Tiểu luận Sinh học phân tử

Tr­êng ®¹i häc quèc gia ®¹i häc khoa häc tù nhiªn khoa sinh häc PCR (Polymerase chain reaction) (TiÓu luËn Sinh häc ph©n tö) Sinh viªn: NguyÔn §øc Nhù Líp K6-CNTNSH Gi¶ng viªn h­íc dÉn: PGS.TS §ç Ngäc Liªn Hµ néi, N¨m 2004 PCR (Polymerase chain reaction) I. Nh÷ng kiÕn thøc c¬ b¶n vÒ PCR. PCR lµ tõ viÕt t¾t cña côm tõ Polymerase Chain Reaction trong tiÕng Anh. Cã nhiÒu c¸ch dÞch cho côm tõ nµy. Cã s¸ch dÞch lµ ph¶n øng tæng hîp d©y chuyÒn nhê Polymerase, cã tµi liÖu dÞch lµ ph¶n øng chuçi trïng hîp, hay ®¬n gi¶n lµ kü thuËt PCR. ë ®©y chóng ta sÏ dïng ®¬n gi¶n lµ kü thuËt PCR. Kü thuËt nµy do Kary Mullis vµ céng sù ph¸t minh vµo gi÷a thËp niªn 80 cña thÕ kû hai m­¬i ®· ®­a l¹i mét cuéc c¸ch m¹ng trong di truyÒn häc ph©n tö. Tõ ®ã ®Õn nay, nã ®· ®­îc sö dông réng r·i vµ trë thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong c¸c hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö. Kary Mullis nhËn gi¶i th­ëng Nobel n¨m 1993 vÒ ph¸t minh PCR Kary Mullis ®· viÕt trong t¹p chÝ khoa häc Mü: “ B¾t ®Çu b»ng mét ph©n tö riªng lÎ cã chøa chÊt liÖu di truyÒn ADN, PCR cã thÓ t¹o ra 100 triÖu ph©n tö t­¬ng tù trong mét buæi chiÒu. Ph¶n øng dÔ dµng thùc hiÖn. Nã ®ßi hái kh«ng nhiÒu h¬n mét èng nghiÖm, mét vµi ho¸ chÊt ®¬n gi¶n vµ mét nguån nhiÖt. MÉu ADN cÇn ®Ó nh©n b¶n cã thÓ tinh s¹ch, hoÆc lµ mét phÇn rÊt nhá trong mét hçn hîp chÊt sinh häc cùc kú phøc t¹p. ADN cã thÓ tõ mÉu bÖnh phÈm cña bÖnh viÖn, mét sîi tãc ng­êi, mét giät m¸u r¬i ë hiÖn tr­êng ph¹m téi, hoÆc tõ m« n·o x¸c ­íp, hay tõ mét wooly kh«ng lå 40.000 n¨m tuæi ®ãng b¨ng ë s«ng b¨ng ” (Kary Mullis website.htm). II. Môc ®Ých vµ ý nghÜa: §èi t­îng nghiªn cøu cña Sinh häc ph©n tö th­êng lµ nh÷ng vËt chÊt di truyÒn cã hµm l­îng t­¬ng ®èi nhá trong mÉu, hoÆc lµ nh÷ng gen ®¬n lÎ, rÊt nhá trong mét hÖ gen phøc t¹p, khæng lå vÝ dô nh­ hÖ gen cña ®éng vËt bËc cao chøa tíi 100.000 gen. Cã nhiÒu kü thuËt trong di truyÒn häc ph©n tö ®­îc hoµn thiÖn ®Ó v­ît qua khã kh¨n nµy, nh­ng chóng ®ßi hái nhiÒu thêi gian, cång kÒnh vµ rÊt khã kh¨n trong viÖc t×m kiÕm nh÷ng ®o¹n and ®Æc hiÖu. Kü thuËt PCR cho phÐp khuÕch ®¹i mét l­îng ADN trong mÉu mét c¸ch nhanh chãng vµ rÎ tiÒn. Cßn ®èi víi nh÷ng gen ®¬n lÎ, viÖc t¹o ra nhiÒu b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn lùa chän ®­îc thùc hiÖn mµ kh«ng cÇn t¸ch vµ nh©n dßng. ADN ®­îc khuÕch ®¹i cã thÓ xuÊt ph¸t tõ c¸c nguån rÊt kh¸c nhau, tõ c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh ë ng­êi (HIV hay lµ bÖnh môn giép -herpes) ®Õn tinh dÞch trong mét vô ¸n téi ¸c nµo ®ã hay ADN cña mét chó mèi sèng tõ 40 triÖu n¨m tr­íc (Powledge 1998). Tr×nh tù ®Ých cã thÓ rÊt nhá (nh­ ®· nãi ë trªn) hay còng cã thÓ rÊt lín (®Õn 104 cÆp baz¬) (Stryer 1995). YÕu tè mÊu chèt cña ADN khiÕn PCR cã thÓ ®­îc sö dông trong mäi tr­êng hîp lµ vËt liÖu di truyÒn. Do nh÷ng ­u ®iÓm tuyÖt ®èi trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö, kü thuËt PCR ®­îc nhanh chãng ¸p dông réng r·i trong nhiÒu lÜnh vùc khoa häc vµ cho kÕt qu¶ chÝnh x¸c. MÆt kh¸c sù ph©n tÝch thµnh phÇn vµ trËt tù nucleotide trªn ph©n tö ADN trong hÖ gen cã gi¸ trÞ rÊt l¬n trong ph©n lo¹i c¸c loµi sinh vËt. ChÝnh nhê tÝnh thùc tiÔn to lín ®ã mµ t¸c gi¶ cña PCR, Kary Mullis ®· ®­îc tÆng gi¶i th­ëng Nobel n¨m 1993. III. C¬ së khoa häc (nguyªn lý) cña kü thuËt PCR: PCR lµ mét ph¶n øng sinh ho¸ phô thuéc nhiÖt ®é, sö dông ®Æc ®iÓm cña qu¸ tr×nh sao chÐp AND víi sù tham gia cña mét lo¹i enzyme AND polymerase chÞu nhiÖt, cã hai ®o¹n ng¾n AND, mét sîi lµm måi (primers) vµ dïng c¸c ®o¹n AND m¹ch ®¬n lµm khu«n ®Ó tæng hîp nªn sîi míi bæ sung víi nã. V× vËy khëi ®Çu qu¸ tr×nh tæng hîp AND cÇn cung cÊp ®o¹n måi oligonucleotide (cã ®é dµi tõ 3-60 nucleotide). §o¹n nµy g¾n kÕt víi and khu«n t¹i ®iÓm khëi ®Çu sao chÐp. §ã lµ ®Æc ®iÓm quan träng ®Çu tiªn cña PCR v× ADN polymerase ®­îc ®iÒu khiÓn ®Ó tæng hîp mét ®o¹n ADN ®Æc