Tài liệu Tiểu luận Sinh học phân tử: ... Ebook Tiểu luận Sinh học phân tử
48 trang |
Chia sẻ: huyen82 | Lượt xem: 1755 | Lượt tải: 3
Tóm tắt tài liệu Tiểu luận Sinh học phân tử, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Trêng ®¹i häc quèc gia
®¹i häc khoa häc tù nhiªn
khoa sinh häc
PCR
(Polymerase chain reaction)
(TiÓu luËn Sinh häc ph©n tö)
Sinh viªn: NguyÔn §øc Nhù
Líp K6-CNTNSH
Gi¶ng viªn híc dÉn:
PGS.TS §ç Ngäc Liªn
Hµ néi, N¨m 2004
PCR
(Polymerase chain reaction)
I. Nh÷ng kiÕn thøc c¬ b¶n vÒ PCR.
PCR lµ tõ viÕt t¾t cña côm tõ Polymerase Chain Reaction trong tiÕng Anh. Cã nhiÒu c¸ch dÞch cho côm tõ nµy. Cã s¸ch dÞch lµ ph¶n øng tæng hîp d©y chuyÒn nhê Polymerase, cã tµi liÖu dÞch lµ ph¶n øng chuçi trïng hîp, hay ®¬n gi¶n lµ kü thuËt PCR. ë ®©y chóng ta sÏ dïng ®¬n gi¶n lµ kü thuËt PCR.
Kü thuËt nµy do Kary Mullis vµ céng sù ph¸t minh vµo gi÷a thËp niªn 80 cña thÕ kû hai m¬i ®· ®a l¹i mét cuéc c¸ch m¹ng trong di truyÒn häc ph©n tö. Tõ ®ã ®Õn nay, nã ®· ®îc sö dông réng r·i vµ trë thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong c¸c hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö.
Kary Mullis nhËn gi¶i thëng Nobel n¨m 1993 vÒ ph¸t minh PCR
Kary Mullis ®· viÕt trong t¹p chÝ khoa häc Mü: “ B¾t ®Çu b»ng mét ph©n tö riªng lÎ cã chøa chÊt liÖu di truyÒn ADN, PCR cã thÓ t¹o ra 100 triÖu ph©n tö t¬ng tù trong mét buæi chiÒu. Ph¶n øng dÔ dµng thùc hiÖn. Nã ®ßi hái kh«ng nhiÒu h¬n mét èng nghiÖm, mét vµi ho¸ chÊt ®¬n gi¶n vµ mét nguån nhiÖt. MÉu ADN cÇn ®Ó nh©n b¶n cã thÓ tinh s¹ch, hoÆc lµ mét phÇn rÊt nhá trong mét hçn hîp chÊt sinh häc cùc kú phøc t¹p. ADN cã thÓ tõ mÉu bÖnh phÈm cña bÖnh viÖn, mét sîi tãc ngêi, mét giät m¸u r¬i ë hiÖn trêng ph¹m téi, hoÆc tõ m« n·o x¸c íp, hay tõ mét wooly kh«ng lå 40.000 n¨m tuæi ®ãng b¨ng ë s«ng b¨ng ” (Kary Mullis website.htm).
II. Môc ®Ých vµ ý nghÜa:
§èi tîng nghiªn cøu cña Sinh häc ph©n tö thêng lµ nh÷ng vËt chÊt di truyÒn cã hµm lîng t¬ng ®èi nhá trong mÉu, hoÆc lµ nh÷ng gen ®¬n lÎ, rÊt nhá trong mét hÖ gen phøc t¹p, khæng lå vÝ dô nh hÖ gen cña ®éng vËt bËc cao chøa tíi 100.000 gen. Cã nhiÒu kü thuËt trong di truyÒn häc ph©n tö ®îc hoµn thiÖn ®Ó vît qua khã kh¨n nµy, nhng chóng ®ßi hái nhiÒu thêi gian, cång kÒnh vµ rÊt khã kh¨n trong viÖc t×m kiÕm nh÷ng ®o¹n and ®Æc hiÖu. Kü thuËt PCR cho phÐp khuÕch ®¹i mét lîng ADN trong mÉu mét c¸ch nhanh chãng vµ rÎ tiÒn. Cßn ®èi víi nh÷ng gen ®¬n lÎ, viÖc t¹o ra nhiÒu b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn lùa chän ®îc thùc hiÖn mµ kh«ng cÇn t¸ch vµ nh©n dßng.
ADN ®îc khuÕch ®¹i cã thÓ xuÊt ph¸t tõ c¸c nguån rÊt kh¸c nhau, tõ c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh ë ngêi (HIV hay lµ bÖnh môn giép -herpes) ®Õn tinh dÞch trong mét vô ¸n téi ¸c nµo ®ã hay ADN cña mét chó mèi sèng tõ 40 triÖu n¨m tríc (Powledge 1998). Tr×nh tù ®Ých cã thÓ rÊt nhá (nh ®· nãi ë trªn) hay còng cã thÓ rÊt lín (®Õn 104 cÆp baz¬) (Stryer 1995). YÕu tè mÊu chèt cña ADN khiÕn PCR cã thÓ ®îc sö dông trong mäi trêng hîp lµ vËt liÖu di truyÒn.
