Tìm hiểu vai trò của Auxin trong sự phát sinh hình thái chồi In vitro từ mô phân sinh ngọn của cây đậu Vigna Anguilaris (Willd.) Ohwi Et Ohashi

ang Việt, Trưởng Bộ mơn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, người đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và hồn chỉnh bài luận văn. TS. Lê Thị Trung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em hồn thành luận văn. TS. Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngơ Hoang, Th.S Trịnh Cẩm Tú đã tận tình giúp đỡ và đĩng gĩp những ý kiến chân tình, những kinh nghiệm bổ ích cho luận văn của em. Quý thầy cơ trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đĩng gĩp nhiều ý kiến cho luận văn của em. Ban chủ nhiệm và tồn thể quý thầy cơ khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh. Các bạn cao học khố 19, CN. Hồ Thị Mỹ Linh (Chuyên viên Phịng thí nghiệm khoa Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tơi trong quá trình thực hiện luận văn. Em Như (Cao học khố 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh) và các em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV đang thực hiện đề tài tại Bộ mơn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ tơi trong việc tìm kiếm sách và tài liệu tham khảo. MỤC LỤC 7TLỜI CẢM ƠN7T ...................................................................................................................... 1 7TMỤC LỤC7T ............................................................................................................................ 2 7TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT7T .................................................................................. 6 7TMỞ ĐẦU7T .............................................................................................................................. 7 7TCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU7T ............................................................................. 8 7T1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi7T ................................. 8 7T1.1.1. Phân loại học7T ........................................................................................................ 8 7T1.1.2. Mơ tả đặc điểm hình thái cây Đậu7T ........................................................................ 8 7T1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật7T .................................................................................... 8 7T1.2.1. Khái niệm7T ............................................................................................................. 8 7T1.2.2. Mơ phân sinh ngọn chồi7T ....................................................................................... 9 7T1.2.2.1. Đặc điểm7T ....................................................................................................... 9 7T1.2.2.2. Cấu trúc của mơ phân sinh ngọn chồi7T .......................................................... 10 7T1.2.2.3. Sự phân bào của mơ phân sinh ngọn chồi7T .................................................... 11 7T1.2.3. Hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi7T .............................................................. 11 7T1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm7T ................... 11 7T1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành7T ............................................ 12 7T1.2.4. Sự phát triển chồi7T ............................................................................................... 12 7T1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách7T ................................................................................ 12 7T1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định7T ..................................................... 13 7T1.3. Vai trị của auxin và các chất điều hồ tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái ngọn chồi7T .................................................................................................................. 14 7T1.3.1. Vai trị của auxin7T ................................................................................................ 14 7T1.3.2. Vai trị của cytokinin7T .......................................................................................... 16 7T1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi7T .......................................... 17 7T1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên7T ...................................................................................... 17 7T1.3.3.3. Sự hình thành rễ7T .......................................................................................... 18 7TCHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP7T .............................................................. 19 7T2.1.Vật liệu7T ...................................................................................................................... 19 7T2.2.Phương pháp7T .............................................................................................................. 19 7T2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn7T ..................... 19 7T2.2.2.Khử trùng hạt7T ...................................................................................................... 19 7T2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ......................................................................................................................... 19 7T2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ........................................................................................................... 20 7T2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7T ..................... 21 7T2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi7T .............................................................................................. 21 7T2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi7T ........................................................................................... 21 7T2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu7T ............................................................................... 22 7T2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hơ hấp7T ..................................................... 23 7T2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hồ tăng trưởng thực vật7T ........................................... 23 7T2.2.9.Xử lý số liệu7T ........................................................................................................ 23 7TCHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN7T .................................................................... 24 7T3.1. Kết quả7T ...................................................................................................................... 24 7T3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn7T ....................................................... 24 7T3.1.2. Nuơi cấy hạt để tạo cây in vitro trên mơi trường MS7T .......................................... 26 7T3.1.3. Sự phát triển chồi mầm7T ...................................................................................... 26 7T3.1.3.1. Trong giai đoạn hạt nảy mầm7T ...................................................................... 26 7T3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khơ theo thời gian từ giai đoạn hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi7T .................................................................................... 27 7T3.1.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hồ tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi mầm7T ......................................................................................................................... 28 7T3.1.4. Các biến đổi hình thái của mơ phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi7T ..................................................................................................................................... 30 7T3.1.5. Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn7T ................................... 33 7T3.1.5.1. Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro7T ............................... 33 7T3.1.5.2. Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn7T .......... 33 7T3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách7T ......................................................... 36 7T3.1.7. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ......................................................................................................................... 45 7T3.1.8. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ7T ........................................................................................................... 47 7T3.1.8.1. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên mơi trường AIA 2 mg/l và sau đĩ chuyển sang mơi trưịng MS theo thời gian7T .......................................................................... 47 7T3.1.8.2. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên mơi trường MS và sau đĩ chuyển sang mơi trưịng AIA 2 mg/l theo thời gian7T ............................................................................ 51 7T3.1.9. Sự thay đổi cường độ quang hợp và hơ hấp của chồi ngọn sau khi xử lý AIA 2 mg/l theo thời gian7T ....................................................................................................... 54 7T3.1.10. Hoạt tính các chất điều hồ tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tăng trưởng chồi7T ................................................................................................................... 55 7T3.1.11. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7T ................... 57 7T3.1.11.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi7T ....................................................................................... 57 7T3.1.11.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi7T ................................................................................... 62 7T3.2. Thảo luận7T .................................................................................................................... 1 7TCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ7T ......................................................................... 12 7T4.1. Kết luận7T..................................................................................................................... 12 7T4.2. Đề nghị7T ..................................................................................................................... 12 7T ÀI LIỆU THAM KHẢO7T ................................................................................................. 14 7TPHỤ LỤC7T ........................................................................................................................... 