thï. Qu¸ tr×nh nµy ®­îc enzyme adn polymerase ®iÒu khiÓn ®Ó tæng hîp nªn mét sîi ADN®Æc thï. C¸c sîi ADN m¹ch ®¬n lµm khu«n ®­îc t¹o ra theo c¸ch ®¬n gi¶n lµ n©ng nhiÖt ®é lªn trªn 90 ®é C mµ th­êng lµ 94 ®é C cho chuçi xo¾n kÐp ADN bung ra. C¶ hai sîi ADN ®Òu ®­îc dïng lµm khu«n cho qu¸ tr×nh tæng hîp nÕu c¸c ®o¹n måi (primer) ®­îc cung cÊp ®Ó b¸m vµo vÞ trÝ t­¬ng øng cho c¶ hai sîi. Trong kü thuËt PCR, c¸c ®o¹n måi ®­îc chän n»m ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n lªn sao cho c¸c sîi ADN tæng hîp míi ®­îc b¾t ®Çu t¹i mçi ®o¹n måi vµ kÐo dµi vÒ phÝa ®o¹n måi n»m trªn sîi kia, cho s¶n phÈm cã ®é dµi n»m gi÷a hai ®o¹n måi nµy. §é dµi cña s¶n phÈm PCR cã thÓ tõ vµi tr¨m ®Õn hµng ngµn, thËm chÝ hµng chôc ngµn cÆp nucleotide. Nh­ vËy, sau mçi chu kú, c¸c ®iÓm b¸m cho c¸c ®o¹n måi l¹i xuÊt hiÖn cho mçi ADN míi ®­îc tæng hîp . Hçn hîp ph¶n øng l¹i ®­îc n©ng nhiÖt ®é lªn thÝch hîp sao cho c¸c sîi ban ®Çu t¸ch khái sîi míi tæng hîp, c¸c sîi nµy sau ®ã ®­îc dïng lµm khu«n cho chu kú tiÕp theo, bao gåm c¸c b­íc: g¾n måi, tæng hîp ADN vµ t¸ch rêi c¸c ®o¹n. KÕt qu¶ cuèi cïng cña ph¶n øng PCR lµ sau n chu kú cña ph¶n øng, tÝnh theo lý thuyÕt ta sÏ cã 2n b¶n sao c¸c ph©n tö ADN m¹ch kÐp n»m gi÷a hai ®o¹n måi. §ã lµ ®Æc ®iÓm quan träng thø hai cña kü thuËt PCR. Nh­ vËy kÕt qu¶ lµ mét ®o¹n ADN ®Þnh tr­íc ®­îc nh©n lªn víi mét l­îng rÊt lín, vÝ dô sau 32 chu kú sè l­îng b¶n sao ADN cña PCR sÏ lµ 1.073.741.824. IV. C¸ch tiÕn hµnh ph¶n øng PCR PCR lµ mét kü thuËt phßng thÝ nghiÖm t­¬ng ®èi dÔ lµm, mÆc dï ®ã lµ mét kü thuËt rÊt ®a n¨ng vµ øng dông hÕt søc réng r·i. VËt liÖu khëi ®Çu cho PCR lµ ADN cã chøa ®o¹n cÇn nh©n lªn, gäi lµ khu«n ADN. Kh«ng ph¶i lóc nµo còng cÇn thiÕt t¸ch chiÕt ®o¹n cÇn nh©n lªn v× viÖc ®ã ®· ®­îc c¸c ®o¹n måi dïng trong ph¶n øng x¸c ®Þnh. Tuy nhiªn nÕu ADN lµm khu«n tinh khiÕt th× ph¶n øng PCR sÏ rÊt nh¹y vµ ®Æc hiÖu. Hµm l­îng ADN khu«n cÇn cho ph¶n øng PCR rÊt nhá. Trong c¸c thÝ nghiÖm b×nh th­êng ë phßng thÝ nghiÖm chØ cÇn 1-100 nanogam (ng) tæng sè cña hÖ gen lµ ®ñ. Tuy nhiªn ngµy nay trong nhiÒu tr­êng hîp, ph¶n øng PCR cã thÓ nh©n c¸c ®o¹n ADN chØ tõ mét ph©n tö ADN riªng lÎ. Nguyªn liÖu cÇn thiÕt ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng invitro còng gièng nh­ nguyªn liÖu cÇn thiÕt ®Ó tæng hîp ADN trong tÕ bµo. Cã 4 thµnh phÇn cÇn thiÕt lµ: ADN lµm khu«n (m¹ch kÐp) cÇn khuÕch ®¹i Hai ®o¹n måi ®Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÓm b¾t ®Çu tæng hîp ADN. Enzyme chÞu nhiÖt ADN-polymerase (hiÖn nay ®­îc dïng phæ biÕn nhÊt lµ Tap, ®­îc chiÕt xuÊt tõ vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus) TÊt c¶ 4 lo¹i deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP’s): dATP, dTTP, dCTP, dDTP. Ngoµi ra m«i tr­êng ®Öm cung cÊp ion Mg++ vµ n­íc tinh khiÕt rÊt cÇn thiÕt ®Ó tiÕn hµnh kü thuËt PCR. Dung tÝch cho mét ph¶n øng PCR th«ng th­êng lµ 50 m hoÆc 20 m . Chu tr×nh thùc hiÖn §Ó thùc hiÖn ph¶n øng, chóng ta kh«ng chØ ®¬n gi¶n lµ cho tÊt c¶ nguyªn liÖu vµo èng nghiÖm råi ®un nãng. §©y lµ mét chu tr×nh khÐp kÝn, gåm ba b­íc c¬ b¶n: (3 b­íc ®iÒu chØnh nhiÖt ®é ) cho mét chu kú: Bung liªn kÕt cña ADN (denuteration): Môc ®Ých cña viÖc nµy lµ lµm biÕn tÝnh ADN, khiÕn hai sîi ADN t¸ch nhau ra. Do ®ã, c¸c ®o¹n måi cã thÓ g¾n vµo phÇn bæ sung trªn ADN ë b­íc sau. Còng trong b­íc nµy, c¸c ph¶n øng enzym ®Òu ngõng l¹i (vÝ dô nh­ sù më réng cña chu tr×nh tr­íc). §­îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é kho¶ng 940 trong vµi gi©y ®Õn vµi phót. T¹i nhiÖt ®é nµy, c¸c ph©n tö ADN m¹ch kÐp sÏ bÞ t¸ch ra hoµn toµn t¹o nªn c¸c sîi ®¬n dïng ®Ó lµm khu«n cho c¸c ®o¹n måi b¸m vµo vµ enzyme polymerase xóc t¸c tæng hîp. Måi b¸m ( hay cßn gäi lµ ñ víi måi) (annealing): Ngay lËp tøc nhiÖt ®é ®­îc h¹ xuèng 540C ®Ó c¸c ®o¹n måi g¾n víi c¸c tr×nh tù bæ xung t­¬ng øng trªn c¸c ph©n tö ADN lµm khu«n. C¸c ®o¹n måi dÞch chuyÓn lén xén d­íi chuyÓn ®éng Brao (Brown). Liªn kÕt ion gi÷a c¸c ®o¹n måi ®¬n vµ c¸c sîi khu«n ®¬n liªn tôc ®­îc t¹o ra råi l¹i ®øt g·y. C¸c liªn kÕt bÒn v÷ng h¬n (do nh÷ng måi g¾n ®óng vµo vÞ trÝ) kÐo dµi l©u h¬n. Trªn nh÷ng ®o¹n ng¾n ADN m¹ch kÐp bao gåm khu«n vµ måi nµy, ADN polymerase cã thÓ g¾n vµo vµ b¾t ®Çu kÐo dµi chuçi. Sau khi ®· cã mét vµi baz¬ ®­îc g¾n vµo, liªn kÕt hy®ro gi÷a m¹ch khu«n vµ måi trë nªn ®ñ m¹nh ®Ó nã kh«ng bÞ ®øt vì n÷a. NhiÖt ®é g¾n kÕt nµy gãp phÇn quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng PCR. NhiÖt ®é vµ kho¶ng thêi gian dïng ë ®ay thay ®æi tuú thuéc vµo chiÒu dµi cña ADN cÇn nh©n lªn. Tæng hîp (hay cßn gäi lµ kÐo dµi)(extension): C¸c ®o¹n måi nµo ®· ®­îc kÐo dµi mét vµi baz¬ th× cã lùc liªn kÕt víi khu«n m¹nh h¬n lùc ph¸ vì chóng. Cßn c¸c måi g¾n kh«ng chÝnh x¸c trë nªn láng lÎo (do nhiÖt ®é ®· cao h¬n) vµ kh«ng cã sù kÐo dµi m¹ch x¶y ra. NhiÖt ®é ngay lËp tøc ®­îc n©ng lªn 720 C, sù tæng hîp ADN diÔn ra tèi ­u d­íi nhiÖt ®é nµy. NhiÖt ®é 720 C ®­îc duy tr× trong 5 phót ®Ó c¸c sîi ADN võa ®­îc tæng hîp xo¾n vµo nhau t¹o nªn ADN sîi kÐp. Vµo cuèi giai ®o¹n nµy, nhiÖt ®é mét lÇn n÷a ®­îc n©ng lªn 940C , nh­ng lÇn nµy chØ trong vßng 20 gi©y ®Ó cho c¸c mÉu ng¾n cña ADN m¹ch kÐp (c¶ sîi ban ®Çu vµ sîi míi ®­îc tæng hîp) t¸ch nhau ra. Nh­ vËy mét chu kú gåm: ®un nãng ®Ó t¸ch c¸c sîi ADN kÐp thµnh sîi ®¬n ®Ó lµm khu«n, g¾n kÕt c¸c ®o¹n måi vµo sîi khu«n vµ tæng hîp ADN b»ng ADN polymerase, ®­îc lÆp ®i lÆp l¹i kho¶ng tõ 30 ®Õn 60 lÇn. Sau chu kú cuèi, nhiÖt ®é ®­îc duy tr× ë 720C trong 5-10 phót cho tÊt c¶ c¸c sîi ®¬n ADN cã trong ph¶n øng xo¾n l¹i t¹o nªn s¶n phÈm PCR. Cuèi cïng nhiÖt ®é ®­îc h¹ xuèng 40 C ®Ó b¶o qu¶n s¶n phÈm. H×nh ¶nh minh ho¹ c¸c b­íc cña ph¶n øng PCR nh­ sau: S¶n phÈm cña ph¶n øng PCR lµ ®o¹n ADN mµ ta cÇn nh©n lªn. S¶n phÈm ®­îc kiÓm tra b»ng c¸ch ch¹y ®iÖn di trªn th¹ch Agarose nång ®é 0,8%-2%, vµ ADN cña PCR sÏ ®­îc nh×n thÊy râ h¬n d­íi t¸c dông cña tia cùc tÝm (ultra-violet) sau khi ®ùc nhuém b»ng Ethidium Bromide, mét lo¹i ho¸ chÊt cã kh¶ n¨ng b¸m vµ lµm hiÓn thÞ ADN. §é dµi cña ADN s¶n phÈm ®­îc tÝnh b»ng c¸ch so s¸nh víi chØ thÞ ADN (ADN marker), sö dông th«ng dông nhÊt lµ ADN cña thùc khuÈn thÓ Lamda c¾t b»ng enzyme giíi h¹n Hindlll. V- Ph¶n øng RT-PCR (PCR ng­îc) * Nguyªn lý: Ph¶n øng RT-PCR thùc chÊt lµ ph¶n øng nh©n mét ®o¹n giíi h¹n cña khu«n ARN theo nguyªn lý cña ph¶n øng PCR, bao gåm hai giai ®o¹n: Giai ®o¹n thø nhÊt lµ chuyÓn ®æi mét sîi ARN lµm khu«n thµnh ADN hai sîi, sau ®ã qua giai ®o¹n thø hai, dïng ADN hai sîi nµy tiÕp tôc lµm khu«n ®Ó thùc hiÖn ph¶n øng PCR nh­ ®· giíi thiÖu. ARN lµ mét sîi bao gåm 4 nucleotide liªn kÕt v¬i nhau, trong ®ã cã Adenin, Guanin, Cystosin vµ Uracin. Chuçi nucleotide nµy ph¶i ®­îc chuyÓn ®æi thµnh AND 2 sîi mµ thµnh phÇn Uracin ®­îc thay thÕ b»ng Thymin. Ph¶n øng lµm biÕn ®æi ARN hÖ gen thµnh AND ph¶i nhê ®Õn vai trß cña mét lo¹i enzyme gäi lµ enzyme sao chÐp ng­îc (Reverse Transcriptase), do vËy giai ®o¹n nµy ®­îc gäi lµ chuyÓn ng­îc (RT), ®­îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é 50-55 ®é C trong 30 phót. Khi ®· cã ADN 2 sîi lµm khu«n chuyÓn ®æi tõ ARN ban ®Çu, ph¶n øng tiÕp theo lµ PCR nh­ ®· giíi thiÖu vµ ®­îc thùc hiÖn theo 3 b­íc thay ®æi nhiÖt ®é cho phï hîp ë mçi chu kú. Toµn bé ph¶n øng nh©n mét ®o¹n ADN tõ khu«n ARN qua hai giai ®o¹n nãi trªn ®­îc gäi lµ ph¶n øng RT-PCR hay ph¶n øng PCR ng­îc. Do mét sè virus cã hÖ gen lµ ARN cho nªn muèn nh©n mét ®o¹n gen cña nã th× ng­êi ta ph¶i dïng ph¶n øng RT-PVR. Mét sè nghiªn cøu vÒ ARN th«ng tin còng cÇn ®Õn ph¶n øng RT-PCR ®Ó chuyÓn ®æi sîi ARN thµnh ADN cho qu¸ tr×nh ®ång ho¸ ®Ó gi¶i tr×nh tù hoÆc t¸i tæ hîp trong nghiªn cøu biÓu thÞ protein. Tr­íc khi tiÕn hµnh ph¶n øng PCR ph¶i thùc hiÖn giai ®o¹n chuyÓn ng­îc RT, sau ®ã thµnh phÇn ADN ®­îc chuyÓn ®æi nµy lµm khu«n tiÕp tôc míi ®­îc nh©n lªn b»ng ph¶n øng PCR. Qu¸ tr×nh nµy gåm hai giai ®o¹n: - Ph¶n øng RT: §ã lµ giai ®o¹n chuyÓn ARN hÖ gen thµnh ADN nhê enzyme sao chÐp ng­îc biÕn ARN ë d¹ng sîi ®¬n sang d¹ng sîi kÐp ADN b»ng c¸ch thùc hiÖn ph¶n øng ë nhiÖt ®é 55 ®é C trong vßng 30 phót. - Ph¶n øng PCR: lµ giai ®o¹n gåm 3 b­íc nh­ ®· níi ë trªn. * C¸ch tiÕn hµnh: - Giai ®o¹n 1 (RT): 1 chu kú. Thùc hiÖn sao chÐp ng­îc tõ ARN sîi ®¬n sang AND sîi kÐp ë nhiÖt ®é 55 ®é C trong vßng 30 phót. - Giai ®o¹n 2 (PCR): + B­íc khëi ®Çu: 1 chu kú. Bung liªn kÕt: Bung chuçi xo¾n kÐp ADN 2 sîi thµnh khu«n 1 sîi lµm khu«n vµ cho primer b¸m vµo: 94-95 ®é C/ 1 phót. + B­íc 1: Bung liªn kÕt: Bung chuçi xo¾n kÐp ADN 2 sîi thµnh khu«n 1 sîi lµm khu«n vµ cho primer b¸m vµo: 94-95 ®é C/ 1 phót + B­íc 2: B¸m måi + B­íc 3: Tæng hîp ADN kÐo dµi (C¸c b­íc 1,2,3 ®­îc thùc hiÖn lÆp ®i lÆp l¹i trong 35-40 chu kú). + B­íc kÕt thóc: (1 chu kú), hoµn chØnh gen ADN cho s¶n phÈm; 72 ®é trong 1 phót. Cuèi cïng nhiÖt ®é ®­îc h¹ xuèng 40 C ®Ó b¶o qu¶n s¶n phÈm. VI- KiÓm tra kÕt qu¶ PCR: Tr­íc khi s¶n phÈm PCR ®­îc ®em sö dông, ng­êi ta cÇn ph¶i kiÓm tra: 1.   S¶n phÈm cã ®­îc h×nh thµnh hay kh«ng: Cho dï ho¸ sinh cã lµ ngµnh khoa häc chÝnh x¸c ®Õn ®©u ®i n÷a, ng­êi ta còng kh«ng thÓ ch¾c ch¾n r»ng mäi ph¶n øng PCR ®Òu thµnh c«ng. ChÊt l­îng cña ADN cã thÓ qu¸ tåi, do ®ã mét trong c¸c ®o¹n måi cã thÓ kh«ng phï hîp, hoÆc còng cã thÓ cã qu¸ nhiÒu ®iÓm b¾t ®Çu. 2.  KÝch th­íc cña s¶n phÈm cã ®óng kh«ng: Cã kh¶ n¨ng s¶n phÈm chØ dµi 500 baz¬, mµ trªn thùc tÕ gen cÇn khuÕch ®¹i l¹i dµi 1800 baz¬. Khi ®ã, mét trong hai måi cã thÓ ®· g¾n (phï hîp) víi phÇn nµo ®ã trªn gen mµ gÇn víi måi cßn l¹i h¬n. Còng cã thÓ c¶ hai måi ®· g¾n vµo mét gen hoµn toµn kh¸c. KÕt qu¶ cña PCR ®­îc kiÓm tra th«ng qua b¨ng ®iÖn di. Ng­êi ta th­êng sö dông ph­¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose. NÕu kh«ng cã s¶n phÈm nµo ®­îc t¹o ra, trªn b¨ng ®iÖn di sÏ kh«ng cã v¹ch nµo. NÕu cã c¸c s¶n phÈm khuÕch ®¹i kh«ng mong muèn, chóng ta sÏ thu ®­îc b¨ng ®iÖn di cã nhiÒu v¹ch. Xem trªn b¨ng ®iÖn di: Cét ë bªn tr¸i lµ hçn hîp c¸c ®o¹n ®· biÕt kÝch th­íc ®Ó so s¸nh. Chó ý r»ng kho¶ng c¸ch gi÷a c¸c ®o¹n trªn cét lµ cÊp sè mò. Cét 1: ®o¹n PCR dµi kho¶ng 1850 baz¬. Cét 2 vµ 4: c¸c ®o¹n dµi kho¶ng 800 baz¬. Cét 3: kh«ng cã s¶n phÈm nµo ®­îc t¹o thµnh, cho thÊy PCR ®· thÊt b¹i. Cét 5: nhiÒu v¹ch ®­îc t¹o ra do mét trong nh÷ng ®o¹n måi ®· g¾n sai chç. KÕt qu¶ cuèi cïng cã thÓ ®­îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrolamide, c¸c ®o¹n gen cã ®é dµi kh¸c nhau hiÖn râ cã thÓ ®äc ®­îc b»ng m¾t th­êng nhê so s¸nh víi thang chuÈn. VII. C¸c chØ tiªu ¶nh h­ëng ®Õn ph¶n øng PCR Mét ph¶n øng PCR ®ßi hái nhiÒu thµnh phÇn tham gia: 1. AND mÉu lµm khu«n; 2. Enzyme ADN polymerase; 3. Måi vµ nhiÖt ®é lai; 4. Dung dÞch ®Öm (Nång ®é ion Magiª); 5. Thµnh phÇn dNDP’s; 6. Thêi gian, sè l­îng chu kú ph¶n øng; 7. YÕu tè chu tr×nh nhiÖt; 8. N­íc; 9. ThiÕt bÞ vµ dông cô nhiÖt. 1. AND mÉu lµm khu«n: Ph¶n øng PCR tèi ­u x¶y ra trªn ADN thËt tinh s¹ch, nh­ng nhiÒu kü thuËt chÈn ®o¸n b»ng PCR vÉn ®¹t kÕt qu¶ tèi ­u víi ADN thu nhËn trùc tiÕp tõ dÞch chiÕt tÕ bµo. L­îng ADN mÉu sö dông còng cã cã khuynh h­íng gi¶m (1 microgam xuèng cßn 100 nanogam) víi viÖc sö dông c¸c polymerase cho hiÖu qu¶ cao. H¬n n÷a viÖc gi¶m l­îng mÉu ban ®Çu cßn cã h¹n chÕ ®­îc c¸c khuÕch ®¹i ký sinh (c¸c nh©n b¶n gi¶) t¹o nªn c¸c s¶n phÈm phô kh«ng mong muèn. Mét ­u ®iÓm kh¸c cña ph¶n øng PCR lµ cho phÐp khuÕch ®¹i c¶ nh÷ng mÉu ADN kh«ng ®­îc b¶o qu¶n tèt, ®· bÞ ph©n huû tõng phÇn nh­ trong c¸c vÕt m¸u ®Ó l©u ngµy, tinh dÞch ®· kh«, ho¸ th¹ch tãc, mãng tay cña ng­êi ®· chÕt, da, niªm m¹c miÖng … 2. Enzyme Enzyme ®­îc sö dông ®Çu tiªn lµ ®o¹n Klenow cña ADN polymerase I. V× ®©y lµ enzyme kh«ng chÞu nhiÖt nªn thao t¸c phøc t¹p vµ hiÖu qu¶ thÊp (ph¶i thªm enzyme míi vµo mçi ph¶n øng sau mçi lÇn biÕn tÝnh v× enzyme cò ®· bÞ nhiÖt ph©n huû, nhiÖt ®é lai thÊp khiÕn sù nh©n b¶n gi¶ t¨ng cao). Ph­¬ng ph¸p ADN chuyÓn