Do nh÷ng u ®iÓm tuyÖt ®èi trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö, kü thuËt PCR ®îc nhanh chãng ¸p dông réng r·i trong nhiÒu lÜnh vùc khoa häc vµ cho kÕt qu¶ chÝnh x¸c. MÆt kh¸c sù ph©n tÝch thµnh phÇn vµ trËt tù nucleotide trªn ph©n tö ADN trong hÖ gen cã gi¸ trÞ rÊt l¬n trong ph©n lo¹i c¸c loµi sinh vËt. ChÝnh nhê tÝnh thùc tiÔn to lín ®ã mµ t¸c gi¶ cña PCR, Kary Mullis ®· ®îc tÆng gi¶i thëng Nobel n¨m 1993.
III. C¬ së khoa häc (nguyªn lý) cña kü thuËt PCR:
PCR lµ mét ph¶n øng sinh ho¸ phô thuéc nhiÖt ®é, sö dông ®Æc ®iÓm cña qu¸ tr×nh sao chÐp AND víi sù tham gia cña mét lo¹i enzyme AND polymerase chÞu nhiÖt, cã hai ®o¹n ng¾n AND, mét sîi lµm måi (primers) vµ dïng c¸c ®o¹n AND m¹ch ®¬n lµm khu«n ®Ó tæng hîp nªn sîi míi bæ sung víi nã. V× vËy khëi ®Çu qu¸ tr×nh tæng hîp AND cÇn cung cÊp ®o¹n måi oligonucleotide (cã ®é dµi tõ 3-60 nucleotide). §o¹n nµy g¾n kÕt víi and khu«n t¹i ®iÓm khëi ®Çu sao chÐp. §ã lµ ®Æc ®iÓm quan träng ®Çu tiªn cña PCR v× ADN polymerase ®îc ®iÒu khiÓn ®Ó tæng hîp mét ®o¹n ADN ®Æc thï. Qu¸ tr×nh nµy ®îc enzyme adn polymerase ®iÒu khiÓn ®Ó tæng hîp nªn mét sîi ADN®Æc thï. C¸c sîi ADN m¹ch ®¬n lµm khu«n ®îc t¹o ra theo c¸ch ®¬n gi¶n lµ n©ng nhiÖt ®é lªn trªn 90 ®é C mµ thêng lµ 94 ®é C cho chuçi xo¾n kÐp ADN bung ra.
C¶ hai sîi ADN ®Òu ®îc dïng lµm khu«n cho qu¸ tr×nh tæng hîp nÕu c¸c ®o¹n måi (primer) ®îc cung cÊp ®Ó b¸m vµo vÞ trÝ t¬ng øng cho c¶ hai sîi. Trong kü thuËt PCR, c¸c ®o¹n måi ®îc chän n»m ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n lªn sao cho c¸c sîi ADN tæng hîp míi ®îc b¾t ®Çu t¹i mçi ®o¹n måi vµ kÐo dµi vÒ phÝa ®o¹n måi n»m trªn sîi kia, cho s¶n phÈm cã ®é dµi n»m gi÷a hai ®o¹n måi nµy. §é dµi cña s¶n phÈm PCR cã thÓ tõ vµi tr¨m ®Õn hµng ngµn, thËm chÝ hµng chôc ngµn cÆp nucleotide. Nh vËy, sau mçi chu kú, c¸c ®iÓm b¸m cho c¸c ®o¹n måi l¹i xuÊt hiÖn cho mçi ADN míi ®îc tæng hîp . Hçn hîp ph¶n øng l¹i ®îc n©ng nhiÖt ®é lªn thÝch hîp sao cho c¸c sîi ban ®Çu t¸ch khái sîi míi tæng hîp, c¸c sîi nµy sau ®ã ®îc dïng lµm khu«n cho chu kú tiÕp theo, bao gåm c¸c bíc: g¾n måi, tæng hîp ADN vµ t¸ch rêi c¸c ®o¹n.
KÕt qu¶ cuèi cïng cña ph¶n øng PCR lµ sau n chu kú cña ph¶n øng, tÝnh theo lý thuyÕt ta sÏ cã 2n b¶n sao c¸c ph©n tö ADN m¹ch kÐp n»m gi÷a hai ®o¹n måi. §ã lµ ®Æc ®iÓm quan träng thø hai cña kü thuËt PCR. Nh vËy kÕt qu¶ lµ mét ®o¹n ADN ®Þnh tríc ®îc nh©n lªn víi mét lîng rÊt lín, vÝ dô sau 32 chu kú sè lîng b¶n sao ADN cña PCR sÏ lµ 1.073.741.824.