18 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abcisic acid AIA : Acetic indol acid BA : Benzyl Adenin CĐHTTTV : Chất điều hồ tăng trưởng thực vật GR1 R : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào ở trạng thái trưởng thành GAR3R : Giberelic acid IBA : Indol Butyric acid MS : Murashige và Skoog TLT : Trọng lượng tươi TLK : Trọng lượng khơ cs : cộng sự MỞ ĐẦU Phát sinh hình thái là cơ sở cho việc vi nhân giống thực vật mà hiện nay đang rất được quan tâm. Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mơ và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhĩm tế bào gốc khơng phân hĩa (undifferentiated stem cells) được gọi là mơ phân sinh. Hơn nữa, kiểm sốt hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi ở mức phân tử dưới tác động của các chất điều hịa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin, gần đây được nghiên cứu bởi nhiều tác giả. Do đĩ, đề tài tập trung nghiên cứu trên cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi, rất thơng dụng ở Việt Nam, để hiểu về hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi dưới tác động của auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin. Việc khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự phát sinh hình thái chồi ở cây Đậu được thực hiện dưới các khía cạnh hình thái học và sinh lý học, qua đĩ bổ sung thêm kiến thức phục vụ cho cơng tác nghiên cứu, ứng dụng trong sự vi nhân giống và giảng dạy. Ảnh 1.1. Cây Đậu đỏ Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi ( sp?param=news&newsid=934) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1.1. Phân loại học Cây Đậu được dùng trong đề tài này là cây Đậu đỏ, được phân loại như sau: Ngành : 7TMagnoliophyta7T Lớp : 7TMagnoliopsida7T Bộ : 7TFabales7T Họ : 7TFabaceae7T Chi : 5TVigna 5TLồi : 5TVigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hồng Hộ, 1999) 1.1.2. Mơ tả đặc điểm hình thái cây Đậu Cây Đậu đỏ (adzuki bean) là loại cỏ nhất niên, đứng hay leo. Cây cĩ chiều cao trung bình 50-80 cm, cĩ cạnh và lơng dài. Cuống lá dài 10-12 cm, cĩ lơng. Lá thường cĩ hình xoan, đầu trịn, cĩ thùy, dài 6-8 cm và cĩ lơng. Mỗi lá gồm 4-5 cặp gân phụ. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10 cm, cĩ màu vàng nhạt. Đài hoa cĩ 5 răng ngắn. Trái dài 6-10 cm và rộng 0,7 cm, cĩ chĩt nhọn. Hột dài 6-10 mm, cĩ màu nâu. Bộ nhiễm sắc thể của Đậu đỏ 2n = 22. Cây Đậu đỏ được trồng nhiều ở Nha Trang, Sài Gịn,… và được trồng để lấy hạt. Cơng dụng của cây Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng; hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hồng Hộ, 1999). 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1. Khái niệm Sự phát sinh hình thái thực vật là sự phát triển cơ thể thực vật theo thời gian để hồn tất chu trình phát triển. Phát triển chỉ những thay đổi của tế bào, mơ hay cơ quan từ lúc khởi đầu cho đến lúc trưởng thành. Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mơ (histogenesis), phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phơi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự phát sinh cơ quan in vitro, cĩ thể tạo các cơ quan theo con đường phát sinh cơ quan trực tiếp (các cơ quan tạo ra trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mơ sẹo, sau đĩ các cơ quan tạo ra từ mơ sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình căn bản sau: - Sự điều hồ hướng kéo dài tế bào. - Sự kiểm sốt vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển ở mức tế bào thể hiện qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia và kéo dài tế bào) và phân hĩa tế bào. Ở thực vật, sự phân chia và kéo dài tế bào tách biệt nhau theo khơng gian và thời gian (Bùi Trang Việt, 2000). Mơn phát sinh hình thái là mơn học nhằm mơ tả các biến đổi hình thái và cấu trúc, phân tích các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, và nghiên cứu sự điều hịa hình thái thực vật. Sự phát sinh hình thái liên quan một cách tồn diện đến nguồn gốc và sự phát triển hình thái thực vật. Do đĩ, khơng cĩ một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào cĩ thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nĩ. Những kỹ thuật của nhiều lĩnh vực khác nhau như mơ học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều cĩ thể giúp tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp được dùng nhiều nhất là: - Cắt bỏ một vùng lân cận của mơ phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đĩ. - Nuơi cấy in vitro trong điều kiện vơ trùng và cĩ kiểm sốt các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khĩ tiến hành do kích thước quá nhỏ bé của các loại mơ cấy, nên sự áp dụng các chất điều hồ sinh trưởng thực vật ngoại sinh là cách hữu hiệu để tìm hiểu về sự phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mơ và cơ quan mới ở thực vật nhờ hoạt động của các nhĩm tế bào gốc khơng phân hĩa (undifferentiated stem cells) được gọi là mơ phân sinh (Vernoux và cs, 2010). 1.2.2. Mơ phân sinh ngọn chồi 1.2.2.1. Đặc điểm Các mơ phân sinh là những vùng riêng biệt luơn hiện diện trong đời sống thực vật. Các tế bào ở vùng mơ phân sinh cĩ khả năng phân chia khơng ngừng, tế bào nhỏ, xếp sát nhau và khơng cĩ khoảng gian bào. Tế bào chất của tế bào mơ phân sinh cĩ độ nhớt cao, cĩ nhiều khơng bào nhỏ li ti, số lượng các bào quan (ribosome, ty thể, lạp thể) nhiều. Nhân lớn chiếm vị trí trung tâm. Như vậy, cấu tạo của tế bào mơ phân sinh nĩi lên hoạt tính sinh lý cao của chúng (Bùi Trang Việt, 2000). Mơ phân sinh là cơ sở hình thành các mơ vĩnh viễn. Nhờ hoạt động của mơ phân sinh mà cây sinh trưởng và phát triển. Trong quá trình sinh phơi, mơ phân sinh ngọn chồi phát triển ở vùng giữa hai sơ khởi lá mầm (đối với cây hai lá mầm) hay ở gốc của thuẫn (đối với cây một lá mầm). Mơ phân sinh ngọn chồi cĩ đường kính 100 – 200 mµ (Bùi Trang Việt, 2000). Khi cây trưởng thành, mơ phân sinh ngọn nằm ở ngọn của chồi chính, chồi bên của thân và ở ngọn rễ. Các mơ phân sinh ngọn hoạt động phân chia suốt cả đời sống của cây, giúp cây dài ra (Nguyễn Như Khanh, 2009). 1.2.2.2. Cấu trúc của mơ phân sinh ngọn chồi Cĩ nhiều quan điểm về tổ chức của mơ phân sinh ngọn chồi, trong đĩ quan điểm thường gặp nhất là sự tổ chức của mơ phân sinh ngọn chồi thành các vùng hay lớp phân biệt (Esau, 1967). Mơ phân sinh ngọn chồi Arabidopsis cĩ ba lớp: L1, L2, và L3. L1 là lớp ngồi cùng (lớp ngoại vi), L2 là lớp bên trong lớp ngoại vi. L1 và L2 tạo nên vỏ. L3 là lớp thể và ở giữa là vùng đỉnh. Vỏ cho các lớp biểu bì và dưới biểu bì của thân và lá. Một số ít tế bào từ các phân chia trong vỏ và thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa) (Bùi Trang Việt, 2000). Nếu chia mơ phân sinh ngọn chồi theo vùng thì mơ phân sinh ngọn chồi được chia thành ba vùng chính: - Vùng đỉnh (vùng mơ phân sinh chờ) chứa các tế bào cĩ khơng bào lớn, tế bào chất chứa ít rRNA, chu kì tế bào rất dài, hoạt tính phân chia thấp, tế bào chủ yếu ở pha GR1R. Vùng này cịn được gọi là mơ phân sinh chờ vì chúng chỉ hoạt động khi mơ phân sinh ngọn chuyển sang trạng thái sinh sản. - Vùng bên (vùng khởi sinh, hay vùng phát sinh cơ quan) chứa các tế bào nhỏ hơn với khơng bào nhỏ, giàu rRNA, cĩ hoạt tính phân chia cao. Chu kì tế bào (pha GR1R) ngắn. Đây là vùng phát sinh lá và các mơ của thân (bao gồm các mơ dẫn). - Vùng lõi (vùng phát sinh mơ) nằm dưới vùng đỉnh, chứa các tế bào cĩ khơng bào lớn, hàm lượng rRNA ít hơn so với vùng đỉnh, hoạt tính phân chia và chu kì phân chia tế bào của vùng này ở mức trung gian so với vùng đỉnh và vùng bên (Bùi Trang Việt, 2000; Taiz và Zeiger, 2002). Vùng lõi là vùng phát sinh mơ lõi của thân trong khi các cơ quan khác đều xuất phát từ vùng bên (Esau, 1967). Theo một cách phân chia khác, tổ chức mơ phân sinh ngọn chồi gồm tunica (vỏ) và corpus (thể). Ở Arabidopsis và hầu hết cây hai lá mầm, tunica gồm lớp L1 bao phủ phía ngồi mơ phân sinh ngọn chồi và lớp L2 nằm ngay dưới lớp L1. Corpus (được gọi là L3) khơng phải là một lớp tế bào đơn lẻ mà là nhĩm các tế bào ngay dưới tunica (Evert, 2006). 1.2.2.3. Sự phân bào của mơ phân sinh ngọn chồi Các tế bào ở lớp áo bọc ngồi hay tunica (hai hay ba lớp) xếp đều dặn, bao quanh các tế bào trung tâm, và phân chia theo những mặt phẳng vuơng gĩc với bề mặt của phơi (anticlinial division). Các lớp tế bào trung tâm (thể corpus) phân bố khơng đều đặn và phân chia theo các mặt phẳng khác nhau (Nguyễn Như Khanh, 2009). 1.2.3. Hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi 1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm Từ hợp tử, sự phát triển phơi trong hạt được kiểm sốt theo thời gian và khơng gian qua hai giai đoạn chính: sinh phơi và trưởng thành của phơi. Kết quả của sự phát triển phơi trong nỗn là hạt chín, vỏ nỗn sẽ mất hầu hết nước và tạo nên vỏ hạt bền chắc bao quanh phơi và nội nhũ. Vào lúc đĩ, phơi ngừng phát triển và hạt ở vào trạng thái ngủ. Hạt sẽ khơng phát triển tiếp cho đến khi nảy mầm. Như vậy, sự nảy mầm của hạt thường chỉ xảy ra sau một giai đoạn khơ (giai đoạn ngủ) ở cuối giai đoạn trưởng thành của phơi. Phơi đang ngủ bao gồm thân mầm và rễ mầm chứa mơ phân sinh đỉnh. Các mơ phân sinh sẽ tạo ra các tế bào làm cho phơi dài ra khi hạt nảy mầm (Bùi Trang Việt, 2000). Sự nảy mầm của hạt được xem như là sự tái lập tăng trưởng của phơi. Quá trình này bắt đầu từ sự tái thu nước của hạt cho tới sự lú rễ mầm ra khỏi hạt. Các đặc tính quan trọng nhất của sự nảy mầm là: hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh, và phát sinh nhiệt mạnh (Bùi Trang Việt, 2000). Sự nảy mầm cuả hạt gồm ba giai đoạn chính: - Giai đoạn thu nước (6 – 12 giờ tùy loại hạt) Hạt (nhất là phơi) thu nước mạnh, phồng lên và tăng trọng lượng tươi. Sự thu nước đi kèm với sự gia tăng cường độ hơ hấp, biểu hiện của sự tái lập hoạt tính biến dưỡng. - Giai đoạn nảy mầm theo nghĩa hẹp (12 – 48 giờ) Giai đoạn này bắt đầu bởi sự bão hịa nước và cường độ hơ hấp ở mức cao của hạt, các phản ứng biến dưỡng bắt đầu, các chất dự trữ bị thủy giải và được phơi đồng hĩa. Kế đĩ, phơi tái lập sự phân chia tế bào, vỏ hạt bị rách, rễ mầm lú ra khỏi các vỏ hạt (1 – 2 mm), thân mầm kéo dài ra. - Giai đoạn tăng trưởng của cây mầm Trong giai đoạn này, hạt thu thêm nước và tăng thêm cường độ hơ hấp, tương ứng với sự tăng trưởng đáng kể của rễ mầm và thân mầm. Hoạt tính biến dưỡng của cây mầm (từ phơi) tăng mạnh, nhưng hoạt tính biến dưỡng của mơ dự trữ (phơi nhũ, tử diệp) giảm mạnh, các chất dự trữ cạn dần. Ở trạng thái này, sự khử nước làm hạt chết (Bùi Trang Việt, 2000). 1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành Hoa được thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách. Để một chồi dinh dưỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trưởng thành ra hoa. Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mơ phân sinh ngọn, từ mơ phân sinh dinh dưỡng thành mơ phân sinh tiền hoa. Quá trình ra hoa biểu thị qua sự thay đổi về hình thái và sinh lý của mơ phân sinh ngọn chồi (Bùi Trang Việt, 2000). Như vậy, mơ phân sinh ngọn chồi khi đã đạt đến một trạng thái nhất định nĩ sẽ diễn ra các hoạt động biến đổi từ trạng thái tăng trưởng sinh dưỡng khơng hạn định sang trạng thái phát triển sinh sản hạn định. Các biến đổi trong giai đoạn này thường khơng quan sát được bằng mắt thường hoặc kính hiển vi, chỉ biết được bởi các phân tích bằng tế bào học hay sinh hố học, với sự tăng mạnh hoạt tính biến dưỡng: rút ngắn chu kỳ tế bào, gia tăng hoạt tính phân chia, đặc biệt trong vùng đỉnh (Bùi Trang Việt, 2000). Mơ phân sinh ngọn chồi tăng cường tổng hợp RNA, tăng tốc độ tổng hợp protein, các enzym chuyển hĩa (invertase) tăng cường hoạt động, số lượng ti thể gia tăng, hàm lượng sucrose và ATP cũng tăng. Bên cạnh đĩ, chu trình tế bào ở mơ phân sinh được rút ngắn lại, tăng tỷ lệ phân chia tế bào. Ở mơ phân sinh dinh dưỡng, các tế bào ở vùng đỉnh phân chia rất chậm. Chính sự phân chia nhanh của vùng đỉnh khiến cho mơ phân sinh hoa lớn hơn mơ phân sinh dinh dưỡng (Taiz và Zeiger, 2002). Sự biến đổi này thể hiện rất rõ ở bộ máy dinh dưỡng, đặc biệt là sự kéo dài lĩng thân do sự phân chia tế bào mạnh của vùng dưới ngọn của mơ phân sinh tiền hoa. Các biến đổi chỉ ở mức tế bào nhưng rất quan trọng, quyết định sự biến đổi ở mức cơ quan sau này (Bùi Trang Việt, 2000). 1.2.4. Sự phát triển chồi 1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách Chồi nách hiện diện ở nách lá, được tạo bởi mơ phân sinh ngọn và các phát thể lá xếp chồng lên nhau. Sự phát triển của chồi nách (sự phát sinh chồi) bao gồm sự tổ chức của một mơ phân sinh ngọn chồi (cĩ cấu trúc giống với mơ phân sinh ngọn của thân chính), sự kéo dài và sự phân hố các mơ. Chồi nách cĩ nguồn gốc ngoại sinh, ngược với nguồn gốc nội sinh của rễ nhánh (Bùi Trang Việt, 2000). Các chồi nách thường bị cản phát triển do bị chồi ngọn ức chế (hiện tượng ưu thế ngọn). Hiện tượng này cĩ thể do auxin tổng hợp ở ngọn di chuyển đến chồi nách và cản sự phát triển của chồi nách (do hiệu ứng cản tăng trưởng của auxin) hoặc do cĩ sự cạnh tranh dinh dưỡng (chồi ngọn thu hút chất dinh dưỡng mạnh về phía nĩ) hoặc do auxin kích thích sự tiết chất cản (etylen hoặc ABA) cản sự phát triển của chồi (Bùi Trang Việt, 2000). Các chồi bên cĩ thể được cảm ứng phát triển bằng cách phá bỏ ưu thế ngọn. Cho nên người ta cĩ thể cắt bỏ chồi ngọn để chồi nách phát triển. Trong nuơi cấy in vitro, các chồi nách cĩ thể được kích thích phát triển mạnh bởi việc bổ sung cytokinin vào mơi trường. Vai trị của cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế ngọn để các chồi bên cĩ thể phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển thân và nhánh: Thân phát triển từ chồi ngọn, nhánh từ chồi nách. Sự tăng trưởng chồi nhờ mơ phân sinh ngọn được bổ sung bởi sự tăng trưởng lĩng nhờ mơ phân sinh lĩng (Bùi Trang Việt, 2000). Sự phát triển lá: Lá bắt nguồn từ bề mặt của mơ phân sinh đỉnh dạng nĩn và do sinh trưởng sơ cấp tạo nên. Lá cĩ sự tăng trưởng bề mặt và đời sống giới hạn. Các tế bào trong sơ khởi lá tiếp tục phân chia và gia tăng kích thước tạo nên cuống và phiến lá (Bùi Trang Việt, 2000). 1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định Chồi bất định xuất hiện khơng chỉ liên hệ với mơ phân sinh chĩp mà cịn xuất hiện gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặc ngồi biểu bì. Vì vậy chồi cĩ thể cĩ nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự khử phân hĩa các tế bào trưởng thành. Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế bào giống như sinh mơ chĩp và cĩ mạch gắn liền với mạch của thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Mơ phân sinh ngọn chồi cĩ thể từ tế bào biểu bì, mơ hàng rào, mơ khuyết hay mơ bao quanh mạch của mơ cấy. Trước khi phân hĩa để hình thành tầng phát sinh chồi được tạo mới, tế bào đã phân hĩa phải trải qua quá trình tái hoạt động. Sự tái hoạt động này cĩ thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mơ cấy nhờ các mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung các chất điều hồ thích hợp. Cĩ hai giai đoạn xảy ra trong quá trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hĩa và giai đoạn tái phân hố (Gautheret, 1966; Bùi Trang Việt, 2009). Trong giai đoạn khử phân hĩa, tế bào đã phân hĩa bắt đầu phân chia, các cơ quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mơ phân sinh thứ cấp (hạch nhân, khơng bào lớn dần và ty thể, lạp thể phân chia thành các bĩng nhỏ). Sau đĩ là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mơ phân sinh thứ cấp sang trạng thái mơ phân sinh sơ cấp cĩ khả năng sinh cơ quan. Lúc này khơng bào phân chia thành những khơng bào nhỏ. Tế bào cĩ thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to (Bùi Trang Việt, 2009). Tiếp theo là giai đoạn tái phân hĩa của mơ phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại trạng thái mơ phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hĩa cũng qua hai bước: bước một, tế bào trở về trạng thái mơ phân sinh hoạt động, các khơng bào trương nước và hợp thành khơng bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ty thể dần trở về hình dạng đặc trưng; bước hai, các lạp phân hĩa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp. Sau đĩ, các tế bào này cĩ thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hĩa mà khơng qua sự phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000). Trong tự nhiên, sự tạo mới chồi trực tiếp cĩ thể xảy ra ở các chỗ khuyết trên lá một số loại sống đời, từ mơ phân sinh trong gân lá dương xỉ (Bùi Trang Việt, 2000). Tĩm lại, sự phát sinh chồi bất định gồm các giai đoạn: - Đầu tiên là sự hình thành các khối sinh mơ (cĩ liên hệ với trung tâm mơ phân sinh chồi hay các mơ phân sinh) - Tiếp theo là sự hình thành sơ khởi chồi - Cuối cùng là chồi bất định được hình thành từ sơ khởi dạng kim và đỉnh vịm (Soh và Bhojwani, 1999). 1.3. Vai trị của auxin và các chất điều hồ tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái ngọn chồi 1.3.1. Vai trị của auxin Auxin đĩng vai trị trung tâm trong hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi (cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào). Tuy nhiên auxin lại phân bố khơng đồng đều trong mơ phân sinh ngọn. Một trong những yếu tố điều hịa lượng auxin là các chất vận chuyển auxin thuộc các họ PIN và AUX (Vernoux và cs, 2010). Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nĩ cĩ vai trị quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mơ phân sinh (ngọn và lĩng) và lá non (tức là các nơi cĩ sự phân chia tế bào nhanh). Sau đĩ, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000). Ở mức tế bào, auxin kiểm sốt sự phân chia, kéo dài và phân hố tế bào. Các tế bào biểu bì hay dưới biểu bì phản ứng mạnh nhất với auxin. Auxin kích thích mạnh sự phân chia của tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe- mộc), nhưng hầu như khơng tác động trên mơ phân sinh sơ cấp. Do đĩ auxin tác động trên sự tăng trưởng theo đường kính. Đồng thời auxin giúp sự phân hĩa của các mơ dẫn, và cĩ khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hố tế bào nhu mơ thành các tổ chức mơ dẫn (Bùi Trang Việt, 2000). Nồng độ của auxin cĩ ảnh hưởng trong sự kéo dài tế bào. Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân. Sự kéo dài tế bào rễ cần những nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân. Trong cả hai trường hợp, hiệu ứng auxin giảm sau một nồng độ tối hảo, và trở nên độc ở các nồng độ quá cao. Hoạt tính kéo dài tế bào của auxin là do auxin tác động lên bơm proton màng nguyên sinh chất. Sự kéo dài tế bào là một quá trình phức tạp: hấp thu nước, dãn dài vách dưới sức trương,._. đặt các hợp chất mới của vách giữa các mạng vi sợi celluloz, sinh tổng hợp protein và các chất khác (Bùi Trang Việt, 2000). Trong quá trình tạo chồi Auxin ở nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi. Auxin kết hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mơ phân sinh ngọn chồi từ nhu mơ. Ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa được thành lập hay của chồi nách (Bùi Trang Việt, 2000). Sự vận chuyển hữu cực của auxin cĩ vai trị thiết lập, duy trì tính hữu cực của thực vật và các cơ quan của chúng. Việc cản sự vận chuyển hữu cực của auxin cĩ thể dẫn tới nhiều tính bất thường, trong phơi và cĩ thể dẫn đến sự chết. Tác dụng của auxin tùy thuộc vào kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu; loại và hàm lượng auxin nội sinh cĩ trong mẫu cấy; tính nhạy của mơ thực vật với auxin; sự tương tác qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh; sự kìm hãm hoạt tính của auxin (bị oxy hố hay liên kết) trong mơi trường và trong mơ cấy (Machakova và cs, 2008). Trong quá trình tạo rễ Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và ở nồng độ thấp cần cho sự tạo chồi. Trong hầu hết các lồi thực vật, sự hình thành rễ bất định đều được khởi phát bởi auxin, nhưng trong một vài lồi thì auxin ngoại sinh dường như ít ảnh hưởng. Sự tăng lượng AIA cần thiết trong giai đoạn cảm ứng tạo sơ khởi rễ, nhưng sự giảm hàm lượng AIA sau đĩ cho phép sự kéo dài sơ khởi rễ. Như vậy auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000). Số lượng rễ trên mỗi chồi thường tăng theo nồng độ auxin xử lý. Nhưng nếu nồng độ auxin quá cao sẽ cĩ sự hình thành callus, rễ cĩ hình dạng khơng bình thường và khơng kéo dài, sau đĩ thì sự tăng trưởng của chồi sẽ bị giảm (George, 1996). Điều này cho thấy, trong cùng một quá trình sinh lý, auxin cĩ thể cĩ những hiệu ứng khác nhau, thậm chí đối nghịch tùy theo nồng độ và cơ quan nuơi cấy. Ở một nồng độ nào đĩ, auxin cĩ hiệu ứng khác nhau đối với các quá trình sinh lý khác nhau của một cơ quan (như sự kéo dài và phát triển rễ), hay đối với một quá trình sinh lý của những cơ quan khác nhau (như sự kéo dài của thân và rễ, sự phát triển chồi và rễ). Đối với sự phân hĩa cơ quan, auxin cĩ hiệu ứng thay đổi theo thời gian, vì hàm lượng auxin thay đổi theo sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). Tĩm lại, auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự đáp ứng của thực vật đối với các tín hiệu từ mơi trường như ánh sáng và trọng lực; sự kiểm sốt các mối tương quan trong ưu thế ngọn; sự acid hĩa vách tế bào, sự tăng trưởng kéo dài tế bào; sự phân chia tế bào; sự hình thành mơ sẹo; sự phân hĩa mơ dẫn và phát triển rễ… (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.2. Vai trị của cytokinin Cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở mơ phân sinh ngọn rễ và được vận chuyển trong xylem đến chồi. Hoạt động của cytokinin trong sự tăng trưởng tế bào: + Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện cĩ auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. + Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ). Cytokinin ngăn cản sự lão hĩa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000). Hoạt động của cytokinin trong sự tạo cơ quan: + Ở nồng độ cao, cytokinin giúp tạo các cụm chồi. Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên cũng cĩ những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi: Chồi được tạo ra trở nên nhỏ, khơng thể kéo dài đến một kích thước nhất định để cĩ thể được tách ra cho sự hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường (Edwin, 1996). + Ở nồng độ thấp, cytokinin kích thích sự phát triển chồi nách. Nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khĩ ra rễ. + Ở một số lồi thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi khơng xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang mơi trường giảm hoặc khơng cĩ cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn đề này cĩ thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ CĐHTTTV sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất (Edwin, 1996). Cytokinin kích thích sự tăng trưởng của chồi nách và giảm ưu thế ngọn. Do đĩ trong nuơi cấy, người ta thường bổ sung một hay vài loại cytokinin vào mơi trường để cảm ứng tăng trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy (Bùi Trang Việt, 2000). Ảnh hưởng của cytokinin trong sự nuơi cấy mơ và cơ quan tùy thuộc vào loại cytokinin được sử dụng, kiểu mơ cấy, loại thực vật được nuơi cấy, tình trạng mơ cịn non hay đã già. Trong nuơi cấy chồi, hầu hết các mẫu cấy từ các lồi thực vật khác nhau đều cần cĩ cytokinin. BA kích thích sự tăng sinh chồi nách ở cây Castanea trong thí nghiệm của Vieitez và cs (1985) trong khi đĩ kinetin thì khơng cĩ ảnh hưởng. Ở cây Corylus avellana, BA 5 mg/l cho tỷ lệ tăng sinh chồi cao nhất từ những mẫu cấy non, nhưng những mẫu cấy đã trưởng thành cần zeatin 10 mg/l (Staden và cs, 2008). 1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi 1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên Tỷ lệ tăng sinh chồi trong nuơi cấy chồi thường tùy thuộc vào nồng độ cytokinin áp dụng. Ở một số thực vật, sự kết hợp giữa cytokinin và auxin giúp hiệu quả tăng sinh chồi cao hơn. Khi cytokinin quá cao, nhiều chồi nhỏ hình thành nhưng khơng thể kéo dài được hoặc cĩ lá bị biến dạng (Staden và cs, 2008). Dưới ảnh hưởng của tỉ lệ cytokinin cao, chồi hình thành dễ bị hiện tượng thủy tinh thể. Mặt khác, chồi hình thành trên mơi trường cĩ nồng độ cytokinin cao thường rất khĩ tạo rễ (George, 1996). 1.3.3.2. Sự hình thành chồi bất định Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mơ phân sinh ngọn chồi từ nhu mơ. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay của chồi nách, các chồi bây giờ vào trạng thái tiềm sinh. Như ở cỏ ba lá, cytokinin riêng rẽ cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi tăng nhanh, nhưng sự thêm auxin vào mơi trường nuơi cấy sẽ làm cho chồi khĩ hình thành hoặc tạo những mơ sẹo khơng mong muốn (Bhojwani, 1981 trong Edwin, 1996). Ở Brassica alboglabra, số lượng chồi hình thành trên mơi trường cĩ kinetin sẽ giảm mạnh nếu bổ sung AIA, IBA hoặc NAA (Pua và cs, 1989 trong Edwin, 1996). Cytokinin cĩ hiệu quả trong việc tạo chồi trực tiếp hay gián tiếp. Tác dụng này của cytokinin cĩ khi hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin ở tỉ lệ thích hợp. Tỷ lệ cytokinin với auxin quyết định kiểu tái sinh cơ quan từ mơ sẹo chưa phân hĩa in vitro: tỷ lệ auxin/cytokinin cao giúp sự tạo rễ; tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi. Một tỷ lệ cân bằng giữa hai chất ĐHTTTV trên sẽ chỉ tạo nên khối mơ sẹo khơng phân hĩa (Mok và cs, 1994). Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng cĩ sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi); sự cân bằng giữa hai hormon này là một trong những yếu tố kiểm sốt sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). 1.3.3.3. Sự hình thành rễ Nồng độ cytokinin cao (0,5–10 mg/l) thường cản hay làm trì hỗn sự hình thành rễ, đồng thời cản sự tăng trưởng rễ, và làm giảm hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin. Vì vậy, cytokinin thường khơng được sử dụng trong kích thích tạo rễ của chồi. Đơi khi người ta cũng thấy cytokinin cảm ứng tạo rễ và kích thích tăng trưởng rễ hoặc kích thích sự hình thành rễ bất định khi mơi trường khơng cĩ auxin. Trong hầu hết các trường hợp này thì lượng cytokinin cần rất thấp. Ví dụ chồi của củ cải đường tạo rễ trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,5 mg/l kinetin. Hay ở cây Rosa hybrida thì cần thiết phải thêm BA 1 mg/l cùng với IBA để cảm ứng hình thành và phát triển rễ (Staden và cs, 2008). Khơng chỉ auxin và cytokinin mà vách tế bào, bộ xương vi ống (microtubule cytoskeleton) cũng liên quan tới sự phát sinh hình thái thực vật nĩi chung và hoạt động của mơ phân sinh ngọn chồi (Ferguson và Beveridge, 2009; Fleming, 2005; Hamant và cs, 2008). CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu - Hạt Đậu đỏ Vigna angularis (được đĩng gĩi tại cơng ty TNHH Xuân Hồng 44/12 Phan Xích Long Phường 16. Quận 11. Thành phố Hồ Chí Minh). - Cây in vitro 6 ngày tuổi được cấy từ hạt Đậu đỏ. 2.2.Phương pháp 2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn Gieo hạt đã nảy mầm (rễ mầm dài 1-2 mm) vào các chậu (đường kính: 20 cm, chiều cao: 30 cm), mỗi chậu gieo 7 hạt. Lặp lại 3 lần. Theo dõi sự tăng trưởng của cây Đậu về chiều dài cây, chiều dài lá, dạng lá, số lượng nhánh, thời gian tăng trưởng của cây, thời gian ra hoa kết quả, thời gian thu hoạch hạt. 2.2.2.Khử trùng hạt Hạt Đậu đỏ được rửa sạch dưới vịi nước 30 phút, rửa lại bằng xà phịng trong 5 phút, rửa sạch xà phịng và rửa lại với nước cất 4 lần. Sau đĩ hạt được chuyển vào Erlen. Lắc hạt với cồn 70P0 P trong vịng 1 phút và rửa sạch cồn bằng nước cất. Tiếp tục khử trùng bằng dung dịch HgCl R2R 0,1 % trong 5phút. Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vơ trùng (5 lần). Sau đĩ cấy hạt vào các ống nghiệm cĩ đường kính 22 mm, dài 20 cm, chứa 10 ml mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). 2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây in vitro 6 ngày tuổi trên các mơi trường MS bổ sung AIA riêng rẽ ở các nồng độ 0,01; 0,1; 1; 2; 5; và 10 mg/l để khảo sát sự tăng trưởng chồi. Mỗi mơi trường nuơi cấy gồm 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả được ghi nhận là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy). Sau 10 ngày nuơi cấy, các chỉ tiêu sau được ghi nhận: - Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn) - Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá) - Số lượng rễ / khúc cắt - Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt Điều kiện nuơi cấy: Nhiệt độ 025 2 C± , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm trung bình 70 %. Thí nghiệm này được dùng để xác định nồng độ auxin (cản sự tăng trưởng của chồi) được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ + Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên mơi trường AIA 2 mg/l và sau đĩ chuyển sang mơi trưịng MS theo thời gian Nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường AIA 2 mg/l, sau đĩ chuyển khúc cắt ngọn chồi qua mơi trường MS sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày nuơi cấy. Mỗi mốc thời gian được thực hiện trên 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả ghi nhận là giá trị trung bình từ 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy). Sau 7 ngày nuơi cấy, ghi nhận các chỉ tiêu như sau: - Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn) - Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá) - Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt - Số lượng rễ / khúc cắt Điều kiện nuơi cấy: Nhiệt độ 025 2 C± , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm trung bình 70 %. + Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên mơi trường MS và sau đĩ chuyển sang mơi trưịng AIA 2 mg/l theo thời gian Nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường MS và sau đĩ chuyển sang mơi trường AIA 2 mg/l, được xử lý theo các mốc thời gian sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Mỗi mốc thời gian được thực hiện trên 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả ghi nhận là giá trị trung bình từ 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy). Sau 7 ngày nuơi cấy ghi nhận các chỉ tiêu như sau: - Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn) - Chiều dài lá (từ vị trí cuống lá đến ngọn lá) - Chiều dài trung bình của rễ / khúc cắt - Số lượng rễ / khúc cắt Điều kiện nuơi cấy: Nhiệt độ 025 2 C± , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm trung bình 70 %. 2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây in vitro 6 ngày tuổi được nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung BA riêng rẽ hay AIA phối hợp với BA. Các xử lý được thực hiện theo thời gian để khảo sát sự tăng sinh và tăng trưởng chồi. Mỗi mơi trường nuơi cấy gồm 5 mẫu cấy với 3 lần lặp lại. Kết quả ghi nhận là giá trị trung bình từ 3 lần lặp lại (15 mẫu cấy). Sau 14 ngày nuơi cấy, ghi nhận các chỉ tiêu sau: - Chiều dài lá (chiều dài của lá tính từ cuống lá đến ngọn lá ) - Chiều dài khúc cắt (từ gốc khúc cắt đến vị trí cuống lá thứ 1) - Chiều dài chồi (từ vị trí cuống lá thứ 1 đến đỉnh ngọn chồi ) - Số chồi nách / khúc cắt - Số lượng rễ / khúc cắt - Chiều dài trung bình rễ / khúc cắt Điều kiện nuơi cấy: Nhiệt độ 025 2 C± , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm trung bình 70 %. 2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi Khúc cắt ngọn chồi với chiều dài 5 mm (đã cắt bỏ 2 lá thứ nhất) từ cây in vitro 6 ngày tuổi được nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung BA ở các nồng độ 0,1; 0,5; và 1 mg/l để khảo sát sự tăng sinh chồi. 2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi * Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 14 ngày. Số ngày xử lý AIA và BA Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 * Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 1 ngày và chuyển sang mơi trường MS trong 13 ngày tiếp theo. Số ngày xử lý AIA và BA MS Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 * Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 4 ngày và chuyển sang mơi trường MS trong 10 ngày tiếp theo. Số ngày xử lý AIA và BA MS Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 * Xử lý AIA 2 mg/l trong 1 ngày và chuyển sang mơi trường bổ sung BA 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 13 ngày tiếp theo. Số ngày xử lý AIA BA Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 * Xử lý AIA 2 mg/l trong 4 ngày và chuyển sang mơi trường bổ sung BA 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 10 ngày tiếp theo. Số ngày xử lý AIA BA Ngày 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tất cả các thí nghiệm trên được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 025 2 C± , quang kỳ 12 giờ, ánh sáng 2.500 ± 200 lux, độ ẩm trung bình 70 %. 2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển chồi và chồi nách được quan sát dưới kính hiển vi quang học thơng qua sự cắt và nhuộm hai màu đỏ carmine - xanh iod. 2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hơ hấp Cường độ quang hợp và cường độ hơ hấp của chồi ngọn từ khúc cắt ngọn chồi được đo bằng máy Leaflab 2/LD2 (Hansatech) ở nhiệt độ 27P0PC ± 0,5P0PC Cường độ quang hợp được đo dưới ánh sáng 2.500 ± 200 lux, được thể hiện bằng lượng khí OR2R thải ra (µmol OR2R/g TLT/phút) và là giá trị trung bình của 5 lần lặp lại. Cường độ hơ hấp được đo ở trong tối, được thể hiện bằng lượng khí OR2R thu vào (µmol OR2R/g TLT/phút) và là giá trị trung bình của 5 lần lặp lại. 2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hồ tăng trưởng thực vật Khúc cắt ngọn chồi 6 ngày tuổi in vitro trên ba mơi trường: MS (đối chứng); AIA 2 mg/l trong 1 ngày trước khi chuyển sang MS; AIA 2 mg/l trong 7 ngày nuơi cấy liên tiếp được dùng để đo hoạt tính CĐHTTTV nội sinh và được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao năng (HPLC) tại phịng thí nghiệm Phân tích trung tâm của trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh (Phụ lục bảng 1). 