Tình hình viêm gan vịt do virus ở một số huyện ngoại thành Hà Nội. Phân lập, khảo sát một số đặc tính sinh học của virus gây bệnh và phương pháp phòng bệnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ HƯỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP ðỀ TÀI: “Tình hình bệnh viêm gan vịt do virus ở một số huyện ngoại thành Hà Nội. Phân lập, khảo sát một số ñặc tính sinh học của virus gây bệnh và phương pháp phòng bệnh” Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học : TS. TRẦN THỊ LAN HƯƠNG HÀ NỘI - 2008 i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phạm Thị Hường ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu ở lớp cao học Thú y K15 - trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, tôi luôn nhận ñược sự giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy giáo, cô giáo. ðến nay hoàn thành khóa học, nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành ñối với các thầy cô giáo trong nhà trường, khoa Sau ñại học, khoa Thú y, các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý. ðặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Trần Thị Lan Hương người ñã trực tiếp hướng dẫn, giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng miễn dịch - Viện công nghệ sinh học, cán bộ Trạm thú y, UBND huyện , UBND, Thú y các xã ñã giúp tôi trong quá trình thực tập. Xin cảm ơn những người thân và bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn. Hà Nội tháng 9 năm 2008 Tác giả luận văn Phạm Thị Hường iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ vết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục các hình ảnh ix 1. MỞ ðẦU....................................................................................................1 1.1 Tính cấp thiết ñề tài ..................................................................................1 1.2 Mục ñích của ñề tài..................................................................................3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................4 2.1 Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck virus Hepatitis - DVH)........................4 2.2 Virus viêm gan vịt (Duck Hepatitis virus - DHV)..................................14 2.3 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt........................................................18 2.4 Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt do virus...............................................22 2.5 Vấn ñề phòng và chống bệnh..................................................................25 3. NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........30 3.1 Nội dung nghiên cứu ..............................................................................30 3.1.3 Phân lập virus viêm gan vịt và ñịnh typ của chủng virus phân lập ñược....30 3.2 Nguyên liệu. ...........................................................................................30 3.3 Phương pháp nghiên cứu. .......................................................................31 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.........................................37 4.1 Tình hình chăn nuôi vịt ở huyện Gia Lâm và ðông Anh - Hà Nội ..........37 4.2 Tình hình bệnh viêm gan vịt do virus ở vịt nuôi tại hai huyện Gia Lâm và ðông Anh - Hà Nội ......................................................................................39 4.3 Kết quả ñiều tra về lứa tuổi mắc bệnh và chết vì bệnh viêm gan vịt do virus trên ñàn vịt ở Huyện Gia Lâm và huyện ðông Anh- Hà Nội................42 iv 4.4 Kết quả phân lập virus viên gan vịt cường ñộc gây bệnh trên ñàn vịt con tại khu vực ngoại thành Hà Nội ....................................................................43 4.6 Kết quả khảo sát một số ñặc tính sinh học của chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược ...............................................................................................59 4.7 Kết quả nghiên cứu phương pháp phòng bệnh viêm gan vịt cho ñàn vịt con................................................................................................................65 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ......................................................................74 5.1. Kết luận .................................................................................................74 5.2. ðề nghị ..................................................................................................74 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DHV Duck hepatitis virus ARN Axit Ribonucleic ADN Axit Deroxyribonucleic EID50 50 percent Embryo Infective Dose ELD50 50 percent Embryo Lethal Dose GPT Glutamate - Pyruvat - Transaminase OIE Office International des Epizooties BEI Binary Ethylenamine LES - STM Lipid Emulsion System - Salmonella typ himurium PP Pages Tr Trang vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN STT TÊN BẢNG TRANG 4.1 Tình hình chăn nuôi vịt của các xã thuộc huyện Gia Lâm và ðông Anh - TP Hà Nội tính ñến 1/ 3/ 2008 ..............................................................................38 4.2 Kết quả ñiều tra tình hình mắc bệnh viêm gan vịt do virus ở huyện Gia Lâm và ðông Anh - Hà Nội .........................................................................40 4.3 Kết quả ñiều tra về lứa tuổi mắc bệnh và chết vì bệnh viêm gan do ........42 virus trên ñàn vịt ở huyện Gia Lâm và ðông Anh - Hà Nội ..........................42 4.4 Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi vịt....................44 4.5 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể của phôi vịt khi phân lập virus .........45 4.6. Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên vịt con ....................................50 4.7 Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của vịt con khi phân lập virus trên vịt con ..........................................................................................................51 4.8 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể ở vịt con khi phân lập virus trên vịt..52 4.9 Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm 50% phôi vịt (EID50) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc ................................................................................60 4.10. Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% phôi vịt (ELD50) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc ................................................................................62 4.11. Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% vịt con (LD50) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc .........................................................................................64 4.12 Xác ñịnh ảnh hưởng của số lần dùng vacxin ở vịt mẹ ñến miễn dịch ở vịt con................................................................................................................67 4.13 Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp dùng vacxin viêm gan vịt ñầu tiên cho ñàn vịt (nở từ vịt mẹ không dùng vacxin)...............................................69 4.14 Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp dùng vacxin viêm gan vịt cho ñàn vịt (nở từ vịt mẹ dùng vacxin) ......................................................................72 vii DANH MỤC CÁC ẢNH STT TÊN ẢNH TRANG 4.1. Phôi vịt bình thường và phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt.................48 4.2. Phôi vịt bị xuất huyết và phù .................................................................48 4.3. Vịt con bị nhiễm virus viêm gan vịt .......................................................55 4.4. Tư thế nằm chết của vịt..........................................................................55 4.5 Vịt bị mắc bệnh viêm gan vịt ..................................................................56 4.6 Gan vịt mắc bệnh viêm gan vịt ...............................................................56 4.7 Sản phẩm RT-PCR của hệ gen virus viêm gan vịt DHV-GL08 chứa phần gen của VP1 ñiện di kiểm tra trên thạch agarose 1%. M: chỉ thị phân tử ADN (λ HindIII); Mũi tên chỉ sản phẩm RT-PCR (~0,8 kb). .........................................57 viii DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG 4.1 Biểu diễn tỷ lệ mắc bệnh viêm gan vịt do virus theo lứa tuổi ..................42 4.2. So sánh trình tự Nucleotit (714bp) gen VP1 của virus viêm gan vịt cường ñộc phân lập ở Gia Lâm, Hà Nội (ký hiệu DHV-GL08) và chủng virus vacxin viêm gan vịt của Hàn Quốc (DHV-HS) ........................................................58 4.3. Ảnh hưởng của số lần dùng vacxin ở vịt mẹ ñến miễn dịch thụ ñộng ở vịt con................................................................................................................68 4.4 Ảnh hưởng thời ñiểm khi dùng liều vacxin ñầu tiên ...............................70 (vịt con nở từ vịt mẹ không dùng vacxin) .....................................................71 4.5 Ảnh hưởng của kháng thể thụ ñộng khi dùng liêu vacxin .......................73 ñầu tiên (nở từ vịt mẹ dùng vacxin) .............................................................73 1 1. MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết ñề tài Trong hơn một thập kỷ qua ngành chăn nuôi vịt ở nước ta ñã có những bước tiến ñáng kể, số ñầu vịt tăng bình quân mỗi năm trên 6%. Năng suất thịt và trứng của vịt tăng nhanh. ðạt ñược thành quả ñó một phần nhờ việc nhập vào Việt Nam một số giống vịt siêu thịt, siêu trứng nổi tiếng trên thế giới. Tính ñến tháng 8/2007 cả nước có 226 triệu con gia cầm, tổng số thịt gia cầm là 359.000 tấn, sản lượng trứng 4,6 tỷ quả. ðể phấn ñấu ñưa giá trị chăn nuôi lên 20.000 tỷ ñồng vào năm 2010. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn vừa hoàn thành xây dựng ñề án ñổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm nhằm ñưa giá trị sản xuất chăn nuôi gia cầm ñạt khoảng 20.000 tỷ ñồng. Kế hoạch phát triển chăn nuôi gia cầm trong giai ñoạn 2005 - 2006 là kiểm soát, khống chế dịch cúm gia cầm, ñồng thời giữ vững mức tăng trưởng sản xuất chăn nuôi gia cầm ñể ñạt giá trị 12000 - 13000 tỷ ñồng (tương ñương năm 2003), trong ñó tổng ñàn gia cầm ñạt 255 triệu con, khối lượng thịt 375 000- 380.000 tấn và tổng sản lượng trứng khoảng 4,8 tỷ quả. Từ năm 2007 trở ñi, phấn ñấu ñạt tốc ñộ tăng trưởng ñầu con ñối với gà là 10%/năm, thuỷ cầm là 5%/ năm, tăng trưởng về sản lượng thịt, trứng từ 12%/ năm trở lên. Mục tiêu ñến năm 2015, tổng ñàn gia cầm ñạt 397,3 triệu con, trong ñó gà 350 triệu con, thủy cầm 47,3 triệu con. Khối lượng thịt 1.992 nghìn tấn, sản lượng trứng 10.207 triệu quả, (Lê Bá Lịch 2007). ðể ñạt mục tiêu này ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia cầm nói riêng ngoài việc ưu tiên lĩnh vực giống, giải quyết vấn ñề thức ăn thì việc tăng cường các biện pháp thú y bảo vệ ñàn gia cầm khoẻ mạnh là một khâu hết sức quan trọng (Lê Minh Chí, 1999). 