IV. C¸ch tiÕn hµnh ph¶n øng PCR
PCR lµ mét kü thuËt phßng thÝ nghiÖm t¬ng ®èi dÔ lµm, mÆc dï ®ã lµ mét kü thuËt rÊt ®a n¨ng vµ øng dông hÕt søc réng r·i. VËt liÖu khëi ®Çu cho PCR lµ ADN cã chøa ®o¹n cÇn nh©n lªn, gäi lµ khu«n ADN. Kh«ng ph¶i lóc nµo còng cÇn thiÕt t¸ch chiÕt ®o¹n cÇn nh©n lªn v× viÖc ®ã ®· ®îc c¸c ®o¹n måi dïng trong ph¶n øng x¸c ®Þnh. Tuy nhiªn nÕu ADN lµm khu«n tinh khiÕt th× ph¶n øng PCR sÏ rÊt nh¹y vµ ®Æc hiÖu. Hµm lîng ADN khu«n cÇn cho ph¶n øng PCR rÊt nhá. Trong c¸c thÝ nghiÖm b×nh thêng ë phßng thÝ nghiÖm chØ cÇn 1-100 nanogam (ng) tæng sè cña hÖ gen lµ ®ñ. Tuy nhiªn ngµy nay trong nhiÒu trêng hîp, ph¶n øng PCR cã thÓ nh©n c¸c ®o¹n ADN chØ tõ mét ph©n tö ADN riªng lÎ.
Nguyªn liÖu cÇn thiÕt ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng invitro còng gièng nh nguyªn liÖu cÇn thiÕt ®Ó tæng hîp ADN trong tÕ bµo. Cã 4 thµnh phÇn cÇn thiÕt lµ:
ADN lµm khu«n (m¹ch kÐp) cÇn khuÕch ®¹i
Hai ®o¹n måi ®Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÓm b¾t ®Çu tæng hîp ADN.
Enzyme chÞu nhiÖt ADN-polymerase (hiÖn nay ®îc dïng phæ biÕn nhÊt lµ Tap, ®îc chiÕt xuÊt tõ vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus)
TÊt c¶ 4 lo¹i deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP’s): dATP, dTTP, dCTP, dDTP.
Ngoµi ra m«i trêng ®Öm cung cÊp ion Mg++ vµ níc tinh khiÕt rÊt cÇn thiÕt ®Ó tiÕn hµnh kü thuËt PCR.
Dung tÝch cho mét ph¶n øng PCR th«ng thêng lµ 50 m hoÆc 20 m .
Chu tr×nh thùc hiÖn
§Ó thùc hiÖn ph¶n øng, chóng ta kh«ng chØ ®¬n gi¶n lµ cho tÊt c¶ nguyªn liÖu vµo èng nghiÖm råi ®un nãng. §©y lµ mét chu tr×nh khÐp kÝn, gåm ba bíc c¬ b¶n:
(3 bíc ®iÒu chØnh nhiÖt ®é ) cho mét chu kú:
Bung liªn kÕt cña ADN (denuteration):
Môc ®Ých cña viÖc nµy lµ lµm biÕn tÝnh ADN, khiÕn hai sîi ADN t¸ch nhau ra. Do ®ã, c¸c ®o¹n måi cã thÓ g¾n vµo phÇn bæ sung trªn ADN ë bíc sau. Còng trong bíc nµy, c¸c ph¶n øng enzym ®Òu ngõng l¹i (vÝ dô nh sù më réng cña chu tr×nh tríc).
§îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é kho¶ng 940 trong vµi gi©y ®Õn vµi phót. T¹i nhiÖt ®é nµy, c¸c ph©n tö ADN m¹ch kÐp sÏ bÞ t¸ch ra hoµn toµn t¹o nªn c¸c sîi ®¬n dïng ®Ó lµm khu«n cho c¸c ®o¹n måi b¸m vµo vµ enzyme polymerase xóc t¸c tæng hîp.
Måi b¸m ( hay cßn gäi lµ ñ víi måi) (annealing):
Ngay lËp tøc nhiÖt ®é ®îc h¹ xuèng 540C ®Ó c¸c ®o¹n måi g¾n víi c¸c tr×nh tù bæ xung t¬ng øng trªn c¸c ph©n tö ADN lµm khu«n.
C¸c ®o¹n måi dÞch chuyÓn lén xén díi chuyÓn ®éng Brao (Brown). Liªn kÕt ion gi÷a c¸c ®o¹n måi ®¬n vµ c¸c sîi khu«n ®¬n liªn tôc ®îc t¹o ra råi l¹i ®øt g·y. C¸c liªn kÕt bÒn v÷ng h¬n (do nh÷ng måi g¾n ®óng vµo vÞ trÝ) kÐo dµi l©u h¬n. Trªn nh÷ng ®o¹n ng¾n ADN m¹ch kÐp bao gåm khu«n vµ måi nµy, ADN polymerase cã thÓ g¾n vµo vµ b¾t ®Çu kÐo dµi chuçi. Sau khi ®· cã mét vµi baz¬ ®îc g¾n vµo, liªn kÕt hy®ro gi÷a m¹ch khu«n vµ måi trë nªn ®ñ m¹nh ®Ó nã kh«ng bÞ ®øt vì n÷a.
NhiÖt ®é g¾n kÕt nµy gãp phÇn quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng PCR. NhiÖt ®é vµ kho¶ng thêi gian dïng ë ®ay thay ®æi tuú thuéc vµo chiÒu dµi cña ADN cÇn nh©n lªn.
