Tình hình bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi tại ngoại thành Hà Nội và một số tỉnh lân cận, phân lập, khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus cường độc

gọc Điểm nh dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi tại ngoại thành tỉnh lân cận. Phân lập, khảo sát đặc tính sinh us c−ờng độc Chuyên ngành: Thú y M∙ số: 60.62.50 Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Bá Hiên Hà nội - 2005 - 2 - Lời cam đoan Tôi xin cam đoan rằng kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực ch−a đ−ợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đ−ợc ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 10 năm 2005 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Điểm - 3 - Lời cảm ơn Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại lớp Cao học khoá 12 Chuyên ngành Thú y tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, tôi đã nhận đ−ợc sự giúp đỡ, giảng dạy nhiệt tình của các thầy giáo, cô giáo trong nhà tr−ờng. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy giáo cô giáo; đặc biệt là các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Bệnh lý Khoa Chăn nuôi Thú y tr−ờng Đại học Nông nghiệp I. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới T.S Nguyễn Bá Hiên, ng−ời đã tận tình h−ớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp và những ng−ời thân đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài. Rất mong nhận đ−ợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn đồng nghiệp đối với đề tài nghiên cứu của tôi. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2005 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Điểm - 4 - Bảng các chữ viết tắt trong luận văn DEV : Duck enteritis virus DNA : Dezoxy ribonucleic acid DTV : Dịch tả vịt DVE : Duck virus enteritis Eld50 : 50 percent Embryo Lethal Dose EID50 : 50 percent Embryo Infective Dose FAO : Food and Agriculture Organization LD50 : 50 percent Lethal Dose OIE : Office International des Epizooties PCR : Polymerase chain reaction p.p : pages RNA : Ribonucleic acid st : Seite tr : trang VSV – TN – BL : Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Bệnh lý - 5 - Danh mục các bảng Thứ tự Tên bảng Trang Bảng 2.1: Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số n−ớc châu á từ năm 1996 - 2003............................................................................................... 6 Bảng 3.1: Thành phần và số l−ợng từng thành phần tham gia PCR......... 40 Bảng 4.1: Kết quả điều tra tình hình chăn nuôi vịt ở một số địa bàn thuộc Hà Nội và các vùng phụ cận.......................................... 46 Bảng 4.2: Tình hình mắc bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt thuộc địa bàn điều tra..................................................................................... 49 Bảng 4.3: Kết quả phân lập virus c−ờng độc dịch tả vịt trên vịt….......... 53 Bảng 4.4: Kết quả phân lập virus c−ờng độc dịch tả vịt trên phôi vịt..... 55 Bảng 4.5: Kết quả cấy truyền chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG- 2004 trên phôi vịt..................................................................... 58 Bảng 4.6: Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004.................................................................................................... 61 Bảng 4.7: Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004........................................................................................... 63 Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra bệnh tích đại thể của phôi sau khi gây nhiễm chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG - 2004............... 65 Bảng 4.9: Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004...................................................................................................... 69 Bảng 4.10: Tỷ lệ triệu chứng, bệnh tích đại thể của vịt sau khi gây nhiễm chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004.............. 72 Bảng 4.11: Kết quả phản ứng trung hoà trên phôi..................................... 75 Bảng 4.12: Kết quả tiêm phòng bệnh của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000............................................................. 80 Bảng 4.13: Kết quả can thiệp dịch của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000…………………………………............. 82 Bảng 4.14: Hiệu lực bảo hộ của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP- EG-2000 trong phòng thí nghiệm....................................... 85 Bảng 4.15: Hiệu lực bảo hộ của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG- 2000 trong thực tế.................................................................... 87 - 6 - Danh mục các Hình Thứ tự Tên hình Trang Hình 4.1: Sản phẩm PCR của đoạn gen DNA-polymerase virus dịch tả vịt c−ờng độc phân lập tại Việt Nam (hình A) và kết quả dòng hoá (hình B)...................... 76 Hình 4.2: Giản đồ (chromatogram) một phần đoạn gen DNA- polymerase (446bp) virus dịch tả vịt của Việt Nam sau khi giải trình trình tự (hình trên) và thành phần nucleotid và axit amin của gen này (hình d−ới)........ 77 Hình 4.3: So sánh trình tự nucleotid (446bp) của c−ờng độc dịch tả vịt phân lập ở Việt Nam (ký hiệu: DEV-VN) và chủng vacxin của thế giới (DEV-vx).................... 78 - 7 - Danh mục các ảnh Thứ tự Tên ảnh trang ảnh 4.1: Vịt bại liệt………………………………………. 89 ảnh 4.2: Vịt chảy n−ớc mắt, n−ớc mũi…………………… 89 ảnh 4.3: Vịt bị phù đầu…………………………………... 89 ảnh 4.4: Vịt ỉa chảy……………………………………… 89 ảnh 4.5: Gan vịt xuất huyết, hoại tử……………………… 90 ảnh 4.6: Ruột xuất huyết, loét……………………………. 90 ảnh 4.7: Gan xuất huyết, thoái hoá không bào…………... 90 ảnh 4.8: Gan xuất huyết, tăng sinh tế bào viêm………….. 90 ảnh 4.9: Phôi vịt xuất huyết, còi cọc…………………….. 91 ảnh 4.10: Phôi vịt xuất huyết, phù………………………… 91 ảnh 4.11: Gan phôi vịt xuất huyết, hoại tử………………… 91 ảnh 4.12: Gan phôi vịt xuất huyết, tăng sinh tế bào viêm…. 91 - 8 - 1. Mở đầu 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Cho đến nay, vịt là loài thuỷ cầm đ−ợc ng−ời dân chăn nuôi nhiều nhất. Trên thế giới hàng năm có khoảng 550 đến 600 triệu vịt, trong đó ở châu á chiếm tới 80 - 86% tổng đàn vịt. Những n−ớc nuôi nhiều vịt phải kể đến là Trung Quốc, Thái Lan, Banglades và Việt Nam. N−ớc ta hàng năm đàn vịt sản xuất khoảng 30.000 đến 40.000 tấn thịt hơi, 0,8 đến 1 tỷ quả trứng và khoảng 1000 đến 1500 tấn lông (Trịnh Quang Khuê, 2003) [20]. Đến năm 2003 số vịt tăng bình quân 7%, đạt gần 70 nghìn tấn thịt vịt; 1,5 tỷ quả trứng vịt và 3.500 tấn lông (Lâm Minh Thuận, 2004) [31]. Theo số liệu thống kê của FAO (2003) [40]: Tổng số vịt của Việt Nam là 57 triệu con, đứng thứ 2 thế giới, sau Trung Quốc; sản l−ợng thịt vịt của Việt Nam là 67,8 nghìn tấn, đứng thứ 5 thế giới. Những vùng chăn nuôi vịt nhiều ở n−ớc ta phải kể đến là khu vực đồng bằng sông Cửu Long và khu vực đồng bằng Bắc Bộ. Hình thức chăn nuôi vịt chủ yếu của ng−ời dân là nuôi chăn thả, tận dụng thóc lúa theo mùa vụ. Hàng năm, Việt Nam sản xuất trên 32 triệu tấn l−ơng thực, chủ yếu là thóc. Nếu tính 5% l−ợng thóc rơi rụng thì đó là một l−ợng thức ăn mất mát không nhỏ. Nuôi vịt theo kiểu chăn thả tận dụng không chỉ giúp ng−ời chăn nuôi có thể tiết kiệm rất lớn chi phí về thức ăn mà còn là biện pháp cơ bản giúp giải quyết vấn đề lãng phí l−ơng thực nêu trên. Tuy nhiên, ph−ơng thức chăn nuôi này lại làm cho dịch bệnh trở thành một yếu tố đáng quan tâm hơn bao giờ hết. Một trong những bệnh quan trọng nhất và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi vịt là bệnh dịch tả vịt (Nguyễn Đức Hiền, 1999) [17]. Căn bệnh là một loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus. Bệnh gây nên tình trạng bại huyết, xuất huyết cho vịt với tỷ lệ chết cao lên đến 90%. - 9 - Theo kết quả nghiên cứu về vấn đề phát triển vịt ở Việt Nam năm 1992 bệnh dịch tả vịt là một trong 3 bệnh mũi nhọn cần quan tâm nghiên cứu quy trình miễn dịch cho khu vực nuôi qui mô lớn ở những vùng tập trung. Điều tra dịch bệnh gia cầm ở 5 tỉnh phía Bắc (năm 1995- 1997), Lê Minh Chí và cộng sự (1999) [8] cho biết: Bệnh dịch tả vịt là một trong hai bệnh tác động lớn nhất đến đàn vịt. Nhận thức đ−ợc tầm quan trọng của việc phòng chống bệnh dịch tả vịt, đã có nhiều nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh dịch tả vịt đ−ợc tiến hành. Nhiều loại vacxin dịch tả vịt đã đ−ợc sản xuất và l−u hành trên thị tr−ờng Việt Nam. Song việc sử dụng vacxin chủ yếu lại do ng−ời chăn nuôi quyết định. Hơn nữa do khâu chăn nuôi ch−a hợp lý, vệ sinh phòng bệnh ch−a triệt để đã ảnh h−ởng rất nhiều đến hiệu quả bảo hộ của vacxin. Gần đây, bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý (VSV - TN - BL) tr−ờng Đại học Nông nghiệp I đang có giống vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 có xuất xứ từ n−ớc ngoài. Những nghiên cứu ban đầu về hiệu lực bảo hộ của vacxin này đối với đàn vịt nuôi ở Việt Nam đã cho kết quả tốt. Để phục vụ cho việc nghiên cứu vacxin, cần thiết phải có một chủng virus c−ờng độc tiêu chuẩn. Chủng virus c−ờng độc này cũng đồng thời phục vụ cho công tác nghiên cứu về mặt độc lực, tính kháng nguyên và đặc điểm bệnh lý học của các chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt gây bệnh ở n−ớc ta những năm gần đây. Nhằm đóng góp thêm cơ sở khoa học đánh giá về tình hình dịch bệnh, sự thiệt hại của bệnh trong chăn nuôi và góp phần bổ sung, hoàn thiện các biện pháp phòng chống dịch bệnh cho đàn vịt đạt hiệu quả cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Tình hình bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi tại ngoại thành Hà Nội và một số tỉnh lân cận. Phân lập, khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus - 10 - c−ờng độc". 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định thực trạng bệnh dịch tả vịt trên các đàn vịt nuôi tại ngoại thành Hà Nội và một số tỉnh lân cận. - Phân lập virus gây bệnh dịch tả vịt. - Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt trên phôi vịt và trên vịt thí nghiệm. - Khảo sát tính t−ơng đồng kháng nguyên của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt chủng VG-2004 với một số chủng virus nh−ợc độc dịch tả vịt khác. - Nghiên cứu ứng dụng vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 vào thực tế sản xuất thông qua đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin. 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Là cơ sở đề ra biện pháp phòng trị bệnh dịch tả vịt có hiệu quả cao. - Là cơ sở để sử dụng virus nh−ợc độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà chủng DP-EG-2000 vào sản xuất vacxin phòng bệnh cho đàn vịt ở Việt Nam. - 11 - 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Bệnh dịch tả vịt Dịch tả vịt (Pestisanatum) là một bệnh truyền nhiễm có tính lây lan mạnh của loài thuỷ cầm do một loại Herpesvirus thuộc họ Herpesvirideae gây ra với đặc điểm là xuất huyết nội tạng và ỉa chảy nặng nề (Nguyễn Đức Hiền, 1999) [17]. 2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh * Lịch sử bệnh Năm 1923, một vụ dịch xảy ra ở đàn vịt nhà với triệu chứng ủ rũ, khát n−ớc và chết sau 1 ngày. Baudet (1923) [33] đã nghiên cứu về bệnh này. Ông không tìm thấy vi khuẩn nh−ng đã gây đ−ợc bệnh cho vịt khoẻ bằng n−ớc chiết phủ tạng của vịt ốm sau khi qua nến lọc Chamberland L3. Sau đó ông tiếp tục gây bệnh cho thỏ và gà nh−ng không thành công. Ông đã kết luận có thể nguyên nhân do một loại virus. (Trần Minh Châu, 1987) [6]. Năm 1930, cũng tại Hà Lan, De Zeeuw mô tả một tr−ờng hợp bệnh t−ơng tự xảy ra ở một đàn vịt 150 con. Năm 1942, dịch lại tái phát ở đất n−ớc này làm chết 2600 trong tổng số 5700 vịt. Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám khi vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, dạ dày tuyến, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu ở cuống họng và lỗ huyệt. Lần này, Boss (1943) [34] đã phân lập ra virus và cấy truyền 18 đời trên vịt. Chủng virus này đ−ợc giữ lại. Năm 1949, tại hội nghị thú y thế giới lần thứ XIV; căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng virus do Boss (1943) phân lập đ−ợc; Jansen và Kunst đã đề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000) [52]. * Phân bố bệnh Tại Châu Âu, bệnh dịch tả vịt đã đ−ợc Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964. Năm 1970, Gaudry [61] phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp; Asplin phát hiện - 12 - bệnh ở Anh. Tiếp theo, Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroj công bố bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Đức (Trần Minh Châu, 1980) [4]. Tại Châu Mỹ, Leibovitz & Hwang (1967) [51]; Brand, C.J., and D.E. Docherty (1984) [35] đã xác nhận bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Mỹ. Tại Châu á, năm 1944 bệnh xảy ra ở ấn Độ và tái phát vào năm 1963. Năm 1968, Jansen khẳng định bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Trung Quốc. Khi nghiên cứu về bệnh này, Mukerji xác nhận chủng virus của ấn Độ và chủng virus của Hà Lan có cùng tính chất kháng nguyên. Năm 1979 đã có báo cáo về sự xuất hiện bệnh dịch tả vịt ở đàn vịt trời và vịt Muscovy. Năm 1976, 1977, bệnh đã phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại tới 650.000 vịt (Vorapee Suwathanaviroij, 1978) [59]. ở Việt Nam, bệnh đ−ợc phát hiện lần đầu tiên ở Cao Bằng vào năm 1963. Lúc đó, sự bùng nổ của bệnh đã làm thiệt hại trên 3000 vịt (Đặng Trần Dũng, 1963) [11]. Tiếp theo, bệnh đã lây lan và có mặt ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả n−ớc. Theo thống kê mới nhất của OIE (2004) [53]; Việt Nam là một trong những n−ớc bị bệnh dịch tả vịt hoành hành dữ dội nhất. Năm 1999, bệnh đã làm chết 51.752 trong tổng số 123.851 vịt. Năm 2000, có 2.964 vịt chết vì bệnh dịch tả vịt trong tổng số 6.747 vịt. Năm 2001 phát hiện có 24.478 vịt chết trong 46.993 vịt và năm 2002 số vịt chết vì bệnh dịch tả vịt là 15.680. Nh− vậy, bệnh dịch tả vịt mặc dù đ−ợc phát hiện ra lần đầu tiên ở Châu Âu nh−ng gần đây bệnh chủ yếu lây lan và gây hại ở các n−ớc Châu á. Có lẽ do ở đây nghề chăn nuôi vịt đang ngày càng phát triển nh−ng các biện pháp phòng chống bệnh này vẫn ch−a đ−ợc quan tâm đúng mức. - 13 - Bảng 2.1: Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số n−ớc châu á từ năm 1996 - 2003 Năm Quốc gia Tổng số vịt (con) Số vịt chết (con) Malaysia 138.400 22430 Singapore 3000 400 1996 Trung Quốc 2000 1100 ấn Độ 424 17 1997 Malaysia 770 770 1998 Malaysia 100 100 ấn Độ 1215 119 Malaysia 2500 50 Nepal 100 74 1999 Việt Nam 123851 51752 ấn Độ 141 85 2000 Việt Nam 6747 2964 ấn Độ 1434 396 Malaysia 790 790 Thái Lan 1414 998 2001 Việt Nam 46993 24478 ấn Độ 1660 681 2002 Việt Nam 33831 15680 ấn Độ 2430 888 2003 Thái Lan 3693 1121 ( Nguồn: Annual animal disease status ) [53] - 14 - 2.1.2. Truyền nhiễm học 2.1.2.1. Loài mắc bệnh Trong tự nhiên, bệnh dịch tả vịt là bệnh của loài vịt bao gồm cả vịt nuôi và vịt hoang: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt đầu đỏ, .... Ngoài ra, các loài thuỷ cầm khác nh− ngỗng, thiên nga ... và một số loài chim hoang dã cũng cảm nhiễm bệnh (Friend (1973) [42]; Docherty D.E. & Franson C.J (1992) [39]). Vịt là loài cảm nhiễm nhất, các giống vịt ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh. Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết có thể lên tới 100%. Tuy nhiên mức độ cảm nhiễm với bệnh có thể khác nhau tuỳ theo giống vịt. Theo các kết quả nghiên cứu đã đ−ợc công bố, loài vịt nhọn đuôi đ−ợc coi là ít cảm nhiễm nhất đối với bệnh (Sandhu T.S. & Leibovitz L., 2003) [56]. Theo Vandorssen (1955) [58] thì trong họ Anatideae, chỉ loài vịt xám đ−ợc coi là đề kháng với bệnh. Các động vật khác nh− bồ câu, công và động vật có vú không cảm thụ với bệnh. Trong phòng thí nghiệm, có thể gây bệnh cho vịt con, ngỗng con, ngan con. Ngoài ra virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968) [46]. Vịt con là động vật thí nghiệm mẫn cảm nhất với bệnh. Theo OIE (2000) [52], dùng vịt con 1 ngày tuổi để gây bệnh, tiêm virus vào cơ bắp. Sau khi gây nhiễm 3- 12 ngày, vịt bị chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh. 2.1.2.2. Mùa vụ phát bệnh Theo các kết quả nghiên cứu trên thế giới nói chung, bệnh dịch tả vịt xảy ra nhiều nhất vào tháng 4 - 6 trong năm. Ngoài ra sự bùng nổ dịch bệnh phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện thời tiết, mùa sinh sản của vịt và ảnh h−ởng của nhân tố stress (Sandhu, T., 1998) [55]. ở Việt Nam, bệnh xảy ra quanh năm nh−ng phát triển mạnh vào thời vụ chăn nuôi vịt và trùng với thời vụ thu hoạch lúa: Vụ chiêm tháng 5 - 6, vụ mùa tháng 10 - 11 (Trần Minh Châu, 1996) [7]. Do đây là thời diểm vịt đã đ−ợc gột xong và đem chăn thả ngoài đồng để tận dụng thức ăn (Lê Hồng Mận, 1999) [24]. - 15 - 2.1.2.3. Tuổi mắc bệnh Bệnh xảy ra ở vịt mọi lứa tuổi, tuy nhiên vịt bị nhiễm nhiều nhất từ 15 ngày tuổi trở đi (Nguyễn Xuân Bình, 2004) [3]. 2.1.2.4. Chất chứa virus ở vịt bị nhiễm bệnh, virus có trong máu, các cơ quan phủ tạng, nhiều nhất là ở gan, lách và óc. Tại Việt Nam đã nghiên cứu sự nhân lên của virus ở cơ thể vịt bị gây nhiễm nhân tạo; sau khi nhiễm virus 24 giờ, vịt còn đang trong thời kỳ mang bệnh thì virus đã nhân lên, xâm nhập vào máu nh−ng số l−ợng virus còn ít. Đến 48 giờ, khi vịt chảy n−ớc mắt, n−ớc mũi thì virus đã xuất hiện trong các dịch này. Và đến 72 giờ, khi vịt bị bệnh nặng, bắt đầu ỉa chảy thì tế bào niêm mạc đ−ờng tiêu hoá do tác động của virus bị huỷ hoại, tróc ra cùng với dịch tiết có nhiều virus, theo phân bài xuất ra ngoài (Trần Minh Châu, 1987) [6]. Ngoài ra, vịt bệnh còn mang virus rất lâu và có thể tái phát bệnh ở thể ẩn tính. Ng−ời ta có thể phát hiện bệnh bằng kiểm tra nốt rộp ở mặt d−ới của l−ỡi vịt. ở môi tr−ờng ngoài, với điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, virus có thể tồn tại tới 30 ngày (OIE, 2004) [53]. Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài, 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây lan bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt chúng vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987) [6]. 2.1.2.5. Đ−ờng xâm nhập và cách lây lan Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm d−ới da, bắp thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi. Trong tự nhiên, đ−ờng xâm nhập chủ yếu của virus dịch tả vịt là đ−ờng tiêu hoá. Bởi vậy, bệnh lây lan rất nhanh và mạnh theo ph−ơng thức truyền lây gián tiếp. Vịt bệnh bài xuất căn bệnh theo phân, n−ớc mắt, n−ớc mũi làm ô nhiễm thức ăn, n−ớc uống. Từ đó bệnh lây lan sang vịt khoẻ và các động vật cảm nhiễm khác. Vịt khoẻ và các động vật cảm nhiễm này lại trở thành nguồn - 16 - phát tán căn bệnh tiếp theo. Jansen (1964) [45] cho biết, nguồn n−ớc và các động vật thuỷ sinh trong đó cũng đóng vai trò nhất định trong việc truyền lây căn bệnh. Khi dịch xảy ra, việc bán chạy vịt bệnh, mổ thịt vịt ốm đều làm cho bệnh lan đi rất nhanh và xa. Ph−ơng thức truyền lây trực tiếp từ mẹ sang con cũng có thể xảy ra (Burgess E.C và TM Yuill, 1981) [36]. 2.1.3. Triệu chứng và bệnh tích 2.1.3.1. Triệu chứng Sau khi bị nhiễm virus c−ờng độc dịch tả vịt thì vịt sẽ phát bệnh sau 3 - 4 ngày, thời gian nung bệnh có thể dài hơn hoặc ngắn hơn phụ thuộc vào bệnh lần đầu tiên xảy ra hay đã từng xảy ra đối với đàn vịt. Các diễn biến về triệu chứng của bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt bị nhiễm bệnh nh− sau: Khi bệnh phát ra, quan sát toàn đàn sẽ thấy nhiều con có tiếng kêu khản đặc. Một số vịt lờ đờ, chậm chạp hẳn. Những vịt này giảm ăn, th−ờng đi ở cuối, thậm chí bị tách khỏi đàn. Sau những dấu hiệu ban đầu, triệu chứng đầu tiên của bệnh thể hiện trên vịt là mắt bị s−ng, chảy nhiều n−ớc mắt. Mũi cũng có hiện t−ợng chảy niêm dịch trong, thành dòng trên mỏ, sau đặc lại đóng chặt hai khoé mũi thành vảy màu vàng, kết hợp với sự tiến triển của quá trình viêm trong đ−ờng hô hấp khiến vịt bị khó thở; n−ớc dãi của vịt có mùi hôi thối (Trần Minh Châu, 1987) [6]. Vịt sốt cao và ỉa chảy nặng. Phân của vịt có màu trắng xanh; có mùi khắm, tanh rất đặc tr−ng. Bệnh tiếp tục diễn biến xấu; vịt bị liệt, nằm một chỗ. Bắt vịt lên xem thì thấy lông quanh vùng hậu môn dính bết phân. Nhiều con bị s−ng đầu, sờ nắn thấy đầu vịt mềm, nhũn. Ngoài ra, bệnh dịch tả vịt còn có một số triệu chứng khác đáng chú ý nh−: vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh. Vịt tì mỏ xuống đất. Vịt đực bị sa d−ơng vật, niêm mạc có những vết loét. Vịt đẻ giảm sản l−ợng trứng mạnh. - 17 - Bệnh kéo dài 4- 6 ngày làm vịt gầy rạc, thân nhiệt hạ và vịt chết. Các tác giả Nguyễn Vĩnh Ph−ớc (1978) [25], Trần Minh Châu (1987) [6], Phạm Quang Hùng (2003) [19] và nhiều công trình nghiên cứu khác về triệu chứng của bệnh dịch tả vịt đều tiến tới xác nhận những triệu chứng đặc tr−ng nhất của bệnh dịch tả vịt là: s−ng đầu, liệt chân, chảy n−ớc mũi, n−ớc mắt có dử, ỉa chảy phân trắng xanh. Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28] cho biết số liệu điều tra về tỷ lệ phân bố các triệu chứng và bệnh tích của bệnh dịch tả vịt, trong đó: - Sốt cao: 100% - ỉa chảy phân xanh: 100% - Liệt chân: 90- 95% - Chảy n−ớc mắt có dử: 90- 95% - S−ng đầu: 70- 80% Căn cứ vào những kết quả nghiên cứu nêu trên, ng−ời chăn nuôi và thú y viên có thể nhanh chóng phát hiện và ngăn ngừa dịch bệnh lây lan. 2.1.3.2. Bệnh tích Khi mổ khám thấy xác chết gầy, bẩn do vịt ỉa chảy, mất n−ớc kéo dài. Nhổ sạch lông thấy da vùng đầu, cổ, ngực, bụng, đùi xuất huyết lấm tấm. Tổ chức liên kết d−ới da vùng đầu, cổ thuỷ thũng, có dịch keo nhầy trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng. Mổ khám các cơ quan nội tạng nh−: gan, lách, thận, cơ tim...thì thấy ở các cơ quan này đều biểu hiện bệnh tích s−ng, tụ huyết hoặc xuất huyết, đặc biệt ở gan còn có những điểm hoại tử màu trắng đục, to bằng đầu đinh ghim hoặc hơn (Trần Kim Anh (2004) [2]; Phạm Sỹ Lăng (2002) [23]). Theo Trần Minh Châu (1996) [7] thì bệnh tích của bệnh dịch tả vịt đặc tr−ng là đ−ờng tiêu hoá có những chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng; bên trên có phủ lớp màng giả, khó bóc. Phần ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn nhìn từ ngoài vào thấy có màu nâu hoặc tím rất đặc tr−ng. - 18 - Phạm Quang Hùng (2003) [19] cho biết ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những đặc tr−ng riêng: Vịt bố mẹ bệnh tích chủ yếu là ở tuyến ức, xuất huyết mô và tổn th−ơng bộ máy sinh sản. Còn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu ở các Lymphoid. Việc kiểm tra triệu chứng và bệnh tích đặc tr−ng có thể giúp sơ bộ kết luận bệnh dịch tả vịt. Tuy nhiên, để chẩn đoán chính xác bệnh dịch tả vịt còn phải sử dụng những cách thức chẩn đoán trong phòng thí nghiệm, thậm chí phải kết hợp nhiều biện pháp chẩn đoán khác nhau. 2.1.4. Chẩn đoán 2.