Tìm hiểu tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng probiotics trong chăn nuôi

m cho con người. Sản phẩm thịt của chúng ta bị hạn chế xuất khẩu do không đủ chất lượng hay tồn dư kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng (người chăn nuôi trộn vào thức ăn để kích thích sinh trưởng, ngăn ngừa bệnh tật, giảm tiêu tốn thức ăn). Với ý thức ngày càng tăng của con người về sự kháng thuốc của vi khuẩn, nên việc sử dụng kháng sinh chữa bệnh, phòng bệnh cho gia cầm đã giảm dần. Từ lâu đã có những mối quan tâm đến việc tìm ra một loại chất thay thế kháng sinh trong chăn nuôi. Vi sinh vật sống trong ống tiêu hóa của vật nuôi có ảnh hưởng sâu sắc đến một vài quá trình sinh lí của vật chủ. Vì vậy, điều quan trong là phải hiểu cơ chế của hệ vi khuẩn đường ruột gia cầm, gia súc, tìm ra chất thay thế chất kháng sinh. Trong trạng thái bình thường thì trong đường ruột có sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và gây bệnh. Nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác và quan hệ cộng sinh và cạnh tranh. Cộng đồng vi khuẩn đó không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hóa mà còn tăng khả năng sản xuất trong động vật chủ. Probiotic là một sản phẩm được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm thay thế chất kháng sinh, tăng cường miễn dịch cho vật nuôi. Probiotic có khả năng hạn chế tiêu chảy ở heo con, kích thích sự tiêu hóa cũng như tăng trưởng của heo thịt đang là đòi hỏi cấp thiết của các nhà chăn nuôi. Việc sản xuất chế phẩm probiotic từ các chủng vi sinh vật cùng với enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sẽ góp phần nâng cao năng suất thông qua việc tăng sức đề kháng cho gia súc, gia cầm, đặc biệt là gia súc non, tăng khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó tăng thu nhập cho nông hộ, giải quyết công ăn việc làm, thúc đẩy sản xuất phát triển. Để có được thịt sạch đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu, ngành chăn nuôi Việt Nam có thể tìm thấy lời giải trong việc thay thế việc sử dụng kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng bằng probiotics kết hợp với enzyme hỗ trợ tiêu hĩa. Cụ thể probiotic là gì? Và việc bổ sung probiotic vào thức ăn cho vật nuôi thì có lợi như thế nào? Để sản xuất chế phẩm probiotic đặc thù cho chăn nuôi cần nghiên cứu triển khai những vấn đề gì? Để giải đáp những câu hỏi trên tôi chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp nhan đề: “Tìm hiểu tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi”. 1.2. Mục đích đề tài: Mục đích của đề tài nhằm tìm hiểu những nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn các vi sinh vật làm chế phẩm probiotic trong chăn nuôi trên thế giới và ở Việt Nam. Tìm hiểu về quy trình sản xuất chế phẩm probiotic Ứng dụng của chế phẩm trong chăn nuôi 1.3. Nội dung đề tài: - Tổng quan về nghiên cứu sản xuất và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi, cụ thể là vi khuẩn lên men lactic, Bacillus spp. và nấm men cũng như các enzyme hỗ trợ tiêu hóa nhằm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn. - Thực nghiệm quy trình sản xuất thử chế phẩm probiotic: khảo sát tìm các môi trường sản xuất và điều kiện bảo quản chế phẩm; khảo sát khả năng sinh enzym cellulase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger, Asperigillus oryzae; thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vào chế phẩm probiotic. 1.4. Ứng dụng đề tài: Đề tài là cơ sở lý thuyết cho nghiên cứu thực nghiệm về phân lập tuyển chọn những chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic để sản xuất và phát triển chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam. CHƯƠNG II: TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 2.1. Lịch sử nguồn gốc: Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm, tăng cường sức khỏe cho con người không phải là mới. Trên hàng nghìn năn về trước, rất lâu đời khi chưa tìm ra thuốc kháng sinh, con người đã biết đến các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe như: Sữa lên men, các sản