Tæng hîp (hay cßn gäi lµ kÐo dµi)(extension):
C¸c ®o¹n måi nµo ®· ®îc kÐo dµi mét vµi baz¬ th× cã lùc liªn kÕt víi khu«n m¹nh h¬n lùc ph¸ vì chóng. Cßn c¸c måi g¾n kh«ng chÝnh x¸c trë nªn láng lÎo (do nhiÖt ®é ®· cao h¬n) vµ kh«ng cã sù kÐo dµi m¹ch x¶y ra.
NhiÖt ®é ngay lËp tøc ®îc n©ng lªn 720 C, sù tæng hîp ADN diÔn ra tèi u díi nhiÖt ®é nµy.
NhiÖt ®é 720 C ®îc duy tr× trong 5 phót ®Ó c¸c sîi ADN võa ®îc tæng hîp xo¾n vµo nhau t¹o nªn ADN sîi kÐp.
Vµo cuèi giai ®o¹n nµy, nhiÖt ®é mét lÇn n÷a ®îc n©ng lªn 940C , nhng lÇn nµy chØ trong vßng 20 gi©y ®Ó cho c¸c mÉu ng¾n cña ADN m¹ch kÐp (c¶ sîi ban ®Çu vµ sîi míi ®îc tæng hîp) t¸ch nhau ra. Nh vËy mét chu kú gåm: ®un nãng ®Ó t¸ch c¸c sîi ADN kÐp thµnh sîi ®¬n ®Ó lµm khu«n, g¾n kÕt c¸c ®o¹n måi vµo sîi khu«n vµ tæng hîp ADN b»ng ADN polymerase, ®îc lÆp ®i lÆp l¹i kho¶ng tõ 30 ®Õn 60 lÇn.
Sau chu kú cuèi, nhiÖt ®é ®îc duy tr× ë 720C trong 5-10 phót cho tÊt c¶ c¸c sîi ®¬n ADN cã trong ph¶n øng xo¾n l¹i t¹o nªn s¶n phÈm PCR. Cuèi cïng nhiÖt ®é ®îc h¹ xuèng 40 C ®Ó b¶o qu¶n s¶n phÈm.
H×nh ¶nh minh ho¹ c¸c bíc cña ph¶n øng PCR nh sau:
S¶n phÈm cña ph¶n øng PCR lµ ®o¹n ADN mµ ta cÇn nh©n lªn. S¶n phÈm ®îc kiÓm tra b»ng c¸ch ch¹y ®iÖn di trªn th¹ch Agarose nång ®é 0,8%-2%, vµ ADN cña PCR sÏ ®îc nh×n thÊy râ h¬n díi t¸c dông cña tia cùc tÝm (ultra-violet) sau khi ®ùc nhuém b»ng Ethidium Bromide, mét lo¹i ho¸ chÊt cã kh¶ n¨ng b¸m vµ lµm hiÓn thÞ ADN. §é dµi cña ADN s¶n phÈm ®îc tÝnh b»ng c¸ch so s¸nh víi chØ thÞ ADN (ADN marker), sö dông th«ng dông nhÊt lµ ADN cña thùc khuÈn thÓ Lamda c¾t b»ng enzyme giíi h¹n Hindlll.
V- Ph¶n øng RT-PCR (PCR ngîc)
* Nguyªn lý:
Ph¶n øng RT-PCR thùc chÊt lµ ph¶n øng nh©n mét ®o¹n giíi h¹n cña khu«n ARN theo nguyªn lý cña ph¶n øng PCR, bao gåm hai giai ®o¹n: Giai ®o¹n thø nhÊt lµ chuyÓn ®æi mét sîi ARN lµm khu«n thµnh ADN hai sîi, sau ®ã qua giai ®o¹n thø hai, dïng ADN hai sîi nµy tiÕp tôc lµm khu«n ®Ó thùc hiÖn ph¶n øng PCR nh ®· giíi thiÖu.
ARN lµ mét sîi bao gåm 4 nucleotide liªn kÕt v¬i nhau, trong ®ã cã Adenin, Guanin, Cystosin vµ Uracin. Chuçi nucleotide nµy ph¶i ®îc chuyÓn ®æi thµnh AND 2 sîi mµ thµnh phÇn Uracin ®îc thay thÕ b»ng Thymin. Ph¶n øng lµm biÕn ®æi ARN hÖ gen thµnh AND ph¶i nhê ®Õn vai trß cña mét lo¹i enzyme gäi lµ enzyme sao chÐp ngîc (Reverse Transcriptase), do vËy giai ®o¹n nµy ®îc gäi lµ chuyÓn ngîc (RT), ®îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é 50-55 ®é C trong 30 phót. Khi ®· cã ADN 2 sîi lµm khu«n chuyÓn ®æi tõ ARN ban ®Çu, ph¶n øng tiÕp theo lµ PCR nh ®· giíi thiÖu vµ ®îc thùc hiÖn theo 3 bíc thay ®æi nhiÖt ®é cho phï hîp ë mçi chu kú. Toµn bé ph¶n øng nh©n mét ®o¹n ADN tõ khu«n ARN qua hai giai ®o¹n nãi trªn ®îc gäi lµ ph¶n øng RT-PCR hay ph¶n øng PCR ngîc.