2 Cùng với việc phát triển của ngành chăn nuôi, chăn nuôi vịt cũng ñang trở thành ngành sản xuất hàng hoá góp phần vào chương trình xoá ñói giảm nghèo. ðể ñẩy mạnh chăn nuôi vịt, hàng năm chúng ta ñã tiến hành nhập nội nhiều giống vịt cao sản và nhân chúng ra diện rộng, các giống này có ưu ñiểm cho năng xuất cao nhưng sức ñề kháng với bệnh kém hơn nhiều so với giống vịt nội. Hiện nay, dịch bệnh ở gia cầm nói chung, trên ñàn vịt nói riêng diễn biến phức tạp có nguy cơ lan rộng và gây tổn thất kinh tế rất nghiêm trọng như bệnh cúm gia cầm, dịch tả vịt, viêm gan vịt do virus. Bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi (Nguyễn Xuân Bình,2002). Bệnh xảy ra chủ yếu ở vịt con 1 - 3 tuần tuổi hoặc ở những vịt 5- 6 tuần tuổi. Tỷ lệ chết của bệnh rất cao có khi tới 100%. Theo quyết ñịnh số 63/2005/Qð - BNN ngày 13/10/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, bệnh viêm gan virus ở vịt ñược xếp vào danh mục các bệnh nguy hiểm của ñộng vật. Cho tới nay bệnh vẫn gia tăng ở các ñịa phương trên khắp cả nước, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi nhất là những giống vịt cao sản nhập ngoại chưa thích ứng ñược với ñiều kiện khí hậu, môi trường sống ở nước ta. Tuy vậy, những nghiên cứu về khống chế bệnh viêm gan vịt do virus còn hạn chế. Trong thực tế người dân chưa quen dùng vacxin phòng bệnh viêm gan do virus cho ñàn thuỷ cầm nên mức tiêu thụ loại vacxin ñông khô của Xí nghiệp sản xuất thuốc thú y TW rất chậm và tồn ñọng. Hiện nay người chăn nuôi mới chỉ dùng kháng thể viêm gan vịt do Công ty thuốc thú y Hanvet và Công ty thuốc thú y RTD sản xuất. Song hiệu quả của chế phẩm 3 này vẫn còn nhiều hạn chế trong việc phòng trị bệnh. Chính vì vậy người chăn nuôi vịt vẫn còn nhiều lo ngại bởi những tổn thất của bệnh viêm gan do virus gây nên trên ñàn vịt nuôi. Trong tình hình chung ñó, người chăn nuôi vịt ở một số huyện phụ cận Hà Nội cũng ñang phải ñối mặt với những tổn thất do bệnh gây ra. Vì vậy ñể có cơ sở khoa học ñánh giá về tình hình dịch bệnh, sự thiệt hại của bệnh trong chăn nuôi và góp phần bổ sung hoàn thiện các biện pháp phòng chống bệnh cho ñàn vịt có hiệu quả cao. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Tình hình bệnh viêm gan vịt do virus ở một số huyện ngoại thành Hà Nội. Phân lập, khảo sát một số ñặc tính sinh học của virus gây bệnh và phương pháp phòng bệnh”. 1.2 Mục ñích của ñề tài - Xác ñịnh thực trạng bệnh viêm gan vịt do virus ở một số huyện ngoại thành Hà Nội. - Phân lập chủng virus viêm gan vịt gây bệnh. - Xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược. - ðưa ra phương pháp phòng bệnh hiệu quả cao cho ñàn vịt con. 1.3 Ý nghĩa khoa học - Thực tiễn của ñề tài - Góp phần ñề ra các phương pháp phòng trị bệnh viêm gan vịt có hiệu quả cao trong chăn nuôi vịt. - Tạo chủng virus viêm gan vịt cường ñộc dùng trong nghiên cứu vacxin. 4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck virus Hepatitis - DVH) Bệnh viêm gan vịt do virus ở vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con dưới 6 tuần tuổi. Bệnh lây lan rất nhanh có biểu hiện ñặc trưng ở gan: gan sưng, xuất huyết ñốm hoặc vệt trên gan. Bệnh do 3 typ virus khác nhau gây ra: virus viêm gan vịt typ I, typ II và typ III. Nhưng phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt typ I. 2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh Mùa xuân năm 1945 ở Mỹ, Levine và Hofstad, quan sát thấy một bệnh lạ xảy ra ở trên ñàn vịt con một ngày tuổi: vịt chết nhanh sau khi có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích tập trung chủ yếu ở gan, gan sưng xuất huyết lốm ñốm trên gan Mùa xuân năm 1949 ở ðảo Long của Mỹ có tổng số vịt nuôi 750.000 con, Levine và Fabricant (1950) quan sát thấy một bệnh tương tự xảy ra trên ñàn vịt con trắng Bắc Kinh, ñầu tiên ở vịt 2 - 3 tuần tuổi, bệnh lây lan nhanh từ trại vịt này sang trại vịt khác làm 70 trại thiệt hại nghiêm trọng, trại bị thiệt hại nặng tỷ lệ vịt chết từ 70 - 95%. Ước tính cuối thời ñiểm dịch chỉ còn sót lại một vài trại, khi bị nhiễm bệnh tỷ lệ chết thấp khoảng 15% tổng ñàn (Woolcock và Fabricant, 1997). Năm 1950, Levine và Fabricant ñã phân lập ñược virus viêm gan vịt typ I, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà (Levine và Fabricant, 1950). Năm 1953, bệnh xảy ra trên các ñàn vịt ở các vùng khác của nước Mỹ. Năm 1954, bệnh xảy ra ở nước Anh do Asplin và Lauchlan phát hiện ra. Năm 1956 Hanson và Alberts ñã phát hiện ở bang Massachuset, Illinois, Michigan và xảy ra khắp nước Mỹ (Woolcock và Fabricant, 1997). Năm 1957, Fabricant J., C.G.Richard và P.P.Levine ñã nghiên cứu biến ñổi 5 vi thể của gan vịt bệnh (Fabricant J., C.G.Richard và P.P.Levine,1957). Năm 1958, Asplin ñã chế ñược vacxin nhược ñộc phòng bệnh cho vịt con. Từ năm 1960, trên thế giới ñã có vacxin phòng bệnh này ñặc biệt là vacxin ñược chế từ giống nhược ñộc Asplin(Asplin, 1958). Năm 1965 tại Norfolk của nước Anh, trên những ñàn vịt con ñã ñược tiêm phòng vacxin nhược ñộc viêm gan vịt typ I. Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên ñàn vịt con người ta ñã phân lập ñược virus viêm gan vịt typ II (Asplin, 1965). Theo (Tempel và Beer, 1968) cho rằng bệnh viêm gan vịt do virus typ I ñã xảy ra trên khắp thế giới trong ñó có Trung Quốc và Hàn Quốc. Cùng năm ñó Toth ñã quan sát thấy bệnh viêm gan xảy ra trên ñàn vịt con ñã ñược miễn dịch ñối với viêm gan vịt typ I. Ông ñã phân lập ñược loại virus có ñặc ñiểm khác với virus typ I và typ II, ông ñã ñặt tên là virus viêm gan vịt typ III. Bệnh do virus này chỉ xảy ra ở Mỹ(Woolcock và Fabricant, 1997). Năm 1969, Tausora và cộng sự ñã xếp virus viêm gan vịt typ I vào nhóm Picornavirus(Tausora, N.M, G.E.Coghill và M.J.Klutch,1969). Năm 1970, Asplin F.D ñã kiểm tra huyết thanh từ những loài cầm hoang dã ñể tìm kháng thể virus dịch tả vịt, viêm gan vịt, cúm vịt. Cũng vào năm này, Hwang J.ñã nghiên cứu tạo ra miễn dịch cho vịt mẹ bằng chủng viêm gan vịt cấy truyền qua phôi gà (Asplin, 1970). Năm 1972 - 1974, một số tác giả như Friend, Trainer… ñã tiến hành nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt do virus ở vịt trời (Woolcock và Fabricant, 1997). Năm 1976 - 1988, có các tác giả như Hanson L.E., Balla L., T. Veress, Grighton G.W., P.R. Woolcock … ñã tiến hành nghên cứu trong việc tạo ra miễn dịch cho ñàn vịt con bằng các chủng virus nhược ñộc (Woolcock và Fabricant, 1997). 6 Năm 1991, Woolcock P.R. ñã nghiên cứu vacxin viêm gan vịt typ I vô hoạt dùng cho vịt ñẻ. Còn Zhao X., R.M. Philips, G.Li và A.Zhong ñã nghiên cứu về việc phát hiện kháng thể viêm gan vịt do virus bằng phương pháp ELISA (Woolcock và Fabricant, 1997). Ở Việt Nam, năm 1978 Trần Minh Châu ñã nghi có bệnh viêm gan vịt do virus nhưng chưa phân lập ñược virus( Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1995). Vào những năm 1979 - 1983, bệnh xảy ra ở nhiều ñịa phương làm chết hàng ngàn vịt con (Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, 1984). Sáu tháng ñầu năm 2001, công ty cổ phần Dược và Vật tư thú y ñã ñiều tra mội số ổ dịch ở Từ Liêm, ðông Anh (Hà Nội), Hà Tây, Hà Nam, Tuyên Quang và kết luận là 5032 vịt con bị bệnh, trong số ñó vịt chết chiếm tới 73% (3311con) (Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn ðức Lưu, Trần Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly, 2001). Theo Lê Văn Tạo (2001), Tháng 3 năm 2001 tại Nông Cống (Thanh Hoá) xảy ra bệnh viêm gan vịt do virus ở vịt có tỷ lệ chết cao, xoá sổ nhiều ñàn vịt, chỉ trong 5 ngày có ñàn chết không còn con nào (Cục Thú y, 2002). Theo Lê Minh Lập( 2001): hầu hết các ñàn bị bệnh dưới 4 tuần tuổi ở các huyện Duy Tiên, Thanh Liêm… bị mắc bệnh và chết ồ ạt, tỷ lệ chết cao có ñàn chết tới 100%, dùng các loại thuốc chữa trị không có hiệu quả, cán bộ thú y gần như bó tay, người nông dân hoang mang, lo ngại, nhiều hộ chăn nuôi bị phá sản (Cục Thú y, 2002). Theo thống kê mới nhất của OIE, Việt Nam là một trong những nước bị bệnh viêm gan vịt gây thiệt hại nặng nề nhất. Năm 1997, bệnh ñã làm chết 24037 con trong tổng số 32.784 con vịt. Năm 2001, có 10276 con vịt chết vì bệnh viêm gan vịt trong tổng số 68.995 con vịt (OIE, 2006). 7 2.1.2 Truyền nhiễm học * Loài mắc bệnh Trong tự nhiên, bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan typ I gây ra chỉ xảy ra ở vịt con (Nguyễn Xuân Bình,1995). Ở những ñàn vịt bị bệnh, tỷ lệ nhiễm bệnh là 100%, tỷ lệ chết tuỳ theo lứa tuổi: vịt dưới 1 tuần tuổi chết khoảng 95%, vịt 1- 3 tuần tuổi chết ít hơn, khoảng 50%, 4 - 5 tuần tuổi tỷ lệ chết không ñáng kể. Vịt trưởng thành bị nhiễm virus không có triệu chứng lâm sàng, không ảnh hưởng ñến sản lượng trứng. Gà, gà tây và các ñộng vật khác không mắc bệnh. Asplin (1961), cho biết gà con có thể bị nhiễm bệnh, bệnh thể hiện không ñiển hình và có thể truyền virus sang con khác. Theo Rahn (1992), gia cầm non một vài ngày hay một vài tuần tuổi vẫn có thể bị nhiễm bệnh, con vật có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích và có kháng thể trung hoà trong máu. Trong phòng thí nghiệm, dùng virus viêm gan vịt typ I gây bệnh cho vịt con bằng cách tiêm phúc mạc hoặc cho uống. Vịt chết có bệnh tích: gan sưng, xuất huyết lốm ñốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng và có thể phân lập ñược virus. Các loài vật khác như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng, chó… ñều không cảm thụ với bệnh. ðối với viêm gan vịt typ II, typ III trong phòng thí nghiệm, ngoài tự nhiên chỉ gây bệnh cho vịt con. * ðường xâm nhập và cách lây lan Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc ñường tiêu hoá, ñường hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu. Virus theo máu ñến các cơ quan, phủ tạng và tập trung nhiều nhất ở gan. Dưới tác ñộng của virus quá trình trao ñổi chất ở gan bị rối loạn, virus phát triển trực tiếp phá hoại tế bào gan và tế bào nội mô huyết quản gây nên xuất huyết ñặc hiệu. Tổ chức gan bị thoái hoá , gan không giải ñộc ñược và con vật chết do bị ngộ ñộc. 8 Trong ñàn vịt bị bệnh, virus viêm gan typ I lây lan rất nhanh, từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm rất cao 100%. Theo Asplin (1961), các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, ñây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa. Priz (1973) ñã gây bệnh cho vịt con bằng ñường lây nhiễm qua không khí. Trong trường hợp gây bệnh này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và ñường hô hấp trên. Theo Hanson (1976), có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống. Demakov (1975), Cho biết chuột cống nâu có thể là vật chủ dự trữ của virus viêm gan vịt typ I. Ở loài ñộng vật này virus xâm nhập vào cơ thể tồn tại 35 ngày, sau ñó ñược bài tiết ra ngoài trong khoảng thời gian 18 - 22 ngày sau khi nhiễm. Trong huyết thanh của chuột có kháng thể và kháng thể tồn tại từ 12 - 24 ngày. Ở những vịt khỏi bệnh, virus ñược bài xuất theo phân ra ngoài sau 8 tuần. Virus viêm gan vịt typ II xâm nhập vào cơ thể qua ñường miệng và ñường lỗ huyệt. Ở những vịt khỏi bệnh, virus ñược bài xuất theo phân ra ngoài sau khi bị nhiễm bệnh một tuần. Bệnh không lây truyền qua trứng, vịt con nở ra từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn khỏe mạnh, nếu vận chuyển ñến nuôi ở nơi trước ñó không có bệnh, ñiều này ñã ñược Asplin khẳng ñịnh (Asplin, 1958). 