2.2.9.Xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS), phiên bản 11.5 dùng cho Windows. Sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức xác suất p = 0,05 (p: probability) của giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau. CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn Cây Đậu đỏ thường phân nhánh ở nách cuống lá thứ ba hoặc thứ tư trở lên ngọn (Ảnh 3.1). Thời gian tăng trưởng của cây khoảng 5- 6 tuần. Cây bắt đầu ra hoa từ tuần thứ 6. Hoa mọc thành từng chùm ở nách lá hoặc đầu cành. Chùm gồm 5-6 hoa, nhưng thường chỉ cĩ 2 hoa trong mỗi chùm thụ phấn và kết trái nên mỗi nhánh chỉ cĩ 2 trái (Ảnh 3.2). Hoa cĩ màu vàng nhạt, dài 2,5 ± 1 cm. Trái dài 12 ± 2 cm, chứa 12 ± 2 hạt. Hạt cĩ màu nâu đỏ (Ảnh 3.3). Từ khi trái được hình thành cho đến khi trái chín và thu hoạch khoảng 2-3 tuần. Như vậy, thời gian từ khi gieo hạt cho đến khi thu hoạch trái của cây Đậu đỏ là 70- 80 ngày. Rễ của cây Đậu đỏ đang tăng trưởng cĩ các nốt sần do vi sinh vật cộng sinh cố định đạm Rhizobium sp. (Ảnh 3.4). Ảnh 3.1. Nhánh và lá của cây Đậu đỏ trong giai đoạn ra hoa. Ảnh 3.2. Hoa và trái non của cây Đậu đỏ trong giai đoạn sinh sản. Ảnh 3.3. Trái chín và hạt của cây Đậu đỏ. Ảnh 3.4. Rễ của cây Đậu đỏ đang tăng trưởng (khoảng 4 tuần tuổi) với các nốt sần do vi sinh vật cộng sinh cố định đạm Rhizobium sp. 3.1.2. Nuơi cấy hạt để tạo cây in vitro trên mơi trường MS Sử dụng HgClR2R 0,1 % để khử trùng hạt Đậu đỏ với thời gian khử trùng lần lượt: 3, 5, 7 và 10 phút thì tỷ lệ hạt sống và khơng nhiễm tương ứng là 50 %, 98 %, 70 % và 30 %. Như vậy, dùng HgClR2R 0,1 % với thời gian khử trùng 5 phút thì tỷ lệ hạt sống và khơng nhiễm đạt cao nhất (98 %). 3.1.3. Sự phát triển chồi mầm 3.1.3.1. Trong giai đoạn hạt nảy mầm Sự hấp thu nước mạnh của hạt thể hiện ở sự gia tăng trọng lượng tươi của hạt từ giờ thứ 4 đến giờ thứ 16 (kéo dài khoảng 12 giờ). Sự hấp thu nước ở giai đoạn này giúp hạt trương phồng lên. Sau thời gian này, sự hấp thu nước của hạt chậm dần và tiến tới giai đoạn bão hịa nước của hạt. Rễ mầm lú ra khỏi vỏ hạt 1-2 mm, thân mầm kéo dài ra từ giờ thứ 20 đến giờ thứ 30 (Bảng 3.1, hình 3.1). Bảng 3.1. Sự gia tăng trọng lượng tươi của hạt trong giai đoạn nảy mầm. Thời gian (giờ) Trọng lượng tươi (mg) 0 123,00 ± 0,00 Pa 2 130,00 ± 0,03 Pa 10 224,00 ± 0,02 Pb 18 243,00 ± 0,02 Pc 24 247,00 ± 0,02 Pcd 32 251,00 ± 0,04 Pcd 40 256,00 ± 0,03 Pde 44 260,00 ± 0,04 Pe Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p = 0,05. Hình 3.1. Sự gia tăng trọng lượng tươi của hạt trong giai đoạn nảy mầm. 3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khơ theo thời gian từ giai đoạn hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi Trong quá trình tăng trưởng của cây mầm, trọng lượng tươi của cây mầm gia tăng theo thời gian từ ngày 0 (hạt chưa nảy mầm) đến ngày 5 (Bảng 3.2, hình 3.2), trong khi đĩ trọng lượng 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Thời gian (giờ) T rọ n g lư ợ n g h ạt ( m g) khơ giảm dần (Bảng 3.2, hình 3.3). Trong giai đoạn này, hạt thu thêm nước tương ứng với sự tăng trưởng đáng kể của rễ mầm và thân mầm. Bảng 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khơ của cây mầm. Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khơ (mg) 0 110,00 ± 1,15 Pa 99,00 ± 0,57 Pf 1 197,00 ± 1,73 Pb 89,66 ± 1,20 Pe 2 226,33 ± 2,03 Pc 85,00 ± 0,58 Pd 3 290,00 ± 1,73 Pd 80,33 ± 0,88 Pc 4 377,67 ± 1,76 Pe 75,33 ± 1,45 Pb 5 466,33 ± 1,76 Pf 67,00 ± 1,73 Pa Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p = 0,05. 3.1.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hồ tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi mầm Sau 6 ngày cấy hạt đã khử trùng vào ống nghiệm, các mơi trường MS cĩ bổ sung BA 1 mg/l; BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l; BA 1 mg/l và AIA 1 mg/l làm cây mầm tăng chậm so với mơi trường MS (đối chứng). Ở các mơi trường được bổ sung BA 1 mg/l hay BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l, hệ rễ khơng phát triển, rễ chính bị cùn và khơng cĩ rễ nhánh. Sự bổ sung BA và AIA 1 mg/l tạo khối mơ sẹo cĩ nhiều rễ nhỏ, ngắn và đường kính cổ rễ tăng (Bảng 3.3, ảnh 3.5). Với AIA 0,1 mg/l, cây mầm cĩ số lượng rễ cao nhất (Bảng 3.3). Hình 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi theo thời gian 110 197 290 377 467 226 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1 2 3 4 5 Thời gian (ngày) T rọ n g lư ợ n g tư ơ i ( m g) từ giai đoạn hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi. Hình 3.3. Sự thay đổi trọng lượng khơ theo thời gian từ giai đoạn hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi. Ảnh 3.5. Ảnh hưởng của các CĐHTTTV lên sự phát triển cây mầm in vitro 6 ngày tuổi trên các mơi trường khác nhau: a) Đối chứng (MS); b) BA 1 mg/l; c) BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l; d) BA 1 mg/l và AIA 1 mg/l; e) AIA 0,1 mg/l. 99 89 84 82 75 67 50 60 70 80 90 100 110 0 1 2 3 4 5 Thời gian (ngày) T rọ ng lư ợn g kh ơ (m g) a b c d e 3.1.4. Các biến đổi hình thái của mơ phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi Mơ phân sinh ngọn của phơi 1 ngày tuổi cĩ hai sơ khởi lá ngắn, khép lại, vịm đỉnh trịn bầu (Ảnh 3.6). Trên mơi trường MS, vịm mơ phân sinh ngọn chồi cĩ dạng trịn, và nằm ngay đỉnh ngọn chồi của cây in vitro 2 và 3 ngày tuổi. Cây mầm 2, 3 ngày tuổi cĩ sơ khởi lá kéo dài, mở rộng và xuất hiện sơ khởi lá thứ hai (Ảnh 3.7, 3.8). Mơ phân sinh của cây mầm 4 ngày tuổi cĩ vịm đỉnh trịn, nhơ cao (Ảnh 3.9). Mơ phân sinh ngọn chồi của cây Đậu đỏ gồm ba vùng: vùng trung tâm, vùng ngoại vi và vùng mơ phân sinh lõi như được thấy ở lát cắt dọc qua mơ phân sinh ngọn chồi của cây in vitro bốn ngày tuổi trên mơi trường MS (Ảnh 3.10). Ở cây đậu in vitro 7 ngày tuổi trên mơi trường MS cĩ sự phát triển chồi xảy ra tại các vị trí chồi nách (Ảnh 3.11, 3.12). Với sự cĩ mặt của chồi nách, chồi ngọn bị đẩy về một phía. . Ảnh 3.6. Lát cắt dọc qua mơ phân sinh ngọn chồi của cây mầm 1 ngày tuổi. Vịm mơ phân sinh cĩ dạng trịn bầu. Ảnh 3.7 Lát cắt dọc qua mơ phân sinh ngọn chồi của cây mầm 2 ngày tuổi với sự kéo dài sơ khởi lá thứ nhất và xuất hiện sơ khởi lá thứ hai. Ảnh 3.8 Lát cắt dọc qua mơ phân sinh ngọn chồi của cây 3 ngày tuổi: sơ khởi lá kéo dài, mở rộng, sơ khởi lá mới được hình thành, mơ phân sinh nằm ngay đỉnh chồi. Ảnh 3.9 Lát cắt dọc qua mơ phân sinh ngọn chồi của cây 4 ngày tuổi với các sơ khởi lá mở rộng, vịm của mơ phân sinh ngọn chồi nhơ cao. Ảnh 3.10. Cấu trúc của mơ phân sinh ngọn chồi của cây in vitro 4 ngày tuổi. Ảnh 3.11. Lát cắt dọc qua mơ phân sinh ngọn chồi của cây in vitro 7 ngày tuổi với sự xuất hiện của chồi bên. Ảnh 3.12. Lát cắt dọc của mơ phân sinh ngọn chồi và chồi bên của cây in vitro 7 ngày tuổi. 3.1.5. Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn 3.1.5.1. Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro 100 % cây Đậu in vitro 3 ngày tuổi trên mơi trường MS sau sự cắt bỏ trụ thượng diệp (cách hai tử diệp 3 mm) đều xuất hiện 2 chồi nách sau 4, 5 ngày nuơi cấy (Ảnh 3.13, 3.14). 3.1.5.2. Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn Các chồi nách ở nách lá thứ 1 cũng như các chồi nách ở hai tử diệp đều bị cản phát triển do bị chồi ngọn ức chế (hiện tượng ưu thế ngọn). Sau khi cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn chồi (nằm giữa hai cuống lá thứ nhất) của khúc cắt ngọn chồi từ cây in vitro 6 ngày tuổi (Ảnh 3.15) và cây Đậu được gieo trồng trong vườn 4 ngày tuổi (Ảnh 3.16), các mẫu đều xuất hiện hai chồi nách ở hai bên cuống lá sau 7 ngày nuơi cấy. Nếu khối mơ phân sinh ngọn chồi khơng bị cắt triệt để thì sẽ cĩ sự tái tạo khối mơ phân sinh mới. Đồng thời với hiện tượng ưu thế ngọn bị phá vỡ một phần, chồi nách cũng xuất hiện được, nhưng ưu thế vẫn là chồi ngọn (Ảnh 3.17). Ảnh 3.13. a) Cây in vitro 3 ngày tuổi đã bị cắt bỏ trụ thượng diệp. b) Cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.14. Sự phát triển của chồi nách từ hai tử diệp của cây in vitro 8 ngày tuổi. a b 10mm 10mm Ảnh 3.15. Sự phát triển chồi nách từ hai nách lá thứ nhất của khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường MS sau 7 ngày nuơi cấy. Ảnh 3.16. Sự phát triển chồi nách từ hai nách lá thứ nhất của cây trong vườn sau 10 ngày tính từ khi cắt bỏ mơ phân sinh ngọn. Ảnh 3.17. Sự tái sinh của mơ phân sinh ngọn và xuất hiện hai chồi nách nhỏ ở cây trong vườn. 3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách Chồi nách từ hai tử diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi (đã cắt bỏ trụ thượng diệp) và chồi nách từ hai cuống lá của cây trong vườn 3 ngày tuổi (đã cắt bỏ khối mơ phân sinh nằm giữa hai cuống lá) được theo dõi, giải phẫu và quan sát dưới kính hiển vi quang học theo thời gian (ngày). Cĩ sự thay đổi về mặt mơ học trong quá trình phát triển chồi nách, bắt đầu từ hoạt động phân chia mạnh của tầng phát sinh libe-mộc đẩy khối mơ phân sinh chồi nách ra ngồi nhu mơ vỏ đến sự kéo dài chồi nách sau sự cắt bỏ phần chồi ngọn (Ảnh 3.18 - 3.35). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hồ tăng trưởng thực vật lên sự phát triển cây mầm in vitro nuơi cấy từ hạt. Chất điều hịa tăng trưởng Chiều dài trụ thượng diệp (mm) Chiều dài trụ hạ diệp (mm) Đường kính trụ thượng diệp (mm) Đường kính trụ hạ diệp (mm) Số rễ/cây Chiều dài rễ/cây Đường kính rễ (mm) MS (đối chứng) 22,71 ± 3,17 P c 44,28 ± 0,94 Pb 1,46 ± 0,48 Pab 1,91 ± 0,26 Pa 8,00 ± 0,98 Pb 27,14 ± 1,81 Pd 2,29 ± 1,32 Pa BA 1 mg/l 11,28 ± 0,47 Pa 31,85 ± 1,50 Pa 1,49 ± 0,45 Pab 2,09 ± 0,59 Pa 1,00 ± 0,00 Pa 11,86 ± 0,67 Pc 2,91 ± 1,01 Pb BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l 17,14 ± 0,67 P b 29,14 ± 1,76P a 1,43 ± 0,47 Pa 2,00 ± 0,78 Pa 1,00 ± 0,00 Pa 8,14 ± 0,46 Pb 3,44 ± 0,57 Pc BA 1 mg/l và AIA 1 mg/l 17,42 ± 1,23 P b 29,28 ± 0,74 Pa 1,59 ± 0,63 Pb 2,00 ± 0,61 Pa 6,86 ± 0,51Pb 5,14 ± 0,26 Pa 3,29 ± 1,42 Pc AIA 0,1 mg/l 17,28± 0,74 Pb 43,00 ± 1,23 Pb 1,39 ± 0,40 Pa 1,96 ± 0,37 Pa 10,29 ± 0,68Pc 10,71 ± 0,27 Pbc 2,30 ± 1,69 Pa Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p = 0,05. Ảnh 3.18. Lát cắt ngang thân của cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.19. Lát cắt ngang thân qua vị trí tử diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.20. Lát cắt ngang qua tử diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi cho thấy các tế bào ở tầng phát sinh libe-mộc phân chia mạnh và kéo dài, đẩy khối mơ phân sinh chồi nách ra ngồi nhu mơ vỏ. Ảnh 3.21. Lát cắt ngang qua tử diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi cho thấy sự kéo dài của chồi nách. Ảnh 3.22. Chồi nách kéo dài với sơ khởi lá ở tử diệp sau 3 ngày cắt bỏ trụ thượng diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.23. Chồi nách kéo dài với sơ khởi lá ở tử diệp sau 4 ngày cắt bỏ trụ thượng diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.24. Lát