Do mét sè virus cã hÖ gen lµ ARN cho nªn muèn nh©n mét ®o¹n gen cña nã th× ngêi ta ph¶i dïng ph¶n øng RT-PVR. Mét sè nghiªn cøu vÒ ARN th«ng tin còng cÇn ®Õn ph¶n øng RT-PCR ®Ó chuyÓn ®æi sîi ARN thµnh ADN cho qu¸ tr×nh ®ång ho¸ ®Ó gi¶i tr×nh tù hoÆc t¸i tæ hîp trong nghiªn cøu biÓu thÞ protein.
Tríc khi tiÕn hµnh ph¶n øng PCR ph¶i thùc hiÖn giai ®o¹n chuyÓn ngîc RT, sau ®ã thµnh phÇn ADN ®îc chuyÓn ®æi nµy lµm khu«n tiÕp tôc míi ®îc nh©n lªn b»ng ph¶n øng PCR. Qu¸ tr×nh nµy gåm hai giai ®o¹n:
- Ph¶n øng RT: §ã lµ giai ®o¹n chuyÓn ARN hÖ gen thµnh ADN nhê enzyme sao chÐp ngîc biÕn ARN ë d¹ng sîi ®¬n sang d¹ng sîi kÐp ADN b»ng c¸ch thùc hiÖn ph¶n øng ë nhiÖt ®é 55 ®é C trong vßng 30 phót.
- Ph¶n øng PCR: lµ giai ®o¹n gåm 3 bíc nh ®· níi ë trªn.
* C¸ch tiÕn hµnh:
- Giai ®o¹n 1 (RT): 1 chu kú. Thùc hiÖn sao chÐp ngîc tõ ARN sîi ®¬n sang AND sîi kÐp ë nhiÖt ®é 55 ®é C trong vßng 30 phót.
- Giai ®o¹n 2 (PCR):
+ Bíc khëi ®Çu: 1 chu kú. Bung liªn kÕt: Bung chuçi xo¾n kÐp ADN 2 sîi thµnh khu«n 1 sîi lµm khu«n vµ cho primer b¸m vµo: 94-95 ®é C/ 1 phót.
+ Bíc 1: Bung liªn kÕt: Bung chuçi xo¾n kÐp ADN 2 sîi thµnh khu«n 1 sîi lµm khu«n vµ cho primer b¸m vµo: 94-95 ®é C/ 1 phót
+ Bíc 2: B¸m måi
+ Bíc 3: Tæng hîp ADN kÐo dµi
(C¸c bíc 1,2,3 ®îc thùc hiÖn lÆp ®i lÆp l¹i trong 35-40 chu kú).
+ Bíc kÕt thóc: (1 chu kú), hoµn chØnh gen ADN cho s¶n phÈm; 72 ®é trong 1 phót.
Cuèi cïng nhiÖt ®é ®îc h¹ xuèng 40 C ®Ó b¶o qu¶n s¶n phÈm.
VI- KiÓm tra kÕt qu¶ PCR:
Tríc khi s¶n phÈm PCR ®îc ®em sö dông, ngêi ta cÇn ph¶i kiÓm tra:
1. S¶n phÈm cã ®îc h×nh thµnh hay kh«ng:
Cho dï ho¸ sinh cã lµ ngµnh khoa häc chÝnh x¸c ®Õn ®©u ®i n÷a, ngêi ta còng kh«ng thÓ ch¾c ch¾n r»ng mäi ph¶n øng PCR ®Òu thµnh c«ng. ChÊt lîng cña ADN cã thÓ qu¸ tåi, do ®ã mét trong c¸c ®o¹n måi cã thÓ kh«ng phï hîp, hoÆc còng cã thÓ cã qu¸ nhiÒu ®iÓm b¾t ®Çu.
2. KÝch thíc cña s¶n phÈm cã ®óng kh«ng:
Cã kh¶ n¨ng s¶n phÈm chØ dµi 500 baz¬, mµ trªn thùc tÕ gen cÇn khuÕch ®¹i l¹i dµi 1800 baz¬. Khi ®ã, mét trong hai måi cã thÓ ®· g¾n (phï hîp) víi phÇn nµo ®ã trªn gen mµ gÇn víi måi cßn l¹i h¬n. Còng cã thÓ c¶ hai måi ®· g¾n vµo mét gen hoµn toµn kh¸c.
KÕt qu¶ cña PCR ®îc kiÓm tra th«ng qua b¨ng ®iÖn di. Ngêi ta thêng sö dông ph¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose. NÕu kh«ng cã s¶n phÈm nµo ®îc t¹o ra, trªn b¨ng ®iÖn di sÏ kh«ng cã v¹ch nµo. NÕu cã c¸c s¶n phÈm khuÕch ®¹i kh«ng mong muèn, chóng ta sÏ thu ®îc b¨ng ®iÖn di cã nhiÒu v¹ch.