sang mét b­íc ngoÆt míi cïng víi sù ph¸t hiÖn mét lo¹i ADN polymerase chÞu nhiÖt ®­îc t¸ch chiÕt tõ mét vi khuÈn sèng trong suãi n­íc nãng cã tªn gäi lµ Thermus aquaticus. Enzyme nµy cã tªn gäi lµ Taq polymerase kh«ng bÞ ph¸ huû ë nhiÖt ®é biÕn tÝnh vµ xóc t¸c tõ ®Çu ®Õn cuèi qu¸ tr×nh ph¶n øng. §iÒu nµy cho phÐp cã thÓ tù ®éng ho¸ tÊt c¶ c¸c b­íc cña chu tr×nh nh©n ADN nhê t¹o ra mét bé m¸y tù ®éng cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn ®­îc c¸c c«ng ®o¹n c¶ vÒ nhiÖt ®é vµ thêi gian. Tõ ®ã m¸y chu tr×nh nhiÖt PCR (Thermal Cycler) ra ®êi vµ hiÖn nay cã hµng chôc lo¹i do rÊt nhiÒu h·ng kh¸c nhau trªn thÕ giíi s¶n xuÊt nh­ h·ng Perkin Elmer, Eppendorf vv… Taq ADN polymerase kh«ng ®Æc hiÖu cho bÊt kú mét lo¹i ph©n tö ADN riªng biÖt nµo, chÝnh v× vËy tÊt c¶ c¸c ph¶n øng PCR sö dông måi vµ khu«n kh¸c nhau ®Òu sö dông Taq ADN polymerase. MÆt kh¸c mét sè ®iÓm quan träng cña Taq- ADN polymerase lµ cã kh¶ n¨ng g¾n thªm vµo ®Çu 3’ mét base lµ Adenine (A). §©y lµ mét ®iÓm quan träng ®Ó trong qu¸ tr×nh ®ång hãa ng­êi ta lîi dông ®Æc tÝnh nµy ®Ó g¾n s¶n phÈm cña PCR vµo plasmide trong qu¸ tr×nh ®ång ho¸. Mét nh­îc ®iÓm cña Taq- ADN polymerase lµ: lo¹i enzyme nµy chØ cã kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c lo¹i ADN cã ®é dµi d­íi 3kb (d­íi 3000 nucleotide), do vËy muèn nh©n b¶n ADN cã ®é dµi h¬n 3-20 kb ph¶i cÇn nh÷ng ®o¹n enzyme kh¸c. Mét nh­îc ®iÓm kh¸c cña Taq- ADN polymerase lµ kh«ng cã kh¶ n¨ng söa ch÷a nh÷ng sai sãt x¶y ra trong qu¸ tr×nh sao chÐp ( trong qu¸ tr×nh sao chÐp c¸c base nit¬ ë trªn m¹ch ®¬n ®­îc tæng hîp, cã thÓ x¶y ra sù thay ®æi mét vµi base nit¬, Taq- ADN polymerase kh«ng cã kh¶ n¨ng söa ch÷a sù nhÇm lÉn trong tr­êng hîp nµy). Ngµy nay nhiÒu polymerase chÞu nhiÖt kh¸c ®· ®ùc ®­a ra thÞ tr­êng víi nhiÒu chøc n¨ng chuyªn biÖt hay hoµn thiÖn h¬n. Tth polymerase, mét enzyme t¸ch chiÕt tõ vi khuÈn Thermus thermophilus cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh­ mét enzyme phiªn m· ng­îc khi cã mÆt ARN khu«n vµ ion Mg++ ; nh­ng víi sù hiÖn diÖn cña ADN khu«n vµ ion Mg++ , Tth pol l¹i xóc t¸c ph¶n øng khuÕch ®¹i ADN. Enyme nµy cho phÐp khuÕch ®¹i b¶n mÉu lµ ARN th«ng qua sù h×nh thµnh cADN. 3. Måi vµ nhiÖt ®é lai 3.1. ChiÒu dµi måi Måi lµ chØ tiªu quan träng nhÊt ®Ó ®¹t ®­îc mét sù nh©n b¶n ®Æc tr­ng vµ hiÖu qu¶ cao nh»m thu nhËn s¶n phÈm PCR chÊt l­îng cao trªn khu«n ADN biÕt tr­íc. ViÖc chän måi lµ giai ®o¹n quyÕt ®Þnh cña ph­¬ng ph¸p PCR vµ tu©n thñ mét sè nguyªn t¾c sau: - Tr×nh tù cña måi ®­îc chän sao cho kh«ng cã sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a måi xu«i vµ måi ng­îc, vµ còng kh«ng cã cÊu tróc kÑp tãc (hair loop forming) do sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a c¸c phÇn kh¸c nhau trong chuçi nucleotide cña mét måi. - NhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña måi xu«i vµ måi ng­îc kh«ng c¸ch biÖt qu¸ xa (th«ng th­êng trong kho¶ng 4-5 ®é C). Thµnh phÇn nucleotide cña c¸c måi c©n b»ng tr¸nh c¸c cÆp GC lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn. - C¸c måi ph¶i chän ®Æc tr­ng cho tr×nh tù ADN cÇn nh©n b¶n, kh«ng trïng víi c¸c tr×nh tù lÆp l¹i trªn gen. - §é dµi cÇn chän cho mét måi ®Æc hiÖu th«ng th­êng lµ 18-30 nucleotide. NÕu qu¸ ng¾n (d­íi 10 nucleotide), måi sÏ b¸m kh«ng ®Æc hiÖu; nÕu qu¸ dµi (trªn 30 nucleotide), chu kú nhiÖt ë giai ®o¹n thø 3 (giai ®o¹n táng hîp hay kÐo dµi) sÏ ¶nh h­ëng ®Õn c¬ chÕ b¸m cña måi. NhiÖt ®é nãng ch¶y cña måi kh«ng ®­îc v­ît qu¸ chu kú nhiÖt ë giai ®o¹n thø 3. ChiÒu dµi tèi ­u cña mét ®o¹n måi phô thuéc vµo l­îng (A+T) cña nã. Mét ®iÒu cÇn lu ý vÒ måi lµ c¸c ®o¹n måi ph¶i ®ñ phøc t¹p ®Ó kh¶ n¨ng x¶y ra viÖc g¾n måi vµo c¸c tr×nh tù kh¸c mµ kh«ng ph¶i lµ tr×nh tù ®Ých ®­îc chän tr­íc rÊt thÊp. VÝ dô, kh¶ n¨ng b¾t gÆp A, G, C hay T trong mét tr×nh tù ADN cho tr­íc bÊt kú lµ 1/4; kh¶ n¨ng b¾t gÆp mét tr×nh tù dinucleotide bÊt kú (vÝ dô AG) lµ 1/16; cßn kh¶ n¨ng b¾t gÆp mét tr×nh tù 4 baz¬ cho tríc lµ 1/256. Do ®ã, mét tr×nh tù 16 baz¬ xÐt vÒ mÆt thèng kª sÏ cã x¸c suÊt cã mÆt lµ 1 trªn 416 (= 4 294 967 296, hay lµ kho¶ng h¬n 4 tØ). 