : 100 ml pH sau khi tiÖt trïng : 8,2 ± 0,2 - ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn vµ thö C©n chÝnh x¸c kho¶ng 25,0 mg tobramycin hßa tan trong dung dÞch ®Öm phosphat pH 8,0 ®Ó cã nång ®é tobramycin chÝnh x¸c kho¶ng 10 IU/ml; 20 IU/ml vµ 40 IU/ml. - TiÕn hµnh thö vµ tÝnh to¸n kÕt qu¶ theo ph­¬ng ph¸p ho¹t lùc kh¸ng sinh - D§VN III. 1.2.1.3. Ph­¬ng ph¸p 3:[14], [20] - X¸c ®Þnh ho¹t lùc kh¸ng sinh cña tobramycin b»ng ph­¬ng ph¸p vi sinh vËt theo BP 2000 hay JP14 - Chñng vi khuÈn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - M«i tr­êng nu«i cÊy : M«i tr­êng ®Æc - Dung dÞch chuÈn C©n chÝnh x¸c mét l­îng tobramycin chuÈn, t­¬ng ®­¬ng kho¶ng 25 mg (hiÖu lùc), hoµ tan trong dung dÞch ®Öm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thµnh chÝnh x¸c 25 ml vµ ®ã chÝnh lµ dung dÞch chuÈn gèc. Gi÷ dung dÞch chuÈn gèc ë nhiÖt ®é tõ 5oC ®Õn 15oC vµ sö dông trong vßng 30 ngµy. Pha lo·ng dung dÞch b»ng dung dÞch chuÈn ®Öm phosphat 0,1M, pH 8 ®Ó ®­îc c¸c dung dÞch cã nång ®é 8mg/ml vµ 2mg/ml (theo hiÖu lùc). - Dung dich thö: C©n chÝnh x¸c mét l­îng tobramycin, t­¬ng ®­¬ng kho¶ng 25 mg (hiÖu lùc), hoµ tan trong dung dÞch ®Öm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thµnh chÝnh x¸c 25ml. Pha lo·ng dung dÞch b»ng dung dÞch chuÈn ®Öm phosphat 0,1M, pH 8 ®Ó ®­îc c¸c dung dÞch cã nång ®é 8mg/ml vµ 2mg/ml (theo hiÖu lùc). 1.2.2. §Þnh l­îng tobramycin b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS 1.2.2.1. Ph­¬ng ph¸p 1: [4] C©n mét l­îng tobramycin sulfat t­¬ng øng víi kho¶ng 0,3 g tobramycin nguyªn liÖu , cho vµo b×nh ®Þnh møc cã dung tÝch 100 ml, bæ sung n­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ ®Õn v¹ch, trén ®Òu. LÊy 1 ml dung dÞch nµy cho vµo b×nh ®Þnh møc cã dung tÝch 20 ml, thªm 5 ml dung dÞch NaOH 0,01N, 2 ml dung dÞch KMnO4. Dung dÞch võa pha ®em ®un c¸ch thuû ë 400C trong 60 phót. Song song tiÕn hµnh ®iÒu chÕ dung dÞch chuÈn b»ng c¸ch dïng chÊt ®èi chiÕu tobramycin. MÉu tr¾ng tiÕn hµnh nh­ mÉu thö nh­ng kh«ng cã tobramycin. Sau khi ®un c¸ch thuû ë 400C, thêi gian 60 phót, ®em ®o mËt ®é quang cña c¸c dung dÞch nµy ë b­íc sãng 425 nm, cuvet dµy 1cm. 1.2.2.2. Ph­¬ng ph¸p 2: [19] Dùa trªn c¬ së t¹o ra s¶n phÈm mÇu xanh víi 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid vµ FeCl3. S¶n phÈm cã ®é hÊp thô lín nhÊt ë 645 nm. §Þnh luËt Lambert-Beer ®­îc ¸p dông trong kho¶ng nång ®é tõ 50-500 mUI/ml. 1.2.3 §Þnh l­îng tobramycin b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC 1.2.2.1 Ph­¬ng ph¸p 1 [14] - Cét styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8mm). - NhiÖt ®é cét: 55 0C. - Pha ®éng: Hçn hîp pha trong 1l n­íc ®· lo¹i CO2 gåm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran vµ 50 ml dung dÞch kali dihydrophosphat 0,2 M ®· ®­îc chØnh pH vÒ 3,0 b»ng acid phosphoric. - Tèc ®é dßng: 1 ml/phót. - Dung dÞch thªm vµo sau cét: Dung dÞch natri hydroxyd 2% pha trong n­íc ®· lo¹i CO2. Tèc ®é 0,3 ml/phót. - Detector: Detector ampe kÕ hoÆc c¸c thiÕt bÞ t­¬ng tù. - ThÓ tÝch tiªm: 20 ml. - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: 0,1 mg/ml. 1.2.2.2 Ph­¬ng ph¸p 2 [20], [23] - Cét RP 18 (3,9 mm x 30 cm). - Pha ®éng: Hßa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong kho¶ng 800 ml n­íc, thªm vµo dung dÞch nµy 20 ml dung dÞch acid sulfuric 1N, sau ®ã pha lo·ng b»ng acetonitril tíi 2000 ml, l¾c ®Òu. - Thuèc thö 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dÞch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%. - Tèc ®é dßng: 