Xem trªn b¨ng ®iÖn di:
Cét ë bªn tr¸i lµ hçn hîp c¸c ®o¹n ®· biÕt kÝch thíc ®Ó so s¸nh. Chó ý r»ng kho¶ng c¸ch gi÷a c¸c ®o¹n trªn cét lµ cÊp sè mò.
Cét 1: ®o¹n PCR dµi kho¶ng 1850 baz¬.
Cét 2 vµ 4: c¸c ®o¹n dµi kho¶ng 800 baz¬.
Cét 3: kh«ng cã s¶n phÈm nµo ®îc t¹o thµnh, cho thÊy PCR ®· thÊt b¹i.
Cét 5: nhiÒu v¹ch ®îc t¹o ra do mét trong nh÷ng ®o¹n måi ®· g¾n sai chç.
KÕt qu¶ cuèi cïng cã thÓ ®îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrolamide, c¸c ®o¹n gen cã ®é dµi kh¸c nhau hiÖn râ cã thÓ ®äc ®îc b»ng m¾t thêng nhê so s¸nh víi thang chuÈn.
VII. C¸c chØ tiªu ¶nh hëng ®Õn ph¶n øng PCR
Mét ph¶n øng PCR ®ßi hái nhiÒu thµnh phÇn tham gia: 1. AND mÉu lµm khu«n; 2. Enzyme ADN polymerase; 3. Måi vµ nhiÖt ®é lai; 4. Dung dÞch ®Öm (Nång ®é ion Magiª); 5. Thµnh phÇn dNDP’s; 6. Thêi gian, sè lîng chu kú ph¶n øng; 7. YÕu tè chu tr×nh nhiÖt; 8. Níc; 9. ThiÕt bÞ vµ dông cô nhiÖt.
1. AND mÉu lµm khu«n:
Ph¶n øng PCR tèi u x¶y ra trªn ADN thËt tinh s¹ch, nhng nhiÒu kü thuËt chÈn ®o¸n b»ng PCR vÉn ®¹t kÕt qu¶ tèi u víi ADN thu nhËn trùc tiÕp tõ dÞch chiÕt tÕ bµo. Lîng ADN mÉu sö dông còng cã cã khuynh híng gi¶m (1 microgam xuèng cßn 100 nanogam) víi viÖc sö dông c¸c polymerase cho hiÖu qu¶ cao. H¬n n÷a viÖc gi¶m lîng mÉu ban ®Çu cßn cã h¹n chÕ ®îc c¸c khuÕch ®¹i ký sinh (c¸c nh©n b¶n gi¶) t¹o nªn c¸c s¶n phÈm phô kh«ng mong muèn. Mét u ®iÓm kh¸c cña ph¶n øng PCR lµ cho phÐp khuÕch ®¹i c¶ nh÷ng mÉu ADN kh«ng ®îc b¶o qu¶n tèt, ®· bÞ ph©n huû tõng phÇn nh trong c¸c vÕt m¸u ®Ó l©u ngµy, tinh dÞch ®· kh«, ho¸ th¹ch tãc, mãng tay cña ngêi ®· chÕt, da, niªm m¹c miÖng …
2. Enzyme
Enzyme ®îc sö dông ®Çu tiªn lµ ®o¹n Klenow cña ADN polymerase I. V× ®©y lµ enzyme kh«ng chÞu nhiÖt nªn thao t¸c phøc t¹p vµ hiÖu qu¶ thÊp (ph¶i thªm enzyme míi vµo mçi ph¶n øng sau mçi lÇn biÕn tÝnh v× enzyme cò ®· bÞ nhiÖt ph©n huû, nhiÖt ®é lai thÊp khiÕn sù nh©n b¶n gi¶ t¨ng cao). Ph¬ng ph¸p ADN chuyÓn sang mét bíc ngoÆt míi cïng víi sù ph¸t hiÖn mét lo¹i ADN polymerase chÞu nhiÖt ®îc t¸ch chiÕt tõ mét vi khuÈn sèng trong suãi níc nãng cã tªn gäi lµ Thermus aquaticus. Enzyme nµy cã tªn gäi lµ Taq polymerase kh«ng bÞ ph¸ huû ë nhiÖt ®é biÕn tÝnh vµ xóc t¸c tõ ®Çu ®Õn cuèi qu¸ tr×nh ph¶n øng.