2.1.3 Triệu chứng bệnh ðối với bệnh do virus viêm gan typ I gây ra, bệnh xảy ra ñột ngột, thời gian nung bệnh ngắn chỉ trong vòng 24 giờ, vịt chết tập trung và ngày thứ 2, 3, 4 sau khi mắc bệnh, tỷ lệ chết rất cao có khi tới 100%. Vịt bị bệnh không theo kịp bầy ñàn, ủ rũ, mệt mỏi, chậm chạp, bỏ ăn , 9 ít vận ñộng và tụm lại một chỗ, mắt nhắm ñột nhiên ngã vật ra, co giật rồi chết, vịt chết nằm ở tư thế ngọeo ñầu ra ñằng sau, vịt chết rất nhanh trong vòng 1 - 2 giờ sau khi xuất hiện triệu chứng. Trong thời gian dịch bệnh, vịt chết nhanh, nhiều gây thiệt hại nặng cho người chăn nuôi với ñặc ñiểm chết ngoẹo ñầu ra ñằng sau, kèm theo các cơn co giật, chân duỗi thẳng thường ñược coi như một dấu hiệu ñặc trưng của bệnh viêm gan vịt do virus (Nguyễn Phục Hưng, 2004). Farmer gọi bệnh viêm gan vịt là hội chứng thận thoái hoá mỡ và hoại tử tuyến tuỵ (Farmer, 1987). ðối với bệnh do virus viêm gan vịt typ II gây ra, quan sát thấy vịt chết trong vòng 1 -2 giờ sau khi có biểu hiện triệu chứng ñầu tiên: vịt khát nước, chảy nước mắt, tăng tiết urat, vịt chết do co giật cấp tính, vịt bị nhiễm bệnh thường chết với tỷ lệ 10 - 50%, vịt trưởng thành không mắc bệnh. Bệnh do virus viêm gan vịt typ III gây ra chỉ xảy ra ở vịt con. Triệu chứng bệnh giống như do virus viêm gan vịt typ I gây ra, tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết hiếm khi vượt quá 30%. 2.1.4 Bệnh tích * Bệnh tích ñại thể Bệnh tích do virus viêm gan typ I gây ra chủ yếu tập trung ở gan, gan sưng to xuất huyết lấm chấm ñỏ sẫm hay xuất huyết thành mảng trên bề mặt gan, lách ñôi khi sưng tụ máu hoặc lấm tấm xuất huyết, thận sưng màu nhợt nhạt, tĩnh mạch thận xung huyết (Nguyễn Thát, 1975). Theo Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001) [4], khi mổ khám 751 con vịt chết trong các ổ dịch tự nhiên thấy bệnh tích ở gan biểu hiện ở 691 con (92,01%), ở thận 141 con (18,77%), ở lách 97 con (12,91%). 10 * Bệnh tích vi thể Các tác giả Fabricant.J., C.G.Richard và P.P.Levin (1957), cho biết: các biến ñổi vi thể rất phức tạp, những biến ñổi nguyên thuỷ trong thể cấp tính bao gồm thay ñổi ñầu tiên là hoại tử tế bào gan, tăng sinh ống mật cùng với tăng sinh tế bào viêm và xuất huyết ở các mức ñộ khác nhau. Ở vịt con không chết có sự tái sinh các tế bào nhu mô gan (Fabrcant, 1957). Sau khi tiêm virus viêm gan vịt typ I vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, khoảng 19- 72 giờ phôi chết, ở phôi chết có biểu hiện xuất huyết dưới da nhất là vùng ñầu, lưng, rìa lách, phôi còi cọc, màng nhung niệu sưng dày, gan phôi xuất huyết lốm ñốm từng ñám (Ngô ðình Long, 2005). Ở vịt 6 ngày tuổi bị nhiễm virus viêm gan vịt typ I bằng ñường nhỏ mũi hoặc tiêm, vào thời ñiểm 14 - 24 giờ sau khi kiểm tra bằng kính hiển vi ñiện tử cho thấy: glucogen của gan giảm, trong tế bào có tiểu thể hình cầu ñường kính 100- 300nm. Trong trường hợp vịt bị bệnh ở thể cấp tính, 24 giờ sau khi nhiễm virus, tế bào gan thoái hoá, hoại tử, trong tế bào có các tiểu phần virus (Adamiker, 1969). Theo Adamiker (1970), sau khi gây nhiễm tế bào lách bị biến ñổi sau 6 giờ, bị hoại tử sau 24 giờ, thoái hoá nhân, tương bào, không tìm thấy tiểu thể virus, tế bào cơ có thể biến ñổi nhẹ. Woolcock và Fabricant (1997), không tìm thấy thể bao hàm trong tế bào gan vịt bệnh, ñây là một ñặc ñiểm khác biệt ñối với bệnh dịch tả vịt. Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt typ II, bệnh tích vi thể ñặc trưng ở gan, các tế bào hoại tử tràn lan, tế bào ống mật tăng sinh trên một phạm vi rộng. * Chỉ tiêu phi lâm sàng Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt typ I kiểm tra các chỉ tiêu huyết học cho thấy hàm lượng protein tổng số giảm, Albumin giảm, men glutamate - pyruvat - transaminase (GPT) tăng, bilirubin tăng. Hàm lượng GPT, GOT 11 tăng có liên quan ñến quá trình nhiễm bệnh. Nghiên cứu vấn ñề này Mennalla và Mandelli (1977), cho biết vịt trời bị nhiễm bệnh, mặc dù triệu chứng bệnh không biểu hiện rõ nhưng hàm lượng men GPT, GOT của gan có thay ñổi. 2.1.5 Chẩn ñoán bệnh viêm gan vịt do virus ðể chẩn ñoán bệnh viêm gan vịt do virus người ta dựa vào các kỹ thuật sau: * Dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích ñại thể của bệnh. Vịt con chết rất nhanh, co giật, ngoẹo ñầu ra ñằng sau, chân duỗi thẳng lúc chết thường ñược coi là một dấu hiệu ñặc biệt của bệnh viêm gan vịt do virus. Bệnh tích ñặc trưng: gan sưng, xuất huyết lốm ñốm trên gan. Tuy nhiên việc dựa vào triệu chứng, bệnh tích có thể phát hiện bệnh nhưng không phân biệt ñược typ virus gây bệnh. * Phân lập virus. Phương pháp phân lập virus có kết quả hữu hiệu và có thể biết ñược typ virus ñang gây bệnh. Người ta có thể phân lập virus bằng nhiều cách khác nhau. Bệnh phẩm dùng chẩn ñoán là gan của vịt mắc bệnh viêm gan vịt. Nghiền bệnh phẩm với dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) tỷ lệ 1/5, xử lý Cloroform 5% trong vòng 10 - 15 phút ở nhiệt ñộ phòng ñể diệt tạp khuẩn. Tiến hành phân lập. - Nuôi cấy virus viêm gan vịt typ I + Dùng phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, sau khi tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào xoang niệu mô, virus giết chết phôi trong khoảng 24 - 72 giờ. + Dùng phôi gà 8 - 10 ngày tuổi tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào xoang niệu mô, sau 8 - 10 ngày phôi chết. Phôi chết có bệnh tích còi cọc, da xuất huyết, phù phôi, gan sưng ñỏ hoặc hơi vàng. + Dùng vịt con 1 - 7 ngày tuổi tiêm dưới da. Sau khi tiêm 48 giờ, vịt có 12 biểu hiện triệu chứng lâm sàng và chết với bệnh tích ñiển hình, chết nhiều vào ngày thứ 2 ñến thứ 4 sau khi tiêm. + Dùng môi trường tế bào một lớp gan phôi vịt sau khi cấy huyễn dịch bệnh phẩm, virus gây hoại tử tế bào: tế bào co tròn, hoại tử, tạo plaques ñường kính gần bằng 1mm. - Nuôi cấy virus viêm gan vịt typ II + Dùng phôi vịt 10- 14 ngày tuổi, gây nhiễm qua xoang niệu mô, trên môi trường này, virus nhân lên hạn chế, sau 6 - 10 ngày mới phát hiện ñược sự nhiễm virus của phôi: phôi còi cọc hoại tử gan, gan có màu xanh. Virus thuộc typ này không nhân lên ñược trong môi trường tế bào một lớp của vịt, gà. + Dùng vịt 1 - 7 ngày tuổi, tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào dưới da hoặc tiêm bắp. Sau khi tiêm 2- 4 ngày vịt chết, tỷ lệ chết ñạt 20%. ðiều này khác hẳn so với virus viêm gan vịt typ I. - Nuôi cấy virus viêm gan vịt typ III + Dùng phôi vịt 10 ngày tuổi, tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào màng nhung niệu, virus nhân lên yếu. Sau khi tiêm 7 - 10 ngày phôi mới chết. Phôi còi cọc, phù phôi, xuất huyết dưới da, màng nhung niệu khô dày, gan, thận, lách sưng to. Virus viêm gan vịt typ III không nhân lên trên phôi gà. Nuôi cấy virus trên môi trường tế bào phôi gà không thành công nhưng có thể phát hiện virus trong tế bào gan phôi vịt, thận phôi vịt bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. + Dùng vịt 1- 7 ngày tuổi tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào bắp thịt, 24 giờ sau khi tiêm vịt không chết, sau 2- 4 ngày vịt mới chết, tỷ lệ chết thấp chỉ ñạt 20%. 13 * Chẩn ñoán huyết thanh học Dùng phản ứng trung hoà virus với mục ñích: ñịnh typ virus, ñánh giá phản ứng miễn dịch của cơ thể ñối với vacxin và dùng trong ñiều tra dịch tễ học. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này: trên ñối tượng nuôi cấy ( phôi, ñộng vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các ñối tượng trên. Còn khi hỗn hợp virus với kháng thể ñặc hiệu tương ứng chúng sẽ bị trung hoà, không nhân lên ñược và không gây bệnh tích (Nguyễn Như Thanh, 1996). Phản ứng trung hoà ñược sử dụng ñể ñịnh typ virus viêm gan typ I (Woolcock, 1998), dùng vịt con 1- 7 ngày tuổi, mỗi con tiêm 1- 2ml huyết thanh miễn dịch hoặc kháng thể ñặc hiệu chế từ lòng ñỏ trứng vào dưới da. Sau 24 giờ tiến hành tiêm virus cường ñộc với liều 103LD50. Kết quả 80 - 100% vịt ñối chứng chết, 80 - 100% vịt thí nghiệm sống sót. Phản ứng trung hoà còn ñược sử dụng ñể chẩn ñoán virus viêm gan vịt typ II, typ III (OIE, 2000). Ngoài ra còn dùng phản ứng bảo hộ chéo ñể phân biệt virus viêm gan vịt typ I, typ II và typ III: tiêm huyết thanh miễn dịch viêm gan vịt typ I, typ II cho vịt 2- 4 ngày tuổi. Sau 3 ngày công cường ñộc virus phân lập ñược (Gough, 1985). * Chẩn ñoán phân biệt Chẩn ñoán phân biệt là phương pháp dựa vào dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệ._.nh ñể phân bịêt với các bệnh khác: - Bệnh phó thương hàn vịt ở vịt (Duck salmonellosis). Vịt con mắc bệnh phó thương hàn do Salmonella thường có biểu hiện gầy, ñi ngoài phân trắng. Vịt giảm ñẻ, vỏ trứng mỏng dễ vỡ. ðối với vịt con gan có ñiểm hoại tử, lòng 14 ñỏ trứng chưa tiêu hết. Vi khuẩn Salmonella có thể nuôi cấy phân lập ñược trong phòng thí nghiệm trên môi trường thạch thông thường. Bệnh có thể chữa khỏi bằng kháng sinh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). - Bệnh dịch tả vịt (Duck plague), bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi với bệnh tích ñiển hình: sưng ñầu, ñau mắt, liệt chân, liệt cánh, tiêu chảy phân xanh, tốc ñộ vịt chết chậm hơn, vịt có bệnh tích viêm kết mạc mắt, xuất huyết dưới da, loét ñường tiêu hoá như niêm mạc dạ dày, ruột. Virus gây bệnh dịch tả vịt rất mẫn cảm với Chloroform và có thể tìm thấy tiểu thể bao hàm trong chẩn ñoán tổ chức học. - Bệnh nhiễm ñộc Aflatoxin (Aflatoxicosis): bệnh có nhiều triệu chứng bệnh tích giống viêm gan vịt do virus. Song ở bệnh nhiễm ñộc do Aflatoxin vịt chết nhanh ở mọi lứa tuổi, gan sưng rắn, nhu mô gan và thận bị phá huỷ nghiêm trọng nhưng không có tế bào viêm, không có sự lây lan bệnh sang các ñàn vịt khác khi không dùng chung một loại thức ăn. 2.2 Virus viêm gan vịt (Duck Hepatitis virus - DHV) Bệnh viêm gan vịt do 3 typ virus khác nhau gây nên: virus viêm gan vịt typ I, virus viêm gan vịt typ II và virus viêm gan vịt typ III. 2.2.1. Virus viêm gan vịt typ I * Hình thái Virus viêm gan vịt typ I là những hạt virus (virion) có kích thước rất nhỏ, là một Enterovirus, nằm trong họ Picornaviridae, loại ARN, có thể xuyên qua ñược màng lọc Beckefeld và Seitz (Levine và Fabricant, 1950). Theo Reuss (1959), dưới kính hiển vi ñiện tử virus là những hạt tròn, bề mặt xù xì, kích thước từ 20 – 40 nm, không có vỏ bọc ngoài, có 32 capxome (Richter, 1964). 15 * ðặc tính sinh học của virus Không có sự trung hoà chéo giữa virus viêm gan vịt với huyết thanh kháng virus viêm gan của người và chó. Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của gà, vịt, cừu, ngựa, chuột lang, thỏ, lợn… virus không gây ngưng kết hồng cầu khỉ khi thí nghiệm ở pH = 6,8 - 7,4, nhiệt ñộ là 40C, 240C, và 370C. * Sức ñề kháng Virus bị vô hoạt ở nhiệt ñộ 560C trong 30 phút. Trong ñiều kiện tự nhiên vệ sinh kém virus có thể tồn tại ñược 10 tuần, trong phân ẩm virus sống ñược 37 ngày, ở nhiệt ñộ 40C virus tồn tại ñược 2 năm, nhiệt ñộ - 20oC ñược 9 năm. Virus có sức ñề kháng với ete, chloroform, virus có thể tồn tại lâu bên ngoài môi trường. Tế bào chứa virus ñề kháng với pH = 3 trong thời gian 9 giờ. Ở ñiều kiện formalin 0,2% trong 2 giờ, chloramin 3% trong 5 giờ virus bị vô hoạt. Theo Haider (1980), ở ñiều kiện có 5% phenol virus bị vô hoạt hoàn toàn. Virus có sức ñề kháng với tác dụng của 5000 UI Penicilin và 100mg Streptomyxin trên 1ml huyễn dịch trong 1giờ (Lê Minh Chí, 1999). * Biến dị của virus. Trong tự nhiên, kháng nguyên của virus viêm gan vịt typ I không ổn ñịnh, dễ bị biến dị (Rao, 1967), (Shalaby, 1978). Người ta ñã phân lập ñược các typ virus biến dị ở Ấn ðộ, Ai Cập… và chứng minh sự biến dị của virus typ I bằng phản ứng huyết thanh học. Sandhu (1988) cho biết vịt ñược miễn dịch với virus viêm gan typ I không ñủ bảo hộ khi công cường ñộc bằng virus biến dị. * ðặc tính nuôi cấy Virus là loại ký sinh nội bào tuyệt ñối, có thể cấy chuyển virus viêm gan vịt trên ñộng vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào. - Nuôi cấy trên phôi trứng: virus viêm gan vịt có khả năng nhân lên trên 16 phôi gà và phôi vịt. + Trên phôi vịt: tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 -14 ngày tuổi, 24 - 72 giờ sau khi tiêm, phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc, xuất huyết dưới da ñặc biệt là vùng ñầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu ñỏ hoặc hơi vàng, có thể có ñiểm hoại tử. Ở những phôi chết muộn nước trong xoang niệu mô có màu xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn. + Trên phôi gà: tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi gà 8 - 10 ngày tuổi, ở lần cấy chuyển ñầu tiên, sau khi gây nhiễm 5 - 6 ngày, cho tỷ lệ phôi chết 10 - 60%, phôi chết với bệnh tích là: còi cọc phù phôi, xuất huyết dưới da (Levine và Fabricant, 1950). Ở lần cấy chuyển thứ 20 - 26, virus không còn khả năng gây bệnh cho vịt con mới nở, khi chuẩn ñộ virus ñạt 1-3log10, lượng virus này thấp hơn khi cấy chuyển qua phôi vịt. Ở lần cấy chuyển thứ 63 cho tỷ lệ phôi chết là 100%. Theo (Toth, 1969), sau 80 lần cấy chuyển qua phôi gà cho hiệu giá virus cao nhất vào thời ñiểm 53 giờ sau khi gây nhiễm phôi, lượng virus ở màng nhung niệu là 105,79, ở dịch niệu mô là 103,62 lượng virus có hiệu giá cao ở lúc 53 - 59 giờ sau khi cấy. Theo Mason (1972), một số trường hợp khi nuôi cấy virus trên phôi gà, vào thời ñiểm 48 giờ sau khi cấy hiệu giá virus ñạt 108, thời gian này kéo dài 6 - 24 giờ. Trên phôi ngỗng, virus viêm gan vịt cũng có khả năng nhân lên. Sau khi cấy virus vào xoang niệu mô 2 - 3 ngày thì phôi chết. - Nuôi cấy trên ñộng vật cảm thụ. Virus viêm gan vịt có khả năng nhân lên trên vịt con, nhất là vịt con nhỏ hơn 7 ngày tuổi. Các loài ñộng vật khác như: thỏ, chuột lang, chuột bạch, chó… virus không có khả năng nhân lên. Dùng huyễn dịch chứa virus viêm gan vịt typ I ñưa vào cơ thể vịt con 17 1- 7 ngày tuổi bằng phương pháp tiêm dưới da, tiêm bắp hoặc cho uống, trong vòng 18- 48 giờ sau khi gây nhiễm, thường dưới 24 giờ vịt thí nghiệm có những biểu hiện triệu chứng, bệnh tích ñặc trưng của bệnh: gan sưng, xuất huyết lốm ñốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng. - Nuôi cấy trên môi trường tế bào. Virus viêm gan vịt typ I có khả năng nhân lên trên nhiều loại tế bào như: tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi gà, thận phôi vịt, thận phôi gà, gan phôi vịt, thận phôi ngỗng… (Hwang, 1966). Trên môi trường nuôi cấy ta có thể quan sát ñược sự huỷ hoại tế bào của virus sau 8 giờ gây nhiễm, ñạt cực ñại sau 2 - 4 ngày. Sự huỷ hoại tế bào ñược biểu hiện dưới dạng cụm tế bào co tròn (Maiboroda, 1972). Môi trường tế bào thận phôi vịt ñược sử dụng làm phản ứng trung hòa, tạo plaques với virus nhược ñộc viêm gan vịt (Woolcock, 1982). 2.2.2 Virus viêm gan vịt type II Virus viêm gan vịt typ II là một Astrovirus có tính kháng nguyên khác với Astrovirus của gà, gà tây. Virus ñược Asplin xác ñịnh năm 1965. Virus có ñường kính 28-30 nm khi quan sát bằng kính hiển vi ñiện tử (Guogh, 1984). Vịt bị nhiễm viêm gan vịt typ II, triệu chứng, bệnh tích giống như bị nhiễm virus viêm gan vịt typ I. Virus viêm gan vịt typ II có khả năng nhân lên trên phôi vịt, phôi gà. Trên môi trường nuôi cấy tế bào, virus không có khả năng nhân lên trên các loại tế bào của phôi gà, phôi vịt. Khi gây nhiễm virus vào xoang niệu mô hay túi lòng ñỏ, ở môi trường này virus nhân lên yếu hơn so với viêm gan vịt typ I. Cụ thể 6 - 10 ngày sau khi gây nhiễm mới phát hiện ñược sự nhiễm virus của phôi (còi 18 cọc, hoại tử gan). Trên phôi gà, sau nhiều lần cấy truyền mù qua xoang niệu mô, virus mới gây chết một số phôi ở thời ñiểm 7 ngày sau khi gây nhiễm, những phôi chết có biểu hiện còi cọc, gan có hoại tử màu xanh. Virus viêm gan vịt typ II mất khả năng gây nhiễm ở nhiệt ñộ 500C trong 60 phút. 2.2.3 Virus viêm gan vịt typ III Virus viêm gan vịt typ III ñược phát hiện vào năm 1969 ở Mỹ (Toth, 1969). Năm 1979 virus ñược Haider và Calnek ñặt tên. Virus là một Picornavirus, có tính kháng nguyên không quan hệ với virus viêm gan vịt typ I. Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử, trên tế bào thận bị nhiễm virus cho thấy, virus viêm gan vịt typ III là một ARN có ñường kính 30nm trong tế bào chất. Trên phôi vịt 9 -10 ngày tuổi, sau khi gây nhiễm virus qua màng nhung niệu, 7-8 ngày mới có phôi chết, tỷ lệ chết phôi ở mức ñộ thấp. Ở phôi chết thấy màng nhung niệu biến màu, dày gấp 10 lần so với bình thường, phôi còi cọc, phù, xuất huyết dưới da, gan sưng, xuất huyết. Nếu cấy truyền virus nhiều lần trên phôi vịt, thời gian phôi vịt chết sớm hơn. Virus typ III không có khả năng nhân lên trên phôi gà. Ở môi trường tế bào thận, gan của phôi vịt hay của vịt con virus có khả năng nhân lên, có thể dùng môi trường này ñể xác ñịnh virus. 2.3 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt Theo Vũ Triệu An, (1997), ðặng ðức Trạch, (1984), miễn dịch là khả năng nhận ra và loại các vật lạ ra khỏi cơ thể., ñể có ñược khả năng này cơ thể phải nhờ ñến hệ thống miễn dịch. Khi ñưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, thời gian này dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng 19 nguyên chứa trong vacxin, sự xâm nhập của kháng nguyên lần ñầu hay lần thứ hai , thứ ba,… sau ñó kháng thể mới ñược sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, ñạt mức cao nhất sau 2 - 3 tuần rồi giảm dần và mất ñi sau vài tháng hoặc vài năm. Quá trình ñáp ứng miễn dịch là kết quả của sự hợp tác nhiều loại tế bào ñể nhận diện và phản ứng với kháng nguyên. Trong ñó quan trọng nhất là sự hợp tác giữa ñại thực bào với các loại quần thể lympho bào với nhau. Hệ miễn dịch của cơ thể gia cầm bao gồm các cơ quan và các tế bào tham gia trong cơ chế ñáp ứng miễn dịch. Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể bảo vệ mình trước hết bằng cơ chế ñáp ứng miễn dịch không ñặc hiệu như: Da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, ñặc biệt là vai trò của tế bào làm nhiệm vụ thực bào. Sau ñó cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu với sự hoạt ñộng của các cơ quan tế bào có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ñặc hiệu ñể loại trừ kháng nguyên (ðỗ Trung Phấn, 1979). Cũng như nhiều bệnh truyền nhiễm khác miễn dịch chống bệnh viêm gan do virus ở vịt bao gồm nhiều loại, ở ñây xin ñề cập tới miễn dịch tiếp thu bị ñộng và miễn dịch tiếp thu chủ ñộng. * Miễn dịch tiếp thu bị ñộng Theo Melekhin (1989), ở gia cầm non, hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện. Vì vậy ngay từ lúc mới sinh, cơ thể của chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh một cách ñặc hiệu. Trạng thái miễn dịch có ñược khi cơ thể mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể ñặc hiệu cho con non qua lòng ñỏ trứng. Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch bị ñộng ở vịt con nhận ñược từ mẹ ñược nhiều tác giả nghiên cứu. Việc tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo ra kháng thể thụ ñộng tốt cho ñàn vịt con. 20 Theo Asplin (1958), ông ñã tạo miễn dịch cho vịt mẹ bằng cách tiêm bắp chủng viêm gan vịt typ I nhược ñộc qua phôi gà từ lúc 2 - 4 tuần trước khi thu hoạch trứng ñể ấp ñã tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con. Rispens (1969) khuyến cáo người chăn nuôi nên tiêm cho ñàn vịt giống hai liều vacxin cách nhau ít nhất 6 tuần, vịt mẹ sẽ có khả năng truyền kháng thể thụ ñộng cho vịt trong khoảng thời gian 9 tháng sau lần tiêm vacxin thứ 2. Ông còn cho biết có thể tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con bằng cách tiêm kháng thể thụ ñộng chế tư lòng ñỏ trứng ñược của vịt ñã gây miễn dịch. Theo (Hwang, 1973), Dùng 2 -3 lần vacxin nhược ñộc cho ñàn vịt giống sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng ñủ bảo hộ cho ñàn vịt con. Theo (Bezrukavaya 1978), ñã dùng virus viêm gan vịt nhược ñộc qua phôi vịt tiêm cho vịt giống, ñã tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con. Theo (Golubnichi 1984) cho bíêt: hàm lượng kháng thể ở vịt mẹ phải ñạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ ñộng hoặc 1/32 trong phản ứng trung hoà mới có thể bảo hộ cho vịt con không bị bệnh. Theo Tripathy (1986), ở vịt con hàm lượng kháng thể thụ ñộng giảm dần trong 2 tuần ñầu. Theo Woolcock (1991), vịt giống tạo ñược miễn dịch cơ sở bằng vacxin nhược ñộc typ I. Sau ñó tiêm bắp vacxin vô hoạt sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con. Theo OIE (2000), nên tiêm vacxin nhược ñộc viêm gan vịt typ I cho vịt mẹ trước khi ñẻ 12, 8 và 4 tuần ñể tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con trong suốt chu kỳ ñẻ trứng. Miễn dịch thụ ñộng ở vịt con với bệnh viêm gan vịt còn ñược tạo ra bằng cách dùng huyết thanh miễn dịch của vịt khỏi bệnh hoặc kháng thể từ 21 lòng ñỏ trứng tiêm cho vịt con. Nếu vịt mẹ ñược miễn dịch tốt thì miễn dịch ñược truyền cho vịt con, vịt con sinh ra sẽ có miễn dịch thụ ñộng và không bị mắc bệnh trong vòng 2 tuần ñầu. Tiêm vacxin ñể tạo miễn dịch chủ ñộng cho vịt con 1 ngày tuổi là rất cần thiết, ñặc biệt ở những vùng có nguy cơ dịch bệnh (Nguyễn Thiện - Nguyễn ðức Trọng, 2004). Ở khu vực có mặt của virus viêm gan vịt typ I, typ III ñể tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con nên dùng vacxin nhược ñộc viêm gan vịt typ I, 2 - 3 lần vào các thời ñiểm 12, 8, 4 tuần trước khi vịt ñẻ và dùng vacxin viêm gan vịt typ III nhược ñộc vào các thời ñiểm 12 - 4 tuần trước khi vịt ñẻ sẽ tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con với virus viêm gan vịt typ I, typ III. Với vacxin viêm gan vịt typ II, chưa một tài liệu nào nói về sử dụng vacxin cho ñàn vịt giống có hiệu quả. * Miễn dịch chủ ñộng Theo (Asplin, 1970), vịt ñược dùng vacxin có thể tạo ñược miễn dịch chủ ñộng chống lại bệnh. Trong bệnh viêm gan vịt do virus, những con sống sót ñều có miễn dịch chắc chắn với virus của typ gây bệnh. ðể tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn vịt, người ta sử dụng các loại vacxin nhược ñộc và vacxin vô hoạt. Vacxin sau khi vào cơ thể ñược ñưa ñến các cơ quan miễn dịch như: hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc, kích thích cơ thể sản sinh kháng thể ñặc hiệu. Malinovskaya (1982), bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ ñộng khi nghiên cứu ñáp ứng miễn dịch với virus viêm gan vịt typ I của vịt giống và vịt con 7 ngày tuổi, cho biết: trong kháng thể dịch thể, kháng thể 7s nhiều hơn kháng thể 19s. Theo Davis (1987), cho biết vịt ở 2 ngày tuổi, kháng thể trung hoà xuất 22 hiện 4 ngày sau khi tiêm vacxin nhược ñộc viêm gan vịt typ I. Theo Asplin (1961), trong huyết thanh của vịt khỏi bệnh có kháng thể trung hoà. * Một số phương pháp ñánh giá ñáp ứng miễn dịch Mức ñộ miễn dịch của vịt với các