1,2 ml/phót. - Detector UV: 365 nm. - ThÓ tÝch tiªm: 20 ml. - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: Kho¶ng 0,22 mg/ml trong dung dÞch acid sulfuric 0,004 N. - C¸c dung dÞch chuÈn vµ thö ®­îc t¹o dÉn xuÊt víi c¸c thuèc thö 2,4-dinitrofluorobenzen vµ tris (hydroxymethyl) aminomethan tr­íc khi tiªm s¾c ký. 1.2.2.3 Ph­¬ng ph¸p 3 [15] - Cét Purospherâ STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 mm, Merck). - Pha ®éng: Acetonitril - n­íc (50:50). - Tèc ®é dßng: 1,3 ml/phót. - Detector UV: 230 nm. - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: Kho¶ng 5 mg/ml trong n­íc. - Dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch thö ®­îc t¹o dÉn xuÊt víi dung dÞch thuèc thö 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ë 700C. 1.2.2.4 Ph­¬ng ph¸p 4 [16] - Cét Xterraâ RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 mm). - NhiÖt ®é cét: 30 0C. - Pha ®éng A: Thªm 0,7 ml dung dÞch amoni hydroxyd 28 - 30 % vµo 1 lÝt n­íc Milli - Qâ. Sö dông dung dÞch natri hydroxyd 2,5 N ®Ó chØnh pH pha ®éng A ®Õn 11,0. - Pha ®éng B: Acetonitril. - TiÕn hµnh s¾c ký theo ch­¬ng tr×nh gradient dung m«i nh­ sau: Thêi gian (phót) Pha ®éng A (%) Pha ®éng B (%) 0 100 0 10 0 100 - Tèc ®é dßng: 0,2 ml/phót. - Detector: Khèi phæ. - ThÓ tÝch tiªm: 4ml. - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: Kho¶ng 0,35 mg/ml trong dung dÞch NaCl 0,9 %. 1.2.2.5 Ph­¬ng ph¸p 5 [15] - Cét Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5mm). - Pha ®éng: Acetonitril - ®Öm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38] - Tèc ®é dßng: 2,5 ml/phót. - Thuèc thö t¹o dÉn chÊt: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic. - Detector UV: 340 nm. - ThÓ tÝch tiªm: 20 ml. - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: Kho¶ng 0,02 mg/ml trong ®Öm phosphat pH 7,4. - Dung dÞch chuÈn vµ thö ®­îc t¹o dÉn xuÊt víi thuèc thö acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ë 70 0C. 1.2.2.6. Ph­¬ng ph¸p 6 [5] - Cét : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5mm) - Detector huúnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm - Tèc ®é dßng: 1ml/phót - Tèc ®é thuèc thö: 0,7ml/phót - ThÓ tÝch tiªm: 20 mm - Pha ®éng: Hoµ tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat vµ 1ml acid acetic b¨ng trong 1000 ml n­íc, l¾c ®Òu, läc qua mµng läc 0,45mm. - Thuèc thö t¹o dÉn xuÊt sau cét: Hoµ tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100 ml methanol, thªm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, l¾c 3 phót. Thªm 1,5 ml dung dÞch polyoxyethylen lauryl ether 12% vµ 350 ml dung dÞch ®Öm borat pH 10,4 l¾c ®Òu. - Dung dÞch ®Öm borat pH 10,4: Hoµ tan 24,64 g acid boric trong 900 ml n­íc. §iÒu chØnh pH ®Õn 10,4 b»ng dung dÞch NaOH 40%, thªm n­íc tíi võa ®ñ 1000 ml, l¾c ®Òu, läc qua mµng läc 0,45 mm (pha theo BP 2005). 1.2.2.7. Ph­¬ng ph¸p 7 [9] Dung dÞch thö C©n chÝnh x¸c kho¶ng 20,0 mg tobramycin nguyªn liÖu cho vµo b×nh ®Þnh møc 20,0 ml. Hßa tan vµ pha lo·ng b»ng n­íc võa ®ñ ®Õn v¹ch. LÊy chÝnh x¸c 5,0 ml dung dÞch trªn cho vµo b×nh ®Þnh møc 20,0 ml. Thªm 0,5 ml thuèc thö X, ®em ®un c¸ch thñy ë 80 0C trong 60 phót. Thªm dung m«i võa ®ñ ®Õn v¹ch, l¾c ®Òu. Läc qua mµng läc 0,45 mm. Dung dÞch chuÈn (®èi chiÕu) TiÕn hµnh t­¬ng tù nh­ dung dÞch thö nh­ng thay tobramycin nguyªn liÖu b»ng tobramycin chuÈn (®èi chiÕu). - Cét s¾c ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5mm). - Detector UV : λ = 215 nm. - Pha ®éng: Methanol : §Öm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80 - ThÓ tÝch tiªm: 10 ml. - Tèc ®é dßng: 0,6 ml/phót. - NhiÖt ®é ph©n tÝch: NhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm. * NhËn xÐt: Qua c¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng nªu trªn, chóng t«i nhËn thÊy: §Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p vi sinh: RÎ, ®¬n gi¶n, kh«ng cÇn trang thiÕt bÞ phøc t¹p nh­ng cã nh­îc ®iÓm lín lµ mÊt nhiÒu thêi gian vµ kÐm dÆc hiÖu do sù cã mÆt cña c¸c chÊt kh¸ng vi sinh vËt kh¸c, tÝnh chÝnh x¸c kh«ng cao. §Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p ®o ®é hÊp thô UV-VIS: Cã ®é chÝnh x¸c cao, tiÕn hµnh ®¬n gi¶n, kh«ng yªu cÇu m¸y mãc qu¸ phøc t¹p, ho¸ chÊt th«ng dông vµ cã thÓ ¸p dông ®Þnh l­îng ë c¸c c¬ së kiÓm nghiÖm trong c¶ n­íc. Tuy nhiªn, nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p lµ: TÝnh ®Æc hiÖu ch­a cao (sù cã mÆt cña chÊt kh¸c cã kh¶ n¨ng hÊp thô tö ngo¹i kh¶ kiÕn nh­ benzalkonium clorid, mét chÊt b¶o qu¶n hay dïng, sÏ ¶nh h­ëng kÕt qu¶ ®Þnh l­îng), hoÆc ph¶i dïng thuèc thö nhËp ngo¹i ®Ó t¹o dÉn chÊt. §Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC : ­u ®iÓm: Nãi chung cã tÝnh ®Æc hiÖu cao, t¸ch riªng ®­îc ho¹t chÊt. Nh­îc ®iÓm: TiÕn hµnh phøc t¹p, ®ßi hái cã trang thiÕt bÞ vµ thuèc thö ®¾t tiÒn v× detector UV th­êng kh«ng dïng ®­îc mµ th­êng ph¶i t¹o dÉn chÊt. Ph­¬ng ph¸p HPLC pha ®¶o víi detector UV rÊt hay sö dông ®Ó ph©n tÝch c¸c hîp chÊt ph©n cùc vµ hÊp thô UV. Nh­ng víi c¸c hîp chÊt hÊp thô UV yÕu nh­ tobramycin th× th­êng ph¶i t¹o dÉn chÊt, hoÆc ph¶i sö dông detector lo¹i ®Æc biÖt ®¾t tiÒn. V× vËy, víi c¸c trang thiÕt bÞ s½n cã ë phßng thÝ nghiÖm, chóng t«i ®Æt vÊn ®Ò nghiªn cøu x©y dùng mét quy tr×nh ®Þnh l­îng tobramycin b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC ®¬n gi¶n, dÔ thùc hiÖn vµ kinh phÝ thÊp h¬n, kh«ng sö dông thuèc thö t¹o dÉn xuÊt nh­ c¸c ph­¬ng ph¸p hiÖn nay víi hi väng cã thÓ ®­a vµo sö dông trong c«ng t¸c kiÓm nghiÖm - gãp phÇn qu¶n lý chÊt l­îng c¸c s¶n phÈm chøa tobramycin. 1.3. Tæng quan vÒ ph­¬ng ph¸p s¾c kÝ láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) 1.3.1. Nguyªn t¾c Ph­¬ng ph¸p HPLC lµ 1 ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hãa lý, dïng ®Ó t¸ch vµ ®Þnh l­îng c¸c thµnh phÇn trong hçn hîp dùa trªn ¸i lùc kh¸c nhau gi÷a c¸c chÊt víi 2 pha lu«n tiÕp xóc nh­ng kh«ng hßa lÉn vµo nhau: Pha tÜnh (trong cét hiÖu n¨ng cao) vµ pha ®éng (dung m«i röa gi¶i). Khi dung dÞch cña hçn hîp c¸c chÊt cÇn ph©n tÝch ®­a vµo cét, chóng sÏ ®­îc hÊp phô hoÆc ph©n bè vµo pha tÜnh tïy thuéc vµo b¶n chÊt cña cét vµ cña chÊt cÇn ph©n tÝch. Khi ta b¬m dung m«i pha ®éng vµo cét th× tïy thuéc vµo ¸i lùc cña c¸c chÊt víi hai pha, chóng sÏ di chuyÓn qua cét víi vËn tèc kh¸c nhau dÉn ®Õn sù ph©n t¸ch. C¸c chÊt sau khi ra khái cét sÏ ®­îc ph¸t hiÖn bëi bé phËn ph¸t hiÖn gäi lµ detector vµ ®­îc chuyÓn qua bé xö lý kÕt qu¶. KÕt qu¶ cuèi cïng ®­îc hiÓn thÞ trªn mµn h×nh hoÆc ®­a ra m¸y in [8]. 1.3.2. C¬ së lý thuyÕt Qu¸ tr×nh ph©n t¸ch trong kü thuËt HPLC lµ do qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ ph©n bè cña c¸c chÊt tan gi÷a 2 pha kh¸c nhau. Khi pha ®éng di chuyÓn víi mét tèc ®é nhÊt ®Þnh qua cét s¾c ký sÏ ®Èy c¸c chÊt tan bÞ pha tÜnh l­u gi÷ ra khái cét. Tïy theo b¶n chÊt pha tÜnh, chÊt tan vµ pha ®éng mµ qu¸ tr×nh röa gi¶i t¸ch ®­îc c¸c chÊt khi ra khái cét s¾c ký. NÕu ghi qu¸ tr×nh t¸ch s¾c ký, chóng ta cã s¾c ®å [8], [11]. 