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng Đây là cách thức chẩn đoán đầu tiên và th−ờng xuyên đ−ợc sử dụng ở các hộ chăn nuôi. Thú y viên hoặc chủ chăn nuôi dựa vào những triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ của bệnh để kết luận bệnh. Trong quá trình chẩn đoán, cần phân biệt với một số bệnh khác ở vịt: Bệnh viêm gan do virus: Bệnh chỉ tập trung ở vịt con từ 1- 3 tuần tuổi. Gan chủ yếu bị viêm, xuất huyết thành điểm, thành vệt chứ ít có hiện t−ợng hoại tử. Bệnh tụ huyết trùng và phó th−ơng hàn: Là hai bệnh do Pasteurella và Salmonella gây nên. Đây là những vi khuẩn th−ờng trú trong cơ thể vịt, ngay cả ở vịt khoẻ. Cho nên bệnh dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khó khăn cho công việc chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phó th−ơng hàn đơn thuần thì khi điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu có thể nhanh chóng dập tắt dịch. Ngoài ra các ph−ơng pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm cũng giúp cho việc phân biệt các bệnh dễ dàng hơn. Bệnh s−ng phù đầu Coryza: Do một loại vi khuẩn Haelmophilus gây ra, nên nếu điều trị bằng kháng sinh: Colistin, Gentamycin, Flumequin... sẽ có hiệu quả. Ngoài ra, vịt không có biểu hiện ỉa chảy phân xanh trắng và tỷ lệ vịt chết do bệnh thấp. (Nguyễn Xuân Bình, 2004) [3]. - 19 - 2.1.4.2. Chẩn đoán virus học Bệnh phẩm dùng để chẩn đoán tốt nhất là gan, thận, lách của vịt nghi mắc bệnh. Nghiền bệnh phẩm với dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline); cho thêm kháng sinh (Penicillin, Steptomycin) diệt tạp khuẩn, ly tâm tốc độ 1800 vòng/phút trong 15 phút, lấy n−ớc trong gây nhiễm cho vịt con, phôi vịt và môi tr−ờng nuôi cấy tế bào. * Nuôi cấy trên vịt con Dùng huyễn dịch bệnh phẩm đã đ−ợc xử lý nh− trên tiêm cho vịt con (mỗi con nặng khoảng 1 kg) với liều 0,5ml/con vào d−ới da hay bắp l−ờn. Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc tr−ng của bệnh dịch tả vịt giống nh− đã mô tả. * Nuôi cấy trên phôi vịt Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào phôi vịt 12 ngày tuổi với liều 0,2ml/phôi vào xoang niệu. Sau 4 - 6 ngày, nếu bệnh phẩm có virus, phôi sẽ chết với bệnh tích: Xuất huyết, phù thũng d−ới da, tổ chức d−ới da; gan bị hoại tử, màng nhung niệu s−ng dày. * Nuôi cấy trên môi tr−ờng tế bào Có nhiều loại môi tr−ờng tế bào đ−ợc sử dụng để nuôi cấy virus dịch tả vịt nh−: tế bào xơ phôi vịt, tế bào xơ phôi ngan, ... Với huyễn dịch bệnh phẩm đ−ợc xử lý nh− trên, nếu có virus dịch tả vịt, thì khi nuôi cấy vào tế bào, virus sẽ gây biến đổi các tế bào trong môi tr−ờng. CPE biểu hiện là sự thoái hoá tế bào và trong nhân tế bào có các hạt vùi dạng Crowdy A (Trần Minh Châu, 1987) [6]. Ngoài ra, có thể sử dụng ph−ơng pháp phát hiện Plaque (những tế bào bị virus gây thoái hoá) để xác định virus. 2.1.4.3. Chẩn đoán bằng phản ứng trung hoà Để làm phản ứng trung hoà có thể dùng kháng huyết thanh dịch tả vịt trộn với huyễn dịch bệnh phẩm. Sau đó tiêm cho phôi trứng hoặc tiêm cho vịt thí nghiệm (lô thí nghiệm). Nếu phôi trứng hoặc vịt thí nghiệm không chết mà - 20 - ở lô đối chứng có hiện t−ợng chết với triệu chứng, bệnh tích đặc tr−ng của bệnh dịch tả vịt thì có thể kết luận bệnh (Nguyễn Xuân Bình, 2004) [3] ở trên vịt, có thể tiến hành phản ứng trung hoà bằng cách tiêm vacxin cho vịt ở lô thí nghiệm. Sau 15 - 20 ngày thì tiêm huyễn dịch bệnh phẩm cho vịt (ở cả lô thí nghiệm và lô đối chứng). Nếu thấy vịt ở lô đối chứng chết với triệu chứng, bệnh tích đặc tr−ng của bệnh dịch tả vịt mà ở lô thí nghiệm vịt không chết thì cũng có thể kết luận đ−ợc bệnh (Nguyễn Nh− Thanh, 2001) [28]. Ngoài các ph−ơng pháp nêu trên, có thể chẩn đoán chính xác bệnh dịch tả vịt bằng các ph−ơng pháp khác nh− phản ứng trung hoà trên nuôi cấy tế bào, chẩn đoán bằng ph−ơng pháp ELISA, ... 2.1.4.4. Chẩn đoán bằng ph−ơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) Ph−ơng pháp Polymerase chain reaction (PCR) hay phản ứng chuỗi polymerase do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 đã đ−a lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một ph−ơng pháp tạo dòng invitro, không cần sự hiện diện của tế bào. PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, dựa trên nguyên tắc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt để tổng hợp nên một mạch DNA mới bổ sung với đoạn DNA khuôn mẫu. Kỹ thuật PCR đ−ợc phát triển từ các tổ hợp đang tồn tại và đ−ợc cải tiến, dựa nhiều vào các đặc điểm nhiệt động học của các cặp gốc AT và GC (Hồ Huỳnh Thuỳ D−ơng (2003) [13]; Lê Thanh Hoà (2002) [18]). Phản ứng PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba b−ớc (ba giai đoạn): Bung liên kết của DNA (giai đoạn biến tính); Mồi bám (giai đoạn lai); Tổng hợp (giai đoạn kéo dài). Ba b−ớc trong chu kỳ này đ−ợc lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả là từ một đoạn DNA bất kỳ có thể đ−ợc nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần mà không cần đến tế bào vi sinh vật. Có nghĩa rằng một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ trong genome đ−ợc khuếch đại lên rất nhiều lần (2n sau n chu kỳ) khi trình tự nucleotid ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết (Võ Thị Th−ơng Lan, 2002) [21]. - 21 - Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA đ−ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 0,8%- 2%, và DNA đ−ợc nhìn thấy rõ d−ới tia cực tím, sau khi đã nhuộm Ethidium Bromid (một loại hoá chất có khả năng bám và làm hiển thị DNA). Độ dài DNA sản phẩm đ−ợc tính bằng cách so sánh với chỉ thị DNA (DNA Marker), hay sử dụng DNA của thực khuẩn thể Lambda cắt bằng enzym giới hạn HindIII (Lê Thanh Hoà, 2002) [18]. ứng dụng trong công tác chẩn đoán bệnh dịch tả vịt, với đoạn mồi đ−ợc xác định tr−ớc là của chủng virus dịch tả vịt chuẩn trên thế giới có trong ngân hàng gen. Khi đ−a mẫu bệnh phẩm cần chẩn đoán vào và tiến hành phản ứng PCR, đoạn mồi nói trên sẽ làm một đoạn DNA của virus dịch tả vịt (nếu có trong bệnh phẩm) nhân lên nhanh chóng với số l−ợng lớn. Sản phẩm này đ−ợc phát hiện khi điện di trên thạch agarose 0,8 - 2%. Để xác định trình tự các nucleotid của vùng gen cần nghiên cứu, có thể lấy sản phẩm PCR để xác định trực tiếp trình tự trên máy giải trình tự động (automated sequencer), nếu sản phẩm PCR tốt và đơn nhất. Tuy nhiên trong nhiều tr−ờng hợp, khi xác định trình tự nucleotid cần thiết phải tạo dòng sản phẩm PCR (gọi là dòng hoá, cloning), vì trong phản ứng PCR, đôi khi có những vùng nhân lên không đặc hiệu nh− mong muốn mà qua điện di không thể phát hiện đ−ợc. Do đó nó sẽ bị lẫn vào sản phẩm PCR, và khi đọc trình tự sẽ làm chuỗi nucleotid bị rối và không chính xác. Mặt khác, số l−ợng DNA trong sản phẩm PCR th−ờng ít, chất l−ợng kém nên khi giải trình trình tự sẽ gặp khó khăn. Nguyên lý của dòng hoá là đ−a đoạn DNA sản phẩm của PCR gài vào trong hệ gen của một vòng DNA đã đ−ợc thiết kế tr−ớc, gọi là plasmid (hay plasmid dẫn truyền, cloning vector). Sau đó plasmid chứa DNA ngoại lai này đ−ợc chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng để nuôi cấy với số l−ợng lớn và tách DNA plasmid chứa đoạn PCR nói trên (plasmid tái tổ hợp), nhằm thu đ−ợc một số l−ợng lớn bản sao DNA một cách chính xác nhất. Để thực hiện - 22 - tạo dòng, phải có các thành phần sau: DNA ngoại lai (DNA của PCR nhân vùng gen mong muốn), vector dẫn truyền (plasmid mang) và dòng tế bào chủ thích ứng (vi khuẩn, nấm men hay tế bào động vật). Đầu tiên, DNA ngoại lai đ−ợc nối vào vector nhằm tạo ra vector tái tổ hợp. Vector sử dụng là plasmid thích ứng của vi khuẩn E. coli. Sau đó vector tái tổ hợp chuyển nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ đ−ợc cấy trong môi tr−ờng thích hợp để nhân vi khuẩn nhân lên nhiều lần. tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E. coli. Cuối cùng qua các b−ớc tách chiết DNA, ng−ời ta sẽ thu đ−ợc một số l−ợng lớn DNA của plasmid tái tổ hợp. Quá trình tạo dòng nói chung gồm các b−ớc: 1) Chọn và xử lý vector, 2) Xử lý DNA cần tạo dòng, 3) Tạo vector tái tổ hợp vào tế bào chủ, 4) Phát hiện dòng cần tìm.._. Tác giả Vũ Minh Thục (2004) [32] cho biết nh−ợc điểm chính của ph−ơng pháp PCR là sự nhạy cảm khác th−ờng của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả “d−ơng tính sai”, và th−ờng diễn ra bởi một số l−ợng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999) [43] khẳng định sự đặc tr−ng của đoạn mồi đã đ−ợc kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở các gia cầm khác nh− đại bàng, chim câu, gà, …Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn không cho sản phẩm. Điều này có nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt. Với hai đoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR đ−ợc đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bào. 2.1.5. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt 2.1.5.1. Biện pháp can thiệp Bệnh dịch tả vịt là bệnh không chữa đ−ợc. Nên giết chết và chôn sâu những vịt bị bệnh chết hoặc bệnh quá nặng. (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1978) [25]. Tuy nhiên đối với tr−ờng hợp đàn vịt mới chớm mắc vài con thì có thể can thiệp - 23 - bằng cách tiêm vacxin dịch tả vịt nh−ợc độc cho toàn đàn. Những vịt nào đã bị nhiễm virus thì sẽ phát bệnh ngay còn những vịt ch−a bị nhiễm virus sẽ đ−ợc bảo hộ nhờ vào hiện t−ợng cản nhiễm. Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc đàn vịt tốt thì có thể cứu đựơc tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1996) [7]. 2.1.5.2. Phòng bệnh Để phòng bệnh hiệu quả, cần thực hiện tốt cả hai khâu: Vệ sinh phòng bệnh và tiêm phòng bằng vacxin * Vệ sinh phòng bệnh ở những nơi ch−a có bệnh tốt nhất nên tự túc con giống. Khi tạo đàn không nên nhập chung nhiều đàn nhỏ lại. Lò ấp trứng cũng không nên ấp trứng của quá nhiều đàn. Sau mỗi lần ấp trứng cần tẩy uế lò ấp rồi sát trùng kỹ bằng hơi formol (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1978) [25]. Ngày nay, bệnh dịch tả vịt có những diễn biến phức tạp. Tác giả Phạm Quang Hùng (2003) [19] nêu một số nguyên tắc phòng bệnh bằng vệ sinh nh− sau: - Chuồng trại vịt cách xa khu dân c−. Cổng trại phải có hố sát trùng (th−ờng sát trùng bằng Cloramin 3%). Hạn chế ng−ời đi lại, ng−ời ra vào trại phải sát trùng giày dép, tay chân. - Điều kiện nuôi d−ỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ. Thức ăn, n−ớc uống phải vệ sinh. Thực hiện tiêu độc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa hai lứa vịt. Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại. - Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất ba tuần lễ. * Tiêm phòng bằng vacxin - Vacxin dùng để phòng bệnh dịch tả vịt có 2 loại là vacxin vô hoạt và vacxin nh−ợc độc. + Vacxin vô hoạt: Để vô hoạt virus dịch tả vịt, tr−ớc đây th−ờng dùng hoá chất là formon, gần đây sử dụng chất BPC (Beta propiolactore). Tại Việt Nam, đã chế thử vacxin vô hoạt nh−: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxin tím, vacxin formon gan. - 24 - Theo OIE (2000) [52]: vacxin vô hoạt tạo đ−ợc miễn dịch cho đàn vịt nh−ng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nh−ợc độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, ch−a đ−ợc áp dụng trong sản xuất. + Vacxin nh−ợc độc: Chủng virus dịch tả vịt nh−ợc độc đầu tiên do Jansen và Kunst (1964) [47] nghiên cứu. Chủng virus này không còn độc với vịt, vẫn giữ đ−ợc tính kháng nguyên và trở thành chủng virus vacxin. Cùng với quá trình nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt; ở nhiều n−ớc, các nhà khoa học đã dùng các chủng virus dịch tả vịt phân lập ở địa ph−ơng để chế tạo virus vacxin bằng các ph−ơng pháp khác nhau. ở ấn Độ, Mukerji đã tạo đ−ợc một chủng virus nh−ợc độc bằng cách dùng virus c−ờng độc phân lập ở Cancuta đem cấy truyền liên tiếp 25 đời trên phôi gà. Vacxin gây hiệu lực miễn dịch cho vịt trong 14 tháng. ở Mỹ, Dardini (1968) [38] đã tạo đ−ợc một chủng virus nh−ợc độc bằng cách cấy truyền nhiều đời virus c−ờng độc trên môi tr−ờng phôi vịt và phôi gà. Ngày nay, ng−ời ta sử dụng hai chủng virus vacxin là virus nh−ợc độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt và virus dịch tả vịt chủng Jasen thích nghi trên phôi gà và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi gà một lớp. Đây là 2 loại vacxin có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài sau khi tiêm vacxin (9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch). Vacxin sử dụng an toàn cả với vịt con một ngày tuổi. Vacxin đ−ợc chế biến d−ới 2 dạng vacxin t−ơi và vacxin đông khô (Lê Hồng Mận, 1999) [24]. Vacxin t−ơi th−ờng đ−ợc đóng ở ampoul 100 liều, chỉ bảo quản tối đa là 4 tháng ở kho lạnh và phải dùng không quá 6 giờ khi đã pha loãng vacxin bằng n−ớc sinh lý. Vacxin đông khô thì thời gian bảo quản dài hơn (khoảng 1 năm) và ít bị mất hiệu lực hơn khi gặp điều kiện bất lợi. Vacxin đông khô có thể đóng 1ampoul 100 liều hoặc chai có từ 500 - 1000 liều (Nguyễn Nh− Thanh, 2001) [28]. - 25 - Tùy theo liều đóng vacxin mà pha loãng với n−ớc sinh lý đủ cho 0,2ml/vịt con và 0,3 - 0,5ml/vịt lớn. Đ−ờng tiêm chủ yếu của vacxin nh−ợc độc là tiêm d−ới da hoặc bắp l−ờn. - Về lịch trình sử dụng vacxin, có nhiều công trình nghiên cứu nhằm mục đích bảo hộ hữu hiệu nhất cho đàn vịt nuôi. Hầu hết các công trình đó đều thống nhất ở một số điểm nh− sau: + Với đàn vịt ở vùng bị dịch uy hiếp, cần tiêm phòng cho vịt con ngay sau khi vịt nở. + Vịt nuôi thịt chỉ cần tiêm phòng 1 lần. ở nơi không bị dịch uy hiếp, có thể tiêm phòng cho vịt vào lúc vịt từ 2-3 tuần tuổi. + Đối với vịt đẻ và vịt giống, lịch tiêm phòng yêu cầu chặt chẽ hơn. Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28], Phạm Quang Hùng (2003) [19] đề nghị tiêm phòng ngay sau khi vịt nở từ đàn vịt bố mẹ đã đựơc phòng bệnh dịch tả vịt. Sau 45 ngày cần tiêm lại và sau 1 năm thì cứ mỗi 6 tháng lại tiêm phòng 1 lần. Lê Hồng Mận (1999) [24], Nguyễn Xuân Bình (2004) [3] cũng cho rằng cần tiến hành tiêm 2 lần/ năm đối với vịt lớn; Lần 1: cuối xuân đầu hè - Lần 2: sau lần thứ nhất 6 tháng. Ngoài ra, tác giả Trần Minh Châu còn đề nghị tiêm củng cố cho vịt con 10 ngày tuổi bằng vacxin viêm gan để đảm bảo cho đàn vịt nuôi tại những nơi bị ô nhiễm nặng. 2.2. Virus Gây bệnh dịch tả vịt Virus gây bệnh dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus. Virus chỉ có 1 serotype đ−ợc biết đến nh−ng có nhiều chủng có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên ( Nguyễn Nh− Thanh, 2001) [28]. 2.2.1. Virus nhóm Herpes Virus Herpes đ−ợc Gritner (1912) phát hiện trong dịch thể nốt phồng Herpes ở ng−ời bằng cách dùng thể này gây bệnh cho thỏ vào giác mạc đã đ−ợc rạch sẵn. - 26 - Các virus nhóm Herpes đ−ợc xếp vào nhóm virus có dạng cấu trúc phức tạp, có kích th−ớc từ 120 - 200nm, là loại có kích th−ớc trung bình. Herpesvirus có kiểu đối xứng khối, đ−ợc tạo thành từ 4 thành phần cấu trúc: vỏ, teguenzymt, capxit và nhân. Vỏ bọc capxit của virus này có đ−ờng kính trung bình từ 110 - 150nm, gồm 160 capsome hình lăng kính. Trung tâm của virus là một nhân đậm đặc chứa DNA mạch đôi, xoắn thẳng có trọng l−ợng phân tử 150.106 Dalton. Tỷ lệ guanin và xytozin không giống nhau giữa các virus trong nhóm.(Gaidamovich, 1970) [15]. Herpesvirus không bền với nhiệt, nhạy cảm với ete và chloroform. Tuy nhiên, chúng t−ơng đối bền với sự thay đổi của pH môi tr−ờng (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1978) [25]. Virus có khả năng nhân lên trên tế bào nuôi. Khi nhiễm trùng tự nhiên hay thực nghiệm trên súc vật, trong các mô nhiễm phát hiện ra các hạt vùi kiểu A theo Crowdy (trên cơ sở đó mà Andrew đề nghị gọi là nhóm Nitavirus, tức Nuclear inclusion type A). Các kiểu tổn th−ơng mà virus gây nên đối với tế bào bị xâm nhiễm có thể là: tế bào đa nhân khổng lồ với các hạt vùi trong nhân; t−ơng bào bị không bào hóa; tế bào nhân sáng hơn do ít chất nhiễm sắc, có những hạt virus đang hình thành ở các giai đoạn khác nhau (Trần Minh Châu, 1987) [6]. Quá trình tổng hợp DNA của Herpesvirus xảy ra trong nhân. Lê Huy Chính (2001) [9] cho biết: Sau khi virion xâm nhập vào nguyên t−ơng bào do sự hòa màng thì diễn ra sự cởi vỏ và phức hợp DNA - protein di chuyển vào nhân tế bào. DNA sao mã thành RNAm trong nhân tế bào, còn protein tổng hợp ở nguyên t−ơng. Sự tổng hợp DNA của virus ở trong tế bào nuôi có thể bị ức chế bởi chất 5 - iod - zdesoxyuridin. Dựa vào đây, ng−ời ta có thể phân loại các virus trong nhóm này và đây cũng chính là nguyên nhân để xếp virus vào nhóm DNA virus (Nguyễn Thị Chính, Lê Tiến Hiển, 2001) [10]. - 27 - 2.2.2. Virus dịch tả vịt ( Duck enteritis virus) 2.2.2.1. Hình thái, kích th−ớc Virus dịch tả vịt có hình thái gần tròn, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa. Về kích th−ớc, virus hoàn chỉnh (có màng nhân bao quanh) có đ−ờng kính trung bình 60nm. Virus ch−a hoàn chỉnh (không có màng nhân bao quanh) có đ−ờng kính trung bình là 100nm. Nguyễn Vĩnh Ph−ớc (1978) [25]; Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28] cho biết: Virus có đ−ờng kính tăng dần khi cấu trúc dần đ−ợc hoàn thiện. ở những tế bào đ−ợc gây nhiễm virus, sau 24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất. Đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống nh− bụi. Trong nhân, hạt virus có đ−ờng kính là 93,5 nm; trong nguyên sinh chất có đ−ờng kính là 136 nm và thành thục ở không bào với đ−ờng kính 250 nm. Theo Trần Minh Châu (1987) [6] ở Việt Nam, virus dịch tả vịt c−ờng độc chủng 769 có hình thái và cấu trúc giống nh− virus mà Brixơ, Dardini (1968) [38], Proctor (1976) [54] và Bergmann (1978) [60] đã mô tả. Virus dịch tả vịt qua đ−ợc lọc Chamberland, Berkefeld nh−ng không qua đ−ợc màng lọc Seitz. Bằng ph−ơng pháp lọc qua màng lọc; Hess và Dardini (1968) [44]đã nhận xét, virus dịch tả vịt nh−ợc độc chủng Jansen và virus c−ờng độc có kích th−ớc 150 - 250 nm. 2.2.2.2. Sức đề kháng Với nhiệt độ, theo nghiên cứu của Hess (1968) [44], ở 22oC virus giảm dần tính gây nhiễm đến 30 ngày thì virus bị vô hoạt hoàn toàn. Virus bị mất hoạt tính ở 50oC sau 2 giờ 30 phút. Nếu đ−ợc sấy khô bằng CaCl2 thì sau 9 ngày virus bị chết. Tác giả Nguyễn Vĩnh Ph−ớc (1978) [25] cho biết: ở 0o - 4oC virus không bảo quản đ−ợc 3 tháng nh−ng nếu ngâm trong dung dịch Glyxerin 50% thì virus giữ đ−ợc độc lực trong thời gian trên. Theo Trần Minh Châu (1986) [5] thì virus dịch tả vịt đề kháng kém với nhiệt độ, ở nhiệt độ cao virus bị vô hoạt nhanh còn ở nhiệt độ thấp - 28 - hơn thì tính gây nhiễm của virus giảm dần. Ngoài ra, Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28] khẳng định: Virus mất khả năng gây nhiễm ở 300C sau 2 giờ; 700C trong 20 phút, 800C virus bị vô hoạt sau 5 phút. Trong điều kiện lạnh từ -100C đến -200C, virus có thể tồn tại rất lâu. Làm đông khô các chất chứa virus không những có thể giữ virus nhiều năm mà còn không làm mất độc lực của virus. Với pH môi tr−ờng: virus ổn định ở pH từ 5 - 10 và bị bất hoạt khi pH < 3 hoặc pH > 10. Với một số nhân tố hóa học, virus dịch tả vịt rất nhạy cảm với ete và chloroform. D−ới tác dụng của hai chất này, virus bị phá hủy. Kunst (1967) [48] cho rằng Natri lauryl sulfate, Natridesoxycholate, Zephirol, Saponin có ảnh h−ởng với virus. Theo Nguyễn Thát (1975) [29]; Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28] thì cồn 750 diệt virus trong 5-30 phút, acid phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút. NaOH 2% và NH4OH 0,5% ở 22 0C cũng giết chết virus sau 30 phút. Với một số enzym, Hess và Dardini (1968) [44] cho biết virus dịch tả vịt bị các men Trypsin, Chimotrypsin, Lypase của tụy phá hủy. 2.2.2.3. Độc lực Cho đến nay, ng−ời ta đã xác định đ−ợc một số chủng virus dịch tả vịt có độc lực khác nhau nh− sau: - ở Hà Lan có: Chủng O độc lực mạnh nhất, sau đó đến các chủng W59, W60, N (Jansen, (1968) [46]. - ở Việt Nam có: chủng 769, 880 có độc lực mạnh nhất, sau dó là các chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987) [6]. 2.2.2.4. Đặc tính nuôi cấy Virus dịch tả vịt không có khả năng gây ng−ng kết hồng cầu, không hấp thụ hồng cầu. Trong tế bào phôi gà, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành tiểu thể bao hàm. Trong môi tr−ờng nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình thành Plaque. Khi có mặt bổ thể, kháng thể dịch tả vịt có khả năng làm tan tế bào xơ phôi vịt bị nhiễm virus (Lam, 1984) [49]. - 29 - * Nuôi cấy trên phôi Jansen sau khi nghiên cứu về đặc tính nuôi cấy của virus dịch tả vịt đã kết luận: Virus dịch tả vịt sau khi đã tiêm truyền trên phôi vịt sẽ dễ dàng thích nghi trên phôi gà. Mặc dù vậy, khi nuôi cấy trên phôi vịt, tỷ lệ chết của phôi không cao và theo kinh nghiệm thì virus dịch tả vịt Việt Nam có vẻ nh− khó nuôi cấy trên phôi gà (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1978) [25]. Nghiên cứu về khả năng nhân lên trên phôi của virus dịch tả vịt, Trần Minh Châu, (1987) [6] cho rằng màng nhung niệu là đ−ờng tiêm truyền tốt nhất. Theo Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28], nuôi cấy virus trên màng niệu đệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4- 6 ngày với các bệnh tích: xuất huyết trên da vùng l−ng, rìa cánh, đầu; gan và bề mặt quả tối có điểm xuất huyết và hoại tử. Ngoài ra, một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi lại có hiện t−ợng màng nhung niệu s−ng dày. Virus dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết chết phôi sau 3 - 5 ngày. Virus c−ờng độc dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền đầu tiên trên phôi gà. Đối với phôi gà 9 - 10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 đời liên tiếp virus mới thích nghi. Qua nhiều lần cấy truyền virus trên phôi vịt, phôi gà, độc lực của virus sẽ giảm dần với vịt. Ng−ời ta sử dụng những chủng virus nh−ợc độc này qua phôi gà, phôi vịt để chế tạo vacxin. * Nuôi cấy trên tế bào Virus dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi tr−ờng tế bào phôi vịt, phôi gà một lớp và gây ra biến đổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968) [46]. Burgess (1981) [36] công bố virus dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi gà. Theo Ronald Atlanasio, (1989) thì không quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, - 30 - BGM và BD (Trần Minh Châu, 1987) [6]. ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus c−ờng độc trên tế bào xơ phôi vịt. Sau 36 giờ có hiện t−ợng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (Synciticum) nh− những dải đăng ten. Lớp tế bào này sẽ bị phá huỷ hoàn toàn vào ngày thứ 4. Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng độ loãng, có thể phát hiện đ−ợc Plaque (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá) bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch Fushin kiềm hoặc đỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng, 1972) [12]. Nếu nhuộm bằng Fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plaque hiện ra trên nền đỏ, hình tròn, bờ không gọn và có đ−ờng kính 1 - 2mm (Trần Minh Châu, 1987) [6]. Theo Dardini và Hess (1968) [38] Plaque của virus dịch tả vịt c−ờng độc hình tròn, to nhỏ không đều, có đ−ờng kính từ 1 - 8mm. Plaque của virus dịch tả vịt nh−ợc độc thì đều hơn, có bờ gọn và sáng, đ−ờng kính là 3 - 4mm. Nguyễn Nh− Thanh (2001) [28] cũng mô tả, với các chủng virus nh−ợc độc, Plaque đều gọn và sáng rõ; ở ngày thứ 3 có đ−ờng kính 3mm, sau 6 ngày là 4 - 7mm và sau 14 ngày sẽ là 10mm. Về sự nhân lên của virus ở tế bào nuôi cấy, qua nghiên cứu thấy rằng: 12 giờ sau khi cấy virus vào tế bào đã tìm thấy virus ở trong nhân tế bào. Đến 24 giờ virus đã có mặt ở nguyên sinh chất và lúc 60 giờ thì tế bào có hàm l−ợng virus cao nhất. Sự xuất hiện Plaque trên các môi tr−ờng nuôi cấy khác nhau là khác nhau. Virus c−ờng độc thì nhân lên và hình thành các Plaque đẹp theo thứ tự các môi tr−ờng sau: tế bào xơ phôi ngan và uyên −ơng, xơ phôi vịt Bắc Kinh, vịt đen, vịt đầu đỏ. Còn xơ phôi vịt mốc và vịt bãi là kém nhất. Virus nh−ợc độc dịch tả vịt của Hà Lan lại có thứ tự các môi tr−ờng thích hợp khác: tế bào xơ phôi vịt Bắc Kinh, tế bào xơ phôi gà, trĩ Mông Cổ, cun cút (Ronald Atlanansio, Robert Olson, James. C. Johnson, 1980) (Trích Trần - 31 - Minh Châu, 1987) [6]. Đối với virus nh−ợc độc chủng Jansen, virus rất thích ứng trên môi tr−ờng tế bào xơ phôi gà. Chỉ sau 24 giờ cấy virus, tế bào đã bắt đầu có hiện t−ợng huỷ hoại. tế bào bị biến dạng, co tròn, phình to ra, tập trung thành từng đám và có thể nhìn rõ d−ới kính hiển vi quang học (nghiên cứu của Bộ môn VSV - TN - BL tr−ờng Đại học Nông nghiệp I). * Nuôi cấy trên động vật cảm thụ Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy, virus nhân lên, 3 - 12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh. Ngoài vịt con, có thể dùng ngan con, ngỗng con, gà con mới nở để gây bệnh. 2.2.3. Miễn dịch chống virus dịch tả vịt 2.2.3.1. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Khi virus xâm nhập và tấn công vào các tế bào, ngay lập tức hệ thống miễn dịch của cơ thể sẽ chống trả bằng việc sinh ra các chất miễn dịch không đặc hiệu nhằm chống lại sự xâm nhập và nhân lên của virus. Các chất đó bao gồm: * Interferon: Là một chất do tế bào sinh ra. Nó có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng virus. Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông điệp của virus ở Ribosome của tế bào (Nguyễn Đ−ờng, 1990) [14]. Nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện t−ợng cản nhiễm (Interferon); Jansen (1964) [45] đã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt đã nhiễm virus c−ờng độc tr−ớc khi tiêm vacxin. Nếu nhiễm virus c−ờng độc tr−ớc 4 giờ thì trong 10 vịt can thiệp bằng vacxin sống 8 con. Nếu can thiệp vacxin lúc vịt nhiễm virus dịch tả vịt tr−ớc 8 giờ, 15 vịt phát bệnh nh−ng còn sống 3 con. Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên, dù tiêm vacxin vịt vẫn không đ−ợc bảo hộ. Nh− vậy, rõ ràng, interferon có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus dịch tả vịt và hiện t−ợng cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch để nhanh chóng dập tắt dịch. * Tế bào NK: tăng c−ờng hoạt động diệt những tế bào đã bị nhiễm virus - 32 - do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào đích (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tín hiệu hoạt hoá và dung giải tế bào đích. * Các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây bệnh. Từ đó tạo điều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên. 2.2.3.2. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Biểu hiện của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là sự sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống virus khi cơ thể bị virus xâm nhập. Các công trình nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch đặc hiệu trong bệnh dịch tả vịt đều tập trung xác định vai trò của các loại kháng thể đ−ợc sinh ra và nguyên nhân, cách thức sản sinh ra các kháng thể đó. 2.2.3.2.1. Sự hình thành kháng thể kháng virus dịch tả vịt. ở vịt, kháng thể kháng virus dịch tả vịt có đ−ợc do các hình thức miễn dịch chủ động và bị động. * Về miễn dịch chủ động tự nhiên: Sau khi vịt mắc bệnh dịch tả vịt và đã khỏi bệnh thì vịt sẽ có kháng thể kháng virus dịch tả vịt trong cơ thể và đ−ợc miễn dịch. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì vịt khỏi bệnh có thể bị mắc trở lại. Bệnh tái phát th−ờng ở thể ẩn, không có triệu chứng rõ. Nếu khám vịt ốm, chỉ thấy bên d−ới l−ỡi có nốt rộp, từ nốt rộp có tác giả đã phân lập đ−ợc virus dịch tả vịt. Do mang đặc tính của một virus Herpes, nên khi gặp điều kiện thuận lợi, virus lại tiếp tục phát triển và gây bệnh làm thành nốt rộp mới. Tác giả đã đề xuất ph−ơng pháp kiểm tra bệnh dịch tả vịt ẩn tính bằng khám nốt rộp ở mặt d−ới của l−ỡi (trích Trần Minh Châu, 1987) [ 6]. * Về miễn dịch chủ động nhân tạo: Vịt có đ−ợc khả năng miễn dịch này nhờ đ−ợc tiêm vacxin. Hiệu lực và độ dài đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh− loại vacxin, đ−ờng đ−a vacxin vào cơ thể,... Trên thực tế, khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt khi sử dụng vacxin dịch tả vịt vô hoạt thấp - 33 - hơn khi dùng vacxin nh−ợc độc (Butterfield W.K. and Dardiri A. H., 1969) [37]. Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số l−ợng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một l−ợng kháng thể lớn hơn (Fenner, 1974) [41]. Còn về đ−ờng đ−a vacxin, Shawky S.A và Sandhu T.S (1997) [57] cho rằng đ−ờng đ−a vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm d−ới da; ph−ơng pháp nhỏ mắt, nhỏ mũi đòi hỏi nhiều thời gian mà hầu nh− không gây đ−ợc miễn dịch. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu về hiệu lực miễn dịch phòng bệnh của vacxin dịch tả vịt khi áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau trong sản xuất, Nguyễn Đức Hiền (1999) [16] cho biết với ph−ơng pháp nhỏ mắt hay tiêm bắp hoặc phối hợp cả hai ph−ơng pháp trên đều cho đáp ứng miễn dịch không khác nhau nhiều. Tuổi tiêm chủng đầu tiên là 14 ngày tuổi thì có ảnh h−ởng tốt đến hiệu quả sử dụng vacxin. * Về miễn dịch bị động tự nhiên: Fenner (1974) [41]; Rohrer (1969) [62] và Leibovitz (1991) [50] đều cho rằng: trong bệnh dịch tả vịt, kháng thể của vịt mẹ đ−ợc truyền cho vịt con qua lòng đỏ trứng. L−ợng kháng thể dịch tả vịt ở trong lòng đỏ cao hơn hay thấp phụ thuộc vào hàm l−ợng kháng thể trong huyết thanh vịt mẹ. ở những vịt con 1 ngày tuổi, hàm l−ợng kháng thể dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm l−ợng kháng thể trong lòng đỏ. Theo thời gian, hàm l−ợng kháng thể này sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối đa là tới ngày 21. Ngoài ra, dù vịt con có đ−ợc h−ởng thụ đ−ợc kháng thể ở vịt mẹ, nh−ng nếu bị nhiễm nhiều virus thì vẫn có thể bị chết vì bệnh dịch tả vịt. Nh− vậy, kháng thể do vịt mẹ truyền cho chỉ có thể bảo vệ vịt con trong những ngày đầu sau khi nở nếu chúng bị nhiễm một l−ợng virus rất ít. ở vịt 1 tháng tuổi, sự hình thành kháng thể chủ động kháng virus dịch tả vịt sẽ bị ảnh h−ởng bởi sự có mặt của kháng thể do tiêm huyết thanh miễn dịch. ở vịt con có kháng thể tiếp thu của mẹ thì sự hình thành kháng thể chủ động bị hạn chế khi đ−ợc tiêm vacxin lúc một ngày tuổi. Trần Minh Châu (1986) [5] cho biết: ở vịt con đ−ợc tiêm vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt - 34 - lúc một ngày tuổi thì tỷ lệ miễn dịch bảo hộ giai đoạn 20 - 30 ngày tuổi đạt 25 - 50% (nếu là con của vịt mẹ đ−ợc tiêm vacxin tr−ớc 6 tháng). Tỷ lệ miễn dịch bảo hộ của vịt con chỉ đạt 20 - 40% trong giai đoạn 10 - 20 ngày tuổi (nếu là con của vịt mẹ đã đ−ợc miễn dịch bằng vacxin 1 hay 2 lần). Còn với vịt con mà vịt mẹ không đ−ợc tiêm vacxin thì tỷ lệ bảo hộ đạt 100% cho đến 45 ngày tuổi. * Về miễn dịch bị động nhân tạo: Là tr−ờng hợp can thiệp vào đàn vịt (đã bị mắc bệnh dịch tả vịt tự nhiên) bằng kháng thể dịch tả vịt. Tuy nhiên, việc tạo miễn dịch dạng này không tồn tại lâu trong cơ thể và cũng không mang lại nhiều ý nghĩa trong thực tiễn. 2.2.3.2.2. Các loại kháng thể chống virus dịch tả vịt. Để chống virus dịch tả vịt, có hai loại kháng thể đặc hiệu đ−ợc sản sinh ra là kháng thể dịch thể và kháng thể tế bào. * Kháng thể dịch thể: Là các Globulin miễn dịch hoạt động chủ yếu khi virus còn trong máu. Chúng phong bế sự hấp thụ virus lên bề mặt tế bào, ngăn cản sự hoà màng vỏ virus vào màng tế bào, ngăn cản virus phá vỡ màng của hốc thực bào hoặc phá mạng phân tử vỏ của virus, ngăn cản sự tái sao của chúng (Vũ Triệu An, 1997) [1]. Đối với bệnh dịch tả vịt, l−ợng kháng thể dịch thể đ−ợc sinh ra trong những tr−ờng hợp vịt bị nhiễm bệnh tự nhiên th−ờng thấp và sự tồn tại trong một thời gian ngắn. (Trần Minh Châu, 1987) [6]. * Kháng thể tế bào: Có thể nói rằng, đáp ứng miễn dịch tế bào có vai trò rất quan trọng trong miễn dịch của cơ thể với virus dịch tả vịt (Dardini, 1968) [38]. Qua kết quả nghiên cứu của Jansen thấy rằng: Một số vịt sau khi đ−ợc tiêm vacxin có hàm l−ợng kháng thể dịch thể rất thấp nh−ng khi đem thử thách với virus dịch tả vịt c−ờng độc thì vẫn đ−ợc bảo hộ. Nh− vậy ở những tr−ờng hợp này rõ ràng có vai trò đáng kể của kháng thể tế bào. - 35 - 2.2.3.3. Một số ph−ơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch bệnh dịch tả vịt Mức độ đáp ứng miễn dịch của vịt với virus dịch tả vịt có thể đ−ợc đánh giá bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc và huyết thanh học. * Ph−ơng pháp huyết thanh học: Kháng thể bảo hộ đàn vịt với với virus dịch tả vịt là kháng thể trung hoà. Khả năng bảo hộ cơ thể chống virus c−ờng độc có mối t−ơng quan với hiệu giá kháng thể (Brand, 1984) [35]. Vậy có thể sử dụng phản ứng huyết thanh học để đánh giá mức độ miễn dịch của đàn vịt. Phản ứng trung hoà đ−ợc sử dụng rộng rãi để phát hiện kháng thể trung hoà trong huyết thanh. Tiến hành phản ứng trên phôi vịt, phôi gà hoặc trên môi tr−ờng nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan trong tr−ờng hợp đàn vịt ch−a đ−ợc miễn dịch hoặc ch−a gây đ−ợc bệnh. Theo Dardini, 1968 [38] chỉ số trung hoà từ 0 - 1,5 đ−ợc coi là cơ thể không bị nhiễm virus dịch tả vịt, cơ thể bị nhiễm virus khi chỉ số trung hoà ≥ 1,75. * Ph−ơng pháp công c−ờng độc: Đ−ợc sử dụng với mục đích xác định mức độ đáp ứng miễn dịch của cơ thể sau khi tiếp xúc với virus vacxin. Ph−ơng pháp này đánh giá đúng mức độ bảo hộ cho đàn vịt. Do một số khó khăn, đặc biệt là vấn đề an toàn dịch bệnh nên không phải lúc nào ph−ơng pháp này cũng đ−ợc sử dụng. 2.3. Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt và vacxin phòng bệnh ở việt nam 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam ở Việt Nam, năm 1963 tại Cao Bằng, bác sĩ thú y Đặng Trần Dũng (1963) [11] cho biết; bệnh dịch tả vịt đã xuất hiện làm thiệt hại trên 3000 vịt. Tháng 5/ 1969, trong vòng 3 tháng bệnh dịch tả vịt đã làm thiệt hại tới 15000 vịt ở 4 huyện ngoại thành Hà Nội. Chính từ ổ dịch này đã phân lập ra virus và có thể nuôi cấy virus này trên màng niệu và xoang niệu phôi vịt 10 ngày tuổi ( Trần Minh Châu, 1987) [6]. Qua nghiên cứu thấy virus gây đ−ợc bệnh điển - 36 - hình cho vịt và không có đặc tính gây ng−ng kết hồng cầu gà. Năm 1969, Vũ Đình Tiếu và Mai Anh đã nghiên cứu và thấy rằng dùng vacxin dịch tả vịt để tiêm cho vịt sẽ ngăn chặn đ−ợc dịch. Từ đó bệnh dịch tả vịt chính thức đ−ợc công nhận có tại Việt Nam. Tiếp theo, bệnh dịch tả vịt đã lan tràn rất mạnh mẽ ở nhiều tỉnh trong cả n−ớc. Năm 1969, dịch phát ra ở Hà Nội, Thanh Hoá, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Nam Hà (cũ), Thái Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Cao Bằng, Hải H−ng (cũ) đều có dịch, số vịt bị thiệt hại lên tới 121.245 con (Trần Minh Châu, 1987 [6]). Ngay sau đó, vào năm 1971, dịch lại phát ra ồ ạt ở các tỉnh Ninh Bình, Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hà Bắc và thành phố Hải Phòng. Nhờ có tiêm phòng vacxin nên diện dịch đã thu hẹp lại, chỉ còn âm ỉ ở một số cơ sở chăn nuôi phân tán. Tuy nhiên, vào năm 1980, dịch lại phát ra mạnh mẽ ở Hà Nam Ninh (cũ), Thanh Hoá và đồng bằng sông Cửu Long. Từ đó, dịch lan ra tới tận Nghệ Tĩnh, Kiên Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp. Năm 1989, Phạm Thị Lan Thu, Thân Thị Hạnh [30] cho biết đàn vịt của Phú Khánh trong những năm 1980 - 1986 th−ờng phát ra bệnh và lây lan nhanh ở nhiều nơi. Các tác giả đã tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên đàn vịt ở Phú Khánh. Nguyễn Đức Hiền (1999) [17] đã chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt ở Cần Thơ và theo kết quả chẩn đoán lâm sàng bệnh vịt vào năm 2000 - 2002 của Nguyễn Đức Hiền và cộng sự thì trên 1.176 vịt bệnh đ−ợc mổ ra khám có 455 vịt đ−ợc chẩn đoán là mắc bệnh dịch tả vịt. Rõ ràng, bệnh dịch tả vịt là căn bệnh cần đ−ợc quan tâm, nghiên cứu sâu nhằm góp phần giảm thiệt hại về kinh tế cho ng−ời chăn nuôi. 2.3.2. Tình hình nghiên cứu vacxin dịch tả vịt ở Việt Nam. ở Việt Nam từ năm 1969 đã sử dụng chủng virus nh−ợc độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt để sản xuất vacxin phòng bệnh cho đàn vịt. Khi nuôi cấy trên phôi vịt, virus gây bệnh phôi ổn định, thời gian chết phôi trung bình - 37 - là 100 ± 0,24 giờ. Trong n−ớc niệu nang, hàm l−ợng virus có ELD50 lúc 72 giờ là 10-4,75/0,2ml. Vacxin khi sử dụng pha 1/200 tiêm vào d−ới da cho vịt con với liều 0,2ml/con và tiêm cho vịt lớn với liều 1ml/con, Vacxin cho kết quả an toàn. Nghiên cứu về độ dài miễn dịch của loại vacxin này, Trần Minh Châu (1987) [6] cho biết Vacxin đ−ợc tạo miễn dịch tốt cho đàn vịt: vịt con 1 ngày tuổi sau khi tiêm Vacxin đ−ợc bảo hộ chắc chắn 100% đến 45 ngày tuổi, vịt lớn kéo dài miễn dịch đến 9 tháng. Trần Minh Châu (1987) [6] đã nghiên cứu chủng virus vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà. Tác giả cho biết, chủng virus này gây chết phôi gà rất ổn dịnh, thời gian chết phôi trong vòng 72 -120 giờ, virus vacxin có ELD50 từ 10 -3,31/0,2ml đến 10-4,5/ 0,2ml. Vacxin khi sử dụng an toàn cho vịt nh−ng về hiệu lực cần nghiên cứu thêm. Ngoài ra, tác giả còn nghiên cứu chế thử 4 loại vacxin vô hoạt và đ−a ra kết luận: Vacxin vô hoạt cũng tạo đ−ợc miễn dịch cho đàn vịt nh−ng đáp ứng miễn dịch không mạnh mà giá thành lại cao. Lê Văn Lãnh (1991) [22] nghiên cứu đặc tính sinh học của virus vacxin dịch tả vịt chủng Jansen và cho biết virus vacxin có tính ổn định khi nuôi cấy trên phôi gà và tế bào xơ phôi gà 1 lớp; chỉ số ELD50 biến động trong khoảng từ 10-3,31/ 0,2ml đến 10-3,66/0,2ml ; CPE50 biến động từ 10 -4,36 đến 10-4,54. Vacxin an toàn khi dùng cho vịt ở mọi lứa tuổi, hiệu lực của vacxin cao. Năm 1999, Nguyễn Đức Hiền [16] nghiên cứu hiệu lực miễn dịch phòng bệnh của vacxin dịch tả vịt khi áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau trong điều kiện sản xuất. Tác giả kết luận: ph−ơng pháp nhỏ mắt hoặc tiêm bắp hoặc kết hợp cả hai đều cho đáp ứng miễn dịch t−ơng đối giống nhau và đạt tỷ lệ bảo hộ hơn 70%. Tuổi tiêm chủng đầu tiên có ảnh h−ởng tốt đến hiệu quả sử dụng vacxin là 14 ngày. Gần đây, bộ môn VSV - TN - BL tr−ờng Đại học Nông Nghiệp I đang nghiên cứu về việc chế tạo vacxin mới với chủng virus nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000 có xuất xứ từ n−ớc ngoài. Những kết quả thử nghiệm ban đầu khá khả quan, dần đáp ứng đ−ợc yêu cầu trong nghiên cứu và sản xuất. - 38 - 3. Nội dung - nguyên liệu - ph−ơng pháp nghiên cứu 3.1. Nội dung nghiên cứu 3.1.1. Nghiên cứu tình hình bệnh dịch tả vịt tại một số địa bàn thuộc ngoại thành H._.−ng Yên 3 650 27 10 -2 0,2 2 0 100 Kim Động H−ng Yên 1 400 30 10 -2 0,2 2 0 100 Tổng hợp 16 4060 0 100 - 73 - Kết quả bảng 4.12 cho thấy có 4060 vịt trong tổng số 16 đàn vịt đ−ợc tiêm phòng vacxin ở các địa bàn: Hà Nội, Hà Tây, Bắc Ninh, H−ng Yên sau 2 tháng theo dõi đều không xảy ra dịch trong khi các đàn khác không đ−ợc tiêm phòng trong những khu vực này bệnh dịch tả vịt vẫn xảy ra. Xét trên từng lứa tuổi của vịt chúng tôi đều thấy với vịt mọi lứa tuổi đều đ−ợc bảo hộ tốt: từ vịt nhỏ 7 ngày tuổi đến vịt lớn 60 ngày tuổi. Nh− vậy, vịt đã đ−ợc bảo vệ bởi vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000. 4.5.2. Kết quả nghiên cứu về khả năng can thiệp dịch của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 Mục đích cuối cùng của công tác nghiên cứu là phục vụ cho quá trình sản xuất. Qua nghiên cứu thấy rằng virus dịch tả vịt có tính chất gây cản nhiễm virus cùng typ. Jansen cũng đã thông báo về việc sử dụng vacxin liều cao có tác dụng bảo vệ đàn vịt rất hiệu quả. Bởi vậy, chúng tôi đã b−ớc đầu thử nghiệm vacxin can thiệp vào các ổ dịch tả vịt xảy ra ở địa ph−ơng. Vacxin đ−ợc pha loãng ở nồng độ 1/50 tiêm d−ới da cho vịt con với liều 0,3 ml/con và vịt lớn với liều 0,5ml/con. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 4.13: Qua bảng 4.13 chúng tôi thấy: Đối với vịt con: có 3 đàn với tổng số1080 thì có 107 con chết trong số 300 con ốm. Số vịt đ−ợc tiêm vacxin là 973 con, sau dập dịch còn 872 con sống. Tỷ lệ bảo hộ đạt 89,6%. Thời gian dập dịch trung bình là 5 ngày. Đối với vịt đẻ: có tổng số 1794 con trong 6 đàn; trong 162 con ốm có 66 con chết. Sau khi tiêm thẳng vacxin vào ổ dịch thấy còn 1679 con sống, đạt tỷ lệ 93,3% với thời gian dập dịch trung bình là 3,7 ngày. Đối với vịt thịt: trong 11 đàn với tổng số 4810 con có 1412 vịt ốm và 152 con chết. Dịch đ−ợc dập sau trung bình 4,1 ngày; số vịt sống là 4429 con; tỷ lệ bảo hộ đạt 95,1%. - 73 - Bảng 4.13: Kết quả can thiệp dịch của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 Tr−ớc khi can thiệp Sau khi can thiệp Địa điểm Loại gia cầm Tuổi (ngày) Thời gian bệnh (ngày) Số con ốm Số con chết Số con tiêm vacxin Thời gian dập dịch (ngày) Số con còn sống Tỷ lệ bảo hộ Vịt con 21 2 10 7 143 5 137 95,8 Vịt thịt 30 5 100 40 60 8 45 75,0 Vịt đẻ 3 50 30 120 5 108 90,0 Vịt đẻ 2 20 6 994 3 975 98,1 Văn Giang H−ng Yên Vịt thịt 45 2 10 6 54 4 52 96,3 Vịt đẻ 2 20 10 130 3 121 93,7Mỹ Hào H−ng Yên Vịt con 11 4 250 100 700 6 622 88,9 Vịt đẻ 3 32 20 130 4 121 93,7Kim Động H−ng Yên Vịt thịt 2 27 7 143 3 136 95,1 Phố Nối H−ng Yên Vịt thịt 35 2 50 0 400 3 393 98,3 Vịt thịt 40 3 790 40 1960 3 1930 98,5 Vịt thịt 45 2 100 0 600 3 586 97,6 Vịt thịt 35 1 15 0 60 3 58 96,6 Vịt thịt 45 3 70 22 108 5 95 87,9 Vịt đẻ 120 2 30 0 50 4 46 92,0 Thuận Thành Bắc Ninh Ngan con 20 2 12 1 54 4 50 92,6 Vịt thịt 45 2 20 0 600 3 579 96,5 Vịt con 15 2 40 0 130 4 113 86,9 Vịt đẻ 1 10 0 300 3 284 94,6 Gia Lâm Hà Nội Vịt thịt 45 3 100 30 450 5 421 92,6 Hoài Đức Hà Tây Vịt thịt 30 3 130 7 223 5 208 93,3 - 73 - Vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 còn đ−ợc sử dụng để can thiệp vào đàn ngan bị dịch tả. Kết quả khi can thiệp dịch vào đàn ngan con có 12 con ốm, 1 con chết trong tổng số 55 con. Sau 4 ngày dập dịch thấy còn 50 con sống và 4 con chết. Tỷ lệ bảo hộ đạt 92,6%. Tác giả Trần Minh Châu, (1980) [4] đã từng sử dụng vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt của Xí nghiệp thuốc thú y để can thiệp dịch. Chủng này có số hiệu 1169 và đã đ−ợc cấy truyền trên phôi vịt 13 ngày tuổi. Kết quả cho thấy, khi can thiệp vào 4 đàn vịt thịt (418 con) và 2 đàn vịt đẻ (1294 con) thì vacxin đã có tác dụng bảo hộ nhất định. Tỷ lệ bảo hộ cao hay thấp còn phụ thuộc vào một số yếu tố. Nếu trong đàn đã có nhiều vịt chết, thì tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt 20,5 % khi dùng vacxin pha 1/500 để can thiệp; ngoài ra thời gian dập dịch cũng kéo dài tới 8 - 9 ngày sau khi tiêm. Nếu dùng nồng độ 1/100 – 1/200 để tiêm và can thiệp vào lúc mới phát hiện trong đàn có con bị chết vì bệnh dịch tả vịt thì thời gian dập dịch sẽ chỉ còn 1 – 5 ngày và vịt đ−ợc bảo vệ từ 87,7% - 97,8%. Tác giả nhận định rằng, khi phát hiện bệnh sớm và can thiệp ngay bằng vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt liều cao thì sẽ làm giảm đáng kể thời gian dập dịch, tăng tỷ lệ bảo hộ đàn vịt, và thậm chí không ảnh h−ởng đến sản l−ợng trứng. Những nhận định này hoàn toàn phù hợp với kết quả thử nghiệm vacxin của chúng tôi. Khi chúng tôi can thiệp vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 vào đàn vịt đẻ tại Văn Giang, H−ng Yên. Tổng số vịt trong đàn là 1000 con. Sau khi can thiệp có 989 vịt còn sống và số l−ợng trứng thu đ−ợc hàng ngày là trên 800. Nh− vậy, vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 khi can thiệp vào ổ dịch cho khả năng bảo hộ cao, thời gian dập dịch ngắn. Có thể ứng dụng chủng virus vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000 để chế tạo vacxin phòng bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt ở n−ớc ta. - 73 - 4.6. Sử dụng chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 trong nghiên cứu vacxin Hiệu lực của vacxin là một trong những chỉ tiêu quan trọng nói lên chất l−ợng của chế phẩm. Để xác định chỉ tiêu này có thể sử dụng nhiều ph−ơng pháp khác nhau, nh−ng ph−ơng pháp chính xác hơn cả vẫn là ph−ơng pháp công c−ờng độc bằng chủng c−ờng độc, đánh giá hiệu lực thông qua tỷ lệ bảo hộ. Với mục đích đó, chúng tôi đã sử dụng chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 để xác định hiệu lực của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chế từ chủng virus DP-EG-2000 thông qua ph−ơng pháp thử thách c−ờng độc. 4.6.1. Kết quả xác định hiệu lực của vacxin bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc trên vịt thí nghiệm Để tiến hành thử nghiệm trên vịt, chúng tôi tiến hành 2 lần thí nghiệm. Mỗi lần theo dõi 15 vịt thí nghiệm và 5 vịt đối chứng. Những vịt này đ−ợc chúng tôi nuôi từ nhỏ trong điều kiện cách ly t−ơng đối chặt chẽ với môi tr−ờng ngoài. Lô thí nghiệm: Bao gồm những vịt khoẻ, đ−ợc chúng tôi tiêm 0,5ml vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000. Sau 21 ngày, tiến hành tiêm chủng virus c−ờng độc mà chúng tôi đã phân lập đ−ợc vào những vịt này với liều 0,5ml huyễn dịch virus có chứa 1000 LD50. Lô đối chứng: Bao gồm những vịt không đ−ợc tiêm vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 cũng nh− bất kỳ một loại vacxin dịch tả vịt nào khác. Sau 21 ngày vẫn tiêm 0,5ml huyễn dịch virus c−ờng độc dịch tả vịt chủng VG-2004 đ−ợc pha loãng ra nồng độ 1000 LD50 nh− bình th−ờng. Chúng tôi theo dõi cả 2 lô trong 10 ngày. Kết quả thể hiện ở bảng 4.14: Kết quả bảng 4.14 cho biết: Theo dõi 15 vịt thí nghiệm ở lần thí nghiệm thứ nhất chúng tôi thấy có 3 vịt ốm chiếm 20%; số vịt chết là 1, chiếm tỷ lệ 6,7%; số vịt sống sau 10 ngày theo dõi là 14 con, đạt tỷ lệ 93,3%. - 73 - Bảng 4.14: Kết quả xác định hiệu lực của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000 bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc với chủng VG-2004 trong phòng thí nghiệm Liều tiêm vacxin Liều công c−ờng độc Kết quả Vịt ốm Vịt chết Vịt sống Lô Lần thí nghiệm Số vịt theo dõi Tuổi (ngày) Nồng độ Khối l−ợng (ml/con) LD50 Khối l−ợng (ml/con) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ bảo hộ (%) 1 15 21 10 -2 0,2 1000 0,5 3 20 1 6,7 14 93,3 2 15 21 10 -2 0,2 1000 0,5 2 13,3 0 0,0 15 100 Lô thí nghiệm ∑ 30 21 10 -2 0,2 1000 0,5 5 15 1 3,3 29 96,7 1 5 21 10 -2 0,2 1000 0,5 5 100 5 100 0 0 Lô đối chứng 2 5 21 10 -2 0,2 1000 0,5 5 100 5 100 0 0 - 73 - Lần thí nghiệm thứ 2: Theo dõi 15 vịt thí nghiệm chúng tôi thấy số vịt ốm là 2 con chiếm 13,3%; song không có vịt chết, tỷ lệ chết là 0%. Vì vậy số vịt sống sau thời gian theo dõi là 15 con, đạt tỷ lệ 100%. Trong cả 2 lần thí nghiệm: Theo dõi 10 vịt ở lô đối chứng thì thấy tất cả các vịt đều bị ốm và chết với triệu chứng, bệnh tích đặc tr−ng của bệnh dịch tả vịt. Kết quả thí nghiệm nêu trên đã chứng tỏ rằng: Vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000 có hiệu lực bảo hộ cao đối với đàn vịt thí nghiệm. Mặt khác, thử nghiệm trên lại khẳng định một lần nữa chủng virus mà chúng tôi phân lập đ−ợc chính là virus c−ờng độc dịch tả vịt và chủng virus này có sự t−ơng đồng kháng nguyên với chủng virus vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP- EG-2000. 