§iÒu nµy cho phÐp cã thÓ tù ®éng ho¸ tÊt c¶ c¸c bíc cña chu tr×nh nh©n ADN nhê t¹o ra mét bé m¸y tù ®éng cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn ®îc c¸c c«ng ®o¹n c¶ vÒ nhiÖt ®é vµ thêi gian. Tõ ®ã m¸y chu tr×nh nhiÖt PCR (Thermal Cycler) ra ®êi vµ hiÖn nay cã hµng chôc lo¹i do rÊt nhiÒu h·ng kh¸c nhau trªn thÕ giíi s¶n xuÊt nh h·ng Perkin Elmer, Eppendorf vv…
Taq ADN polymerase kh«ng ®Æc hiÖu cho bÊt kú mét lo¹i ph©n tö ADN riªng biÖt nµo, chÝnh v× vËy tÊt c¶ c¸c ph¶n øng PCR sö dông måi vµ khu«n kh¸c nhau ®Òu sö dông Taq ADN polymerase. MÆt kh¸c mét sè ®iÓm quan träng cña Taq- ADN polymerase lµ cã kh¶ n¨ng g¾n thªm vµo ®Çu 3’ mét base lµ Adenine (A). §©y lµ mét ®iÓm quan träng ®Ó trong qu¸ tr×nh ®ång hãa ngêi ta lîi dông ®Æc tÝnh nµy ®Ó g¾n s¶n phÈm cña PCR vµo plasmide trong qu¸ tr×nh ®ång ho¸.
Mét nhîc ®iÓm cña Taq- ADN polymerase lµ: lo¹i enzyme nµy chØ cã kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c lo¹i ADN cã ®é dµi díi 3kb (díi 3000 nucleotide), do vËy muèn nh©n b¶n ADN cã ®é dµi h¬n 3-20 kb ph¶i cÇn nh÷ng ®o¹n enzyme kh¸c.
Mét nhîc ®iÓm kh¸c cña Taq- ADN polymerase lµ kh«ng cã kh¶ n¨ng söa ch÷a nh÷ng sai sãt x¶y ra trong qu¸ tr×nh sao chÐp ( trong qu¸ tr×nh sao chÐp c¸c base nit¬ ë trªn m¹ch ®¬n ®îc tæng hîp, cã thÓ x¶y ra sù thay ®æi mét vµi base nit¬, Taq- ADN polymerase kh«ng cã kh¶ n¨ng söa ch÷a sù nhÇm lÉn trong trêng hîp nµy).
Ngµy nay nhiÒu polymerase chÞu nhiÖt kh¸c ®· ®ùc ®a ra thÞ trêng víi nhiÒu chøc n¨ng chuyªn biÖt hay hoµn thiÖn h¬n. Tth polymerase, mét enzyme t¸ch chiÕt tõ vi khuÈn Thermus thermophilus cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh mét enzyme phiªn m· ngîc khi cã mÆt ARN khu«n vµ ion Mg++ ; nhng víi sù hiÖn diÖn cña ADN khu«n vµ ion Mg++ , Tth pol l¹i xóc t¸c ph¶n øng khuÕch ®¹i ADN. Enyme nµy cho phÐp khuÕch ®¹i b¶n mÉu lµ ARN th«ng qua sù h×nh thµnh cADN.
3. Måi vµ nhiÖt ®é lai
3.1. ChiÒu dµi måi
Måi lµ chØ tiªu quan träng nhÊt ®Ó ®¹t ®îc mét sù nh©n b¶n ®Æc trng vµ hiÖu qu¶ cao nh»m thu nhËn s¶n phÈm PCR chÊt lîng cao trªn khu«n ADN biÕt tríc.
ViÖc chän måi lµ giai ®o¹n quyÕt ®Þnh cña ph¬ng ph¸p PCR vµ tu©n thñ mét sè nguyªn t¾c sau:
- Tr×nh tù cña måi ®îc chän sao cho kh«ng cã sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a måi xu«i vµ måi ngîc, vµ còng kh«ng cã cÊu tróc kÑp tãc (hair loop forming) do sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a c¸c phÇn kh¸c nhau trong chuçi nucleotide cña mét måi.
- NhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña måi xu«i vµ måi ngîc kh«ng c¸ch biÖt qu¸ xa (th«ng thêng trong kho¶ng 4-5 ®é C). Thµnh phÇn nucleotide cña c¸c måi c©n b»ng tr¸nh c¸c cÆp GC lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn.
- C¸c måi ph¶i chän ®Æc trng cho tr×nh tù ADN cÇn nh©n b¶n, kh«ng trïng víi c¸c tr×nh tù lÆp l¹i trªn gen.
- §é dµi cÇn chän cho mét måi ®Æc hiÖu th«ng thêng lµ 18-30 nucleotide. NÕu qu¸ ng¾n (díi 10 nucleotide), måi sÏ b¸m kh«ng ®Æc hiÖu; nÕu qu¸ dµi (trªn 30 nucleotide), chu kú nhiÖt ë giai ®o¹n thø 3 (giai ®o¹n táng hîp hay kÐo dµi) sÏ ¶nh hëng ®Õn c¬ chÕ b¸m cña måi. NhiÖt ®é nãng ch¶y cña måi kh«ng ®îc vît qu¸ chu kú nhiÖt ë giai ®o¹n thø 3.
ChiÒu dµi tèi u cña mét ®o¹n måi phô thuéc vµo lîng (A+T) cña nã. Mét ®iÒu cÇn lu ý vÒ måi lµ c¸c ®o¹n måi ph¶i ®ñ phøc t¹p ®Ó kh¶ n¨ng x¶y ra viÖc g¾n måi vµo c¸c tr×nh tù kh¸c mµ kh«ng ph¶i lµ tr×nh tù ®Ých ®îc chän tríc rÊt thÊp.