1.3.3. Nguyªn t¾c cÊu t¹o hÖ thèng HPLC HÖ thèng HPLC ®¬n gi¶n vµ ®ñ ®Ó lµm viÖc theo kü thuËt HPLC bao gåm 6 bé phËn chÝnh sau: 1.3.3.1. HÖ thèng b¬m §Ó b¬m pha ®éng vµo cét t¸ch. B¬m nµy ph¶i ®iÒu chØnh ®­îc ¸p suÊt (0 - 400 bar) 1.3.3.2. B×nh chøa dung m«i vµ hÖ thèng xö lý dung m«i B×nh chøa dung m«i th­êng b»ng thñy tinh hoÆc thÐp kh«ng gØ. Dung m«i ch¹y s¾c ký ®­îc läc qua mµng läc (th­êng mµng läc cì lç 0,45 mm ) vµ ®uæi khÝ hßa tan. 1.3.3.3. HÖ tiªm mÉu §Ó ®­a mÉu ph©n tÝch vµo cét. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p tiªm mÉu kh¸c nhau, ®¬n gi¶n nhÊt lµ sö dông mét van tiªm. Trong c¸c hÖ thèng s¾c ký hiÖn ®¹i lµ hÖ tiªm mÉu tù ®éng. MÉu thö (d¹ng láng hay d¹ng r¾n) ®Òu ph¶i hoµ tan trong dung m«i thÝch hîp råi läc qua mµng läc 0,45mm tr­íc khi tiªm. 1.3.3.4. Cét s¾c ký láng HPLC Cét ®­îc chÕ t¹o b»ng thÐp ®Æc biÖt tr¬ víi hãa chÊt, chÞu ®­îc víi ¸p suÊt cao ®Õn vµi tr¨m bar. - ChiÒu dµi cét: 10, 15, hoÆc 25 cm; thÝch hîp víi c¸c tiÓu ph©n pha tÜnh cã ®­êng kÝnh rÊt nhá (3, 5, 10 mm). - §­êng kÝnh cét: 4 hoÆc 4,6 mm. Nãi chung, cét HPLC cã tuæi thä kh¸ dµi nÕu ta sö dông ®óng c¸ch. NÕu sö dông kh«ng ®óng c¸ch tuæi thä cña cét sÏ gi¶m. VÝ dô dung m«i cã tÝnh chÊt acid m¹nh hoÆc base m¹nh hoÆc tiªm liªn tiÕp c¸c mÉu sinh häc hay nguyªn liÖu bÈn th× tuæi thä cña cét sÏ bÞ gi¶m. 1.3.3.5. Detector trong HPLC Lµ bé phËn ph¸t hiÖn chÊt ph©n tÝch, tïy theo b¶n chÊt cña chÊt cÇn ph©n tÝch mµ sö dông detector thÝch hîp. Detector hay sö dông lµ detector hÊp thô UV - VIS. Nguyªn lý ho¹t ®éng cña detector UV - VIS dùa trªn nguyªn lý ho¹t ®éng cña ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô. Ngoµi ra cßn cã detector khóc x¹, huúnh quang, ®iÖn hãa. 1.3.3.6. ThiÕt bÞ hiÓn thÞ kÕt qu¶ Cã nhiÒu lo¹i, nh­ng ®¬n gi¶n vµ phæ biÕn nhÊt lµ m¸y tù ghi c¸c tÝn hiÖu d­íi d¹ng pic [8], [14]. S¬ ®å khèi hÖ thèng HPLC ®­îc tæng qu¸t ë h×nh 1.1 Cét Binh chøa pha ®éng B¬m Detector Bé phËn tù ghi Van tiªm mÉu H×nh 1.1: S¬ ®å khèi tæng qu¸t hÖ thèng HPLC 1.3.4. C¸c th«ng sè ®Æc tr­ng cña qu¸ tr×nh s¾c ký H×nh 1.2: S¾c ký ®å cña 2 chÊt vµ c¸c th«ng sè ®Æc tr­ng KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh t¸ch c¸c chÊt ®­îc detector ph¸t hiÖn, phãng ®¹i vµ ghi thµnh s¾c ký ®å víi c¸c th«ng sè: * tR (Thêi gian l­u): thêi gian kÓ tõ khi chÊt ph©n tÝch ®­îc b¬m vµo cét cho ®Õn khi ®­îc ph¸t hiÖn ë nång ®é cùu ®¹i cña nã. * t0 (Thêi gian chÕt): thêi gian cÇn thiÕt ®Ó pha ®éng ch¶y qua hÖ thèng s¾c ký. * tR’ (Thêi gian l­u thùc): tR’ = tR - t0 * W0.5 : §é réng cña pic ë nöa chiÒu cao. * Wb : §é réng ë ®¸y pic. Thêi gian l­u lµ th«ng tin vÒ mÆt ®Þnh tÝnh cña s¾c ®å, nã lµ mét h»ng sè ®èi víi mét chÊt nhÊt ®Þnh khi tiÕn hµnh s¾c ký trong ®iÒu kiÖn kh«ng ®æi. 1.3.4.1. HÖ sè dung l­îng k’ [8],[14] NÕu k' nhá th× tR còng nhá vµ sù t¸ch kÐm. Trong thùc tÕ k' n»m trong kho¶ng 2 - 5 lµ tèt nhÊt. Hai chÊt chØ ®­îc t¸ch ra khái nhau nÕu chóng cã gi¸ trÞ kh¸c nhau. Trong ph©n tÝch th­êng chän cét, pha ®éng vµ c¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch sao cho: 1 < k' < 8 1.3.4.2. §é chän läc a (selectivity - factor) a= (k2' > k1' ) [8], [14] a kh¸c 1 cµng nhiÒu th× kh¶ n¨ng t¸ch cµng râ rµng, tèi ­u tõ 1,5 ®Õn 2. 1.3.4.3. §é ph©n gi¶i (resolution) §Æc tr­ng cho møc ®é t¸ch hai chÊt ra khái nhau trªn mét ®iÒu kiÖn s¾c ký. §é ph©n gi¶i cña 2 pic ë c¹nh nhau ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: [8], [14] §é ph©n gi¶i c¬ b¶n ®¹t ®­îc khi R = 1,5 1.3.4.4. HÖ sè bÊt ®èi AF Cho biÕt møc ®é c©n ®èi cña pic s¾c ký, nã ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: [8], [14] Trong ®ã: W1/20: lµ chiÒu réng cña pic ®­îc ®o ë 1/20 chiÒu cao cña pic a: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng vu«ng gãc h¹ tõ ®Ønh pic ®Õn mÐp ®­êng cong phÝa tr­íc t¹i vÞ trÝ 1/20 chiÒu cao cña pic. Trong phÐp ®Þnh l­îng, yªu cÇu: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22]. 