4.6.2. Kết quả xác định hiệu lực của vacxin bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc trên vịt ở thực tế sản xuất Trong quá trình tiêm phòng thử nghiệm b−ớc đầu vacxin dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 cho các đàn vịt ở các địa ph−ơng khác nhau, chúng tôi theo dõi các đàn đ−ợc nuôi ở điều kiện tự nhiên trong 21 ngày, sau đó bắt vịt ở một số đàn (mỗi đàn 30 vịt) để tiến hành công c−ờng độc bằng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 với nồng độ bằng 1000 LD50 và liều l−ợng tiêm là 0,5ml nhằm xác định hiệu lực của vacxin thông qua tỷ lệ bảo hộ. Kết quả trình bày ở bảng 4.15: Kết quả bảng 4.15 cho thấy: - Tại Gia Lâm - Hà Nội: Theo dõi 30 vịt có 3 vịt ốm, chiếm tỷ lệ 10%; trong đó có 2 vịt chết chiếm tỷ lệ 6,7%. Tỷ lệ bảo hộ của vacxin đạt 93,3%. - Tại Hoài Đức – Hà Tây: Có 2 vịt ốm trong số 30 vịt đ−ợc theo dõi chiếm tỷ lệ 6,7%. Số vịt ốm này bị chết ngay sau đó. Nh− vậy tỷ lệ bảo hộ của vacxin là 93,3%. - 73 - Bảng 4.15: Kết quả xác định hiệu lực của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000 bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc với chủng VG-2004 ở thực tế sản xuất Liều tiêm vacxin Liều công c−ờng độc Kết quả Vịt ốm Vịt chết Vịt sống Địa điểm Số vịt theo dõi Tuổi (ngày) Nồng độ Khối l−ợng (ml/con) LD50 Khối l−ợng (ml/con) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ (%) Số con Tỷ lệ bảo hộ (%) Gia Lâm Hà Nội 30 15 10 -2 0,2 1000 0,5 3 10 2 6,7 28 93,3 Hoài Đức Hà Tây 30 21 10 -2 0,2 1000 0,5 2 6,7 2 6,7 28 93,3 Ba Vì Hà Tây 30 17 10 -2 0,2 1000 0,5 5 16,7 4 13,3 26 86,7 Văn Giang H−ng Yên 30 27 10 -2 0,2 1000 0,5 3 10 3 10 27 90 Thuận Thành Bắc Ninh 30 25 10 -2 0,2 1000 0,5 4 13,3 2 6,7 28 93,3 Tổng hợp 150 15 - 27 10 -2 0,2 1000 0,5 17 11,3 13 8,7 137 91,3 - 73 - - Tại Ba Vì - Hà Tây: Trong số 5 vịt ốm vì bệnh dịch tả vịt thì có 4 vịt chết. Tỷ lệ vịt ốm và chết lần l−ợt là16,7% và 13,3%. Tỷ lệ bảo hộ của vacxin là 86,7%. - Tại Văn Giang - H−ng Yên: Số vịt ốm trong 30 vịt theo dõi là 3, số vịt chết là 3. Tỷ lệ vịt ốm và vịt chết đều là 10%. Nh− vậy, tỷ lệ bảo hộ của vacxin là 90%. - Tại Thuận Thành - Bắc Ninh: Trong 30 vịt đ−ợc theo dõi có 4 vịt ốm chiếm tỷ lệ 13,3%; 2 vịt chết chiếm tỷ lệ 6,7%. Tỷ lệ bảo hộ của vacxin đạt 90%. Tổng hợp lại thấy rằng, trong 30 vịt đ−ợc theo dõi ở mỗi đàn, tỷ lệ vịt ốm dao động từ 6,7% - 16,7%; tỷ lệ vịt chết dao động từ 6,7% - 13,3%; tỷ lệ bảo hộ của đàn vịt là 86,7% - 93,3%, thấp hơn so với trong thí nghiệm. Nh− vậy, vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chế bằng chủng DP-EG-2000 khi sử dụng tiêm phòng cho đàn vịt có hiệu lực cao thể hiện qua tỷ lệ bảo hộ là 86,7% - 93,3% sau khi tiêm vacxin 21 ngày. Vacxin này hoàn toàn có thể bảo vệ đàn vịt tr−ớc sự tấn công của mầm bệnh trong thực tế sản xuất. Mặt khác, qua những thí nghiệm nêu trên (bảng 4.14, 4.15) thấy rằng: chủng virus c−ờng độc mà chúng tôi phân lập đ−ợc có thể dùng để xác định hiệu lực vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt bằng ph−ơng pháp thử thách c−ờng độc. - 73 - Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng của vịt bị mắc bệnh dịch tả vịt ảnh 4.1: Vịt bại liệt ảnh 4.2: Vịt chảy n−ớc mắt, n−ớc mũi ảnh 4.3: Vịt bị phù đầu ảnh 4.4: Vịt ỉa chảy - 73 - Một số hình ảnh bệnh tích đại thể và vi thể của vịt bị mắc bệnh dịch tả vịt ảnh 4.5: Gan vịt xuất huyết, hoại tử ảnh 4.6: Ruột xuất huyết, loét ảnh 4.7: Gan xuất huyết, thoái hoá không bào ảnh 4.8: Gan xuất huyết, tăng sinh tế bào viêm - 73 - Một số hình ảnh bệnh tích phôi vịt bị nhiễm virus c−ờng độc dịch tả vịt chủng VG – 2004 ảnh 4.9: Phôi vịt xuất huyết, phù ảnh 4.10: Phôi vịt xuất huyết, còi cọc ảnh 4.11: Gan phôi vịt xuất huyết, hoại tử ảnh 4.12: Gan phôi vịt xuất huyết, tăng sinh tế bào viêm - 73 - 5. Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận 1 - Nghiên cứu về tình hình chăn nuôi vịt ở một số địa bàn thuộc Hà Nội và các vùng phụ cận thấy nghề chăn nuôi vịt khá phát triển. Nh−ng quy mô chăn nuôi chủ yếu ở mức độ nhỏ, số hộ nuôi d−ới 200 vịt chiếm tỷ lệ 75,1%. Tại địa bàn điều tra, bệnh dịch tả vịt th−ờng xuyên xảy ra, gây tỷ lệ chết cao trong đàn (tỷ lệ chết của vịt thịt là 57,3%) 2 - Về kết quả phân lập virus: Từ bệnh phẩm đã phân lập thành công đ−ợc virus trên vịt. Qua 40 vịt thí nghiệm theo dõi, có 39 vịt chết, chiếm tỷ lệ 97,5%. Các vịt chết đều biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc tr−ng của bệnh dịch tả vịt. Sử dụng 60 phôi vịt để phân lập virus, với độ pha loãng huyễn dịch bệnh phẩm là 10 -1; sau 144 giờ theo dõi, có 56 phôi vịt chết, chiếm tỷ lệ 93,3%. Các phôi chết có bệnh tích đặc tr−ng: Phôi còi cọc, phù phôi, xuất huyết da; gan s−ng, tụ huyết, xuất huyết, .... 3 - Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 thấy: Virus có khả năng thích ứng cao trên phôi vịt, gây chết phôi đến 144 giờ theo dõi trong 3 đợt thí nghiệm với tỷ lệ phôi chết dao động trong khoảng từ 96,67 - 100%. Thời gian chết tập trung vào khoảng 73 - 120 giờ. Đã xác định đ−ợc các chỉ số sinh học của virus c−ờng độc dịch tả vịt chủng VG-2004 nh− sau: Chỉ số ELD50 = 10 -6,59/ 0,2ml; EID50 = 10 -8,74/ 0,2ml và LD50 = 10 -9,69/ 0,5ml. Khi tiêm truyền qua phôi vịt và qua vịt thí nghiệm, virus gây ra triệu chứng lâm sàng và các biến đổi bệnh lý đặc tr−ng. Nh− vậy, chủng virus phân lập đ−ợc có độc lực khá cao và ổn định. - 73 - 4 - Qua kết quả của phản ứng trung hoà và kỹ thuật PCR có thể xác định: Chủng virus c−ờng độc VG-2004 mà chúng tôi phân lập đ−ợc là virus c−ờng độc dịch tả vịt, có tính t−ơng đồng kháng nguyên với chủng virus dịch tả vịt tiêu chuẩn của Mỹ và virus nh−ợc độc dịch tả vịt DP-EG-2000. 5 - Vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chế từ chủng DP-EG-2000 sử dụng để phòng bệnh cho vịt b−ớc đầu đạt hiệu quả tốt. Sử dụng vacxin can thiệp vào ổ dịch có thể dập tắt đ−ợc dịch nhanh chóng. 6 - Bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc với chủng virus dịch tả vịt c−ờng độc VG-2004 đã xác định: Vacxin dịch tả vịt chế từ chủng virus nh−ợc độc DP-EG- 2000 có hiệu lực khá cao, tỷ lệ bảo hộ đạt 96,7% (đối với vịt nuôi thí nghiệm) và 91,3% (đối với vịt nuôi ở thực tế sản xuất). Nh− vậy, có thể ứng dụng đ−ợc vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chế từ chủng DP-EG-2000 trong công tác phòng bệnh và can thiệp dịch nhằm mục đích khống chế bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam. 5.2. Đề nghị 1 - Tiếp tục khảo sát thêm về đặc tính sinh học của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004. 2 - Có thể sử dụng chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 làm chủng c−ờng độc tiêu chuẩn trong nghiên cứu vacxin và nghiên cứu bệnh lý của bệnh dịch tả vịt. 3 - Tiến hành thử nghiệm rộng rãi hơn nữa đối với vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 để có thể chính thức đ−a vacxin vào thực tế sản xuất phục vụ cho công tác phòng bệnh và can thiệp dịch. - 73 - mục lục 1. Mở đầu ................................................................................................................1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 9 1.2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................... 11 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................. 11 2. Tổng quan tài liệu ...................................................................................12 2.1. Bệnh dịch tả vịt....................................................................................... 12 2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh ..................................................................................12 2.1.2. Truyền nhiễm học ............................................................................................15 2.1.3. Triệu chứng và bệnh tích .................................................................................17 2.1.4. Chẩn đoán.........................................................................................................19 2.1.5. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt ...............................................23 2.2. Virus gây bệnh dịch tả vịt...................................................................... 26 2.2.1. Virus nhóm Herpes ..........................................................................................26 2.2.2. Virus dịch tả vịt (Duck enteritis virus)............................................................28 2.2.3. Miễn dịch chống virus dịch tả vịt....................................................................32 2.3. Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt và vacxin phòng bệnh ở Việt Nam................................................................................................................. 36 2.3.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam ...................................36 2.3.2. Tình hình nghiên cứu vacxin dịch tả vịt ở Việt Nam. ....................................37 3. Nội dung - nguyên liệu - ph−ơng pháp nghiên cứu ...............39 3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 39 3.2. Nguyên liệu ............................................................................................. 40 3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 41 4. Kết quả và thảo luận ............................................................................53 4.1. Tình hình bệnh dịch tả vịt trên các đàn vịt nuôi ở một số địa bàn thuộc Hà Nội và các vùng phụ cận .............................................................. 53 4.1.1 Tình hình chăn nuôi vịt ở một số địa bàn thuộc ngoại thành Hà Nội và các tỉnh lân cận..................................................................................................................53 4.1.2. Tình hình bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi ở một số địa bàn thuộc Hà Nội và các vùng phụ cận ...................................................................................................56 4.2. Phân lập virus c−ờng độc dịch tả vịt chủng VG-2004 ........................ 60 4.2.1. Phân lập virus c−ờng độc dịch tả vịt trên vịt...................................................60 4.2.2. Phân lập virus c−ờng độc dịch tả vịt trên phôi vịt...........................................62 4.3. Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 .................................................................................................... 