cắt dọc của chồi nách ở vị trí tử diệp sau 4 ngày cắt bỏ trụ thượng diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.25. Lát cắt ngang qua chồi nách ở tử diệp sau 4 ngày cắt bỏ trụ thượng diệp của cây in vitro 3 ngày tuổi. Ảnh 3.26. Lát cắt ngang thân ở vị trí cuống lá thứ nhất của cây trong vườn 3 ngày tuổi. Ảnh 3.27. Lát cắt ngang thân qua cuống lá của cây trong vườn 3 ngày tuổi cho thấy sự phân hĩa thành bĩ mạch ở gốc cuống lá và khối sinh mơ nằm ngay bên ngồi tầng tiền phát sinh của thân. Ảnh 3.28. Lát cắt ngang thân qua cuống lá ở ngày 1 sau khi cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn của cây trong vườn 3 ngày tuổi. Ảnh 3.29. Lát cắt ngang thân qua cuống lá ở ngày 1 cho thấy sự phát triển của các tế bào mơ dẫn truyền, đẩy khối mơ phân sinh chồi ra ngồi. Ảnh 3.30. Lát cắt ngang thân qua cuống lá ở ngày 2 sau khi cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn của cây trong vườn 3 ngày tuổi. Ảnh 3.31. Lát cắt ngang thân qua cuống lá ở ngày 2 cho thấy các tế bào ở tầng phát sinh libe-mộc phân chia mạnh và kéo dài, đẩy khối mơ phân sinh chồi nách ra ngồi nhu mơ vỏ. Ảnh 3.32. Lát cắt ngang thân qua cuống lá ở ngày 3 sau khi cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn cho thấy chồi nách và các sơ khởi lá xuất hiện ở 2 bên cuống lá. Ảnh 3.33. Lát cắt dọc qua cuống lá ở ngày 3 sau khi cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn cho thấy chồi nách kéo dài với khối mơ phân sinh và 2 sơ khởi lá. Ảnh 3.34. Lát cắt dọc qua cuống lá ở ngày 4 sau khi cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn cho thấy chồi nách kéo dài. Ảnh 3.35. Lát cắt dọc của chồi nách ở cuống lá của cây trong vườn 7 ngày tuổi. 3.1.7. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu đỏ Sau 10 ngày nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi trên các mơi trường cĩ bổ sung AIA riêng rẽ ở các nồng độ 0,01; 0,1 và 1 mg/l, chiều dài khúc cắt như nhau và tương đương với đối chứng (mơi trường MS). Mơi trường AIA 0,1 mg/l cĩ chiều dài lá cao nhất (Bảng 3.4, hình 3.4). Trên mơi trường AIA ở các nồng độ cao hơn: 2; 5 và 10 mg/l thì chiều dài lá và chiều dài khúc cắt giảm dần theo nồng độ. Số lượng rễ trên một khúc cắt tăng dần theo nồng độ cịn chiều dài trung bình rễ thì giảm dần theo nồng độ (Bảng 3.4 , hình 3.5). Như vậy, AIA ở nồng độ 2 mg/l đã bắt đầu cản sự tăng trưởng của mẫu cấy. Và nồng độ AIA 2 mg/l được sử dụng để nghiên cứu sự tăng sinh và tăng trưởng của mẫu cấy ở các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.4. Sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi 10 ngày tuổi khi nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung AIA riêng rẽ ở các nồng độ khác nhau (đối chứng là mơi trường MS). Nồng độ AIA(mg/l) Chiều dài khúc cắt (mm) Chiều dài lá (mm) Số lượng rễ / khúc cắt Chiều dài trung bình rễ / khúc cắt (mm) 0 20,57 ± 1,02 P c 35,42 ± 0,94 Pc 2,71 ± 0,18 Pa 21,42 ± 1,02 Pde 0,01 23,00 ± 1,39 P c 36,14 ± 1,69 Pcd 4,14 ± 0,26 Pb 24,00 ± 1,62 Pef 0,1 22,85 ± 1,10P c 40,28 ± 2,59 Pd 5,29 ± 0,29 Pb 25,86 ± 0,96 Pf 1 20,57 ± 0,65 P c 37,00 ± 1,63 Pcd 6,71 ± 0,42 Pc 19,86 ± 1,10 Pd 2 16,14 ± 1,47 P b 25,71 ± 1,14 Pb 8,57 ± 0,39 Pd 13,43 ± 0,75 Pc 5 12,71 ± 0,61 P a 20,42 ± 1,06 Pa 11,57 ± 0,63 Pe 10,14 ± 0,51 Pb 10 11,00 ± 0,38 P a 17,85 ± 0,93 Pa 11,85 ± 0,49 Pe 5,28 ± 0,60 Pa Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức p = 0,05. Hình 3.4. Sự tăng trưởng chồi trên mơi trường AIA ở các nồng độ khác nha._. Đây là mơi trường tăng trưởng chồi tốt nhất, chiều dài lá tăng, lá lớn. Chồi cần nhiều chất hữu cơ được tạo ra từ quá trình quang hợp nên cường độ quang hợp tăng. Trong điều kiện tăng trưởng bình thường, quang hợp luơn cao hơn hơ hấp (Bùi Trang Việt, 2009). Do đĩ, các chồi in vitro ở mơi trường như MS hay AIA 2 mg/l 1 ngày sau đĩ chuyển sang MS cĩ cường độ quang hợp cao hơn cường độ hơ hấp (Hình 3.10). - Sự thay đổi hoạt tính của các chất điều hồ tăng trưởng thực vật Hoạt tính auxin của khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường cĩ bổ sung AIA 2 mg/l và được xử lý trong 7 ngày liên tiếp là thấp nhất (0,16 µ g/g TLT) so với hai mơi trường: MS và AIA 2 mg/l chỉ được xử lý trong 1 ngày (ngày 0-1). Ở mơi trường với AIA 2 mg/l trong 7 ngày liên tiếp, mẫu cấy cĩ số lượng rễ cao nhất. Do đĩ hoạt tính AIA sẽ cao ở giai đoạn hình thành sơ khởi rễ, nhưng ở thời điểm sau 7 ngày nuơi cấy, các rễ đã hình thành cần hoạt tính auxin thấp để kéo dài các sơ khởi rễ. Cịn ở hai mơi trường: MS và AIA 2 mg/l được xử lý trong 1 ngày, hoạt tính auxin cao hơn (lần lượt là 0,27 µ g/g TLT và 0,24 µ g/g TLT), hoạt tính auxin cao, nhưng khơng phải để kích thích tạo sơ khởi rễ mà để giúp sự phân chia, kéo dài tế bào ở vùng kéo dài dưới mơ phân sinh ngọn. Do đĩ, chồi tăng trưởng tốt, chiều dài lá tăng. Chồi, lá non là nơi sản sinh ra nhiều auxin. Chồi phát triển tốt sẽ kích thích tổng hợp auxin nội sinh cao. Điều này cũng đúng với nhận định là sự kéo dài tế bào rễ cần những nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân (Bùi Trang Việt, 2000). - Ảnh hưởng của auxin theo nồng độ và theo thời gian lên sự tăng trưởng chồi Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự hình thành và phát triển của phát thể lá ở mơ phân sinh đỉnh. Auxin di chuyển hữu cực để giúp sự phát triển lá, và sự vận chuyển auxin qua các mơ mạch non do protein PIN I đảm nhiệm (Alconi và cs, 2003; Benkova và cs, 2003; Reinhardt và cs, 2000; Reinhardt và cs, 2003). Việc xử lý auxin chỉ cĩ tác dụng kích thích tăng trưởng khi nồng độ của nĩ bằng nồng độ tối hảo thường gặp trong bản thân cơ thể thực vật, ở nồng độ cao trái lại sẽ ức chế tăng trưởng và cĩ thể trở thành độc tố (Thimann, 1937). Auxin kích thích sự kéo dài của các tế bào dẫn xuất từ mơ phân sinh ngọn (vùng dưới ngọn, vùng kéo dài) (Bùi Trang Việt, 2000). Do đĩ, khi nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi từ cây in vitro 6 ngày tuổi trên mơi trường MS bổ sung AIA riêng rẽ ở nồng độ thấp (0,01 mg/l; 0,1 mg/l; 1 mg/l) thì chiều dài lá, chiều dài khúc cắt gia tăng. Hiệu ứng auxin giảm sau một nồng độ tối hảo, và trở nên độc ở các nồng độ quá cao (Bùi Trang Việt, 2000). Cho nên ở mơi trường AIA 2 mg/l đã làm giảm sự tăng trưởng của mẫu cấy so với ở các mơi trường trên (Bảng 3.4). Auxin ít được sử dụng trong nhân chồi, chủ yếu được sử dụng trong kích thích tạo sơ khởi rễ hoặc tạo mơ sẹo. Ở đây cĩ lẽ AIA đã khơng giúp phá bỏ được ưu thế ngọn, nên các chồi nách khơng thể phát triển được trên các mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung AIA riêng rẽ. Tất cả các mẫu cấy trên các mơi trường bổ sung AIA riêng rẽ (0,01 mg/l; 0,1 mg/l; 1 mg/l; 2 mg/l; 5 mg/l; 10 mg/l) đều khơng cho chồi nách xuất hiện. Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ, nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000). Điều này cũng đúng với vai trị của auxin trong sự hình thành và phát triển của phát thể lá. Ở nồng độ cao (2 mg/l), AIA cản trở sự kéo dài các phát thể lá, làm cho chiều dài lá và chiều dài khúc cắt giảm, nhưng khi chuyển sang mơi trường cĩ nồng độ auxin thấp hơn hoặc khơng cĩ auxin thì mẫu cấy sẽ kéo dài phát thể lá thành lá. Do đĩ mẫu cấy khi được xử lý AIA 2 mg/l trong 1 ngày (ngày 0-1) sau đĩ chuyển sang mơi trường MS (ngày 1-7), hay mẫu cấy trên mơi trường MS 5 hay 6 ngày (ngày 0-5 hay 0-6) sau đĩ mới chuyển sang AIA 2 mg/l trong 2 hay 1 ngày (ngày 5-7 hay 6-7) thì chiều dài lá gia tăng. Như vậy, AIA 2 mg/l cĩ vai trị trong sự tăng trưởng của phát thể lá thành lá khi được xử lý trong một thời gian ngắn nhưng cản sự kéo dài của lá nếu duy trì nồng độ này trong thời gian dài (Bảng 3.5, 3.6). - Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự tăng sinh chồi từ khúc cắt ngọn chồi Chồi nách thường bị cản phát triển do sự ức chế của chồi ngọn. Trong nuơi cấy in vitro các chồi nách cĩ thể được kích thích phát triển mạnh bởi việc bổ sung cytokinin vào mơi trường (Bùi Trang Việt, 2000). Trong thí nghiệm tăng sinh chồi, ở mơi trường khơng cĩ bổ sung BA (mơi trường MS cơ bản), khơng cĩ sự tăng sinh chồi mới do các chồi nách này bị chồi ngọn ức chế. Ở các mơi trường BA 0,5 mg/l và 1 mg/l, sự tăng sinh chồi nách từ khúc cắt ngọn chồi của cây in vitro 6 ngày tuổi tăng (2,00 ± 0,19 và 2,26 ± 0,18),P Pnhưng ở mơi trường BA 0,1 mg/l thì chồi nách khơng xuất hiện (Bảng 3.9). Điều này chứng tỏ BA ở nồng độ thấp khơng thể kích thích sự bộc phát của chồi nách, và sự tăng trưởng của chồi nách bị auxin nội sinh ức chế. Như vậy, BA cĩ vai trị quan trọng trong việc làm giảm ưu thế ngọn, giúp cho chồi nách phát triển. Ở cây Đậu đỏ, nồng độ BA 1 mg/l là thích hợp cho sự phát sinh chồi nách. Ngồi ra, cytokinin cản sự kéo dài của thân và rễ nhưng kích thích tăng rộng tế bào, ngăn cản sự lão hĩa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi (Taiz và Zeiger, 2002). Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện cĩ auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào (Bùi Trang Việt, 2000). Do đĩ các mẫu cấy trên mơi trường MS bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (0,1 mg/l; 0,5 mg/l và 1 mg/l) đều hình thành khối mơ sẹo ở gốc khúc cắt ngọn chồi. Các khối mơ sẹo này là do BA ngoại sinh cùng với auxin nội sinh được chuyển từ trên ngọn xuống đã kích thích sự phân chia tế bào ở vị trí gốc cắt. Trên các khối mơ sẹo này khơng thấy xuất hiện chồi bất định hoặc rễ. Ở một số lồi thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi khơng xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang mơi trường giảm hoặc khơng cĩ cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Do đĩ các mẫu cấy trên các mơi trường bổ sung BA cĩ chiều dài khúc cắt và chiều dài lá giảm, lá nhỏ, xoăn, ngắn và xanh đậm. Những vấn đề này cĩ thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ CĐHTTTV sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất (Edwin,1996). Do đĩ khi chuyển các cụm chồi 20 ngày tuổi được nuơi cấy trên mơi trường BA 1 mg/l sang mơi trường MS cơ bản thì cĩ sự gia tăng chiều dài của các cụm chồi. Nếu vẫn tiếp tục nuơi cấy trên mơi trường cũ (BA 1 mg/l) thì sự tăng trưởng chồi chậm (Ảnh 3.47). - Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo nồng độ và theo thời gian lên sự tăng sinh và tăng trưởng chồi của khúc cắt ngọn chồi Các chất điều hồ tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin cĩ vai trị quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Sự phối hợp của các CĐHTTTV này được khảo sát theo nồng độ và theo thời gian phối hợp và đã dẫn đến các kết quả khác nhau. * Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA trong 14 ngày Cytokinin cĩ hiệu quả trong việc tạo chồi trực tiếp hay gián tiếp. Tác dụng này của cytokinin hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin ở tỉ lệ thích hợp. Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng cĩ sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi); sự cân bằng giữa hai hormon này là một trong những yếu tố kiểm sốt sự phát triển (Bùi Trang Việt, 2000). Khi bổ sung AIA 2 mg/l vào mơi trường BA 0,5 mg/l thì khơng cĩ xuất hiện chồi nách. Ngược lại, BA 0,5 mg/l (khơng bổ sung AIA 2 mg/l) giúp chồì nách xuất hiện (2,00 ± 0,19). Auxin cĩ thể ức chế sự tích luỹ cytokinin (Gaspar và cs, 1996; Bùi Trang Việt, 2000). Như vậy, sự cĩ mặt của auxin đã ảnh hưởng đến sự tích lũy cytokinin trong mơi trường nuơi cấy, và do hoạt tính của BA yếu hơn, nên số lượng chồi cũng giảm theo hoặc khơng xuất hiện chồi. Mặt khác, khi được xử lý trực tiếp lên chồi nách, auxin cũng khơng kìm hãm được sự tăng trưởng của chồi nách (Brown và cs, 1979). Auxin khơng trực tiếp cản sự tăng trưởng của chồi mà phải di chuyển xuống thân và kìm hãm sự phát triển của chồi nách theo một cơ chế gián tiếp mà chắc chắn cĩ liên quan đến những tín hiệu điều hịa khác như là cytokinin, nhiệt độ, ánh sáng, tình trạng sinh lý của cây,… (Leyser, 2003). Tuy nhiên, chỉ cĩ mơi trường AIA 2 mg/l kết hợp BA 1 mg/l giúp chồi nách xuất hiện (1,80 ± 0,25) do tỷ lệ cytokinin/ auxin nghiêng về cytokinin, nhưng số lượng chồi nách giảm so với mơi trường tăng sinh chồi chỉ bổ sung BA ở cùng nồng độ (2,26 ± 0,18) (hình 3.35). Nồng độ cytokinin cao (0,5-10 mg/l) thường cản hay làm trì hỗn sự hình thành rễ, đồng thời cản sự tăng trưởng rễ, và làm giảm hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin (Staden và cs, 2008). BA kích thích sự phân chia tế bào. Do đĩ trên mơi trường chỉ cĩ BA đã xuất hiện khối mơ sẹo ở gốc khúc cắt ngọn chồi mà khơng thấy xuất hiện rễ (Bảng 3.9). Khi BA phối hợp với AIA 2 mg/l, BA đã cản trở vai trị của AIA trong việc tạo rễ khi xử lý trong 14 ngày nuơi cấy liên tiếp. Chỉ trong mơi trường AIA 2 mg/l và BA 0,1 mg/l, rễ hình thành với số lượng ít, trong khi mơi trường BA riêng rẽ ở cùng nồng độ (0,1 mg/l), rễ khơng hình thành mà khối mơ sẹo xuất hiện ở gốc khúc cắt ngọn chồi (hình 3.36). Hình 3.35. Số lượng chồi trung bình /khúc cắt ngọn chồi sau 14 ngày nuơi cấy trên mơi trường AIA 2 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau và xử lý theo thời gian (so với mơi trường đối chứng 1 là MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng 2 là MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA). Hình 3.36. Số lượng rễ trung bình và chiều dài rễ trung bình/ khúc cắt ngọn chồi sau 14 ngày nuơi cấy trên mơi trường AIA 2 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau và xử lý theo thời gian (so với mơi trường đối chứng 1 là MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng 2 là MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA). Như vậy, AIA đã khơng giúp phá bỏ được ưu thế ngọn do ảnh hưởng đến sự tích lũy BA, nên các chồi nách khơng thể phát triển, cịn BA cản AIA trong sự hình thành và phát triển rễ. 0 0 0 0 2 0 0,2 0 2,3 1,8 0,4 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 BA AIA+BA(14ngày) AIA+BA(1ngày chuyển) AIA+BA(4ngày chuyển) Mơi trường nuơi cấy Số lư ợn g ch ồi BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) Số lượng rễ Chiều dài rễ 0 2,3 3 2,5 0 0 2,7 1,8 0 0 2,5 1,5 0 9,5 19,3 0 37,7 28,3 26,8 27,2 36,5 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 BA AIA+BA(14ngày) AIA+BA(1ngày chuyển) AIA+BA(4ngày chuyển) Mơi trường số lư ợn g rễ /c hi ều d ài r ễ (m m ) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) * Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA trong 1 ngày và chuyển sang mơi trường MS trong 13 ngày tiếp theo Khi nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường MS cĩ AIA 2 mg/l phối hợp với BA ở các nồng độ khác nhau chỉ trong một ngày và sau đĩ chuyển sau mơi trường MS cơ bản trong 13 ngày, thì chiều dài lá tăng, số lượng rễ cũng tăng, cịn số lượng chồi rất ít so với mơi trường MS phối hợp với BA ở cùng nồng độ trong 14 ngày liên tiếp (hình 3.35). Điều này cĩ thể là do trong khoảng thời gian ngắn (1 ngày) chỉ đủ để AIA 2 mg/l cảm ứng và phát triển phát thể lá thành lá. Trong thời gian ngắn, lượng AIA và BA tích lũy trong mẫu cấy khơng nhiều, nên chúng hỗ trợ nhau trong sự tăng trưởng mẫu cấy. Điều này đúng với nhận định là auxin kiểm sốt sự phân chia, kéo dài và phân hĩa tế bào, cịn cytokinin điều hịa quá trình sinh tổng hợp protein liên quan tới sự phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000). Khi xử lý AIA 2 mg/l và BA trong 1 ngày đã tạo sự cân bằng các chất điều hịa tăng trưởng thực vật nội sinh trong khúc cắt ngọn chồi, làm cho sự phân chia tế bào nhanh và thu hút dinh dưỡng nhiều giúp rễ dài ra. Từ đĩ chiều dài lá cũng kéo dài so với mẫu cấy trên mơi trường MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA được xử lý trong 14 ngày (hình 3.37). Hình 3.37. Chiều dài lá trung bình của khúc cắt ngọn chồi sau 14 ngày nuơi cấy trên mơi trường AIA 2 mg/l kết hợp BA ở các nồng độ khác nhau và xử lý theo thời gian (so với mơi trường đối chứng 1 là MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng 2 là MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA). * Xử lý AIA 2 mg/l kết hợp BA trong 4 ngày và chuyển sang mơi trường MS trong 10 ngày tiếp theo Nếu tiếp tục nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường MS cĩ AIA 2 mg/l phối hợp với BA ở các nồng độ khác nhau trong 4 ngày và sau đĩ chuyển sang mơi trường MS cơ bản trong 10 ngày tiếp theo, thì chiều dài lá giảm, số lượng rễ giảm và khơng cĩ chồi nách nào xuất hiện so với cùng thí nghiệm nhưng xử lý trong 1 ngày (Hình 3.35, 3.36, 3.37). Điều này cĩ thể là do trong thời 8,1 22,4 35,7 26,4 6,1 19,3 29,3 19,9 5,7 8,7 26,5 18,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 BA AIA+BA(14ngày) AIA+BA(1ngày chuyển) AIA+BA(4ngày chuyển) Mơi trường nuơi cấy C hi ều d ài lá t hứ n hấ t (m m ) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) gian 4 ngày, AIA 2 mg/l đủ thời gian và liều lượng để ức chế sự tăng trưởng chồi của khúc cắt ngọn chồi nên chiều dài lá giảm và cản sự tích lũy BA nên khơng hình thành chồi nách nào (Bảng 3.12). Đồng thời BA cũng phần nào cản sự hình thành rễ và kéo dài rễ do AIA đảm nhiệm. Chiều dài lá, số lượng rễ, chiều dài rễ tăng khi xử lý AIA 2 mg/l và BA kéo dài 4 ngày so với mẫu cấy được xử lý AIA 2 mg/l và BA ở cùng nồng độ kéo dài 14 ngày, nhưng giảm so với mẫu cấy được xử lý trên cùng mơi trường chỉ trong 1 ngày và sau đĩ chuyển sang MS (Hình 3.36, 3.37). Kết quả này cho thấy thời gian xử lý càng lâu (4 ngày, 14 ngày), liều lượng các CĐHTTTV được tích lũy càng nhiều và do đĩ hiệu ứng cản tác động của các CĐHTTTV với nhau tăng. * Xử lý AIA 2 mg/l trong 1 ngày và chuyển sang mơi trường cĩ BA trong 13 ngày tiếp theo Khi nuơi cấy khúc cắt ngọn chồi trên mơi trường AIA 2 mg/l trong 1 ngày, sau đĩ chuyển sang mơi trường BA ở các nồng độ khác nhau (0,1 mg/l; 0,5 mg/l và 1 mg/l) trong 13 ngày tiếp theo thì ưu thế nghiêng về tác động của BA. BA phá vỡ ưu thế ngọn và cùng với auxin kích thích chồi nách phát triển, nên số lượng chồi sinh ra cao hơn so với mẫu cấy trên mơi trường tăng sinh chồi chỉ cĩ bổ sung BA ở cùng nồng độ trong 14 ngày tuổi (Hình 3.38). Hình 3.38. Số lượng chồi/ khúc cắt ngọn chồi 14 ngày tuổi trên mơi trường AIA 2 mg/l, sau đĩ chuyển sang mơi trường cĩ BA ở các nồng độ khác nhau và xử lý theo thời gian (so với mơi trường đối chứng 1 là MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng 2 là MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA). BA cũng cản sự tăng trưởng của lá. Do cĩ xử lý AIA 2 mg/l trong thời gian 1 ngày - là ngưỡng thích hợp cho sự tăng trưởng chồi (Bảng 3.5) - trước khi chuyển sang mơi trường MS bổ sung BA, nên chiều dài lá tăng so với mẫu cấy trên mơi trường MS chỉ bổ sung BA ở cùng nồng độ trong 14 ngày (Hình 3.39). 0 0 0 0 2 0 2,4 0 2,3 1,8 2,7 1,6 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 BA AIA+BA(14ngày) AIA 1ngày chuyển sang BA AIA 4ngày chuyển sang BA Mơi trường nuơi cấy Số lư ợn g ch ồi BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) Hình 3.39. Chiều dài lá trung bình/ khúc cắt sau 14 ngày nuơi cấy trên mơi trường AIA 2 mg/l, sau đĩ chuyển sang mơi trường BA ở các nồng độ khác nhau và xử lý theo thời gian khác nhau (so với mơi trường đối chứng 1 là MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng 2 là MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA). Trong khoảng thời gian 1 ngày, AIA ở nồng độ 2 mg/l khơng tích lũy đủ liều lượng để kích thích hình thành và phát triển bộ rễ. Cho nên, số lượng rễ trên một khúc cắt ngọn chồi trong thí nghiệm này tương đương với kết quả trên mơi trường MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l trong 14 ngày (Hình 3.40). Ở thí nghiệm này, số lượng chồi là nhiều nhất so với các thí nghiệm cịn lại và tương đương với mơi trường tăng sinh chồi chỉ bổ sung BA (Hình 3.38). Như vậy, việc xử lý lần lượt các CĐHTTTV theo thời gian (AIA 2 mg/l trong 1 ngày và BA trong 13 ngày tiếp theo) sẽ mang lại hiệu quả hơn so với xử lý kết hợp đồng thời các CĐHTTTV trong 14 ngày. Sự phát sinh hình thái ở đây nghiêng về sự phát triển chồi (chiều dài lá tăng, số chồi tăng), cịn rễ khơng phát triển (Hình 3.40). 8,1 22,4 21,5 25,5 6,1 19,3 11,6 18,1 5,7 8,7 6,9 17,1 0 5 10 15 20 25 30 BA AIA+BA(14ngày) AIA 1ngày chuyển sang BA AIA 4ngày chuyển sang BA Mơi trường nuơi cấy C hi ều d ài lá t hứ n hấ t (m m ) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) Hình 3.40. Số lượng và chiều dài trung bình rễ/ khúc cắt sau 14 ngày nuơi cấy trên mơi trường AIA 2 mg/l, sau đĩ chuyển sang mơi trường BA ở các nồng độ khác nhau và xử lý theo thời gian khác nhau (so với mơi trường đối chứng 1 là MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng 2 là MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA). * Xử lý AIA 2 mg/l trong 4 ngày và chuyển sang mơi trường BA trong 10 ngày tiếp theo Nếu tiếp tục nuơi cấy khúc cắt trên mơi trường AIA 2 mg/l trong 4 ngày, sau đĩ chuyển sang mơi trường BA ở các nồng độ khác nhau (0,1 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l) trong 10 ngày tiếp theo thì AIA 2 mg/l đủ thời gian để cảm ứng hình thành và phát triển bộ rễ và BA 0,5 mg/l và 1 mg/l cĩ đủ thời gian tích lũy đủ liều lượng để kích thích sự hình thành chồi nách. Tuy nhiên sự tích lũy BA của khúc cắt ngọn chồi bị cản bởi AIA nên sự hình thành chồi chỉ cĩ trên mơi trường BA 1 mg/l (do tỷ lệ cytokinin/ auxin nghiêng về cytokinin). Số lượng chồi sinh ra trong nghiệm thức này tương đương với kết quả của mẫu cấy nuơi ở mơi trường MS bổ sung AIA 2 mg/l và BA ở cùng nồng độ trong 14 ngày tuổi (Hình 3.38). Bên cạnh đĩ, số lượng rễ nhiều và rễ phát triển mạnh, kéo theo chiều dài lá tăng. Như vậy, việc xử lý lần lượt các CĐHTTTV theo thời gian (AIA 2 mg/l trong 4 ngày và BA trong 10 ngày tiếp theo) sẽ mang lại hiệu quả hơn so với xử lý kết hợp đồng thời các CĐHTTTV trong 14 ngày. Sự phát sinh hình thái ở đây nghiêng về sự phát triển rễ, cịn sự tăng sinh chồi giảm (Hình 3.38, 3.40). - Sự phát triển chồi nách và ưu thế ngọn Số lượng rễ Chiều dài rễ 0 2,3 2 6,8 0 0 0 6,5 0 0 0 4,9 0 9,5 13,9 22,1 0 0 18,3 12,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 BA AIA+BA(14ngày) AIA 1ngày chuyển sang BA AIA 4ngày chuyển sang BA Mơi trường Số lư ợn g rễ / C hi ều d ài r ễ BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) Trong tự nhiên, ngọn chồi của thực vật lúc nào cũng ít nhiều vượt cao hơn các nhánh dưới bởi một hiện tượng gọi là ưu thế ngọn (Cline, 1997). Nếu cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn chồi của khúc cắt ngọn chồi từ cây in vitro 6 ngày tuổi hoặc cắt bỏ trụ thượng diệp của cây Đậu đỏ in vitro 4 ngày tuổi thì cây mất ưu thế ngọn, các chồi nách ở hai cuống lá thứ nhất của khúc cắt ngọn chồi và ở hai tử diệp sẽ xuất hiện và kéo dài. Ưu thế ngọn được kiểm sốt bởi các chất điều hịa tăng trưởng thực vật, mà auxin và cytokinin đĩng vai trị rất quan trọng (Sachs và Thimann, 1967; Shimizu và Mori, 2001). Cytokinin được tổng hợp từ rễ và chuyển lên chồi theo hướng ngọn để kích thích sự bộc phát của chồi, thúc đẩy sự tăng trưởng này (Cline và Harrington, 2007), nhưng bị auxin kiềm hãm nếu cây cịn ưu thế ngọn. Auxin di chuyển từ đỉnh xuống gốc ức chế sự tăng trưởng của chồi nách (Ongaro và Leyser, 2007). Do đĩ, cắt bỏ khối mơ phân sinh ngọn chồi của khúc cắt ngọn chồi từ cây in vitro 6 ngày tuổi hoặc cắt bỏ trụ thượng diệp của cây Đậu đỏ in vitro 4 ngày tuổi là loại bỏ vai trị ức chế sự tăng trưởng chồi nách của auxin. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Sử dụng dung dịch HgCl R2 R0,1% trong 5 phút là tốt nhất cho việc khử trùng hạt Đậu đỏ. - Chồi nách chứa khối sinh mơ cĩ tổ chức của một mơ phân sinh ngọn chồi, cĩ nguồn gốc ngoại sinh. Trong sự phát triển chồi nách (sau khi ưu thế ngọn đã được tháo gỡ) ở cây Đậu đỏ, nhu mơ vỏ và các tế bào ở tầng phát sinh libe-mộc phân chia mạnh mẽ để đẩy khối sinh mơ dần ra phía vỏ và đồng thời tạo hệ thống mạch dẫn, kế đĩ là sự nối mạch giữa chồi mới hình thành với mạch chính của thân. - AIA kích thích sự kéo dài thân và rễ của khúc cắt ngọn chồi của cây Đậu đỏ ở nồng độ thấp (0,01 mg/l, 0,1 mg/l, 1 mg/l). AIA ở các nồng độ từ 2 mg/l trở lên cản sự tăng trưởng của khúc cắt. Nhưng nếu xử lý AIA 2 mg/l trong thời gian ngắn (1 ngày) thì sẽ kích thích sự tăng trưởng của phát thể lá thành lá, kéo dài khúc cắt và kéo dài lá. - BA 0,5 mg/l và 1 mg/l thích hợp để kích thích và bộc phát chồi nách, phá bỏ ưu tính ngọn. - AIA 2 mg/l phối hợp đồng thời với BA ở những khoảng thời gian khác nhau (1 ngày, 4 ngày, và 14 ngày) sẽ cho kết quả khác nhau: • Nếu xử lý trong 1 ngày thì chúng hỗ trợ nhau trong sự phát sinh hình thái ngọn chồi của cây Đậu đỏ. • Nếu xử lý trong 14 ngày thì chúng tăng hiệu ứng cản tác động của nhau. AIA 2 mg/l cản sự tích lũy BA, khơng phá bỏ ưu tính ngọn do BA. BA cản sự tạo rễ do AIA đảm nhiệm. • Nếu xử lý trong 4 ngày thì chúng cho kết quả trung gian giữa xử lý 1 ngày và xử lý 14 ngày. - AIA 2 mg/l phối hợp với BA theo thời gian cho kết quả khác nhau: • Nếu xử lý AIA 2 mg/l trong 1 ngày sau đĩ chuyển sang BA trong 13 ngày tiếp theo thì sự phát sinh hình thái nghiêng về sự phát triển chồi (chiều dài lá tăng, số chồi tăng), cịn rễ khơng phát triển. • Nếu xử lý AIA 2 mg/l trong 4 ngày sau đĩ chuyển sang BA trong 10 ngày tiếp theo thì sự phát sinh hình thái nghiêng về sự phát triển rễ, cịn sự tăng sinh chồi giảm. 4.2. Đề nghị Trong thời gian tới, nếu cĩ điều kiện, chúng tơi sẽ tiếp tục nghiên cứu: - Ảnh hưởng của các chất điều hịa tăng trưởng thực vật lên sự tái sinh chồi từ khối mơ sẹo ở gốc khúc cắt ngọn chồi. - Khoảng thời gian thích hợp xử lý auxin và cytokinin để vừa kích thích phát triển rễ, vừa tăng sinh chồi tốt nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Phạm Hồng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển 1, NXB Trẻ 2. Trần Thanh Hương (2011), Phân tích các biến đổi hình thái học và sinh lý học trong các quá trình phát sinh cơ quan và phơi thể hệ ở một số giống chuối (Musa sp.), Luận văn tiến sĩ khoa học ngành sinh học, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 3. Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục 4. Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), Thực vật cấp cao, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 5. Lê Thị Trung (2003), Tìm hiểu và áp dụng các chất điều hịa sinh trưởng thực vật để kiểm sốt hiện tượng rụng trái non Xồi (Magifera indica L.), Luận án Tiến sĩ khoa học ngành Sinh học, Đại học quốc gia TPHCM 6. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương. Phần II- Phát triển, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 7. Bùi Trang Việt, (2009), Nuơi cấy mơ và sinh phơi thể hệ ở thực vật bậc cao, Giáo trình cao học Sinh lý thực vật * Tài liệu tiếng nước ngồi 8. Alconi R., Schwalm K., Langhans M. and Ullrich C.I. (2003), Gradual shifts in site of free – auxin production during leaf – primordium development and their role in vascular differentiation and leaf morphogenesis in Arabidopsis, Planta, 216, 841- 853 9. Benkova E., Michniewicz M., Sauer M., Teichmann T., Seifertova D., Jurgens G. and Friml J. (2003), Local efflux – dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation, Cell, 115, 591- 602 10. Braybrook S.A. and Kuhlemeier C. (2010), How a Plant Builds Leaves, 3TPlant Cell, 3T22: 1006- 1018. 11. Brown B.T., Foster C., Phillips J.N. and Rattigann B.M. (1979), The indirect role of 2,4-D in the maintenance of apical dominance in decapitated sunflower seedlings (Helianthus annuus L.), Planta, 146:475–480 12. Calderon-Villalobos L.I., Tan X., Zheng N. and Estelle M. (2010), Auxin Perception- Structural Insights,1T Cold Spring Harbor Laboratory Pressed1T. 13. Cline M.G. and Harrington C.A. (2008), Apical dominance and apical control in multiple flushing of temperate woody species, Can. J. For. Res. 37:74-83 14. Cline M.G. (1997), Concepts and terminology of apical dominance, American Journal of Botany 84:1064–1069. 15. Edwin F.G. (1996), Plant propagation by tissue culture. Part 2: In practice, Exegetics Limited, 613 – 936. 16. Esau K. (1967), Plant anatomy, John Wiley and Sons 17. Evert R.F. (2006), Esau’s Plant Anatomy, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., Publication. 18. 21T Ferguson B. and Beveridge C. (2009), 21TRoles for Auxin, Cytokinin, and Strigolactone in Regulating Shoot Branching, Plant Physiology 7TAmerican Society of Plant Biologists7T. 149: 1929-1944. 19. Fleming A. (2006), The co-ordination of cell division, differentiation and morphogenesis in the shoot apical meristem: a perspective, Journal of Experimental Botany. 57(1): 25-32. 20. Gaspar T., Kevers C., Penel C., Greppin H., Reid D.M., and Thrope T.A. (1996), Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 32: 272- 289 21. Gautheret R.J. (1966), Factors affecting differentiation of plant tissues grown in vitro”, cell differentiation and morphogenesis, North-Holland Publishing Company – Amsterdam, 55-95. 22. 21T Hamant O., Heisler M., Jưnsson H., Krupinski P., Uyttewaal M., Bokov P., Corson F., Sahlin P., Boudaoud A., Meyerowitz E., Couder Y. and Traas J. (2008),21T Developmental Patterning by Mechanical Signals in Arabidopsis, 3TScience. 3T 22(5908): 1650 – 1655. 23. Higuchi M., Pischke M.S., Mahonen A.P., Miyawaki K., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Shinozaki K., Kato T., Tabata S. et al. (2004), In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family, Proc Natl Acad Sci USA, 101, 8821- 8826 24. Kurakawa T., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Koijima M., Nagato Y., Sakakibara H. and Kyozuka J. (2007), Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme, 8TNature8T. 9T4459T: 652-655. 25. Leibfried A., Jennifer P.C. To, Busch W., Stehling S., Kehle A., Demar M., Kieber J. and Lohmann J. (2005), WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin- inducible response regulators, Nature. 438: 1172-1175. 26. Leyser O. (2003), Regulation of shoot branching by auxin, Trends in Plant Science 8:541– 545 27. Machakova I., Zazimalova E. and George E.F. (2008), Plant Growth Regulators I: introduction; Auxins, their Analogues and Inhibitors, Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Volume 1. The Background, 185-197. 28. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M. and Kakimoto T. (2004), Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrat, Plant J, 37, 128- 138 29. Mok, D.W.S. and Mok M.C. (1994), Cytokinin metabolism and action, Plant Mol. Biol., 52,89-118. 30. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S. and Ueguchi C. (2004), Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis, Plant Cell, 16, 1365- 1377 31. Ongaro V. and Leyser O. (2007), Hormonal control of shoot branching, Journal of Experimental Botany, doi: 10. 1093/ jxb/erm 134 32. Reinhardt D., Mandel T. and Kuhlemeier C. (2000), Auxin regulates the initiation and radial position of plant lateral organs, Plant Cell, 12, 507-518 33. Reinhardt D., Pesce E.R., Stieger P., Mandel T., Baltensperger K., Bennett M., Traas J., Friml J. and Kuhlemeier C. (2003), Regulation of phyllotaxis by polar auxin transport, Nature, 426, 255-260 34. Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmulling T. (2006), Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin metabolism, Plant Cell, 18, 40- 54 35. Rudall P.G. (2007), Anatomy of Flowering Plants, Cambridge University Press. 36. Sachs T. and Thimann K. (1967), The role of auxins and cytokinins in the release of buds from dominance, American Journal of Botany 54:136–144. 37. 21T Shimizu-Sato S. and Mori H21T. (2001), Control of outgrowth and dormancy in axillary buds, 13TPlant Physiol13T 14T 2714T2:21T 1405–1413 38. Soh W.Y. and Bhojwani S.S. (1999), Morphogenesis in Plant Tissue Cultures, Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 520p. 39. Staden J., Zazimalova E. and George E.F. (2008), Plant Growth Regulators II: Cytokinin, their Analogues and Antagonists, Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Volume 1. The Background, 213-220. 40. Taiz L. and Zeiger E. (2002), Plant Physiology. 3th edition, Sinauer Associates. 41. Thimann K.V. (1937), On the Nature of Inhibitions Caused by Auxin, American Journal of Botany, Vol. 24, No. 7 (Jul., 1937), 407- 412 42. Vernoux T., Besnard F. and Traas J. (2010), Auxin at the Shoot Apical Meristem, 1T Cold Spring Harbor Laboratory Press.1T 43. Vieitez A.M. and San-Jose M.C. (1985), In vitro plantlet regeration from Juvenile and matura Quercua robus L., J.Hortic Sci, 60, 99-106. 44. Zhao Z., Andersen S., Ljung K., Dolezal K., Miotk A., Schultheiss S. and Lohmann J. (2005), Hormonal control of the shoot stem-cell niche, Nature. 438: 1172-1175. * Tài liệu internet 45. PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962) Khống đa lượng Nồng độ (mg/l) NHR4RNOR3 KNOR3 CaClR2R.2HR2RO MgSOR4R.7HR2RO KHR2RPOR4 NaHR2RPOR4 1650 1900 440 370 170 170 Khống vi lượng Nồng độ (mg/l) HR3RBOR3 MnSOR4.R2HR2RO ZnSOR4R.4HR2RO KI NaR2RMoOR4R.2HR2RO CuSOR4R.5HR2RO CoClR2R.6HR2RO 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 Dung dịch Fe-EDTA Nồng độ (mg/l) FeSOR4R.7HR2RO NaR2REDTA 27,8 37,3 Vitamin Morel và Wetmore (1951) Nồng độ (mg/l) Panthotenat decalcium Meso - inositol Acid nicotinique Pyridoxine - HCl Thiamine Biotin 1 100 1 1 1 0,001 Đường 30 Agar 6,5 pH 5,7 ± 0,1 ._.