phẩm lên men khác… khi điều tra dựa trên khoa học, việc sử dụng các loại thực phẩm lên men trong nhiều nền văn hóa của thế giới xảy ra trước sự ra đời của điện lạnh. Khái niệm áp dụng cải thiện sức khỏe bằng cách bổ sung tự nhiên các vi sinh vật có ích cho đường ruột, bằng cách thêm vào đồ uống đi từ thế kỷ thứ mười chín muộn. Vào thời điểm đó, một số bác sĩ cho rằng do bệnh tật và lão hóa chính là quá trình để xây dựng các sản phẩm chất thải hoặc, sự thối rữa trong ruột già (phần dưới của ruột già mà đổ vào trực tràng), và vật liệu độc hại bị rò rỉ từ ruột kết vào dòng máu. Quá trình rò rỉ-bây giờ gọi là ruột thấm hoặc hội chứng ruột bị thủng, và dẫn đến ngộ độc từ nó, được gọi là sự tự thụ độc . Lý thuyết cho rằng sự tự thụ độc thay đổi chế độ ăn kiêng nhằm giảm phân hủy chất độc hại trong ruột kết sẽ có lợi cho sức khỏe. Một số nhà quan sát đã biết về việc sử dụng các vi khuẩn Acid lactic trong xúc xích, lên men thịt và bảo vệ nó khỏi hư hỏng, bởi vì các vi khuẩn này vô hại đối với con người, họ đã nghĩ rằng bổ sung chúng vào chế độ ăn uống bằng cách, ăn các loại thực phẩm lên men sẽ làm giảm lượng độc tố sản xuất trong ruột kết. Nhóm Lactobacilli của vi khuẩn, một số trong đó được tìm thấy trong sữa chua, đây là những người đầu tiên tìm hiểu, xác định probiotic. Trong thập niên 1920 và 1930, nhiều bác sĩ khuyến cáo Acidophillus có trong sữa, trong đó có các loài vi khuẩn Lactobacillus acidophillus, để điều trị táo bón và tiêu chảy . Điều này đã được điều trị hiệu quả cho nhiều bệnh nhân Giai đoạn tiếp theo trong sự phát triển của probiotic vào những năm 1950, khi các nhà nghiên cứu y tế bắt đầu biết đến Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus acidophilus là một câu trả lời cho một số các tác dụng phụ tiêu hóa khi dùng thuốc kháng sinh. Mọi người biết rằng thuốc kháng sinh phá vỡ cân bằng tự nhiên của đường ruột bằng cách giết chết vi của các lợi ích cũng như các vi khuẩn gây bệnh. Các nhà nghiên cứu nghĩ rằng việc uống các chế phẩm cĩ bổ sung Lactobacillus acidophilus, có thể bù đắp những tác dụng phụ của thuốc kháng sinh. Một trong những khó khăn chính của chế phẩm probiotic là đảm bảo sự sống sót của những vi khuẩn khi ở trong dạ dày và các quá trình tiêu hóa của ruột non và thành công với thực dân trong ruột kết. Gần đây, probiotic với sự sống sót đặc biệt và thành công với thực dân trong ruột kết được minh chứng trong các nghiên cứu, đã nổi lên trên thế giới. Điều này cho thấy, probiotic đã được sàng lọc từ nhiều chủng của lactobacilli Goldin, Sherwood Gorbach và Barry đã nghiên cứu Lactobacillus GG  (LGG) và chứng minh có hiệu quả chống viêm đại tràng Clostridium difficile chống nhiễm trùng ruột kết là kết quả của Overkill, kháng sinh của vi khuẩn hữu ích và chống dị ứng  ở trẻ em do ruột thấm.  Hippoocrates và nhều người khác đã chỉ định sữa lên men có tác dụng dinh dưỡng và nó có thể chữa trị rối loạn ruột và dạ dày. ( oberman, 1985) Từ thời đó thì các nhà khoa học đã nghiên cứu và rất nhiều người đã tìm ra những vi sinh vật sống và lợi ích của chúng có ý nghĩa rất lớn đến cuộc sống của con người. Với hai nhà khoa học Lourens Hattigh và Viljoen, 2001, những nghiên cứu từ trước các kiến thức về probiotic ngày càng được đẩy mạnh hơn nũa Giai đoạn của thế kỷ này là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây tập trung vào lợi ích khác cuả các vi khuẩn khi ở trong đường ruột và các loại thực phẩm để vận chuyển vào cơ thể con người và vật nuôi. 2.2. Định nghĩa probiotic: Thuật ngữ probiotic do Metchnikoff  đưa ra khi nghiên cứu tại sao những người nông dân BUNGARY có sức khỏe tốt vào năm 1970. Probiotic là những nhóm vi khuẩn trung tính, sống trong đường tiêu hóa của động vật, chúng tạo thành một khu hệ vi sinh vật, chúng cản trở sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch. Con người sử dụng các chế phẩm có chứa các probiotic như một loại thực phẩm và như một loại thuốc phòng và chữa bệnh. Đồng hành với thuật ngữ probiotic là thuật ngữ PREBIOTIC : Là những non-digestible oligosaccharides (NDOs), ảnh hưởng đến sự phát triển của khu hệ vi sinh vật (bao gồm cả resistant starches). Sự kết hợp của probiotic và prebiotic  gọi là synbiotic tăng cường khả năng điều hòa khu hệ vi sinh vật ảnh hưởng đến khả năng tiêu  hóa, chống  bệnh đường tiêu hóa của vật chủ. Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “Cho cuộc sống”. Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian. Lily và Stillwell (1965), đã mô tả trước tiên probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm, dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như: vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể vi sinh vật đường ruột của sinh vật chủ ( parrer, 1974). Vì vậy, khái niệm “probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định nghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên men), mà thể hiện có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ”( Havenaar và Huis in't Veld, 1992). Theo Laurent Verschuere và CTV (2000) probiotic được định nghĩa như sau: "Probiotics là sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ vào sự biến đổi hệ sinh vật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ đó cải thiện khả năng sử dụng thức ăn, nâng cao khả năng chống bệnh của vật chủ, và cải thiện môi trường xung quanh” Năm 2001 Schrezenmeir và Devrese định nghĩa Probiotic là "Lượng vi sinh vật sống xác định với số lượng thích hợp được chuẩn bị trong các sản phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật vùng ruột và có tác dụng tốt đến sức khỏe vật chủ” Theo định nghĩa của FAO/WHO 2002:" Probiotic, đó là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ".  Tóm lại probiotic là: - Tập hợp các vi sinh vật sống - Được đưa vào cơ thể vật nuôi qua đường tiêu hóa (thức ăn hay thuốc) - Đem lại hiệu quả thích cực cho sức khỏe của vật chủ Để “tập hợp các vi sinh vật sống “thực sự” đem lại hiệu quả tích cực cho sức khỏe vật chủ”, chúng phải được chọn lọc đáp ứng các tiêu chuẩn về. - An toàn sinh học - Hoạt tính sinh học - Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm của ngành lên men công nghiệp (Tuomola et al.,2001) 2.3. Tiêu chẩn an toàn sinh học Các vi khuẩn Lactic hay vi khuẩn lên men Lactic acid bacteria (LAB), được sử dụng làm probiotic nhiều nhất vì chúng được sử dụng trong thực phẩm lên men truyền thống từ rất lâu. Người ta xếp chúng vào vi sinh vật GRAS (Generelly. Recognized. As safe ).lee y .k và salminens., 2009) 2.4. Hoạt tính sinh học Để có ảnh hưởng tích cực lên sức khỏe vật chủ, probiotics phải có những hoạt tính sinh học như sau: - Có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa nghĩa là chịu được acid, dịch tiêu hóa dạ dày - Có khả năng kết dính trên bề mặt biểu mô ruột và tồn tại lâu dài bên trong đường tiêu hóa - Có hoạt tính đối kháng chống lại các vi sinh vật gây bệnh như: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella. Ssp, Helicobacter pylori… - Kích thích miễn dịch nhưng không gây viêm - Kháng đột biến và kháng ung thư ( Matila et al.,2002 ) 2.5. Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm của ngành lên men công nghiệp - Khả năng lên men - Khả năng tổ hợp - Khả năng sinh axit lactic - Khả năng kháng khuẩn 2.6. Cơ chế hoạt động của probiotic Cách thức hoạt động của probiotics là loại trừ, cạnh tranh, nghĩa là cạnh tranh bám vào màng nhầy thành ruột, qua đó tạo nên một hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các khuẩn gây bệnh ( Fullar, 2005). Chúng cũng sản xuất ra hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch. Ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra acid lactic, acid béo, peroxide và các kháng sinh. In vitro, các vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của Staphylococcus, Shigella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella và các chủng E.coli gây bệnh. Tăng cường tiêu hóa thức ăn: Vi khuẩn lactic sản xuất vitamin nhóm B và các enzyme phân giải protein, lipid và chuyển hóa đường latose trong sữa thành acid lactic, ngăn ngừa chứng tiêu chảy do không dung nạp đường lactose trong sữa (xảy ra ở 90% dân châu Á). Giảm cholesterol: Nhiều kết quả cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu. Gilliland và cộng sự thấy rằng vi khuẩn lactic phân lập từ phân lợn có khả năng phân huỷ cholesterol trong môi trường nuôi cấy. Các báo cáo cho thấy nồng độ cholesterol trong máu thấp ở những con lợn được nuôi bằng cholesterol có bổ sung các chủng vi khuẩn lactic được phân lập trên. 2.6.1. Tác dụng trên biểu mô ruột. Vi sinh vật probiotic có khả năng bám dính tốt tế bào biểu môruột, cạnh tranh nơi cư trú với các vi sinh vật bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng. Do đó, chúng có khả năng giảm kích thích bài tiết và những hậu quả do phản ứng viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn, cũng như đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy. 2.6.2.Tác dụng đến hệ vi sinh vật đường ruột Probiotic điều chỉnh thành phần của vi khuẩn đường ruột. Sự sống sót của probiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này thì đúng cho tất cả các loại probiotic. Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột. Probiotic định cư ở ruột với những vi khuẩn có lợi và loại trừ bệnh gây ra bởi các sinh vật như E.coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lông nhung của ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lông nhung. Probiotic gia tăng sự kháng bệnh bằng cách tăng độ cao của lông nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữa lông nhung, theo cách đó sẽ gia tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng. Vì vậy, vật sẽ gia tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn. Những nhà khoa học từ Viện nghiên cứu thực phẩm ở Norwich, nước Anh báo cáo là những probiotic đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruột gia cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi thức ăn. 2.6.2.1.Cơ chế kháng khuẩn của vi sinh vật probiotic: Vi sinh vật probiotic làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Đó là các acid hữu cơ như: Acid lactic, acid acetic…và đặc biệt là Bacteriocin - nhóm peptide hay protein được tổng hợp nhờ ribosome có hoạt tính kháng vi sinh vật (Hình 2.1). Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid beo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic. Hình 2.1: Cơ chế kháng vi sinh vật của Bacteriocin.(Cotter et al.,2005). Bacteriocin class I ( đại diện: nisin của Lactococcus lactis), gắn vào lớp lipid II, ngăn cản sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptiddoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, do đó ngăn cản tổng hợp vách tế bào hoặc bám vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh, lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin), protein không bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích. 2.6.2.2. Cơ chế tăng cường miễn dịch và các hoạt tính khác Probiotic như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm. Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng. Vi khuẩn probiotics có khả năng huy động các tế bào miễn dịch, hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch thích hợp nhờ một cơ chế phức tạp bắt đầu bằng sự tương tác giữa tế bào probiotic và tế bào của hệ miễn dịch. Một nhóm các nhà khoa học vừa công bố tác dụng của vi sinh vật probiotic ảnh hưởng như thế nào đến hoạt động của các gene của các tế bào trong ruột. Đây là kết quả đầu tiên về cơ chế thay đổi các phản ứng miễn dịch của probiotics. Nghiên cứu được thực hiện bởi một nhóm các nhà khoa học của Viện Dinh dưỡng và thực phẩm (TIFN) thuộc trường Đại học Maastricht và trường Đại học Radboud (Hà Lan) và trung tâm nghiên cứu Hà Lan NIZO. (hình 2.2.) Hình 2.2. Cơ chế miễn dịch Lactobacillus plantarum-tạp chí Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS Early Edition). Trong nhóm các tình nguyện viên, một số được tiếp thu probiotic sống Lactobacillus plantarum, một số khác tiếp thu các tế bào vô hoạt của chủng probiotic này, và số còn lại tiếp nhận placebo. Các phân tích biểu hiện gene các tế bào của tá tràng đã được tiến hành và cho thấy