416 baz¬ t­¬ng ®­¬ng víi kÝch th­íc hÖ gen ng­êi hay ng«, vµ lín gÊp 1000 lÇn so víi kÝch th­íc hÖ gen cña E.coli. Do ®ã viÖc kÕt hîp mét oligonucleotide dµi h¬n 17 baz¬ víi tr×nh tù ®Ých cña nã lµ mét qu¸ tr×nh thùc sù ®Æc hiÖu, ®Æc hiÖu h¬n c¶ sù ®Æc hiÖu cña kh¸ng thÓ víi kh¸ng nguyªn. V× vËy mét ®o¹n måi dµi 17 baz¬ hay h¬n th­êng ®­îc dïng ®Ó khuÕch ®¹i tõ ADN thuéc hÖ gen cña thùc vËt vµ ®éng vËt. Måi qu¸ dµi cã thÓ ®ång nghÜa víi viÖc ngay c¶ nhiÖt ®é g¾n måi cao còng kh«ng ng¨n ngõa ®­îc sù b¾t cÆp sai vµ g¾n måi kh«ng ®Æc hiÖu. 3.2. Mét sè nguyªn t¾c thiÕt kÕ tr×nh tù måi (theo Innis vµ GelfDNA, 1991). i.   Måi nªn dµi 17 - 28 baz¬. ii.  Thµnh phÇn cña c¸c baz¬ nªn cã 50 - 60% (G+C). iii. Måi nªn cã ®Çu 3’ ë G hay C hay CG hay GC; ®iÒu nµy ng¨n ngõa viÖc “thë” (breathing) cña c¸c ®Çu vµ t¨ng hiÖu suÊt g¾n måi. iv. NhiÖt ®é Tm tèt nhÊt lµ n»m trong kho¶ng 55 - 80oC. v .ViÖc sö dông måi cã nhiÒu h¬n 3 G hay C ë ®Çu 3’ cã thÓ lµm t¨ng kh¶ n¨ng b¾t cÆp sai ë nh÷ng tr×nh tù giµu G hay C (do sù æn ®Þnh cña viÖc g¾n måi), nªn tr¸nh ®iÒu nµy. vi .  C¸c ®Çu 3’ cña c¸c måi kh«ng nªn bæ sung cho nhau (cô thÓ h¬n lµ kh«ng nªn b¾t cÆp baz¬ víi nhau), nÕu kh«ng th× c¸c dimer måi sÏ ®­îc tæng hîp nhiÒu h¬n lµ c¸c s¶n phÈm kh¸c. vii. Nªn tr¸nh dïng c¸c måi cã thÓ tù bæ sung cho nhau (nghÜa lµ kh¶ n¨ng h×nh thµnh cÊu tróc 2o nh­ c¸i thßng läng). 6.5 Dung dÞch ®Öm cho ph¶n øng. Dung dÞch ®Öm th­êng chøa:      + Tris-HCl pH 8,3 10-50mM.      + KCl kh«ng qu¸ 50 mM; MgCl2 1,5 mM hay cao h¬n.      + Måi 0.2 - 1mM ®èi víi mçi måi.      + 50 - 200m ®èi víi mçi dNTP.      +  Gelatin hay BSA ®Õn 100mg/ml.      +  Vµ/hoÆc thuèc tÈy kh«ng mang tÝnh ion vÝ dô Tween-20 hay Nonidet P40 hay Triton x-100 (0,05 - 0.1% nÕu dïng mét lo¹i nµo ®ã). (Innis vµ Gelfan, 1990). C¸c c«ng thøc hiÖn ®¹i cã thÓ kh¸c mét c¸ch ®¸ng kÓ, nh­ng chóng th­êng cã tû lÖ t­¬ng ®­¬ng. Ng­êi ta cho r»ng PCR lµm viÖc tèt nhÊt trong dung dÞch ®Öm phiªn m· ng­îc (Krawet vµ céng sù, 19xx; Fuqua vµ ng­êi kh¸c, 1990). Nång ®é KCl hay NaCl cao h¬n 50mM sÏ øc chÕ Taq, nh­ng víi nång ®é thÊp, nã sÏ cÇn ®Ó gióp måi g¾n dÔ dµng h¬n. Nång ®é ion Mg2+ ¶nh h­ëng ®Õn viÖc g¾n måi, nhiÖt ®é Tm cña khu«n, sù liªn kÕt gi÷a måi vµ khu«n; tÝnh ®Æc hiÖu cña s¶n phÈm, ho¹t ®éng vµ sù chÝnh x¸c cña enzyme. Taq cÇn Mg2+ tù do, do ®ã, cÇn ph¶i t¹o ra l­îng khÊu hao cho dNTP’s, måi vµ khu«n, tÊt c¶ chóng ®Òu c« lËp cation, vµ trong sè ®ã th× dNTP’s cã nång ®é cao nhÊt, do ®ã, nång ®é Mg2+ nªn cao h¬n nång ®é dNTP 0,5 - 2,5mM. §èi víi mçi tæ hîp khu«n-måi míi, nång ®é Mg2+ thay ®æi nªn cÇn ph¶i ®Þnh l­îng l¹i, v× nhu cÇu cña chóng sÏ kh¸c nhau ®¸ng kÓ thËm chÝ d­íi cïng ®iÒu kiÖn nång ®é vµ thêi gian hay nhiÖt ®é cña chu tr×nh. Nång ®é ion Mg++ lµ thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu ®­îc cña ph¶n øng PCR. Tuy nhiªn kh«ng cã mét qui luËt chung cho vÊn ®Ò nµy. Nång ®é tèi ­u ph¶i ®­îc x¸c ®Þnh cho tõng ph¶n øng qua nhiÒu thö nghiÖm. Mét sè enzyme kh«ng cÇn protein bæ sung, trong khi sè kh¸c l¹i phô thuéc vµo chóng. Mét vµi enzyme ho¹t ®éng tèt h¬n râ rÖt khi cã mÆt chÊt tÈy (detergent), cã thÓ bëi v× chÊt tÈy ng¨n c¶n xu h­íng tù nhiªn lµ co côm l¹i cña enzyme. Nång ®é måi kh«ng nªn vît qu¸ 1mM trõ phi møc ®é tho¸i ho¸ cao; 0,2mM lµ ®ñ ®èi víi c¸c måi t­¬ng ®ång. Nång ®é nucleotide kh«ng cÇn nhiÒu h¬n 50mM ®èi víi mçi lo¹i; tuy nhiªn c¸c s¶n phÈm dµi cã thÓ cÇn nång ®é cao h¬n. 5. Thµnh phÇn dNDP Bèn lo¹i nucleotide trong ph¶n øng PCR th­êng ®­îc sö dông ë d¹ng deoxynucleotide (dNTP’s bao gåm dATP; dGTP; dCTP vµ dTTP). Th­êng ®­îc sö dông ë nång ®é 20-200 mM / mçi lo¹i nucleotide. Nång ®é cao h¬n hay thÊp h¬n dÔ dÉn ®Õn sù t¹o nªn s¶n phÈm PCR gi¶. Sù mÊt c©n b»ng trong thµnh phÇn c¸c nucleotide l¹i lµm t¨ng c¸c lçi sao chÐp cña enzyme ADN polymerase. 