typ virus gây bệnh viêm gan có thể ñược ñánh giá bằng phương pháp công cường ñộc và huyết thanh học. Theo (OIE, 2000), có thể dùng phản ứng trung hoà ñể kiểm tra mức ñộ miễn dịch của vịt sau khi dùng vacxin hoặc sau khi vịt khỏi bệnh. Kháng thể bảo hộ cho ñàn vịt với virus viêm gan vịt là kháng thể trung hoà. Phương pháp công cường ñộc ñược sử dụng với mục ñích xác ñịnh mức ñộ ñáp ứng miễn dịch của ñàn vịt sau khi dùng vacxin, phương pháp cho kết quả chính xác. ðể ñánh giá tính gây miễn dịch của vacxin viêm gan vịt typ I, typ II có thể tiến hành: Tiêm vacxin vào dưới da cho vịt với liều 103,3ELD50, 72 giờ sau khi tiêm virus cường ñộc cho vịt liều 103,3LD50. Vacxin viêm gan vịt typ I có hiệu quả ít nhất 80% vịt tiêm vacxin sống sót, 80% vịt ñối chứng chết. Vacxin typ II có 20% vịt ñối chứng biểu hiện bệnh. 2.4 Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt do virus Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt do virus có 2 loại: vacxin nhược ñộc và vacxin vô hoạt. 2.4.1 Vacxin vô hoạt Virus cường ñộc dưới tác ñộng của các yêu tố vật lý, hoá học, ñộc lực của virus giảm ñi hoặc mất hẳn, khi ñó virus không còn khả năng nhân lên trong cở thể vật chủ, không còn khả năng gây bệnh, virus này ñược dùng làm vacxin. Theo (Gough 1981), vacxin vô hoạt chế từ virus viêm gan vịt nuôi cấy trên phôi gà. Sử dụng 3 lần vacxin viêm gan vịt typ I vô hoạt nhũ dầu cho ñàn 23 vịt giống sẽ tạo miễn dich thụ ñộng cho vịt con. Cũng theo tác giả dùng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc cho vịt lúc 2 - 3 ngày tuổi vào thời ñiểm 22 tuần tiêm nhắc lại bằng vacxin vô hoạt sẽ tạo ñược kháng thể trung hoà cao hơn khi sử dùng 3 lần vacxin vô hoạt. Theo (Woolcock 1991), vacxin viêm gan vịt vô hoạt ñược sản xuất từ virus viêm gan vịt typ I, virus ñược nuôi cấy trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEI (Binary Ethylenimine) dùng bổ trợ dạng nhũ dầu LES - STM (Lipid Emulsion System - Salmonella typhimurium) và lympho B phân bào. Vacxin bảo quản ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ ñược hiệu lực của vacxin. Vacxin viêm gan vịt vô hoạt có khả năng tạo miễn dịch cho ñàn vịt. Sử dụng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc kết hợp với vacxin vô hoạt cũng tạo ñược miễn dịch cao ở ñàn vịt giống. Sử dụng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc typ I sau tiêm bắp một lần vacxin vô hoạt cho vịt sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng tốt ở ñàn vịt con trong suốt chu kỳ ñẻ trứng. 2.4.2 Vacxin nhược ñộc Virus cường ñộc dưới tác ñộng của các yếu tố sinh học, tiêm truyền nhiều lần qua ñộng vật ít cảm thụ, qua phôi, ñộc lực của virus giảm ñi, virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh, virus này ñược dùng làm vacxin. Theo (Asplin, 1958), virus viêm gan vịt cường ñộc sau khi truyền ñời qua phôi gà, khả năng gây bệnh cho vịt con giảm. Theo (Hwang, 1965), ñã tìm thấy một chủng virus mất khả năng gây bệnh cho vịt từ lần tiêm truyền phôi gà thứ 20 trở lên. ðồng thời ông cũng thấy ở chủng ñó mất khả năng gây bẹnh cho vịt sau lần cấy truyền thứ 6 cho xơ phôi vịt nhưng vẫn có khả năng gây bệnh cho gà. Theo (Hwang, 1965), các chủng virus viêm gan cường ñộc sau khi ñã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gây bệnh cho vịt con, nhưng virus 24 vẫn nhân lên trong tế bào các mô so với chủng virus viêm gan cường ñộc thì mức ñộ nhân lên của virus này là thấp hơn. Trên cơ sở nghiên cứu này nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược ñộc ra ñời bằng phương pháp giảm ñộc trên phôi. Chủng TN do Asplin tạo ra (Asplin, 1958), virus viêm gan vịt giảm ñộc sau khi cấy truyền trên phôi gà từ ñời thứ 23. Theo Hwang và Dougherty (1964), ở ñời thứ 26 virus mới giảm ñộc lực. Hiện nay vacxin viêm gan vịt nhược ñộc typ I dùng chủ yếu ở Châu Âu giảm ñộc sau 53 - 55 lần truyền ñời qua phôi gà. Ở Mỹ loại giảm ñộc sau 84 - 89 lần cấy truyền (OIE, 2000). Vacxin viêm gan vịt nhược ñộc nhược ñộc typ I ñược sản xuất trên phôi gà 8 - 10 ngày tuổi, vị trí tiêm là xoang niệu mô, nuôi cấy ở nhịêt ñộ 370C. Sau khi tiêm phần lớn phôi chết trong vòng 19 - 72 giờ với bệnh tích: phôi còi cọc, phù phôi, xuất huyết trên da, gan sưng xuất huyết, sau 3 - 5 ngày thu vacxin, thời ñiểm này lượng vacxin ñạt số lượng cao nhất, phôi chết trước thời ñiểm 24 giờ loại bỏ. Vacxin bảo quản ở nhiệt ñộ âm 700C trong vài năm. Vacxin viêm gan vịt typ II nhược ñộc ñược giảm ñộc khi cấy truyền qua phôi gà 25 lần. Quy trình sản xuất vacxin giống như virus nhược ñộc viêm gan vịt typ I. Loại vacxin này không dùng trong sản xuất chỉ dùng cho vịt con trong phòng thí nghiệm . Vacxin viêm gan vịt typ III nhược ñộc ñược giảm ñộc khi cấy truyền 30 lần trên màng nhung niệu của phôi vịt, nuôi cấy ở nhiệt ñộ 370C. Sau khi tiêm phôi chết trong vòng 6 - 10 ngày với bệnh tích của virus gây trên phôi, thu nước trứng và màng nhung niệu bảo quản ở nhiệt ñộ âm 700C trong vài năm. Theo Asplin (1961); Balla(1984), có thể dùng phương pháp cho uống, tiêm dưới da, tiêm bắp với vacxin nhược ñộc viêm gan vịt typ I ñều tạo miễn dịch tốt. 25 Theo (OIE, 2000), ñưa vacxin nhược ñộc viêm gan typ II bằng ñường cho uống, tiêm dưới da, tiêm bắp. Virus viêm gan vịt typ III bằng ñường tiêm dưới da sẽ tạo ñược ñáp ứng miễn dịch cao cho ñàn vịt. Vacxin viêm gan vịt ñược giảm ñộc trên phôi khi sử dụng cho vịt rất an toàn, ñộc lực của chủng virus ổn ñịnh và không trở lại ñộc lực với vịt mẫn cảm. Khi sử dụng phương pháp tiêm vacxin nhắc lại có khả năng tạo miễn dịch cao cho ñàn vịt. 2.5 Vấn ñề phòng và chống bệnh * Phòng bệnh ðể phòng bệnh viêm gan vịt có hiệu quả ñòi hỏi người chăn nuôi phải thực hiện tốt quy trình vệ sinh thú y kết hợp với việc sử dụng vacxin. Phòng bệnh bằng vệ sinh thú y ñối với các cơ sở chăn nuôi vịt cách ly nghiêm ngặt ñối với vịt con, nhất là trong 4 -5 tuần ñầu. Nhiều tác giả nghiên cứu ñã cho thấy tính khả thi của việc thanh toán bệnh ở những khu vực ñã lựa chọn thí nghiệm. Những nơi này ñã thành công trong việc cách ly ñể bảo vệ ñàn vịt con với bệnh, bên cạnh công tác vệ sinh phòng bệnh phải dùng vacxin cho ñàn vịt. Sử dụng vacxin viêm gan vịt ñể phòng bệnh nhằm mục ñích tạo cho vịt con ở lứa tuổi cảm thụ với bệnh có miễn dịch và ñề kháng với bệnh. ðể tạo miễn dịch cho vịt con có nhiều cách. Theo (Crighton, 1978), với trường hợp vịt con mới nở khi tiêm vacxin nhược ñộc typ I, sau 48 -72 giờ vịt có miễn dịch, miễn dịch kéo dài trong suốt giai ñoạn vịt mẫn cảm với bệnh. Vịt con của ñàn vịt giống không có miễn dịch với bệnh viêm gan vịt có thể dùng vacxin viêm gan vịt nhược ñộc typ I lúc một ngày tuổi bằng ñường cho uống hoặc tiêm dưới da ñể gây miễn dịch. Vịt con ñược nở từ ñàn mẹ có miễn dịch, kháng thể thụ ñộng giảm dần trong 2 tuần, nên dùng vacxin nhược 26 ñộc typ I cho vịt vào thời gian 7 -10 ngày tuổi (Tripathy, 1986). ðể tạo miễn dịch cho ñàn vịt con với bệnh viêm gan vịt ngoài việc sử dụng vacxin còn có thể dùng kháng thể viêm gan vịt chế từ lòng ñỏ trứng, nhưng thời gian miễn dịch với bệnh ngắn (OIE, 2000). * ðiều trị và khống chế bệnh ðối với bệnh viêm gan vịt do virus gây ra, ñể làm giảm thiệt hại của bệnh có thể tiến hành một số biện pháp: - Qua nhiều nghiên cứu, Levine và Fabricant (1950), nhận thấy là có thể bảo hộ vịt con bằng cách tiêm bắp 0,5 ml kháng huyết thanh từ vịt có miễn dịch hay tiêm bắp hoặc tiêm dưới da 0,5 - 1ml kháng thể lòng ñỏ. Khi xuất hiện vịt chết ñầu tiên trong ổ dịch viêm gan vịt thì việc sử dụng kháng huyết thanh là một biện pháp kiểm soát hữu hiệu. - Phát hiện sớm, can thiệp bằng cách tiêm kháng huyết thanh miễn dịch hay kháng thể viêm gan vịt chế từ lòng ñỏ ñể gây miễn dịch cho vịt. - Dùng vacxin tiêm thẳng vào ổ dịch. Thực hiện nghiêm ngặt quy trình vệ sinh thú y, trong ñó chú trọng ngăn không cho mần bệnh lây lan bằng cách: không bán chạy vịt, không mua vịt nơi có ổ dịch, xử lý xác chết không vứt bừa bãi, tiêu ñộc khử trùng chuồng nuôi, dụng cụ, thức ăn, nước uống… * Những nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt và vacxin phòng bệnh ở Việt Nam Năm 1978, Trần Minh Châu và cộng sự ñã nghi có bệnh viêm gan do virus ở vịt nhưng vào thời ñiểm ñó chưa phân lập ñược mần bệnh (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985). Năm 1979 - 1983, bệnh xảy ra ở nhiều ñịa phương làm chết rất nhiều vịt con, theo các tác giả Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984), ở Gia Lâm - Hà Nội bệnh viêm gan vịt do virus xảy ra làm chết hàng 27 ngàn vịt con. Năm 1983, Trần Minh Châu và cộng sự ñã phân lập ñược chủng virus cường ñộc (chủng TT) tại một trại chăn nuôi vịt ở Phú Xuyên- Hà Tây. Tác giả cho biết khi nuôi cấy trên phôi vịt 12 ngày tuổi virus gây chết phôi 100%, thời gian chết phôi từ 48- 96 giờ, phôi có bệnh tích xuất huyết. Các tác giả làm giảm ñộc virus bằng cách cấy truyền 39 ñời trên phôi gà và tạo ñược chủng nhược ñộc (chủng VN) có ELD50/0,2 ml (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985). Năm 1984, Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984), ñã nghiên cứu ñặc tính sinh học của virus viêm gan vịt nhược ñộc chủng TN của Asplin và ứng dụng quy trình sản xuất vacxin của Hunggari vào Việt Nam, các tác giả cho biết vacxin ñạt chỉ tiêu an toàn và hiệu lực khi sử dụng. Năm 1985, nghiên cứu thăm dò chế tạo chủng vacxin nhược ñộc viêm gan vịt bằng chủng virus phân lập ñược tại ñịa phương. Các tác giả cho biết qua nhiều ñời tiếp truyền phôi gà, chủng virus ñã giảm ñộc với vịt con và cho miễn dịch tốt (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985). Năm 1985, Trần Minh Châu, Lê Thị Nông, Nguyễn ðức Tạo ñã xây dựng quy trình sản xuất vacxin từ 3 chủng viêm gan vịt nhược ñộc: TN (Hunggari), E52 (Pháp) và VN (Việt Nam). Theo các tác giả cả 3 chủng virus vacxin ñều an toàn và có hiệu lực khi sử dụng (Trần Minh Châu và Cộng sự, 1989). Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001), khi ñiều tra 20 ổ dịch từ tháng 1- 6 năm 2001 tại các ñịa phương Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang… ñã cho kết luận: ðó chính là bệnh viêm gan do virus với tỷ lệ nhiễm trong ñàn lên tới 100%. Lứa tuổi mắc bệnh từ 1 - 21 ngày tuổi, tỷ lệ chết từ 48,57% - 90%. Theo Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn ðức Lưu và cộng sự (2001) gần ñây nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta chưa thích nghi với ñiều kiện môi trường nên bệnh viêm gan vịt xảy ra nhiều hơn. Bệnh xảy ra ở tất cả các 28 giống vịt, ngan, giống ngan pháp bị nhiều nhất 31/ 104 ñàn, sau ñó là giống vịt siêu trứng Trung Quốc 18/ 104 ñàn. Theo Nguyễn Văn Cảm và cộng sự (2001) ñã nghiên cứu biến ñổi bệnh lý bệnh viêm gan vịt do virus nhằm ñưa ra một phương pháp chẩn ñoán chính xác. Các tác giả cho biết bệnh tích ñiển hình về ñại thể chủ yếu là viêm gan, xuất huyết hoại tử chiếm tỷ lệ 79,66%- 100%, bệnh tích vi thể ñiển hình ở gan có tế bào viêm dạng ñơn nhân, xuất huyết, hoại tử, tăng sinh ống mật với tỷ lệ 100%. Bệnh viêm gan vịt gây tổn thất lớn cho người chăn nuôi, nhưng việc nghiên cứu về biện pháp phòng trị bệnh còn ít (Nguyễn ðức Lưu và Cộng sự, 2001). Bên cạnh nghiên cứu sử dụng vacxin một số tác giả còn nghiên cứu ứng dụng kháng thể ñể phòng trị bệnh viêm gan vịt do virus.Tháng 8 năm 2001 công ty Hanvet ñã tạo ñược chế phẩm kháng thể viêm gan vịt (Nguyễn ðức Lưu, Vũ Như Quán, 2002). Nguyễn Hữu Vũ và cộng sự (2001), chế phẩm kháng thể viêm gan vịt khi sử dụng an toàn và hiệu quả cao khi phòng trị bệnh. Theo Bùi Thị Cúc (2002), khi nghiên cứu về biến ñổi bệnh lý ñại thể, vi thể và siêu vi thể bệnh viêm gan vịt do virus cho biết: bệnh tích siêu vi thể ñiển hình là màng nhân của tế bào gan bị thoái hoá và hoại tử, các glucogen trong tế bào gan bị phá huỷ, ñồng thời xuất hiện các tiểu thể hình cầu có bán kính 100 -300nm. Theo (ðào Văn Dưỡng 2002), cho biết bệnh viêm gan vịt bệnh thường xảy ra trên ñàn vịt nuôi ở huyện Việt Yên, Yên Dũng, Tân Yên của Tỉnh Bắc Giang (86/534 ñàn) lứa tuổi mắc bệnh cao nhất lúc 1 - 7 ngày tuổi chiếm tỷ lệ 61,63%, tỷ lệ chết cao 53,9 - 72%. Theo (Nguyễn Phục Hưng, 2004) cho biết bệnh viêm gan vịt trên các ñàn vịt ở 10 huyện thuộc 4 tỉnh: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Tây, Bắc Ninh, tỷ lệ 29 vịt chết rất cao. Ở vịt 1 - 7 ngày tuổi chết 45,23%, vịt 8-21 ngày tuổi chết 34,4%, ở vịt 22- 42 ngày tuổi chết 18,9%. Theo (Nguyễn Khánh Ly, 2004), trong thời gian 2002- 2003 một số tỉnh phía bắc ñã xảy ra dịch viêm gan vịt do virus ở các ñộ tuổi rất khác nhau từ 2 - 14 ngày tuổi. Tổng số vịt ở các ổ dịch ñiều tra là 7798 con, số vịt chết là 5614 con chiếm tỷ lệ 71,99%. Trong ñó tỷ lệ vịt chết cao nhất là ở Hà Tây chiếm 90% và thấp nhất là ðông Anh chiếm 48,57%. Theo (Nguyễn Phục Hưng, 2004), vacxin nhược ñộc viêm gan vịt chế từ chủng virus DH -EG -2000 trên phôi gà ñạt các chỉ tiêu của vacxin: thuần khiết, an toàn và có hiệu lực cao khi phòng bệnh, có thể dùng vacxin tiêm thẳng vào ổ dịch khi dịch xảy ra, tỷ lệ sống sót (83,3 - 88,4%). Theo (Ngô ðình Long, 2005) cho biết trên ñịa bàn huyện Hiệp Hoà tỉnh Bắc Giang virus viêm gan vịt xuất hiện và gây bệnh trên các ñàn vịt ở 26 xã thị trấn, ở các lứa tuổi khác nhau tình hình mắc bệnh có khác nhau. Nếu ñược can thiệp bằng kháng thể hoặc vacxin tỷ lệ chết giảm ñi nhiều. (Nguyễn Bá Hiên, 2007) tiến hành khảo sát một số ñặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược ñộc viêm gan viêm DH- EG- 2000 và bước ñầu nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh. Theo (Bùi Thanh Khiết, 2007) cho biết chủng virus vacxin nhược ñộc viêm gan vịt DH - EG -2000 có xuất xứ từ nước ngoài trong ñiều kiện bảo quản ở Việt Nam, không bị thay ñổi các chỉ tiêu về sinh học của giống: như tính thích ứng và nhân lên trên phôi gà 10 ngày tuổi. 30 3. NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 3.1.1 Nghiên cứu tình hình chăn nuôi vịt ở một số huyện thuộc ngoại thành Hà Nội 3.1.2 Nghiên cứu tình hình bệnh viêm gan vịt do virus trên ñàn vịt con ở một số huyện ngoại thành Hà Nội 3.1.3 Phân lập virus viêm gan vịt và ñịnh typ virus phân lập ñược 3.1.4 Khảo sát một số ñặc tính sinh học của chủng virus cường ñộc phân lập ñược 3.1.5 Nghiên cứu phương pháp phòng bệnh viêm gan vịt cho ñàn vịt con 3.2 Nguyên liệu. * Giống virus - Virus vacxin viêm gan vịt nhược ñộc DH- EG -2000 do bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, Khoa Thú y cung cấp. - Giống virus viêm gan vịt cường ñộc phân lập từ các ổ dịch tự nhiên. * Phôi vịt Phôi vịt 12-13 ngày tuổi, khoẻ mạnh ñược lấy từ ñàn vịt mẹ khoẻ mạnh chưa tiêm phòng vacxin viêm gan vịt. * ðộng vật thí nghiệm - Vịt con 1 - 7 ngày tuổi khoẻ mạnh chưa ñược tiêm kháng thể hoặc vacxin phòng bệnh viêm gan vịt, ñược nở từ trứng của ñàn vịt bố mẹ chưa ñược tiêm phòng vacxin và kháng thể viêm gan vịt. - Vịt con 1-7 ngày tuổi khoẻ mạnh, nở từ trứng của ñàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh ñược tiêm phòng vacxin viêm gan vịt 2,3 lần. - Vịt giống nuôi từ các hộ gia ñình của ñịa phương. - Vịt con ốm chết vì bệnh tại các ổ dịch ở ñịa phương ñể phân lập virus. * Môi trường kiểm tra 31 Thạch thường, thạch máu, nước thịt, thạch sabouraud. * Các trang thiết bị phòng thí nghiệm - Buồng cấy vô trùng. - Tủ ấm. - Nồi hấp ướt. - Tủ lạnh âm sâu -860C. - Máy ly tâm. - ðèn soi trứng. - Tủ sấy khô. * Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm. - Bình tam giác - Ống nghiệm. - Cối chầy sứ… 3.3 Phương pháp nghiên cứu. 3.3.1 Phương pháp ñiều tra - Dựa vào số liệu Trạm thú y, phòng thống kê huyện, ñiều tra trực tiếp từ các hộ chăn nuôi và mạng lưới thú y cơ sở. - Xác ñịnh bệnh dựa vào ñặc ñiểm dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích ñiển hình của bệnh viêm gan vịt. 3.3.2 Phân lập virus bằng phương pháp nuôi cấy virus trên phôi vịt và vịt con * Xử lý bệnh phẩm Lấy gan của vịt con bị mắc bệnh trong tự nhiên, có triệu chứng bệnh tích ñiển hình của bệnh viêm gan vịt do virus. ðem nghiền gan với nước sinh lý thành huyễn dịch 1/5 làm ñông tan 3 lần, xử lý kháng sinh (Penicillin và Streptomycin), ñể ở n._. thành 8 nồng ñộ theo cơ số 10, từ 10-1 ñến 10-8. Ở mỗi nồng ñộ tiêm cho 4 phôi cùng với liều 0,2 ml/phôi. Theo dõi phôi trong 96 giờ, ghi số phôi sống, phôi chết theo từng nồng ñộ và tính ELD50 theo công thức Reed - Muench. Kết qủa ñược trình bày ở bảng 4.10. Ở bảng 4.10 cho thấy: + Lần thí nghiệm thứ nhất: Ở ñộ pha loãng 10-1 ñến 10-3, virus gây chết 100% phôi. Các ñộ pha loãng tiếp theo số phôi chết giảm dần, ở ñộ pha loãng 10-8 không còn gây chết phôi. Chỉ số ELD50 của virus ñạt 10-5,5/0,2 ml. + Lần thí nghiệm thứ hai: Ở ñộ pha loãng 10-1 ñến 10-3, virus gây chết 100% phôi. Các ñộ pha loãng tiếp theo số phôi chết giảm dần, ở ñộ pha loãng 10-8 không còn gây chết phôi. Chỉ số ELD50 của virus ñạt 10-5,8/0,2 ml. + Lần thí nghiệm thứ ba: Ở ñộ pha loãng 10-1 ñến 10-4, virus gây chết 100% phôi, ñến ñộ pha loãng 10-8 không còn gây chết phôi. Chỉ số ELD50 của virus ñạt 10-6/0,2 ml. Theo dõi thời gian phôi chết chúng tôi thấy phôi chết tập trung trong khoảng thời gian từ 19 - 72 giờ sau khi tiêm virus. Mổ phôi chết, kiểm tra thấy bệnh tích ñiển hình của bệnh viêm gan vịt. So sánh chỉ số ELD50 của lần thí nghiệm thứ nhất với lần thí nghiệm thứ hai và thứ ba không có sai khác với P > 0,05. Chỉ số ELD50 qua 3 lần chuẩn ñộ là tương ñối ổn ñịnh, chỉ số ELD50 trung bình của 3 lần chuẩn ñộ là 10- 5,8/0.2 ml. Qua kết quả xác ñịnh chỉ số EID50, ELD50 cho thấy virus viêm gan vịt mà chúng tôi phân lập ñược tại Kim Sơn, Gia Lâm có ñộc lực tương ñối cao, virus nhân lên và phát triển tốt trên phôi vịt, ở ñộ pha loãng 10-4 virus làm chết 100% phôi, thời gian phôi chết tập trung từ 19 - 72 giờ sau khi tiêm. 62 Bảng 4.10. Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% phôi vịt (ELD50) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc Kết quả Số liệu thực tế Số liệu tính toán ðịa ñiểm lấy mẫu (xã) Lần thí nghiệm ðộ pha loãng virus Liều tiêm (ml) Số phôi thí nghiệm Số phôi sống Số phôi chết Số phôi sống Số phôi chết Tỷ lệ phôi chết (%) ELD50 I 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 1 2 2 3 4 4 4 4 3 2 2 1 0 0 0 0 1 3 5 8 12 20 16 12 8 5 3 1 0 100 100 100 88,9 62,5 37,5 11,1 0 10-5,5 II 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 4 4 4 4 4 4 0 1 1 2 3 4 4 3 3 2 1 0 0 1 2 4 7 11 13 9 6 3 1 0 100 90 75 42.9 12,5 0 10-5,8 Kim Sơn III 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 4 4 4 4 4 4 0 0 1 2 3 4 4 4 3 2 1 0 0 0 1 3 6 10 14 10 6 3 1 0 100 100 85,7 50,0 14,3 0 10-6 ELD50= 10-5,8/ 0,2 ml 63 4.6.3 Kết quả xác ñịnh chỉ số LD50 của chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược Cùng với việc chuẩn ñộ virus trên phôi vịt, chúng tôi còn tiến hành chuẩn ñộ virus trên vịt con thông qua việc xác ñịnh chỉ số LD50 của chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược. ðể xác ñịnh chỉ số này chúng tôi dùng vịt con 7 ngày tuổi, khoẻ mạnh chưa ñược tiêm kháng thể hoặc vacxin viêm gan vịt, vịt con này ñược nở từ trứng của ñàn bố mẹ khoẻ mạnh chưa ñược tiêm vacxin viêm gan vịt. Virus ñược pha loãng làm 10 nồng ñộ theo các ñộ pha loãng tương ứng từ 10-1 ñến 10-10. Mỗi nồng ñộ chúng tôi tiến hành tiêm cho 4 vịt con với liều 0,5ml/ con. Theo dõi biểu hiện của vịt trong 14 ngày. Ghi số vịt chết, sống ở từng nồng ñộ của virus. Tính chỉ số LD50 theo công thức Reed - Muench. Kết quả ñược trình bày ở bảng 4.11. Ở bảng 4.11 cho thấy: + Lần thí nghiệm thứ nhất ở ñộ pha loãng 10-1 ñến 10-5, virus gây chết 100% số vịt, ở các nồng ñộ tiếp theo số vịt chết giảm dần và ñến nồng ñộ 10-10 không còn vịt chết. Chỉ số LD50 là 10-7,5/0,5 ml. + Lần thí nghiệm thứ hai ở ñộ pha loãng 10-4 ñến 10-5 virus gây chết số vịt 100%, ở các nồng ñộ pha loãng tiếp theo số vịt chết giảm dần, ñến nồng ñộ 10-10 không còn vịt chết. Chỉ số LD50 là 10-7,8/0,5 ml. + Lần thí nghiệm thứ ba ở ñộ pha loãng 10-4 ñến 10-5 số vịt chết 100%, ở các nồng ñộ tiếp theo số vịt chết giảm dần, ở nồng ñộ 10-9 và 10-10 không còn vịt chết. Chỉ số LD50 là 10-7,25/0,5 ml. Qua các lần thí nghiệm, chúng tôi thấy vịt chết trong khoảng thời gian từ 19 -72 giờ sau khi tiêm, vịt co giật và chết với tư thế ngoẹo ñầu rất rõ, mổ khám vịt chết có bệnh tích ñặc trưng của bệnh viêm gan vịt. So sánh chỉ số LD50 qua 3 lần thí nghiệm không có sự sai khác lớn với P > 0,05, trung bình của 3 lần thí nghiệm có chỉ số LD50 = 10-7,25/0.5 ml. 64 Bảng 4.11. Kết quả xác ñịnh liều gây chết 50% vịt con (LD50) của chủng virus viêm gan vịt cường ñộc Kết quả Số liệu thực tế Số liệu tính toán ðịa ñiểm lấy mẫu (xã) Lần thí nghiệm ðộ pha loãng virus Liều gây nhiễm (ml) Số vịt thí nghiệm (con) Số vịt sống số vịt chết Số vịt sống số vịt chết Tỷ lệ vịt chết (%) LD50 I 10-1 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 1 2 2 3 4 4 4 4 3 2 2 1 0 0 0 0 1 3 5 8 12 20 16 12 8 5 3 1 0 100 100 100 88,9 62,5 37,5 11,1 0 10-7,5 II 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 4 4 4 4 4 4 4 0 0 1 1 2 3 4 4 4 3 3 2 1 0 0 0 1 2 4 7 11 17 13 9 6 3 1 0 100 100 90 75 42.9 12,5 0 10-7,8 Kim Sơn III 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 4 4 4 4 4 4 4 0 0 1 2 2 4 4 4 4 3 2 2 0 0 0 0 1 3 5 9 13 15 11 7 4 2 0 0 100 100 87,,5 57,1 28.6 0 0 10-7,25 LD50= 10-7,52/ 0,5 ml 65 Qua việc chuẩn ñộ virus trên vịt con cho thấy chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược có ñộc lực cao và ổn ñịnh. Khi virus xâm nhập vào vịt con, virus nhanh chóng nhân lên gây chết vịt với tỷ lệ cao. Theo Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng(1985)[5], phân lập ñược chủng virus viêm gan vịt TT ở Phú Xuyên - Hà Sơn Bình, ñây là một chủng virus có ñộc lực yếu, khi chuẩn ñộ trên vịt con 2- 3 ngày tuổi cho LD50 = 10-3,5/0,5 ml. Như vậy kết quả xác ñịnh chỉ số EID50, ELD50, LD50 của chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược tại xã Kim Sơn - Gia Lâm - Hà Nội cho thấy ñây là một chủng virus có ñộc lực cao và ổn ñịnh. 4.7 Kết quả nghiên cứu phương pháp phòng bệnh viêm gan vịt cho ñàn vịt con Ở nước ta, bệnh viêm gan vịt do virus vẫn thường xảy ra gây tổn thất lớn cho người chăn nuôi. ðể phòng bệnh có hiệu quả, ngoài việc thực hiện tốt công tác vệ sinh phòng bệnh còn phải tạo miễn dịch cao cho ñàn vịt con. Gây miễn dịch cho vịt con có 2 phương pháp: - Dùng vacxin cho ñàn vịt mẹ ñể tạo miễn dịch thụ ñộng ở vịt con. - Dùng vacxin cho ñàn vịt con ñể tạo miễn dịch chủ ñộng. ðể tạo miễn dịch cao cho ñàn vịt con có nhiều vấn ñề liên quan: số lần dùng vacxin cho ñàn vịt mẹ, ảnh hưởng của miễn dịch thụ ñộng khi sử dụng liều vacxin ñầu tiên cho ñàn vịt. Chúng tôi nghiên cứu một số yếu tố có ảnh hưởng ñến miễn dịch ở ñàn vịt con. 4.7.1 Xác ñịnh ảnh hưởng của số lần sử dụng vaxin cho ñàn vịt mẹ ñến miễn dịch thụ ñộng ở vịt con Theo Hwang (1973) số lần sử dụng vacxin ở vịt mẹ có ảnh hưởng ñến miễn dịch thụ ñộng ở vịt con. 66 Tìm hiểu vấn ñề này chúng tôi dùng vacxin cho ñàn vịt mẹ với số lần khác nhau: - ðàn vịt mẹ dùng vacxin 2 lần vào lúc 12, 4 tuần trước khi ñẻ. - ðàn vịt mẹ dùng vacxin 3 lần vào lúc 12, 8, 4 tuần trước khi ñẻ. Sau khi vịt mẹ ñẻ ñược 1, 3, 6 tháng chúng tôi tiến hành thu trứng cho ấp nở, chọn vịt khỏe mạnh kiểm tra miễn dịch thụ ñộng ở vịt con (3 ngày tuổi) bằng phương pháp công cường ñộc. Kết quả thu ñược trình bày ở bảng 4.12. Kết quả cho thấy: + Vịt mẹ có miễn dịch sẽ truyền miễn dịch cho ñàn vịt con. Theo thời gian miễn dịch có hướng giảm dần. + Vịt mẹ ñược gây miễn dịch bằng cách dùng 3 lần vacxin, ở vịt con có miễn dịch cao hơn so với vịt con của vịt mẹ dùng 2 lần vacxin. - Vịt mẹ ñược dùng 3 lần vacxin: Vịt con nở từ trứng của vịt mẹ sau khi ñẻ 1 tháng cho tỷ lệ bảo hộ lúc 3 ngày tuổi là 100%, sau 3 tháng còn 80%, sau 6 tháng còn 70%. - Vịt mẹ ñược dùng 2 lần vacxin: Sau khi vịt mẹ ñẻ 1 tháng, ở dàn vịt con tỷ lệ bảo hộ lúc 3 ngày tuổi là 90%, sau khi ñẻ 3 tháng còn 60%, sau khi ñẻ 6 tháng chỉ còn 40%. Có thể thấy rõ ñiều này qua hình 4.3. 