rõ ràng hiệu quả của probiotic sống đối với các hoạt động tế bào. Các hoạt động này kích hoạt hệ miễn dịch và cho phép nó giữ vai trò bảo vệ (phản ứng miễn dịch) Giáo sư Michiel Kleerebezem giải thích rằng các cơ chế phân tử liên quan đến hoạt động của probiotics hiện vẫn còn ít được biết đến. Các phương pháp tiếp cận đa chiều của TIFN, nơi tập trung các nhà khoa học về thực phẩm, về ngành ruột và các nhà vi sinh vật học, đã cho phép nghiên cứu các cơ chế phân tử các hoạt động của probiotic. Các phân tích biểu hiện gene cho phép các nhà khoa học chứng minh hiệu quả trực tiếp của probiotics đối với màng nhầy ruột. Nhờ sự giúp đỡ của cơ sở dữ liệu và các chuyên gia tin sinh học, họ đã xác định gene của các tế bào biểu mô gây ra cơ chế của các phản ứng miễn dịch. Kết quả nghiên cứu đầu tiên về cơ chế ảnh hưởng của probiotic đến hệ miễn dịch này đã được xuất bản trong tạp chí Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS Early Edition). Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho rằng probiotic có tác dụng kháng đột biến và kháng ung thư nhờ sự tương tác của các tế bào này với các tác nhân gây đột biến và ung thư nhưng còn gây nhiều bàn cãi. 2.7. Những vi sinh vật đĩng vai trị là probiotic 2.7.1. Vi khuẩn Lactic 2.7.1.1. Hình thái, sinh lý vi khuẩn lactic Nhìn chung, vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tửø, kị khí tùy ý, hầu hết không di động. Chúng không có khả năng sản xuất những hợp chất cần thiết để chúng tồn tại và phát triển. Môi trường sống của vi khuẩn lactic phải hiện diện hầu hết các chất dinh dưỡng. Chúng được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua….Vi khuẩn lactic tồn tại khá hạn chế trong một số môi trường do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó. * Phân loại Theo khoá phân loại Bergey(2001), vi khuẩn lactic được xếp Vào 4 họ: Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, stretococcaceae Giới : Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus Họ II : Enterococcaceae Giống : Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống : Leuconostoc Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus * Sự sắp xếp của các chi Lactobacillus Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men - + - CO2 từ glucose - - + CO2 từ gluconate - +a +a FDP aldolase present + + - Phosphoketolase - +b + Hiện nay Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus brevis Lactobacillus delbruckii Lactobacillus curvatus Lactobacillus buchneri Lactobacillus helveticus Lactobacillus plantarum Lactobacillus fermentum Lactobacillus salivarius Lactobacillus sakei Lactobacillus reuteri (a): Khi lên men, (b): Cảm ứng bởi pentoses Nguồn chuyển thể từ Sharpe [117] and Kandler and Weiss [113 Về mặt hình thái các nhóm vi khuẩn lactic tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hình cầu - Hình cầu: Diplococcus (hình cầu kết đôi), Tetracoccus (4 tế bào kết lại), Streptococcus (hình cầu chuỗi). - Hình que: que ngắn hoặc que dài, có thể tồn tại dạng tế bào đơn, kết đôi, hoặc kết chuỗi. Về mặt sinh lí chúng tương đối đồng nhất: Thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbonhydrate và tiết ra acid lactic. Khác với các vi khuẩn đường ruột cũng sinh acid lactic, các vi khuẩn lactic là vi khuẩn lên men bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzyme catalase. Tuy nhiên chúng vẫn có thể sinh trưởng được khi có mặt oxi do có enzyme peroxidase. Không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và NH4+. Vì có nhu cầu về các chất dinh dưỡng phức tạp nên đa số chúng cần một môi trường chứa hàng loạt các vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin) và các acid amin. Do đó, người ta thường nuôi cấy các chủng vi khuẩn này trên môi trường chứa một số lượng tương đối cao nấm men, dịch cà chua và thậm chí là máu * Đặc điểm chi tiết của từng giống theo khoá phân loại Bergey Lactobacillus: Tế bào hình que và thường có kích thước (0,5–1,2) ´(1,0–10,0)μm, kết thành chuỗi ngắn nhưng thỉnh thoảng có dạng gần giống hình cầu. Đây là các vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động bằng lông roi. Kị khí không bắt buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có khí oxy. Nhìn chung, các loài trong giống này sẽ phát triển tốt hơn trong điều kiện có 5% CO2 . Khuẩn lạc trên môi trường agar có kích thước 2 - 5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu. Những tế bào này hóa dưỡng hữu cơ đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp và giàu chất dinh dưỡng; có khả năng lên men và phân huỷ saccharose; ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn carbon là lactate. Không khử được nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome. Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 30 – 40oC. Lactobacilii phân bố rộng rãi trong môi trường, đặc biệt là trên những thực phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật; chúng thường sống trong ruột của chim và động vật hữu nhũ Một số chủng điển hình: Lactobacills acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillu bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus Lactobacillus, Lactobacillus helveticus,LactobacillusplantarumLactobacillus reuteri… a) Lactobacillus bulgaricus b) Lactobacillus casei Hình 2.3 : Tế bào vi khuẩn lactic giống Lactobacillus phóng đại 2000 lần Pediococcus: Tế bào hình cầu, không bao giờ kéo dài, đường kính 0,5 – 1,2μm. Sự phân chia luân phiên về góc bên phải tạo thành dạng tứ cầu khuẩn dưới điều kiện thích hợp. Đôi khi tế bào vi khuẩn này cũng tồn tại ở dạng kết đôi. Rất hiếm gặp tế bào đơn và không bao giờ chúng ở dạng chuỗi. Không di động, không tạo bào tử . Là loại vi khuẩn hiếu khí tuỳ ý nhưng đôi khi sự tăng trưởng bị ức chế khi ủ trong không khí. Hoá dưỡng hữu cơ, tế bào đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng và có thể lên men carbonhydrate (chủ yếu là mono- và disaccharide). Lên men glucose sinh acid nhưng không sinh gas; sản phẩm chính là DL và L(+)-lactate. Catalase âm, không có cytochrome. Không khử được nitrate. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25 – 40oC. Thường xuất hiện trên rau quả và các loại thực phẩm khác; không gây bệnh cho thực vật và động vật Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn lactic thuộc giống Pediococcus. Các chủng thường gặp: Pediococcus acidilactici, Pediococcus cellicola, Pediococcus claussenii, Pediococcus damnosus, Pediococcus dextrinicus, Pediococcus inopinatus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus stilesii… Enterococcus: Enterococcus durans Enterococcus faecalis Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn lactic thuộc giống Enterococcus Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước (0,6–2,0) ´ (0,6–2,5)μm, thường xuất hiện ở dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng. Không tạo nội bào tử, Gram dương. Thỉnh thoảng di độâng bằng lông roi. Không có bao nang. Hiếu khí tuỳ ý, hóa dưỡng hữu cơ bằng cách lên men nhiều loại đường khác nhau tạo sản phẩm chính là L(+)-acid lactic nhưng không sinh gas và pH đạt được tối đa là 4,2 – 4,6. Môi trường dinh dưỡng phức tạp. Catalase âm. Có thể phát triển ở 10 – 45oC (tối thích 37oC), pH 9,6; 6,5% muối NaCl, và 40% muối mật. Rất hiếm khi khử được nitrate. Thường lên men lactose. Hiện diện rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt trong phân động vật có xương sống, thỉnh thoảng gây bệnh. Một số chủng thông thường: Enterococcu durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium… Leuconostoc: Hình 2.6: tế bào vi khuẩn lactic thuộc giống Leuconostoc Tế bào có dạng hình cầu, đôi khi kéo dài khi ở dạng kết cặp hoặc kết chuỗi, kích thước (0,5 - 0,7) ´ (0,7 - 1,2) μm. Khi kết thành chuỗi dài, tế bào có dạng que ngắn và những tế bào ở cuối có dạng hơi tròn. Gram dương, không di động, không tạo bào tử. Phát triển khá chậm, khuẩn lạc nhỏ và dẹt trên môi trường có chứa sucrose. Hiếu khí tuỳ ý, hóa dưỡng hữu cơ bằng con đường lên men carbonhydrate bắt buộc, đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 20 – 30oC. Lên men glucose tạo thành acid và sinh