6. Thêi gian 6.1. Thêi gian vµ nhiÖt ®é biÕn tÝnh: Hai tr×nh tù bæ sung liªn kÕt víi nhau bëi liªn kÕt hydro gi÷a c¸c baz¬ bæ sung cña chóng (G víi C vµ A víi T hay U), h×nh thµnh ph©n tö m¹ch kÐp æn ®Þnh. Ph¶n øng PCR cÇn c¸c sîi ADN m¹ch ®¬n lµm khu«n, do ®ã nÕu ADN khu«n ban ®Çu kh«ng ph¶i lµ d¹ng sîi ®¬n, nh­ hÇu hÕt c¸c virus ARN, th× cÇn ph¶i lµm nãng nã ®Õn trªn “nhiÖt ®é nãng ch¶y” (melting temperature) cña d¹ng sîi kÐp hoÆc “nhiÖt ®é nãng ch¶y” cña mét phÇn d¹ng sîi kÐp. Råi sau ®ã lµm l¹nh nhanh nã. ViÖc lµm l¹nh nhanh lµ ®Ó ch¾c ch¾n c¸c sîi ®· ®­îc lµm biÕn tÝnh, tøc lµ c¸c sîi ®· t¸ch nhau ra, kh«ng cßn liªn kÕt l¹i víi nhau n÷a. Ngoµi ra, nÕu acide nucleic ®­îc ®un nãng trong dung dÞch ®Öm chøa c¸c ion cã nång ®é thÊp h¬n 150mM NaCl th× nhiÖt ®é nãng ch¶y th«ng th­êng sÏ thÊp h¬n 100oC. §©y chÝnh lµ kho¶ng nhiÖt ®é lµm viÖc cña PCR, nhiÖt ®é biÕn tÝnh n»m trong kho¶ng tõ 91oC ®Õn 97oC. Taq polymerase cã thêi gian b¸n huû ë 95oC lµ 30 phót. §©y chÝnh lµ lý do t¹i sao kh«ng nªn thùc hiÖn qu¸ 30 chu tr×nh khuÕch ®¹i. Tuy nhiªn còng cã thÓ gi¶m nhiÖt ®é biÕn tÝnh xuèng sau kho¶ng 10 chu tr×nh, khi mµ chiÒu dµi trung b×nh cña ADN ®Ých ®· gi¶m xuèng. VÝ dô, ®èi víi khu«n dµi kho¶ng 300 cÆp baz¬ hay ng¾n h¬n, nhiÖt ®é biÕn tÝnh cã thÓ ®­îc gi¶m xuèng ®Õn 88oC cho khu«n chøa 50% (G+C) (Yap vµ McGee, 1991). §iÒu nµy ®ång nghÜa víi viÖc cã thÓ tiÕn hµnh ®Õn 40 chu tr×nh mµ kh«ng sî lµm gi¶m hiÖu suÊt cña enzyme. “Thêi gian t¹i nhiÖt ®é” lµ nguyªn nh©n chÝnh cho sù biÕn tÝnh hay lµ bÊt ho¹t cña Taq. Do ®ã, nÕu ta cã thÓ gi¶m ®iÒu nµy, ta sÏ cã thÓ t¨ng sè chu tr×nh ph¶n øng mµ bÊt kÓ lµ nhiÖt ®é cã gi¶m hay kh«ng. Th«ng th­êng, thêi gian biÕn tÝnh lµ 1 phót ë 94oC: ®èi víi nh÷ng tr×nh tù khu«n ng¾n thêi gian nµy cã thÓ ®­îc gi¶m xuèng ®Õn 30 gi©y hay thÊp h¬n n÷a. Ng­êi ta còng cã thÓ võa t¨ng nhiÖt ®é biÕn tÝnh, võa gi¶m thêi gian biÕn tÝnh: Innis vµ GelfDNA (1990) ®· ®Ò xuÊt thêi gian lµ 15 gi©y khi nhiÖt ®é lµ 96oC. 6.2 Thêi gian g¾n måi vµ viÖc thiÕt kÕ måi. ChiÒu dµi vµ tr×nh tù måi lµ mét tham sè cã ý nghÜa v« cïng quan träng ®¶m b¶o sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i. NhiÖt ®é nãng ch¶y cña mét acide nucleic m¹ch kÐp t¨ng lªn theo chiÒu dµi cña nã còng nh­ lµ sè l­îng (G+C). C«ng thøc ®¬n gi¶n ®Ó tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (temperature melting-Tm) cña mét ®o¹n DNA kÐp lµ: Tm (oC) = 4(G + C) + 2(A + T) Do ®ã, nhiÖt ®é g¾n måi (annealing temperature-Ta) cho mét ph¶n øng PCR nhÊt ®Þnh phô thuéc trùc tiÕp vµo thµnh phÇn vµ chiÒu dµi måi. NhiÖt ®é Ta nªn chän thÊp h¬n kho¶ng 5oC so víi nhiÖt ®é Tm thÊp nhÊt cña cÆp måi ®­îc sö dông (Innis vµ GelfDNA, 1990). Rychlik vµ nhiÒu ng­êi kh¸c (1990) ®· chØ ra c¸ch xö sù cña Ta. Hä cho r»ng nÕu t¨ng nhiÖt ®é Ta lªn 1oC sau mçi chu tr×nh th× tÝnh ®Æc hiÖu cña qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i vµ sè l­îng s¶n phÈm (1kb chiÒu dµi) ®Òu t¨ng lªn. Mét hÖ qu¶ cña viÖc sö dông nhiÖt ®é Ta qu¸ thÊp lµ mét hay c¶ hai ®o¹n måi l¹i g¾n vµo c¸c tr×nh tù kh¸c chø kh«ng ph¶i tr×nh tù ®Ých, do c¸c b¾t cÆp sai mét baz¬ hay sù g¾n måi mét phÇn. §iÒu nµy kh«ng g©y ¶nh h­ëng g× nÕu ta chØ khuÕch ®¹i c¸c tr×nh tù ®Ých th©n thuéc hoÆc t­¬ng tù nhau. Tuy nhiªn, ®iÒu nµy cã thÓ dÉn ®Õn viÖc khuÕch ®¹i “kh«ng ®Æc hiÖu” vµ hËu qu¶ lµ sè l­îng c¸c s¶n phÈm mong muèn bÞ gi¶m xuèng. Mét hËu qu¶ cña viÖc sö dông nhiÖt ®é Ta qu¸ cao lµ rÊt Ýt s¶n phÈm ®­îc t¹o ra do kh¶ n¨ng g¾n måi bÞ gi¶m xuèng. Mét ®iÒu quan träng kh¸c cÇn c©n nh¾c lµ mét cÆp måi víi nhiÖt ®é Ta kh«ng thÝch hîp sÏ kh«ng bao giê cho s¶n phÈm duy nhÊt víi sè l­îng ®¸ng kÓ, vµ cßn cã thÓ dÉn ®Õn sù khuÕch ®¹i kh«ng ®èi xøng cã nghÜa lµ sù khuÕch ®¹i sîi ®­îc g¾n måi hiÖu qu¶ h¬n. Sù g¾n måi kh«ng thÓ diÔn ra trong thêi gian dµi: hÇu hÕt c¸c måi chØ g¾n hiÖu qu¶ ®­îc trong 30 gi©y hay