67 Bảng 4.12 Xác ñịnh ảnh hưởng của số lần dùng vacxin ở vịt mẹ ñến miễn dịch ở vịt con Kết quả công cường ñộc Vịt con của vịt mẹ dùng 2 lần vacxin Vịt con của vịt mẹ dùng 3 lần vacxin Lần TN Thời gian thu trứng ấp sau tiêm vacxin ở vịt mẹ (tháng) ðối tượng Liều virus cường ñộc Vị trí tiêm Số vịt theo dõi (con) Số vịt ốm (con) Số vịt sống sót (con) Tỷ lệ bảo hộ (%) Số vịt theo dõi (con) Số vịt ốm (con) Số vịt sống sót (con) Tỷ lệ bảo hộ (%) Vịt TN 103,3LD50 Dưới da 10 1 9 90 10 0 10 100 I 1 Vịt ðC 103,3LD50 Dưới da 5 5 0 0 5 4 1 20 Vịt TN 103,3LD50 Dưới da 10 4 6 60 10 2 8 80 II 3 Vịt ðC 103,3LD50 Dưới da 5 5 0 0 5 5 0 0 Vịt TN 103,3LD50 Dưới da 10 6 4 40 10 3 7 70 III 6 Vịt ðC 103,3LD50 Dưới da 5 5 0 0 5 5 0 0 68 Hình 4.3. Ảnh hưởng của số lần dùng vacxin ở vịt mẹ ñến miễn dịch ñộng ở vịt con. Như vậy dùng 3 lần vacxin viêm gan vịt nhược ñộc DH - EG - 2000 cho ñàn vịt mẹ trước khi ñẻ 12, 8, 4 tuần tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con cao hơn so với dùng vacxin hai lần (12, 4 tuần). Theo OIE (2000)[59], nên tiêm vacxin nhược ñộc viêm gan vịt typ I cho vịt mẹ trước khi ñẻ 12, 8 và 4 tuần (2 - 3 lần). Sau khi ñẻ 3 tháng một lần tiêm vacxin nhắc lại cho vịt mẹ ñể tạo miễn dịch thụ ñộng cho vịt con trong suốt chu kỳ ñẻ trứng. 4.7.2 Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp sử dụng vacxin viêm gan vịt lần ñầu tiên cho ñàn vịt con Ở ñàn vịt con có miễn dịch thụ ñộng, sự có mặt của kháng thể thụ ñộng trong máu vịt con có làm trung hòa một số virus vacxin tương ứng khi sử dụng vacxin lần ñầu hay không? 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 3 6 T û lÖ b ¶o h é (% ) Thêi gian sau ®Î cña vÞt mÑ (th¸ng)VÞt con cña vÞt mÑ dïng 2 lÇn vacxin VÞt con cña vÞt mÑ dïng 3 lÇn vacxin Thời gian thu trứng ấp sau khi iêm vacxin của vịt mẹ 69 Việc nghiên cứu ảnh hưởng của kháng thể thụ ñộng ñến ñáp ứng miễn dịch ở vịt con khi dùng vacxin là việc làm cần thiết, tạo cơ sở ñể chọn thời ñiểm dùng liều vacxin viêm gan vịt ñầu tiên thích hợp cho ñàn vịt. ðể xác ñịnh chỉ tiêu này chúng tôi tiến hành sử dụng vacxin cho ñàn vịt con không có miễn dịch thụ ñộng và ñàn vịt con có miễn dịch thụ ñộng. Kết quả ñược trình bày ở bảng 4.13 và 4.14. Bảng 4.13 Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp dùng vacxin viêm gan vịt ñầu tiên cho ñàn vịt (nở từ vịt mẹ không dùng vacxin) Tuổi (ngày) Kết quả công cường ñộc Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Dùng vacxin Công cường ñộc Số vịt thí nghiệm Số vịt sống sót Tỷ lệ bảo hộ (%) Số vịt thí nghiệm Số vịt sống sót Tỷ lệ bảo hộ (%) 1 5 0 0 5 0 0 3 5 1 20 5 1 20 7 5 2 40 5 2 40 14 5 4 80 5 4 80 1 21 5 4 80 5 4 80 7 5 0 0 5 0 0 10 5 2 40 5 1 20 14 5 3 60 5 2 40 21 5 4 80 5 4 80 7 28 5 4 80 5 5 100 ðối với ñàn vịt con không có miễn dịch thụ ñộng, khi sử dụng vacxin viêm gan vịt liều ñầu tiên vào thời ñiểm 1 ngày tuổi và 7 ngày tuổi ñều tạo ñược 70 miễn dịch cao cho ñàn vịt (bảng 4.13). - Ở lô vịt dùng vacxin vào lúc 1 ngày tuổi, sau 3 ngày tỷ lệ bảo hộ cho vịt ñạt 20%, 7 ngày sau ñạt 40%, 14 ngày sau ñạt 80%, 21 ngày sau tỷ lệ bảo hộ ñạt 80% (thí nghiệm I). Kết quả của lần thí nghiệm II cho kết quả tương tự. - Ở lô vịt dùng vacxin vào lúc 7 ngày tuổi, 1 tuần sau vào lúc vịt 14 ngày tuổi tỷ lệ bảo hộ cho vịt ñạt 60%, 3 tuần sau vào lúc vịt 28 ngày tuổi số vịt ñược bảo hộ ñạt 80% ở lần thí nghiệm I, 100% ở lần thí nghiệm II. Như vậy ở ñàn vịt con không có miễn dịch viêm gan vịt thụ ñộng có thể dùng liều vacxin ñầu tiên cho vịt vào lúc 1, 7 ngày tuổi ñều tạo ñược miễn dịch tốt cho ñàn vịt. Nhưng theo chúng tôi dùng vacxin cho vịt vào lúc 1 ngày tuổi là thích hợp nhất vì dùng vacxin lúc vịt 7 ngày tuổi sẽ có một thời gian dài vịt không có miễn dịch, không bảo hộ ñược với bệnh. Có thể thấy rõ ñiều này qua hình 4.4. Hình 4.4 Ảnh hưởng thời ñiểm khi dùng liều vacxin ñầu tiên 0 20 40 60 80 100 1 3 7 10 14 21 28 Dùng vacxin lúc 1 ngày tuổi Dùng vacxin lúc 7 ngày tuổi Tỷ lệ bảo hộ (%) Ngày tuổi 71 (vịt con nở từ vịt mẹ không dùng vacxin) ðối với ñàn vịt con có miễn dịch thụ ñộng, khi sử dụng vacxin viêm gan vịt liều ñầu tiên vào thời ñiểm khác nhau 1, 7, 10 ngày tuổi (bảng 4.14), chúng tôi thấy: - Ở vịt dùng vacxin lúc 1 ngày tuổi khả năng bảo hộ với bệnh của vịt giảm ñi nhanh chóng. Chỉ sau 3 ngày sử dụng vacxin tỷ lệ bảo hộ với bệnh giảm mạnh từ 100% giảm còn 20%, từ 80% giảm còn 40%. Tại thời ñiểm 7 ngày tuổi, tỷ lệ bảo hộ cho vịt ñã tăng lên. Sau khi dùng vacxin 2 – 3 tuần sau tỷ lệ bảo hộ với bệnh viêm gan vịt ở vịt chỉ ñạt 60%. - Ở vịt dùng vacxin vào lúc 7 ngày tuổi, sau khi dùng vacxin 3 ngày, tỷ lệ bảo hộ cho vịt có giảm xuống : từ 80% giảm còn 40%, từ 60% giảm còn 40%. Sau ñó tỷ lệ bảo hộ với vịt tăng dần, tại thời ñiểm sau khi dùng vacxin 3 tuần, tỷ lệ bảo hộ cho vịt ñạt 100%. - Ở những vịt dùng vacxin viêm gan vịt vào thời ñiểm 10 ngày tuổi, sau khi dùng vacxin 3 ngày tỷ lệ bảo hộ cho vịt có giảm ñi từ 60% còn 20%, từ 40% giảm còn 20%. Sau ñó tỷ lệ bảo hộ ở vịt tăng dần, tại thời ñiểm sau khi dùng vacxin 2 tuần tỷ lệ bảo hộ cho vịt ñạt 100%. Như vậy ở ñàn vịt con có miễn dịch thụ ñộng viêm gan vịt, khi sử dụng liều vacxin viêm gan vịt ñầu tiên, tỷ lệ bảo hộ cho vịt có giảm xuống, nhưng sau ñó tỷ lệ này tăng dần. Tại thời ñiểm dùng liều vacxin ñầu tiên 7 ngày tuổi, 10 ngày tuổi cho ñáp ứng miễn dịch tốt. Theo chúng tôi, ở ñàn vịt con có miễn dịch thụ ñộng nên dùng vacxin liều ñầu tiên cho vịt thích hợp nhất là lúc 7 ngày tuổi. Có thể thấy rõ ñiều này ở hình 4.5. 72 Bảng 4.14 Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp dùng vacxin viêm gan vịt cho ñàn vịt (nở từ vịt mẹ dùng vacxin) Tuổi (ngày) Kết quả công cường ñộc Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Dùng vacxin Công cường ñộc Số vịt thí nghiệm Số vịt sống sót Tỷ lệ bảo hộ (%) Số vịt thí nghiệm Số vịt sống sót Tỷ lệ bảo hộ (%) 1 5 5 100 5 4 80 3 5 1 20 5 2 40 7 5 2 40 5 2 40 14 5 3 60 5 3 60 1 21 5 3 60 5 3 60 7 5 4 80 5 3 60 10 5 2 40 5 2 40 14 5 4 80 5 4 80 21 5 5 100 5 4 80 7 28 5 5 100 5 5 100 10 5 3 60 5 2 40 13 5 1 20 5 1 20 17 5 3 60 5 3 60 10 24 5 5 100 5 5 100 73 Hình 4.5 Ảnh hưởng của kháng thể thụ ñộng khi dùng liều vacxin ñầu tiên trên ñàn vịt con nở từ vịt mẹ ñược dùng vacxin Theo (Crighton, 1978), với trường hợp vịt con mới nở khi tiêm vacxin nhược ñộc typ I, sau 48 - 72 giờ vịt có miễn dịch, miễn dịch kéo dài trong suốt giai ñoạn vịt mẫn cảm với bệnh. Theo (Tripathy, 1986), vịt con của ñàn vịt giống không có miễn dịch với bệnh viêm gan vịt có thể dùng vacxin viêm gan vịt typ I lúc 1 ngày tuổi bằng ñường cho uống hoặc tiêm dưới da ñể gây miễn dịch. Vịt con ñược nở từ ñàn vịt mẹ có miễn dịch, kháng thể thụ ñộng giảm dần trong 2 tuần nên dùng vacxin nhược ñộc typ I cho vịt con vào thời gian 7 - 10 ngày tuổi. Theo Davis (1987), cho biết vịt ở 2 ngày tuổi, kháng thể trung hòa xuất hiện 4 ngày sau khi tiêm vacxin viêm gan vịt nhược ñộc typ I. Theo Nguyễn Thiện - Nguyễn ðức Trọng (2004), tiêm vacxin ñể tạo miễn dịch chủ ñộng cho vịt con 1 ngày tuổi là rất càn thiết, ñặc biệt ở những vùng tiềm tàng dịch bệnh. Tỷ lệ bảo hộ (%) Ngày tuổi 74 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Huyện Gia Lâm và ðông Anh thuộc thành phố Hà Nội có nghề chăn nuôi vịt tương ñối phát triển với quy mô vừa và nhỏ. Tính ñến thời ñiểm 3/2008 huyện Gia Lâm có 77.272 con vịt, ðông Anh có 247.816 con vịt.  Bệnh viêm gan do virus ở vịt vẫn thường xảy ra trên ñàn vịt nuôi của 2 huyện Gia Lâm, ðông Anh (Hà Nội) chủ yếu ở vịt nhỏ hơn 7 ngày tuổi. Vịt trên 22 ngày tuổi không thấy xuất hiện. Tỷ lệ chết 17,36% ở lứa tuổi 7 ngày tuổi; 26,93% ở lứa tuổi 8 – 21 ngày tuổi.  Chủng virus viêm gan vịt cường ñộc phân lập tại Gia Lâm thuộc virus viêm gan vịt typ I ñược giám ñịnh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.  Chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược có ñộc lực tương ñối cao có khả năng gây chết phôi vịt 100%, gây chết vịt con 100%, thời gian gây chết vịt 25 – 72 giờ và các chỉ số sinh học khá ổn ñịnh: EID50 = 10-7,7/0,2ml ELD50 = 10-5,8/0,2ml LD50 = 10-7,52/0,5ml  Dùng vacxin chủng nhược ñộc virus viêm gan vịt DH-EG-2000 tiêm cho ñàn vịt mẹ 3 lần vào thời ñiểm 12 – 8 – 4 tuần trước khi ñẻ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con cao hơn so với vịt con của vịt mẹ dùng 2 lần vacxin (12, 4 tuần trước khi ñẻ).  Thời ñiểm thích hợp dùng vacxin viêm gan vịt lần ñầu tiên cho vịt con vào lúc 1 ngày tuổi (vịt con không có miễn dịch thụ ñộng), lúc 7 ngày tuổi (vịt con có miễn dịch thụ ñộng). 5.2. ðề nghị - Sử dụng chủng virus viêm gan vịt cường ñộc GL-08 mà chúng tôi phân lập ñược từ ổ dịch viêm gan vịt ở Kim Sơn vào nghiên cứu. - Áp dụng những nghiên cứu tạo miễn dịch cao cho ñàn vịt con nhằm ngăn chặn và khống chế bệnh viêm gan do virus ở vịt. 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng việt 1. Vũ Triệu An (1997), Miễn dịch học, NXB Y học. Hà Nội 2. Nguyễn Xuân Bình (1995), 109 bệnh gia cầm, NXB Long An. 3. Nguyễn Xuân Bình (2002), bệnh của vịt biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 4. Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Khánh Ly (2001), “Nghiên cứu biến ñổi lý viêm gan vius”, khoa học và kỹ thuật thú y, 8 (4), Hội thú y Việt Nam. Tr 48 - 51. 5. Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng (1985), “thăm dò tạo chủng vacxin nhược ñộc viêm gan vịt bằng chủng phân lập tại ñịa phương”, khoa học và kỹ thuật thú y 6(4), hội thú y Việt Nam, tr 3 - 8. 6. Trần Minh Châu, Lê Thị Nông, Nguyễn ðức Tạo, (1989), “Thăm do chế tạo vacxin viêm gan vịt và sử dụng”, kết qua nghiên của khoa học kỹ thuật thú y (1985 - 1989). Viện thú y, NXB nông nghiệp Hà Nội, tr 41 - 45. 7. Lê Minh Chí, (1999) “giải pháp chủ yếu dành cho thú y ñến năm 2000”, chăn nuôi, hội chăn nuôi Việt Nam, tr 7 - 10. 