Tìm hiểu về vi khuẩn Samonella

họ Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác. Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tôi thực hiện nghiên cứu đề tài “tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi khuẩn Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác. Mục đích - Tổng quan về một số loại vi sinh vật thường lây nhiễm vào thực phẩm và tìm hiểu về Salmonella với độc tố của nó. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố và cơ chế gây độc của một số chủng vi sinh vật. - Nghiên cứu về cách phát hiện Salmonella và đề xuất biện pháp phòng ngừa. Chương II: TỔNG QUAN Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm Escherichia Coli Giới thiệu - Escherichia Coli do Theodore Escherich (1857 – 1911), một bác sĩ nhi khoa người Áo phát hiện năm 1885. - E.Coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở đường ruột, nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng. - E.Coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. Trong đó, chủng E.coli K12 là mô hình được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học đã thu được dựa trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này. Phân loại - Về phân loại, Escherichia Coli được xếp vào: ? Giới: Bacteria ? Ngành: Proteobacteria ? Lớp: Gamma Proteobacteria ? Bộ: Enterobacteriales ? Họ: Enterobacteriaceae ? Chi: Escherichia ? Loài: Escherichia Coli Đặc điểm - E.Coli là trực khuẩn, Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 µm × 0,5 µm. Một số ít chủng E.Coli có vỏ, nhưng hầu hết đều có lông và có khả năng di động. - E.Coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có khả năng sinh hơi E.Coli có khả năng sinh Indol, không sinh H2S, không sử dụng được nguồn carbon của citrat trong môi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả năng phân giải carborxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h có thể dương tính . Hình 2.1 : Vi khuẩn Escherichia Coli Yếu tố độc lực - Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, mỗi nhóm sinh ra các loại độc tố khác nhau, hiện có 5 nhóm chính : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E.Coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC (Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative E.Coli) và EIEC (Enteroinvasive E.Coli). Nhóm STEC - Hiện nay có khá nhiều thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E.Coli này. Tên gọi Verotoxigenic E.Coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng tác viên (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero. Tên gọi Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết và hội chứng huyết niệu (Nataro và Kaper, 1989). Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E.Coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga-like toxin producing E.Coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga. - STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2. - Hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B có khối lượng phân tử 7,7 kDa và 1 tiểu đơn vị A có khối lượng phân tử 32 kDa. Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N-glycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây nên hiện tượng phù thủng ở heo. - Yếu tố bám dính của STEC/EHEC đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột. Đó chính là intimin, một protein màng ngoài có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Intimin được mã hóa bởi gen eae (E.Coli attaching and effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching-and-effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae gây tổn thương kiểu A/E là một trong số các gen nằm trên vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của STEC/EHEC chứa những gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor của intimin Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà còn là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae. - Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper, 1998). Trên plasmid này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open reading frame ORF) là hlyCABD. Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin. Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng có ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm STEC. Nhóm EPEC - Các yếu tố độc lực chính bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần thiết cho việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP (bundle – forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) và Ler (LEE – encorded regulator). Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP ( mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô và CDT (Cytolethan distending toxin) Nhóm ETEC - Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF). - Độc tố ruột enterotoxin + Nhóm ETEC gồm những E.Coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST. ? Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT của E.Coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor, hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào. ? LT có 2 serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch. LT-I được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. Còn LTII được tìm thấy chủ yếu ở E. coli trên thú và hiếm khi ở người. LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính enzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là các receptor của LT. Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và có thể phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh-I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và/hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA). ? Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi. Đích đến của LT trong tế bào là enzym adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. Vì vậy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được họat hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998). Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của LT và CT, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ chế phức tạp hơn. Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến những prostaglandin E (PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng hợp và phóng thích những chất chuyển hóa của acid arachidonic như prostaglandin và leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu động ruột. Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột. Cơ chế thứ ba là CT và LT gây đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ. ? Nhóm LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm receptor thay vì GM1. Như đã nói ở trên, LT-II không có liên quan đến bệnh trên người và thú. ? Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Sta (hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia enterocolitica và V. cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC. ? STa là một peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa. STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) phân lập được đầu tiên trên heo và STh (ST human hay STIb) phân lập trên người. Cả 2 loại độc tố có thể được tìm thấy ở dòng ETEC người. Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng GCC (guanylate cyclase C) thuộc họ những enzyme receptor cyclase. Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột. STb: STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo cáo về vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào. Không tạo ra sự tiết Cl- như STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb cũng kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng ENS có thể cũng có liên quan đến đáp ứng tiết gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi, 1992). - Yếu tố định vị (CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF). CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Gen của CFA thường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT. Nhóm EAEC - Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và độc tố EAST – 1. AFF được xem là yếu tố quyết định độc lực. Ba loại AAF đã được biết đến gồm AAF/I, AAF/II và AAF/III, trong đó loại I và loại II có cấu trúc bó, loại III có cấu trúc dạng sợi riêng biệt. Các AAF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch lên tế bào Hep – 2. Yếu tố aggR có vai trò điều hòa sự biểu hiện của các AAF. Protein Pet được tiết ra màng ngoài vi khuẩn gây ra sự tụ dịch và gây độc cho biểu mô tiêu hóa. EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô. Ngoài các yếu tố độc lực nêu trên, EAEC còn tiết ra một protein làm tan máu và làm mất thăng bằng vận chuyển protein qua màng. Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC chủ yếu được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa. Một số yếu tố độc lực được mã hóa trên các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu. Nhóm EIEC - EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140 MDa. Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion plasmid antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc ruột giống một số Shigella. Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác. Khả năng gây bệnh - E.Coli là nguyên nhân gây ra các bệnh như tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. E.Coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. - Trong các loại độc tố của E.Coli, độc tố Shiga là nguy hiểm nhất được biết đến trên người, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những trường hợp họai tử nặng có thể gây thủng ruột. Các thực phẩm liên quan - Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh (CDC) tính rằng có 85% nguồn gốc E.Coli có nguồn gốc là thực phẩm. Trên thực tế, bất kỳ sự tiêu thụ thực phẩm nhiễm phân (đặc biệt là phân gia súc) đều có thể dẫn đến việc nhiễm bệnh. Các thực phẩm được xác định là nguồn gây bệnh bao gồm thịt bò xay, thịt nai, xúc xích sấy khô (không nấu chín), sữa chưa tiệt trùng, phô mai, nước trái cây chưa tiệt trùng, cỏ linh lăng, mầm củ cải, rau và nước. Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát - Hiện nay chưa có biện pháp phòng ngừa đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm khẩn đường tiêu hóa do E.Coli, thực hiện các biện pháp phòng ngừa không đặc hiệu giống các loại vi khuẩn đường ruột khác. - Đề phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.Coli : thực hiện về sinh cùng hậu môn và bộ phận sinh dục ngoài. Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơ khác vì E.Coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng. Listeria monocytogenes Giới thiệu - Năm 1924, Muray và cộng sự trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnh trên các động vật được thí nghiệm, đã phân lập được một chủng vi sinh vật từ các hạch lympho của các động vật bị bệnh. Sau đó ông lấy chủng vi khuẩn này tiêm cho các con vật khỏe mạnh thì thấy có hiện tượng tăng bạch cầu đơn nhân (monocytosis), vì vậy ông đặ tên cho nó là Bacillus monocytogenes. Ba năm sau, tại Nam Phi, Pirie, khi đó đang nghiên cứu sự mang Yersinina pestis trên chuột, đã phân lập được từ gan chuột một chủng vi khuẩn và đặt tên cho nó là Listeria hepatolitica. Loại vi khuẩn này hoàn toàn không thể phân biệt được với chủng vi khuẩn của Muray. Chính vì vậy, Pirie đã đề xuất một tên mới cho các chủng vi khuẩn này, đó là Listeria monocytogenes. Phân loại ? Giới: Bacteria ? Ngành : Firmicutes ? Lớp: Bacilli ? Bộ: Bacillales ? Họ: Listeriaceae ? Chi: Listeria ? Loài : Listeria monocytogenes Đặc điểm - Các loài Listeria là trực khuẩn Gram dương, có kích thước ngắn (0,4 – 0,5 × 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid, không sinh nha bào. Ở 20oC chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), nhưng sự di động không quan sát được ở 37oC. Chúng là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 45oC (tối ưu là 30 – 36oC), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng cũng mọc trên một khoảng pH dao động rất rộng, một số chủng có thể mọc ở pH 9,6, nhưng đạt điều kiện tối ưu ở pH hơi kiềm hoặc môi trường trung tính. Hình 2.2: Vi khuẩn Listeria monocytomonogenes Yếu tố độc lực - Listeriolysin O (LLO) là yếu tố độc lực chính của Listeria monocytigenes cho phép nó thoát khỏi sự thực bào. LLO có khối lượng phân tử 58,6 kDa, hình thành bởi một chuỗi polypeptide đơn gồm 529 amino acids. Trình tự đầu N đại diện cho đặc điểm của trình tự dấu hiệu của vi khuẩn Gram dương điển hình: phần đầu tiên có tính ái nước và mang điện tích dương được theo sau bởi 20 đầu kỵ nước. Trình tự này mã hóa trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25. Kết quả là LLO được bắt đầu từ amino acid 26, là một phân tử protein dài 504 aa và có trọng lượng phân tử 55,8 kDa. - LLO thuộc về họ độc tố gắn cholesterol được hoạt bởi nhóm thiol được tạo bởi hầu hết các vi khuẩn Gram dương. Hoạt tính ly giải của các độc tố này bởi giảm bớt một số tác nhân và bị kìm hãm bởi sự oxy hóa và biểu hiện khi có cholesterol hoặc kháng thể kháng streptolysin O. Cytolysin được hoạt hóa bởi thiol có một cystein đơn ở vùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt bởi sự oxy hóa mặc dù cystein này có thể được thay thế bằng alanine mà không làm mất chức năng ly giải. Chúng tạo nên những lỗ không liên tục với đường kính bên trong lên đến 30 nm trong những màng chứa cholesterol. Cơ chế hoạt động của chúng dựa vào sự tương tác với cholesterol có chức năng không chỉ là vị trí gắn kết mà còn như một tác nhân làm thay đổi hoạt động của enzyme dẫn đến quá trình oligomer hóa của khoảng 20 – 80 toxin monomer thành cấu trúc vòng hoặc giống vòng cung. - Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường: nó hoạt động cao nhất ở pH 5,5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7,0. Trái lại, các độc tố được hoạt hóa ở gốc thiol có phổ pH hoạt động rộng hơn như pH 6.0 đối với pneumolysin, pH 6.5 đối với perfringolysin O và alveolysin, pH 7.0 đối với streptolysin O. Sự phát hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của LM. Sau quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa LLO. Chính độc tố này sẽ xúc tiến quá trình ly giải không bào và tế bào vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất trong khi đó môi trương pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. Sự hư hại của màng tế bào chủ cũng bị ngăn cản bởi sự phân hủy nhanh của LLO trong tế bào chất do sự nhận biết của một trình tự giống PEST. Một trình tự amino acid giàu Proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T) được gọi là PEST và protein đích để phân hủy. Trong đầu N của LLO nằm ở vùng 19 aa (từ 32 – 50) chứng minh đặc điểm này. Một điều thú vị khi loại bỏ motif giống PEST này không chỉ nâng cao độc lực của LLO mà còn sửa đổi các yếu tố độc lực của vi khuẩn. LM bị đột biến, thiếu trình tự PEST LLO, được chứng minh là việc thoát ra khỏi không bào thực bào theo một con đường rất khó khăn. Điều này chứng tỏ rằng vùng này cũng rất quan trọng cho quá trình phá hủy màng. Khả năng gây bệnh - Ngoài những trường hợp rất hiếm gặp nhiễm trực tiếp qua đường da hoặc đường kết mạc, hầu hết ở người trưởng thành vi khuẩn xâm nhạp qua đường tiêu hóa. Với thai nhi, nhiễm Listeria hầu hết xảy ra qua đường máu và một số ít trường hợp xảy ra qua đường sinh đẻ. Các trường hợp khởi nhiễm Listeria muộn ở trẻ mới sinh là do quá trình lây nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp từ người sang người. Các thực phẩm liên quan - Nguồn lây nhiễm Listeria chủ yếu là từ gia cầm, những kết quả theo dõi gần đây cho thấy, hơn 62% mẫu thịt gà sống có khả năng bị nhiễm khuẩn. Tỷ lệ nhiễm L.monocytogenes ở thịt chín ít hơn thịt sống nhưng cũng có khả năng gây ra bệnh Listeriosis trên người. - Listeria monocytogenes cũng đến từ các nguồn khác như patê, rau (kể cả loại salad đóng sẵn), hải sản đặc biệt là thịt cua và cá hun khói, trong các sản phẩm đông lạnh. Biện pháp ngăn ngừa và kiểm soát - Làm sạch bề mặt tiếp xúc với thực phẩm, có thể dùng cồn hoặc kết hợp với amoni 4 để tăng hiệu suất khử trùng. Thực phẩm lưu trữ cần được giữ lạnh dưới 4oC để đảm bảo an toàn. - Thực hiện các biện pháp vệ sinh an toàn vệ sinh thực phẩm cho cộng đồng. Kiểm tra các cơ sở giết mổ cung cấp thịt cho thị trường. Đối với cá nhân, thực hiên vệ sinh ăn uống, ăn chín, uống sôi, rửa tay trước khi ăn, diệt khuẩn, diệt ruồi - Phát hiện người mang vi khuẩn, đặc biệt là những người có liên quan trực tiếp đến ăn uống của tập thể như cấp dưỡng của các cơ quan, người chế biến thức ăn, người phục vụ ở các nhà hàng ăn uống. - Chuẩn đoán sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của bệnh nhân. Đối với súc vật bị bệnh cần chữa triệt để hoặc tiêu hủy. Tổng quan về Salmonella sp. Lịch sử phát hiện - Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn. - Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là S.enteritidis. Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner… - Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được S.pullorum năm 1909. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S.gallinarum –pullorum. - Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.paratyphi equi và S.paratyphi bacilus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là S.paratyphi B và đến năm 1898, S.paratyphi A đã tìm được do N.Guyn và H Keyser. Phân loại - Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào: ? Giới : Bacteria ? Ngành: Proteobacteria ? Lớp: Gramma Proteobacteria ? Bộ: Enterobacteriales ? Họ: Enterobacteriaceae ? Giống: Salmonella lignieres 1900 - Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột), về sau người ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau. Vì những lý do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S.teheran, S.congo, S.london. - Salmonella đã từng được chia thành các chi phụ và nhiều loài, mỗi loài lại có khả năng có chi phụ. Ví dụ như loài Salmonella enterica được chia thành 6 loài phụ gồm S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae và S.indica. - Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu sau này cho phép xếp tất cả các loại Salmonella vào 1 loài duy nhất. Mặc dù ý kiến này đã được nêu ra nhưng cách truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa riêng nên nó không được chấp nhận. - Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H, Salmonella được chia thành các nhóm và các type huyết thanh. Hiện nay được xác định gồm trên 2500 type huyết thanh Salmonella. Đặc điểm Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy - Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 x 0,5 – 1 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S. gallimarum và S. pullorum, không tạo bào tử, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 420C, thích hợp nhất ở 350C – 370C, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2. Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. - Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ. Hình 2.3 : Vi khẩn Salmonella Tính chất hóa sinh - Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi. Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môn trường Simmons. - Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các ngoại lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác. Cấu trúc của Salmonella - Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu. - Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O) + Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạ p gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide. + Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau : kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài. Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài - Kháng nguyên lông (kháng nguyên H) +Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông. Hầu hết Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng nguyên H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O. Kháng nguyên H rất dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu. + Kháng nguyên H chia làm 2 phase : F Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữa số La tinh thường: a, b, c… F Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x… - Kháng nguyên vỏ K + Kháng nguyên K: Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi. Kháng nguyên Vi – angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây bệnh. Yếu tố độc lực - Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố. + Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. + Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính._.