1.3.4.5. Sè ®Üa lý thuyÕt N §Æc tr­ng cho hiÖu lùc cét. N = 16 hay N=5,54[8], [12], [22] NÕu gäi L lµ chiÒu cao cét s¾c ký, th× chiÒu cao cña ®Üa lý thuyÕt H ®­îc tÝnh b»ng c«ng thøc: 1.3.5. C¬ së lý thuyÕt cña viÖc lùa chän ®iÒu kiÖn s¾c ký 1.3.5.1. Lùa chän cét (pha tÜnh) [12], [18] Pha tÜnh trong HPLC lµ chÊt nhåi cét cã nhiÖm vô t¸ch mét hçn hîp cã nhiÒu thµnh phÇn. Nã lµ mét chÊt r¾n xèp cã kÝch th­íc h¹t rÊt nhá, ®­êng kÝnh cì h¹t tõ 3 - 10 mm, diÖn tÝch bÒ mÆt riªng tõ 50 - 500 m2/g. Yªu cÇu pha tÜnh trong HPLC: Ph¶i tr¬ vµ bÒn v÷ng trong m«i tr­êng HPLC. Cã kh¶ n¨ng t¸ch mét hçn hîp chÊt tan nhÊt ®Þnh. TÝnh chÊt bÒ mÆt æn ®Þnh. C©n b»ng ®éng häc cña sù t¸ch diÔn ra nhanh vµ lÆp l¹i tèt. Cì h¹t ph¶i ®ång nhÊt. Pha tÜnh th­êng ®­îc chÕ t¹o trªn nÒn silica (SiO2), nÒn oxyd nh«m (Al2O3), nÒn hîp chÊt cao ph©n tö (cellulose) hay trªn nÒn m¹ch carbon. Trong s¾c ký hÊp phô, pha tÜnh trªn nÒn silica cã nhiÒu ­u ®iÓm vµ sö dông nhiÒu nhÊt. Cã thÓ ph©n lo¹i chÊt nhåi cét theo gèc siloxan: | 0 CH3 | | ¾ Si ¾ 0 ¾ Si ¾ R | | 0 CH3 | * R lµ nhãm ph©n cùc (­a n­íc): nhãm hydroxyl (-0H) hoÆc c¸c alkylamin (-CH2NH2), alkylnitril (-CH2CN). Lo¹i nµy sö dông lµm pha tÜnh trong s¾c ký pha thuËn ®Ó ph©n tÝch c¸c chÊt Ýt hoÆc kh«ng ph©n cùc. * R lµ c¸c nhãm Ýt ph©n cùc: c¸c nhãm octyl, octadecyl, phenyl ®­îc chÕ b»ng c¸ch alkyl hãa c¸c nhãm OH trªn bÒ mÆt silica trung tÝnh b»ng c¸c gèc alkyl - R cña m¹ch carbon (C2, C8, C18) hay c¸c gèc carbon vßng (phenyl). Do c¸c nhãm OH th©n n­íc ®­îc thay b»ng c¸c gèc R kþ n­íc nªn bÒ mÆt trë nªn Ýt ph©n cùc. Silica ®· alkyl hãa ®­îc sö dông trong s¾c ký pha ®¶o ®Ó ph©n tÝch c¸c chÊt ph©n cùc, Ýt ph©n cùc hay s¾c ký cÆp ion. 1.3.5.2. Lùa chän pha ®éng cho HPLC [12], [18] Pha ®éng lµ dung m«i ®Ó röa gi¶i chÊt ph©n tÝch ra khái cét s¾c ký, lµ yÕu tè thø hai quyÕt ®Þnh hiÖu suÊt t¸ch cña mét hçn hîp. Pha ®éng cã thÓ lµ n­íc, dung m«i h÷u c¬ hay hçn hîp dung m«i theo tû lÖ nhÊt ®Þnh. Pha ®éng trong HPLC ¶nh h­ëng tíi rÊt nhiÒu th«ng sè cña qu¸ tr×nh s¾c ký nh­ ®é chän läc a, thêi gian l­u tR, hiÖu lùc t¸ch cña cét, ®é ph©n gi¶i RS , ®é réng cña pic s¾c ký ... ChÝnh v× vËy viÖc lùa chän pha ®éng thÝch hîp lµ rÊt quan träng. Yªu cÇu cña pha ®éng: Ph¶i tr¬ víi pha tÜnh. Hßa tan ®­îc chÊt cÇn ph©n tÝch. BÒn v÷ng theo thêi gian. Cã ®é tinh khiÕt cao. Nhanh ®¹t c©n b»ng trong qu¸ tr×nh s¾c ký. Phï hîp víi detector. Cã tÝnh kinh tÕ vµ ®¶m b¶o m«i tr­êng. Trong s¾c ký pha thuËn, pha ®éng th­êng lµ c¸c dung m«i h÷u c¬ Ýt ph©n cùc (kþ n­íc) nh­: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform... C¸c pha ®éng nµy th­êng ®­îc b·o hoµ. Trong s¾c ký pha ®¶o, pha ®éng lµ hÖ dung m«i h÷u c¬ ph©n cùc nh­: n­íc, methanol, acetonitril... hay hçn hîp cña chóng. C¸c dung m«i nµy cã thÓ hßa tan thªm mét l­îng nhá acid hay base h÷u c¬. Bèn yÕu tè chÝnh cÇn chó ý khi lùa chän pha ®éng: B¶n chÊt cña dung m«i ®Ó ch¹y pha ®éng. Thµnh phÇn cña c¸c chÊt trong pha ®éng. pH cña pha ®éng. Tèc ®é dßng cña pha ®éng. 1.3.5.3. Chän ®Öm pH Trong s¾c ký t¹o cÆp ion, s¾c ký trao ®æi ion, s¾c ký hÊp phô mµ chÊt tan cã tÝnh acid hay base th­êng ph¶i thªm ®Öm vµo pha ®éng ®Ó æn ®Þnh pH cho qu¸ tr×nh s¾c ký. Gi¸ trÞ pH thÝch hîp sÏ lµm t¨ng hiÖu lùc t¸ch cña s¾c ký [12], [18]. 