gas; sản phẩm chính là ethanol và D(-)-lactate. Chỉ lên men được mono- và disaccharide. Catalase âm, không phân giải được arginine, không sinh indol, không làm tan máu, không khử nitrate. PH của môi trường lỏng khi kết thúc nuôi cấy là 4,4 – 5,0. Phân bố rộng rãi trên thực vật, các sản phẩm sữa và các sản phẩm khác. Không gây bệnh cho thực vật và động vật Một số chủng ưa gặp: Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc urionis, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostocgarlicum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc pseudoficulneum, Leuconostoc pseudomesenteroides… Streptococci Các vi khuẩn thuộc Streptococcus trước kia nay trong hệ thống phân loại Bergey bao gồm cả những vi sinh vật được xếp vào giống Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus. Nói cách khác, chúng bao gồm enterococci, lactic streptococcci và các streptococci hiếu khí và sinh mủ. Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đường kích 0,5 – 2,0 μm, thường kết thành cặp hoặc thành chuỗi khi phát triển trên môi trường lỏng; đôi khi chúng kéo dài theo trục của chuỗi tạo thành dạng như mũi mác. Không di động, không tạo bào tử và Gram dương. Một vài loài có thể tạo bao nang, hiếu khí tuỳ ý, hóa dưỡng hữu cơ, đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng và đôi khi cần duy trì lượng CO2 là 5%. Lên men trao đổi chất, sản phẩm chính là lactate nhưng không sinh gas. Catalase âm. Nhiệt độ phát triển là 25 – 45oC, tối thích là 37oC. Kí sinh trên động vật có xương sống, đặc biệt là vùng miệng và ruột, thỉnh thoảng gây bệnh cho người và động vật b) a) a) Streptococcus lactis b) Streptococcus thermophilus Hình 2.7 : Tế bào vi khuẩn lactic giống Streptococcus phóng đại 2000 lần Lactococcus: Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước (0,5 – 1,2) ´ (0,5 – 1,5) μm, thường xuất hiện dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng. Không tạo nội bào tử. Gram dương. Không di động và không có bao nang. Hiếu khí tuỳ ý. Hóa dưỡng hữu cơ bằng con đường lên men trao đổi chất; lên men nhiều loại carbonhydrate với sản phẩm tạo thành chủ yếu là L(+)-lactic acid nhưng không sinh gas. Môi trường dinh dưỡng phức tạp. Catalase âm. Phát triển được ở 10 – 45oC và tối thích ở 30oC, không có muối NaCl. Được tìm thấy phổ biến nhất trong các sản phẩm sữa và trên thực vật Một số chủng thông thường Lactococcus lactis cremoris, Lactococcus lactis hordniae, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis lactis bv. Diacetylactis… Hình 2.8 : Tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis 2.7.1.2. Giới thiệu một số vi khuẩn lactic được sử dụng là probiotic Fuller (1989) and Conway (1996) đã liệt kê những loài vi sinh vật được sử dụng là probiotic: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve. *. Lactobacillus acidophilus Đặc điểm chung của vi khuẩn này được tóm tắt như sau: Lactobacillus acidophilus thuộc trực khuẩn, có kích thước: rộng 0,6 – 0,9 mm, dài 1,5 – 6,0 mm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và có khả năng chuyển động, có khả năng lên men một số loạt đường như: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo ra acid lactic, hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rahamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inositol. Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học D và L- lactic acid. Trong đó L-lactic acid chiếm tỉ lệ gần 70%. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C - 500C. Lactobacillus acidophilus là loại vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm probiotic, chúng có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết, 8 ngày trong dịch tràng. Lactobacillus acidophilus sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột. Lactobacillus acidophilus còn có thể tổng hợp các vitamin và đây là loài vi khuẩn có khả năng bền vững với 40 loại kháng sinh. *. Lactobacillus casei Lactobacillus casei: Trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn. Chúng có thể tạo thành chuỗi, không chuyển động, Gram._.