Ýt h¬n, trõ tr­êng hîp nhiÖt ®é Ta rÊt gÇn nhiÖt ®é Tm hoÆc c¸c måi dµi bÊt th­êng. H×nh trªn minh ho¹ ¶nh h­ëng cña nhiÖt ®é g¾n måi dÕn tÝnh ®Æc hiÖu vµ hiÖu suÊt khuÕch ®¹i cña papillomavirus ng­êi type 16 (Human papillomavirus type 16, HPV-16) (Williamson vµ Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171). Plasmide vµ khu«n DNA mÉu ®­îc khuÕch ®¹i ë c¸c nhiÖt ®é g¾n måi kh¸c nhau nh­ ®· chØ ra ë trªn. Chó ý r»ng trong khi plasmide ®­îc khuÕch ®¹i trong kho¶ng tõ 37oC ®Õn 55o C th× HPA, ADN chØ ®­îc khuÕch ®¹i ®Æc hiÖu ë 50oC. 6.4 Thêi gian vµ nhiÖt ®é kÐo dµi m¹ch: Th«ng th­êng ng­êi ta tiÕn hµnh ë 70oC - 72oC trong 0,5 ®Õn 3 phót. Trong khi ®ã, Taq ho¹t ®éng thùc sù ®Æc hiÖu ë 37oC, nhiÖt ®é rÊt gÇn víi nhiÖt ®é ho¹t ®éng cña ®o¹n Klenow cña E.coli DNA polymerase I. §©y qu¶ lµ mét nghÞch lý, lµm thÕ nµo mµ c¸c ®o¹n måi chØ g¾n vµo m¹ch khu«n ë nhiÖt ®é tèi ­u cña nã l¹i cã thÓ ®­îc kÐo dµi ë nhiÖt ®é cao mét c¸ch ®¸ng kÓ nh­ vËy. C©u tr¶ lêi lµ sù kÐo dµi m¹ch x¶y ra ngay tõ khi b¾t ®Çu cã sù g¾n måi, thËm chÝ nÕu ®iÒu nµy chØ x¶y ra trong thêi gian rÊt ng¾n ngñi, th× nã còng dÉn ®Õn sù æn ®Þnh ®¸ng kÓ. Ho¹t ®éng nµy x¶y ra tèi ­u ë kho¶ng 70oC vµ sù më réng måi diÔn ra víi tèc ®é tèi ®a lµ 100 baz¬/gi©y. Thêi gian kho¶ng mét phót lµ ®ñ ®Ó sù khuÕch ®¹i tr×nh tù 2kb lµ ®¸ng tin cËy (Innis vµ GelfDNA, 1990). C¸c s¶n phÈm dµi h¬n th× cÇn thêi gian l©u h¬n: 3 phót cho s¶n phÈm 3kb hay dµi h¬n. ViÖc kÐo dµi thêi gian lµ cÇn thiÕt trong nh÷ng chu tr×nh cuèi khi mµ nång ®é s¶n phÈm v­ît qu¸ nång ®é enzyme (>1nM), vµ khi dNTP vµ/hoÆc sù suy gi¶m sè l­îng måi cã thÓ trë nªn h¹n chÕ. 6.6 Sè chu tr×nh. Sè l­îng chu tr×nh cÇn thiÕt ®Ó t¹o ra b¨ng nh×n thÊy ®­îc trªn gel phô thuéc phÇn lín vµo nång ®é ADN ®Ých ban ®Çu: Innis vµ GelfDNA (1990) ®Ò xuÊt khuÕch ®¹i 40 - 45 chu tr×nh ®èi víi 50 ph©n tö ®Ých, vµ 25-30 chu tr×nh cho 3x105 ph©n tö cïng nång ®é. Sù kh«ng t­¬ng xøng nµy do c¸i gäi lµ hiÖu øng b»ng (plateau effect) g©y nªn. §©y lµ sù gi¶m tèc ®é t¨ng cña sù tÝch luü s¶n phÈm theo cÊp sè mò ë nh÷ng giai ®o¹n cuèi cña PCR, khi mµ nång ®é s¶n phÈm ®¹t ®Õn 0,3 - 1,0 nM. Cã thÓ sù ph©n r· cña c¸c chÊt ph¶n øng (dNTPs, enzyme), sù depletion cña chÊt ph¶n øng (måi, dNTPs - c¸i ®Çu lµ trôc trÆc ®èi víi c¸c s¶n phÈm ng¾n, c¸i sau lµ trôc trÆc ®èi víi c¸c s¶n phÈm dµi), sù øc chÕ ®Çu s¶n phÈm (end-product) (sù h×nh thµnh Pyrophosphate), sù c¹nh tranh cña c¸c s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu víi chÊt tham gia ph¶n øng, sù c¹nh tranh cña viÖc t¸i g¾n måi cña c¸c s¶n phÈm nång ®é cao (10nM) víi viÖc g¾n måi (Innis vµ GelfDNA, 1990). NÕu s¶n phÈm mong muèn kh«ng ®­îc t¹o ra sau 30 chu tr×nh, tèt h¬n lµ lÊy mét mÉu nhá (1ml) cña hçn hîp ®· khuÕch ®¹i lµm hçn hîp ph¶n øng míi, ®em khuÕch ®¹i 20-30 lÇn chø kh«ng nªn tiÕp tôc ch¹y thªm nhiÒu chu tr×nh. Trong mét sè tr­êng hîp khi mµ nång ®é khu«n h¹n chÕ, ®iÒu nµy cã thÓ t¹o ra s¶n phÈm tèt trong khi viÖc tiÕp tôc chu tr×nh ®Õn 40 lÇn hay h¬n kh«ng lµm ®­îc. Mét biÕn sè quyÕt ®Þnh sè l­îng chu tr×nh lµ PCR måi lµm tæ. Sù khuÕch ®¹i PCR ®­îc thùc hiÖn víi mét tËp hîp c¸c måi, sau ®ã s¶n phÈm nµo ®ã ®­îc lÊy ra - cã hay kh«ng cã sù bá thuèc thö- ®Ó khuÕch ®¹i l¹i, vãi tËp hîp c¸c måi n»m bªn trong, hay cßn gäi lµ måi lµm tæ. Qu¸ tr×nh nµy lµm t¨ng møc ®é cña tÝnh ®Æc hiÖu, cã nghÜa lµ tÊt c¶ c¸c s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu ®­îc khuÕch ®¹i trong lÇn ch¹y ®Çu tiªn sÏ kh«ng ®­îc khuÕch ®¹i trong lÇn ch¹y thø hai. §iÒu nµy ®­îc minh ho¹ nh­ sau:  Thêi gian cho mét chu kú khëi ®Çu môc ®Ých bung liªn kÕt cña chuçi xo¾n kÐp ADN lµ kh«ng v­ît qu¸ 5 phót. §èi víi 25-40 chu kú tiÕp theo, thêi gian cho giai ®o¹n 1 (bung liªn kÕt ) lµ 10 gi©y – 2 phót; thêi gian cho giai ®o¹n 2 (måi b¸m) kh«ng qu¸ nhanh hoÆc qu¸ l©u, th«ng th­êng d­íi 1 phót; thêi gian cho giai ®o¹n 3 (tæng hîp) tuú thuéc vµo ®é dµi vïng ADN cÇn nh©n lªn, n._.