1.3.5.4. Tèc ®é dßng Sau khi cã pha tÜnh, pha ®éng, pH thÝch hîp th× mét yÕu tè cÇn lùa chän ®Ó qu¸ tr×nh t¸ch tèt h¬n lµ tèc ®é dßng [12], [18]. 1.3.6. C¸ch ®¸nh gi¸ pic * §¸nh gi¸ diÖn tÝch pic: DiÖn tÝch cña mét chÊt t­¬ng øng víi tæng l­îng chÊt ®ã. §Ó tÝnh diÖn tÝch pic, hiÖn nay ng­êi ta th­êng dïng m¸y tÝch ph©n ®iÖn tö g¾n víi m¸y vi tÝnh (sai sè kho¶ng 0,5 %) hoÆc m¸y ph©n tÝch c¬ häc (sai sè 1,3 %). Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ dïng cho c¸c pic kh«ng bÞ tr«i ®­êng nÒn vµ c¶ pic cã ®­êng nÒn bÞ tr«i. Ph­¬ng ph¸p nµy chØ cÇn ®iÓm ®Çu ®iÓm cuèi cña pic ®­îc nhËn ra chÝnh x¸c vµ cho vµ cho kÕt qu¶ tèt víi nång ®é võa, trung b×nh vµ cao. * §¸nh gi¸ chiÒu cao pic: Khi pic cã d¹ng kh«ng ®æi th× chiÒu cao pic (kho¶ng c¸ch gi÷a ®­êng nÒn vµ ®Ønh pic) lµ mét ®¹i l­îng tû lÖ víi diÖn tÝch pic vµ nã còng cã thÓ dïng ®Ó ®¸nh gi¸ phæ. Ph­¬ng ph¸p chØ ¸p dông khi c¸c chØ sè k' lµ h»ng ®Þnh. 1.3.7. øng dông cña HPLC S¾c ký nãi chung vµ HPLC nãi riªng cã ba øng dông chÝnh: 1.3.7.1. §Þnh tÝnh vµ thö ®é tinh khiÕt: Thêi gian l­u cña chÊt thö trªn s¾c ®å ph¶i t­¬ng øng víi thêi gian l­u cña chÊt chuÈn ®èi chiÕu trªn s¾c ký ®å. 1.3.7.2. S¾c ký ®iÒu chÕ: Qua qóa tr×nh s¾c ký c¸c chÊt ®­îc t¸ch ra vµ dÞch röa gi¶i ®­îc høng riªng råi cho bèc h¬i dung m«i thu lÊy chÊt. 1.3.7.1. §Þnh l­îng: S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao cã øng rÊt lín trong ®Þnh l­îng chÊt trong hçn hîp vµ x¸c ®Þnh giíi h¹n t¹p chÊt. C¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng b»ng s¾c ký ®Òu dùa trªn nguyªn t¾c: nång ®é cña mét chÊt tû lÖ víi chiÒu cao hoÆc diÖn tÝch pic cña nã. Mét sè ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng hay ¸p dông trong HPLC: Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i (external standard method) §©y lµ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng c¬ b¶n trong ®ã c¶ hai mÉu chuÈn vµ mÉu thö ®Òu ®­îc tiÕn hµnh s¾c ký trong cïng ®iÒu kiÖn. Sau ®ã ®em so s¸nh diÖn tÝch (hoÆc chiÒu cao) pic thu ®­îc tõ mÉu thö víi pic cña mÉu chuÈn ®· biÕt nång ®é. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi (internal standard method) Lµ ph­¬ng ph¸p cho thªm nh÷ng l­îng gièng nhau cña chÊt chuÈn thø hai cã thêi gian l­u vµ ®¸p øng gÇn gièng mÉu thö vµo c¶ mÉu chuÈn vµ mÉu thö råi tiÕn hµnh s¾c ký. ChÊt chuÈn thø hai gäi lµ chÊt chuÈn néi. Ph­¬ng ph¸p chuÈn hãa diÖn tÝch pic (area normalisation) + Nguyªn t¾c: Hµm l­îng phÇn tr¨m cña mét chÊt trong hçn hîp nhiÒu thµnh phÇn ®­îc tÝnh b»ng tû lÖ phÇn tr¨m diÖn tÝch pic cña nã so víi tæng diÖn tÝch cña tÊt c¶ c¸c pic thµnh phÇn trªn s¾c ®å. Ph­¬ng ph¸p nµy yªu cÇu tÊt c¶ c¸c thµnh phÇn ®Òu ®­îc röa gi¶i vµ ®­îc ph¸t hiÖn, vµ tÊt c¶ c¸c thµnh phÇn ®Òu cã ®¸p øng detector nh­ nhau. + Áp dông: Ýt dïng ®Ó ®Þnh l­îng, chØ dïng trong x¸c ®Þnh hµm l­îng t¹p chÊt khi coi ®¸p øng cña c¸c chÊt lµ nh­ nhau. [12], [18]. PhÇn 2: thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶ 2.1. Nguyªn vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p thùc nghiÖm 2.1.1. nguyªn vËt liÖu : 2.1.1.1. nguyªn liÖu vµ ho¸ chÊt: Nguyªn liÖu: Tobramycin cña c«ng ty CPDP Hµ T©y. ChÊt ®èi chiÕu: Tobramycin cña viÖn kiÓm nghiÖm trung ­¬ng, hµm l­îng 94,96%. KH2PO4 (PA) H3PO4 (PA) Methanol dïng cho HPLC (Meck) N­íc cÊt tinh khiÕt 2 lÇn Mét vµi ho¸ chÊt kh¸c 2.1.1.2. Dông cô: M¸y s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao: DIONEX - detector UV Diode array - PDA 100 M¸y quang phæ UV- VIS Lambda EZ210 M¸y siªu ©m SONOREX C©n ph©n tÝch Mettler AB 204 cã ®é chÝnh x¸c 0,1mg M¸y läc ch©n kh«ng Satorius B×nh ®Þnh møc c¸c lo¹i Cèc cã má Pipet chÝnh x¸c, pipet th­êng Lä ®ùng mÉu, mµng läc 0,45 mm 2.1.2. Néi dung vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1.2.1. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu Tham kh¶o c¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng tobramycin ®· c«ng bè. Tham kh¶o c¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng tobramycin b»ng HPLC. - Dùa vµo cÊu t¹o ph©n tö, tÝnh chÊt ho¸ lý cña tobramycin còng nh­ ®iÒu kiÖn thùc nghiÖm cña n­íc ta hiÖn nay ®Ó x©y dùng quy tr×nh kü thuËt ®Þnh l­îng tobramycin b»ng HPLC. 2.1.2.2. Néi dung nghiªn cøu Nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn tiÕn hµnh ®Ó x©y dùng ph­¬ng ph¸p: Chän cét, pha ®éng, b­íc sãng ph¸t hiÖn vµ tèc ®é dßng, thÓ tÝch tiªm thÝch hîp ®Ó ®Þnh l­îng. X©y dùng, ®¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng tobramycin nguyªn liÖu. Kh¶o s¸t tÝnh thÝch hîp cña hÖ thèng s¾c ký §¸nh gi¸ sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é tobramycin vµ diÖn tÝch pic trªn s¾c ký ®å §¸nh gi¸ tÝnh chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p §¸nh gi¸ tÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p §¸nh gi¸ tÝnh ®Æc hiÖu cña ph­¬ng ph¸p Mét sè c«ng thøc tÝnh to¸n trong xö lý thèng kª kÕt qu¶ - Gi¸ trÞ trung b×nh: (2.1) - §é lÖch chuÈn: (2.2) - §é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi (RSD): (2.3) - Sai sè chuÈn: (2.4) - Sai sè t­¬ng ®èi: (2.5) - Kho¶ng tin cËy ± taSx (2.6) 2.2. thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶ 2.2.1. X©y dùng quy tr×nh kü thuËt ®Ó ®Þnh l­îng tobramycin b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC 2.2.1.1. Nguyªn t¾c lùa chän ®iÒu kiÖn s¾c ký Chän ph­¬ng ph¸p s¾c ký: Tobramycin sulfat lµ chÊt h÷u c¬ ph©n cùc, tan nhiÒu trong n­íc. V× vËy, ®Ó ph©n tÝch vµ ®Þnh l­îng tèt, chóng t«i chän ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao pha ®¶o. Chän cét s¾c ký: Trong ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng HPLC pha ®¶o, cét s¾c ký th«ng dông lµ Nucleosil C8, C18, ... Víi ®iÒu kiÖn s½n cã cña phßng thÝ nghiÖm chóng t«i sö dông cét Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5 mm). Chän pha ®éng: Trong ph­¬ng ph¸p HPLC pha ®¶o, pha ®éng th«ng dông nhÊt lµ acetonitril, methanol, n­íc hay hçn hîp cña methanol, acetonitril víi n­íc. Do tobramycin sulfat tan nhiÒu trong n­íc, ®Ó rót ng¾n thêi gian l­u thÝch hîp cña chÊt cÇn ph©n tÝch, pha ®éng cÇn ph¶i cã n­íc, ®Ó chuyÓn tobramycin sang hÕt d¹ng ion cÇn sö dông ®Öm pH acid. Chän b­íc sãng: cÊu tróc tobramycin cã 5 nhãm amin (-NH2), tuy nhiªn kh¶ n¨ng hÊp thô UV cña tobramycin kh«ng cao v× vËy b­íc sãng nghiªn cøu dù kiÕn lµ b­íc sãng thÊp. 2.2.1.2. Kh¶o s¸t lùa chän ®iÒu kiÖn s¾c kÝ: a. Kh¶o s¸t chän b­íc sãng thÝch hîp §Ó x¸c ®Þnh b­íc sãng thÝch hîp ph¸t hiÖn ra tobramycin, chóng t«i tiÕn hµnh quÐt phæ UV dung dÞch tobramycin 0,2 mg/ml trªn m¸y quang phæ UV- VIS Lambda EZ210. TiÕn hµnh: C©n chÝnh x¸c kho¶ng 20 mg tobramycin nguyªn liÖu cho vµo b×nh ®Þnh møc 100,0 ml, thªm n­íc võa ®ñ ®Õn v¹ch l¾c ®Òu. QuÐt phæ hÊp thô tö ngo¹i cña dung dÞch nµy. KÕt qu¶ ghi ë h×nh 1. H×nh 1: Phæ hÊp thô cña dung dÞch tobramycin 0,02% NhËn xÐt: Tõ phæ hÊp thô cña dung dÞch tobramycin chóng t«i thÊy: Cùc ®¹i hÊp thô cña dung dÞch chÊt nµy kho¶ng 194 nm. §Ó gi¶m ¶nh h­ëng cña dung m«i vµ t¹p chÊt nh­ng vÉn ®¶m b¶o ®Þnh l­îng ®­îc tobramycin chóng