8. Bùi Thị Cúc (2002), Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñại thể, vi thể và siêu vi thể bệnh viêm han siêu vi trùng vịt. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp. Viện Khoa học Kỹ thuật Việt Nam. 9. ðào Văn Dưỡng (2003),“Tình hình bệnh viêm gan do virus và dịch tả vịt trên ñàn vịt ở tỉnh Bắc Giang. Nghiên cứu ñặc tính sinh học của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DH - EG - 2000 và quy trình sản xuất vacxin”. 10. Nguyễn Bá Hiên (1007), “ðã tiến hành khảo sát một số ñặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược ñộc viêm gan vịt DH – EG – 2000 và 76 bước ñầu nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh” khoa học và kỹ thuật thú y 14(2), hội thú y Việt Nam, tr 11 - 15. 11. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên (1984) “ ðặc tính sinh học của giống virus vacxin viêm gan vịt chủng của asplin phòng bệnh ở Việt Nam”. Khoa học và Kỹ thuật Thú y. 2(1), tr 21 - 25. 12. Nguyễn Phục Hưng (2004). “Tình hinh mắc bệnh viêm gan vịt do virus ở một số tỉnh ñồng bằng Bắc Bộ. Phân lập virus gây bệnh, nghiên cứu ñặc tính sinh học của chủng virus nhược ñộc viêm gan vịt DH - EG - 2000 và quy trình sản xuất vacxin”. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường ðại học nông nghiệp I. 13. Bùi Thanh Khiết (2007), "Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược ñộc DH-EG-2000 và ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất". Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường ðại học nông nghiệp I. 14. Lê Bá Lịch (2007), Bài phát biểu tại hội thảo chăn nuôi gia cầm Việt Nam sau hội nhập WTO tại Viện Chăn Nuôi ngày 14/3/2007. 15. Ngô ðình Long (2005), “Tình hình bệnh viêm gan vịt do virus ở Huyện Hiệp Hòa - Tỉnh Bắc Giang. Phân lập khảo sát một số ñặc tính sinh học của chủng virus gây bệnh và biện pháp phòng bệnh”. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường ðại học nông nghiệp I. 16. Nguyễn ðức Lưu, Lương Tất Nhợ, Hoàng Văn Tiêu, Nguyễn Hữu Vũ (2001), Nuôi ngan vịt và các bệnh thường gặp, NXB Nông nghiệp I Hà Nội. 17. Nguyễn ðức Lưu, Vũ Như Quán (2002), “ Bệnh viêm gan virus viêm gan vịt”, Khoa học và Kỹ thuật Thú y, 9(1), Hội thú y Việt Nam, tr 87 - 90 18. Nguyễn Khánh Ly (2004). “Phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt và nghiên cứu biến ñổi bệnh lý của bệnh ở vịt gây bệnh thực nghiệm”. Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp. Trường ðại học Nông nghiệp I. 77 19. ðỗ Trung Phấn (1989), Miễn dịch qua trung gian tế bào, NXB Y học Hà Nội. 20. Melekhin G.P, Gridin N.I (1989), Sinh lý. NXB Nông nghiệp Hà Nội 21. Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ ðình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, ðặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc. NXB Nông nghiệp Hà Nội. 22. Nguyễn Như Thanh (1996), Miễn dịch thú y, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 23. Nguyễn Thát (1975). Bệnh gia cầm, NXB KHKT, Hà Nội. 24. Nguyễn Thiện, Nguyễn ðức Trọng (2004), “chăn nuôi vịt trên cạn”, nhà xuất bản lao ñộng. 25. ðặng ðức Trạch, Nguyễn ðình Hưng, Phạm Mạnh Hùng, Pondman, 30. K. W; Wright, E. P (1984) Miễn dịch học (textbook of immunology), University press (University of Asterdam), NXB KHKT. 26. Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn ðức Lưu, Trần Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly (2001), “Kết quả sử dụng kháng thể viêm gan virus vịt phòng Bệnh cho vịt, ngan” khoa học kỹ thụât thú y, 8 (4), hội thú y Việt Nam. Tr. 52 - 58. 27. Cục thú y (2002), Thông báo tình hình dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2001 Hà Nội. 78 II. Tiếng nước ngoài 28. Adamiker, D. (1969). ”Elektronenmikros kopiscle untersuchungen zus virushepatitis der Etenkken”. Zentrabl Veterianezmed [B] 16: 620-636. 29. Adamiker, D. (1970). Die Virushepatitis der Entenkken im elektronenmikroskopischen Bild. Teil II: Befunde an der Milz und am Muskei. Zentralbl Veterinaermed [B] 17: 880 - 889. 30. Asplin, F. D. (1958), “An attenuated strain of Vet Rec 7 virus”, Vet Rec 70, pp. 1226 - 1230. 31. Asplin, F. D. (1961), “Notes on epidemiology and vaccination for hepatitis virus of ducks”, Off. Int.Epizoot Bull 56, pp. 793 - 800. 32. Asplin, F. D. (1965) “Duck hepatisis: Vaccination against two serological typs”, Vet Ret 87, pp. 182 - 183. 33. Asplin, F. D. (1970), “Examination of sera from wildfowl for antibodies against the viruses of duck plasgue duck hepatitis and duck influenza”. Vet Rec 87, pp. 182 - 183. 34. Balla, L., and T. Veress. (1984), “Immunization experiments with a duck virus hepatitis vaccine. I. Antibody response of ducklings of different immune status after subcutaneous, oral and aerosol vaccination”. Magi Allatorv Lapja 39, pp 395-400. (Abstr Vet Bull 1985 : 100). 35. Bezrukavaya L.J. (1978),Vaccine against duck virus hepatitis from strain ZM. Sborn Rad Puti Ob Vet Blago Prom Zivot (Kiev), pp 90 - 95. 36. Crighton, G.W., and P.R. Woolcock (1978), “Active immunization of ducklings against duck virus hepatitis”, Vet Rec 102, pp 358 - 361. 37. Davis, D., and D. Hannant (1987), “Factionation of neutralizing antibodies in serum of ducklings vaccinated with live duck hepatitis virus vaccine” Res Vet Sci 34, pp 276 - 277. 38. Demakov, G.P., S.N. Ostashev, V.N. Ogorodincova and M.A. Shiov 79 (1975), “Infection of brown rats with duck hepatitis virus”, Veterinarya 3 : 57 -58. Abstr Vet Bull 45: 4375. 39. Fabricant, J., C. G. Rickard, and P.P. Levine (1957), The pathology of duck virus hepatitis, Avian Diseases, pp. 265 - 275. 40. Farmer, F., W. S. K. Chalmers, and P. R. Woolcock (1987), “The duck fatty kidney syndrome - an aspect of duck viral hepatitis”, Avian Pathology 2, pp. 227 - 236. 41. Golubnichi, V. P., G.V. Malinovskaya (1984), Dynamics of postvaccinal antibodies in blood serum against duck hepatitis virus, Vet Nauk Proiz (Minsk) 22, pp.72 - 75. (Abstr Agro Salekt 1985: 1973). 42. Gough, R.E. and D. Spackman (1981). Studies With inactivated duck virus hepatitis vaccines in breeder ducks. Avian pathol 10: pp. 471 - 479. 43. Gough, R.E., MS. Collins, E.D. Borland, and L.F..Keymer (1984), “Atrovirus - like parti cles associated with hepatitis in ducklings” Vet Rec 1, 14:279. 44. Gough, R, E., E.D. Borland, I.F. Keymer and J.C. Stuart (1985), “Anoutbreak of duck hepatitis typ II in commercial ducks”. Avian Pathol 14, pp. 227-236. 45. Haider, S.A., and B.W. Calnek (1979), “Invitro isolation, propagation and characterization of duck hepatitis virus typ III”, Avian Dis 23, pp. 715 -729. 46. Haider, S.A. (1980), Ducks virus hepatitis. In S.B. Hichner, C. H. Domemuth, H.G. Purchse, And J.E. Williams (ads), Isolation and Indentifeication of avian pathogens, 2ND Ed., Pp. 75 - 76. Am Assoc Avian Pathol. Kennett Square, P. A. 47. Hanson, L.E., and D.N.Tripathy (1976). Oral immunization of ducklings with attenuated duck hepatitis virus. Dev Biol Stand 33, pp. 357- 363. 80 48. Hwang, J. and E. Dougherty (1964), “Seriral passage of duck hepatitis virus in chicken embryos”, Avian dis 6, pp.435- 440. 49. Hwang, J. (1965), “Duck hepatitis virus in duck embryo fibroblast cultures”, Avian dis, pp. 285-290. 50. Hwang, J. (1965), “A chicken embryo-lethal-strain of duck hepatitis virus”, Avian dis, pp. 417-422. 51. Hwang, J. (1966), “Duck hepatitis virus in duck embryo liver cell culture”, Avian dis, pp. 508-512. 52. Hwang, J. (1973), “Active immunization against duck hepatitis virus” Amj Vet Res 33, pp. 2539- 2544. 53. Levine, P.P. and M.S. Hofstad (1945), Duck disease investigation. Annu Rep New York State Vet Coll, Ithaca Vet 40, pp. 71-86. 54. Levine, P.P and J. Fabricant (1950). Virus disease of ducks in Nopth America. Corell Vet 40, pp. 71-78. 55. Maiboroda, A.D. (1972). “Formation of duck hepatitis virus in culture cells”. Veterinarya( 8), pp.50-52. (Abstr Vet Bull 42: 502-503). 56. Malinovskaya, G.V. (1982), Formation of 19s and 7s antibodies during immunogenesis and pathogenesis of duck viral hepatitis, Vet Nauk Proiz (Minsk) 19 pp. 68-70. (Abstr Vet Bull 53, pp.3209). 57. Manson, R.A. N.M. Tauraso and R.K. Ginn (1972). Growth of duck hepatitis virus in chicken embryos and in cell cultures derived from infected embryos. Avian Dis 16: 973-979. 58. Mennella, G.R. and G. Mandelli (1977), Glutamic - oxaloaxetat - Transaminaza (GOT) and glutamic - pyruvic - transamilaza(GPT) in the blood serum in experimenral viral hepatitis of ducklings. Arch Vet Ital 28: 187 - 190. 59. OIE (2000), Manual of standards for diagnostic test and vaccines. 81 60. OIE (2006), Annual animal disease status oie.int/hs2/report.asp. 61. Priz, N.N. (1973). Comparative study of virus hepatitis in animal (dogs and duck) using different roites of influence. Vapr Virusol 6: 696-700. (abstr Vet Bull 44: 1746). 62. Rahn, D.P. (1962), Susceptibiliti of turkeys to duck hepatitis virus and turkey hepatitis virus. MS thesis Univ Illinois. 63. Rao, S.B.V, and B.R. Gupta (1967). Studies on a filterable agent causing hepatitis in ducklings, and biliary cirrhosis and blood dyscrasia in adults. Indian J Poult Sci2: 18-30. 64. Reuss, U.(1959), Virusbiologische Untersuchungen bei der Entenhpatitis, Zintalbl Veterinaermed, pp. 808-815. 65. Richter, W.R., E.J.Razok and S.M. Moize (1964). Electron microscopy of virus like particle associated with duck viral hepatitis. Virolory 24: 114-116. 66. Rispens, B.H. (1969), Some aspects of control of infectious hepatitis in ducklings, Avian dis 13, pp. 417-426. 67. Sandhu, T. (1988), Personal Communication. 68. Shalaby, M.A. M.N.K. Ayoub and I.M. Reda (1978), A study on a new isolate of duck hepatitis virus and its relationship to other duck hepatitis virus strains. Vet Med J. Cairo Univ 26: 215- 221. 69. Tauraso, N.M., G.E. Coghill, and M.J. Klutch (1969). “Properties of the attenuated vaccine strain of duck hepatitis virus”, Avian Diseases 13, pp.321-329. 70. Temple, E., and J.Beer. (1968), Die virushepatitis der enten. In H. Rohrer (ed), Handbuch der Virusinfektionenbei Tieren,Vol. 3, pp. 1019- 1032. Gustav Fischer,Jena. 82 71. Toth, T.E. (1969), Studies of and agent causing mortaliry among ducklings immune to duck virus hepatitis, Avian Dis 13, pp.535-539. 72. Tripathy, D.N., and L.E. Hanson (1986), Impact of oral immunization against duck viral hepatitis in passively immune ducklings, Prevent Vet Med 4, pp. 355-360. 73. Woolcock P.R., W.S.K. Chalmers and D. Davis (1982), A plaque assay for duck hepatitis virus. Avian Pathol 11: 607-610. 74. Woolcock P.R., (1991), Duck hepatitis virus typ I; Studies with inactivated vaccines in breeder ducks. Avian Pathol., 20, 509- 522. 75. Woolcock P.R. & Fabricant J. (1997), Duck hepatitis. In. Diseases of Poultry Thnth Edition, Calnek B.W., BRNAes H.J., Beard C.W., McDougald L.R. & Saif Y.M., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, 661- 673. 76. Woolcock P.R., (1998), Duck hepatitis. In: A laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogen, Fourth Edition, Swaync D.E., Glisson J.R., Jackwood M.W., pearson J.E & Reed W.M., eds. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, Pennylvania, USA, 200-204. ._.