64 4.3.1. Khả năng thích ứng và ổn định của chủng virus dịch tả vịt trên phôi vịt......64 4.3.2. Kết quả xác định chỉ số ELD50 của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG- 2004.............................................................................................................................67 4.3.3. Kết quả xác định chỉ số EID50 của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG- 2004.............................................................................................................................70 4.3.4. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của phôi sau khi gây nhiễm chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004.............................................................................................72 4.3.5. Kết quả xác định chỉ số LD50 của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG- 2004.............................................................................................................................75 4.3.6. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý của vịt sau khi gây nhiễm chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004..................................................77 4.4. Kết quả xác định tính t−ơng đồng kháng nguyên của chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 với một số chủng virus nh−ợc độc dịch tả vịt khác ........................................................................................................... 80 4.4.1. Phản ứng trung hoà trên phôi vịt .....................................................................81 4.4.2. Ph−ơng pháp PCR (Polymerase chain reaction).............................................83 4.5. Kết quả nghiên cứu khả năng phòng bệnh và can thiệp dịch trong thực tế sản xuất của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 ... 87 4.5.1. Kết quả sử dụng vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 trong phòng bệnh dịch tả vịt ................................................................................................87 4.5.2. Kết quả nghiên cứu về khả năng can thiệp dịch của vacxin nh−ợc độc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000...............................................................................................89 4.6. Sử dụng chủng virus c−ờng độc dịch tả vịt VG-2004 trong nghiên cứu vacxin.............................................................................................................. 92 4.6.1. Kết quả xác định hiệu lực của vacxin bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc trên vịt thí nghiệm.......................................................................................................92 4.6.2. Kết quả xác định hiệu lực của vacxin bằng ph−ơng pháp công c−ờng độc trên vịt ở thực tế sản xuất ...........................................................................................94 5. Kết luận và đề nghị...............................................................................100 5.1. Kết luận ................................................................................................. 100 5.2. Đề nghị................................................................................................... 101 Tài liệu tham khảo Tài liệu tham khảo I. Tiếng việt 1. Vũ Triệu An (1997), Miễn dịch học, NXB Y học, Hà Nội. 2. Trần Kim Anh (2004), Kỹ thuật chăn nuôi vịt ngan trong nông hộ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Xuân Bình (2004), Bệnh của vịt và biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Trần Minh Châu (1980), Chủng virus c−ờng độc 769 và sử dụng vacxin để phòng bệnh, Luận án PTS Khoa học nông nghiệp. 5. Trần Minh Châu, Lê Thị Thiện (1986), " ảnh h−ởng của kháng thể tiếp thu đến sự hình thành miễn dịch chủ động của vịt con 1 ngày tuổi khi đ−ợc tiêm vacxin dịch tả vịt nh−ợc độc", Khoa học và kỹ thuật Thú y 1979 - 1984, Viện Thú y, tr. 39 - 45. 6. Trần Minh Châu (1987), Bệnh dịch tả vịt, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Trần Minh Châu (1996), 100 câu hỏi về bệnh dịch tả vịt, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Lê Minh Chí, Hồ Đình Chúc, Bùi Quý Huy (1999), “Kết quả điều tra dịch bệnh gia súc, gia cầm 5 tỉnh phía Bắc 1995 - 1997”, Khoa học và kỹ thuật Thú y, 6 (3), Hội thú y Việt Nam, tr 75 – 78. 9. Lê Huy Chính (2001), Vi sinh vật y học, NXB Y học, Hà Nội. 10. Nguyễn Thị Chính, Ngô Tiến Hiển (2001), Virus học, NXB ĐHQG, Hà Nội. 11. Đặng Trần Dũng (1963), Thông báo riêng về bệnh dịch tả vịt ở Cao Bằng. 12. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân M−ợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số ph−ơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB KHKT, Hà Nội. 13. Hồ Huỳnh Thuỳ D−ơng (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 301tr 14. Nguyễn Đ−ờng, Nguyễn Nh− Thanh, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Lộc, Nguyễn Bá Hiên (1990), Vi sinh vật học đại c−ơng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 15. Gaidamovich – V.M.JDA NOV (1970), Virus học (Đoàn Xuân M−ợu dịch). 16. Nguyễn Đức Hiền (1999), "Nghiên cứu hiệu lực miễn dịch phòng bệnh của vacxin dịch tả vịt khi áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau trong điều kiện sản xuất", Khoa học và kỹ thuật Thú y, 5, Hội Thú y Việt Nam, tr. 37 - 41. 17. Nguyễn Đức Hiền (1999), "Chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt ở tỉnh Cần Thơ", Khoa học và kỹ thuật Thú y, 4, (1), Hội Thú y Việt Nam, tr. 27 - 31. 18. Lê Thanh Hoà (2002), "Sinh học phân tử: Nguyên lý và ứng dụng", Tài liệu giảng dạy sau đại học. 19. Phạm Quang Hùng (2003), Con vịt với ng−ời nông dân, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 20. Trịnh Quang Khuê, Nguyễn Văn Vinh (2003), Nghề nuôi gia cầm, NXB Giáo dục, Hà Nội. 21. Võ Thị Th−ơng Lan (2002), Sinh học phân tử, NXB ĐHQG, Hà Nội. 22. Lê Văn Lãnh (1991), “Khảo sát một số đặc tính sinh học giống virus vacxin Jansen và chế vacxin phòng bệnh dịch tả vịt”, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT Nông nghiệp 1986 – 1991. NXB Nông nghiệp, tr. 120 - 121. 23. Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện (2002), Một số bệnh mới do virus ở gia súc, gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 24. Lê Hồng Mận (1999), Bệnh của vịt và biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 25. Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, Hồ Đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, Đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 26. Nguyễn Nh− Thanh (1974), Giáo trình thực tập vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 27. Nguyễn Nh− Thanh, Lê Thanh Hoà (1974), Miễn dịch học thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 28. Nguyễn Nh− Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan H−ơng (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Nguyễn Thát (1975), Bệnh gia cầm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 30. Phạm Thị Lan Thu, Thân Thị Hạnh (1989), “Kết quả b−ớc đầu phân lập virus dịch tả vịt ở Phú Khánh”, Viện Thú y, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật Thú y (1985 – 1989), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 40 – 41. 31. Lâm Minh Thuận, Chế Minh Tùng (2004), Kỹ thuật chăn nuôi thuỷ cầm, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. 32. Vũ Minh Thục (2004), Một số vấn đề dị ứng và miễn dịch phân tử, NXB Y học, Hà Nội, tr. 58 - 66. II. Tiếng Anh 33. Baudet, A.E.R.F. (1923), "Mortality in ducks in the Netherlands caused by a filtertable virus; fowl plague", Tijdschr Diergeneeskd 50, pp 455 - 459. 34. Boss, A. (1943), "Some new cases of duck plague", Tijdschr Diergeneeskd 69, pp 372 - 381. 35. Brand, C.J., and D.E.Docherty (1984), "A survey of North American migratory waterfowl for duck plague virus", J Wildl Dis 20, pp 261 - 266. 36. Burgess, E.C., and T.M. Yuill (1981), " Increased cell culture incubation temperatures for duck plague virus isolation", Avian Dis 25, pp 222 - 224. 37. Butterfield W.K. and Dardiri A. H, “Serologic and Immunologic Response of Wild water fowl vaccinated with Attenated Duck Plague virus”, Bull wild life disease Assoc, Vol 5, April 1969, pp 99 - 102. 38. Dardini, A.H., and W.R. Hess (1968), " A plague assay for duck plague virus", Can J Comp Med Sci 32, pp 505 - 510. 39. Docherty D.E. & Franson C.J. (1992), Duck Virus Enteritis, In: Veterinary Diagnostic Virology, Castro A.E. & Heuschele W.P., eds. Mosby Year Book, St Louis, Missouri, USA, pp 25–28. 40. FAO (2003), 41. Fenner F., Mac Auslan R.R., Minus C.A., Sambrook J., White D. The biology of animal viruses, Second edition (1974), Academic press New York and London. 42. Friend, M and G.L, Pearson (1973)., Duck plague in wild waterfowl, US Dep Int Sport Fish Wild Bull, Washington. D. C. 43. Hansen W.R., Brown S.E., Nashold S.W. & Knudson D.L. (1999)., "Identification of duck plague virus by polymerase chain reaction", Avian Dis., 43, pp 106–115. 44. Hess, W.R., and Dardiri (1968), "Some properties of the virus of duck plague", Arch Gesamte Virusforsch 24, pp 148 - 153. 45. Jansen, J. (1964), "Duck plague (a concise survey)", Indian Vet J 41, pp 309 - 316. 46. Jansen, J. (1968), "Duck plague", J Am Vet Med Assoc 152, pp 1009 - 1016. 47. Jansen J., and Kunst H., “Vaccination of ducklings agianst duck plague by the addition of attenuated virus to the drinking water”, Tijdchr Diergeneesk, deel 89, afl 17, 1964, pp 1234 - 1235. 48. Kunst H., “Isolation of duck plague virus in tissue cultures”, Tijdchr Diergeneesk, deel 92, afl II, 1967, pp 713 – 714. 49. Lam, K.M. (1984), "Antibody and complement mediate cytolysis against duck-enteritis-virus-infected cells", Avian Dis 28, pp 1125 - 1129. 50. Leibovitz, L. (1991), Duck virus enteritis in disease of poultry, Iowa State University Press, pp 609 - 618. 51. Leibovitz L. and Hwang J., “Duck plague on the American continent”, Proc. 39th Ann. Mtg Northeasthern Conj. Avian disease State Univer. New York Stony bool, N.Y.Yune 1967. 52. OIE (2000), Manual of Standards for diagnostic test and vaccines. 53. OIE (2004), Annual animal disease status. 54. Proctor S.M, Pearson G.L, Leibovitz L. “Duck plague in free flying water fowl observed during the lake Andes epizootic”, Wild life disease (1975). 55. Sandhu, T. (1998), Personal communication. 56. Sandhu T.S. & Leibovitz L. (2003), "Duck virus enteritis (duck plague)", Diseases of Poultry, Eleventh Edition, Saif Y.M., Barnes H.J., Glission J.R., Fadly A.M., McDougald, L.R. & Swayne D.E., eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, pp 354–363. 57. Shawky S.A. & Sandhu T.S. (1997), "Inactivated vaccine for protection against duck virus enteritis", Avian Dis., p 41, p 461 - 468 58. Vandorssen, C.A., and H. Kunst (1955), "Sussceptibility of ducks and various other waterfowl to duck plague virus", Tijdschr Diergeneeskd 80, pp 1286 - 1295. 59. Vorapee Suwathanaviroij, Report at Poultry disease workshop in Kualalumpur Malaysia (3/1978). Iii. Tiếng Đức 60. Bergmann V., Heidrich R., Ziedler K. and Sobanski E., "Zum Auftreten von Entenpest in einem Maschusenten (Cairina moschata) Mastbestand", Mh. Vet. Med. 34(1979), st 524 - 527. iv. Tiếng pháp 61. Gaudry D., Tetkoff J. et Charles J.M., “A propos d’un nouveau virus isolé chez le canard de Barbarie”, Bull. Soc. Sci. Vet. Et Med. Comp. Lyon 74 (2) 1972, pp 137 - 143. 62. Rohrer H., “Traités des maladies à virus des ani maux”, Traduction de l’allemand Vigot frères é diteurs. ._.