t«i chän b­íc sãng ®o lµ 195 nm. b. Lùa chän cét: Sö dông cét Nucleosil C18 (250x4 mm), cì h¹t 5 mm s½n cã ë bé m«n Ho¸ d­îc, tr­êng ®¹i häc D­îc Hµ Néi. c. Lùa chän ®Öm: Chóng t«i tiÕn hµnh kh¶o s¸t pha ®éng lµ dung dÞch ®Öm phosphat 0,01M ë c¸c pH kh¸c nhau, kÕt qu¶ cho thÊy: Víi pH=3,5 th× hÖ sè bÊt ®èi cña pic tobramycin lµ 2,95 Víi pH=3,0 th× hÖ sè bÊt ®èi cña pic tobramycin lµ 1,53 Víi pH=2,5 th× hÖ sè bÊt ®èi cña pic tobramycin lµ 1,49 NhËn xÐt: Khi pH gi¶m, hÖ sè bÊt ®èi gi¶m, pic tobramycin t¸ch tèt c©n xøng h¬n. Tuy nhiªn, dÔ thÊy lµ hÖ sè bÊt ®èi cña pic tobramycin t¹i pH 3,0 vµ pH 2,5 kh¸c biÖt kh«ng ®¸ng kÓ. Trong khi ®ã, nÕu sö dông t¹i pH 2,5 sÏ lµm gi¶m tuæi thä cña cét do ®ã chóng t«i ®· lùa chän ®Öm phosphat 0,01 M, pH 3,0 ®Ó kh¶o s¸t tiÕp. d. Lùa chän pha ®éng: §Ó chän ®­îc hÖ pha ®éng phï hîp chóng t«i ®· tiÕn hµnh kh¶o s¸t trong cïng ®iÒu kiÖn s¾c kÝ: Tèc ®é dßng 1,0 ml/phót, nång ®é chÊt chuÈn tobramycin lµ 3,0 mg/ml, thÓ tÝch tiªm 20ml trªn c¸c hÖ pha ®éng víi thµnh phÇn gåm acetonitril vµ ®Öm phosphat pH 3,0 víi c¸c tØ lÖ kh¸c nhau. Theo dâi sù thay ®æi hÖ sè bÊt ®èi cña c¸c pic tobramycin, kÕt qu¶ thu ®­îc ghi ë b¶ng 1: B¶ng 1: Gi¸ trÞ hÖ sè bÊt ®èi cña c¸c pic tobramycin khi kh¶o s¸t lùa chän pha ®éng Acetonitril §Öm pH 3,0 HÖ sè bÊt ®èi 20 80 2,43 10 90 2,02 5 95 1,75 0 100 1,52 NhËn xÐt: Víi pha ®éng lµ 100% ®Öm phosphat 0,01 M pH 3,0 cho pic gän, kh¸ c©n xøng, hÖ sè bÊt ®èi thÊp nhÊt. KÕt luËn: Pha ®éng ®­îc chän ®Ó nghiªn cøu ®Þnh l­îng tobramycin lµ 100% ®Öm phosphat 0,01 M pH 3,0. e. Lùa chän tèc ®é dßng TiÕn hµnh s¾c kÝ víi ®iÒu kiÖn ®· chän trªn nh­ng víi tèc ®é dßng thay ®æi 1,0 ml/phót; 0,8 ml/phót: 0,6 ml/phót. KÕt qu¶ nh­ sau: Víi tèc ®é dßng 0,6 ml/phót thêi gian l­u cña tobramycin lµ 2,95 phót Víi tèc ®é dßng 0,8 ml/phót thêi gian l­u cña tobramycin lµ 2,32 phót Víi tèc ®é dßng 1,0 ml/phót thêi gian l­u cña tobramycin lµ 1,86 phót NhËn xÐt: Víi tèc ®é dßng 1,0 ml/phót thêi gian l­u qu¸ ng¾n nªn chÊt cÇn t¸ch bÞ röa gi¶i ë thêi gian gÇn víi thêi gian chÕt, t¸ch kh«ng tèt. Víi tèc ®é dßng 0,8 ml/phót pic cña tobramycin vµ pic t¹p bÞ chång phñ nhau mét phÇn, hiÖu lùc t¸ch kÐm. Víi tèc ®é dßng 0,6 ml/phót kÕt qu¶ t¸ch tèt, pic c©n ®èi, thêi gian ph©n tÝch tR= 2,95 phót lµ thêi gian ch¹y s¾c ký phï hîp. KÕt luËn: Chän tèc ®é dßng lµ 0,6 ml/phót ®Ó nghiªn cøu ®Þnh l­îng tobramycin. ®. §iÒu kiÖn s¾c ký lùa chän Tõ c¸c kÕt qu¶ kh¶o s¸t, chóng t«i ®· x©y dùng mét quy tr×nh s¾c kÝ cã kh¶ n¨ng ph©n tÝch tèt tobramycin trong nguyªn liÖu nh­ sau: Cét Nucleosil C18 (250x4,6 mm, 5mm). Pha ®éng: §Öm phosphat 0,01M pH 3 Tèc ®é dßng: 0,6 ml/phót. ThÓ tÝch tiªm: 30 ml. Detector UV: B­íc sãng ®o 195 nm. NhiÖt ®é ph©n tÝch: NhiÖt ®é phßng. 2.2.2. Qui tr×nh ®Þnh l­îng 2.2.2.1. Kh¶o s¸t tÝnh thÝch hîp cña hÖ thèng C©n chÝnh x¸c kho¶ng 30,0 mg tobramycin ®èi chiÕu cho vµo b×nh ®Þnh møc 10,0ml. Hoµ tan vµ pha lo·ng b»ng n­íc võa ®ñ ®Õn v¹ch, l¾c ®Òu. Läc qua mµng läc 0,45 mm, dïng dÞch läc tiªm s¾c ký. Tiªm 5 lÇn mÉu ®èi chiÕu vµo hÖ thèng HPLC, tiÕn hµnh s¾c ký theo ®iÒu kiÖn ®· chän ë trªn. Ghi kÕt qu¶: thêi gian l­u, diÖn tÝch vµ hÖ sè bÊt ®èi cña pic tobramycin. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh thÝch hîp cña hÖ thèng s¾c ký ®­îc tr×nh bµy nh­ b¶ng 2. B¶ng 2: KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh thÝch hîp cña hÖ thèng STT Pic cña tobramycin Thêi gian l­u (phót) DiÖn tÝch pic (mAU) HÖ sè bÊt ®èi (AF) 1 2,94 12,2985 1,52 2 2,95 12,3001 1,53 3 2,96 12,2805 1,51 4 ._.