VÝ dô, kh¶ n¨ng b¾t gÆp A, G, C hay T trong mét tr×nh tù ADN cho tríc bÊt kú lµ 1/4; kh¶ n¨ng b¾t gÆp mét tr×nh tù dinucleotide bÊt kú (vÝ dô AG) lµ 1/16; cßn kh¶ n¨ng b¾t gÆp mét tr×nh tù 4 baz¬ cho tríc lµ 1/256. Do ®ã, mét tr×nh tù 16 baz¬ xÐt vÒ mÆt thèng kª sÏ cã x¸c suÊt cã mÆt lµ 1 trªn 416 (= 4 294 967 296, hay lµ kho¶ng h¬n 4 tØ). 416 baz¬ t¬ng ®¬ng víi kÝch thíc hÖ gen ngêi hay ng«, vµ lín gÊp 1000 lÇn so víi kÝch thíc hÖ gen cña E.coli. Do ®ã viÖc kÕt hîp mét oligonucleotide dµi h¬n 17 baz¬ víi tr×nh tù ®Ých cña nã lµ mét qu¸ tr×nh thùc sù ®Æc hiÖu, ®Æc hiÖu h¬n c¶ sù ®Æc hiÖu cña kh¸ng thÓ víi kh¸ng nguyªn. V× vËy mét ®o¹n måi dµi 17 baz¬ hay h¬n thêng ®îc dïng ®Ó khuÕch ®¹i tõ ADN thuéc hÖ gen cña thùc vËt vµ ®éng vËt. Måi qu¸ dµi cã thÓ ®ång nghÜa víi viÖc ngay c¶ nhiÖt ®é g¾n måi cao còng kh«ng ng¨n ngõa ®îc sù b¾t cÆp sai vµ g¾n måi kh«ng ®Æc hiÖu.
3.2. Mét sè nguyªn t¾c thiÕt kÕ tr×nh tù måi (theo Innis vµ GelfDNA, 1991).
i. Måi nªn dµi 17 - 28 baz¬.
ii. Thµnh phÇn cña c¸c baz¬ nªn cã 50 - 60% (G+C).
iii. Måi nªn cã ®Çu 3’ ë G hay C hay CG hay GC; ®iÒu nµy ng¨n ngõa viÖc “thë” (breathing) cña c¸c ®Çu vµ t¨ng hiÖu suÊt g¾n måi.
iv. NhiÖt ®é Tm tèt nhÊt lµ n»m trong kho¶ng 55 - 80oC.
v .ViÖc sö dông måi cã nhiÒu h¬n 3 G hay C ë ®Çu 3’ cã thÓ lµm t¨ng kh¶ n¨ng b¾t cÆp sai ë nh÷ng tr×nh tù giµu G hay C (do sù æn ®Þnh cña viÖc g¾n måi), nªn tr¸nh ®iÒu nµy.
vi . C¸c ®Çu 3’ cña c¸c måi kh«ng nªn bæ sung cho nhau (cô thÓ h¬n lµ kh«ng nªn b¾t cÆp baz¬ víi nhau), nÕu kh«ng th× c¸c dimer måi sÏ ®îc tæng hîp nhiÒu h¬n lµ c¸c s¶n phÈm kh¸c.
vii. Nªn tr¸nh dïng c¸c måi cã thÓ tù bæ sung cho nhau (nghÜa lµ kh¶ n¨ng h×nh thµnh cÊu tróc 2o nh c¸i thßng läng).
6.5 Dung dÞch ®Öm cho ph¶n øng.
Dung dÞch ®Öm thêng chøa:
+ Tris-HCl pH 8,3 10-50mM.
+ KCl kh«ng qu¸ 50 mM; MgCl2 1,5 mM hay cao h¬n.
+ Måi 0.2 - 1mM ®èi víi mçi måi.
+ 50 - 200m ®èi víi mçi dNTP.
+ Gelatin hay BSA ®Õn 100mg/ml.
+ Vµ/hoÆc thuèc tÈy kh«ng mang tÝnh ion vÝ dô Tween-20 hay Nonidet P40 hay Triton x-100 (0,05 - 0.1% nÕu dïng mét lo¹i nµo ®ã). (Innis vµ Gelfan, 1990).
C¸c c«ng thøc hiÖn ®¹i cã thÓ kh¸c mét c¸ch ®¸ng kÓ, nhng chóng thêng cã tû lÖ t¬ng ®¬ng.
Ngêi ta cho r»ng PCR lµm viÖc tèt nhÊt trong dung dÞch ®Öm phiªn m· ngîc (Krawet vµ céng sù, 19xx; Fuqua vµ ngêi kh¸c, 1990).
Nång ®é KCl hay NaCl cao h¬n 50mM sÏ øc chÕ Taq, nhng víi nång ®é thÊp, nã sÏ cÇn ®Ó gióp måi g¾n dÔ dµng h¬n.
Nång ®é ion Mg2+ ¶nh hëng ®Õn viÖc g¾n måi, nhiÖt ®é Tm cña khu«n, sù liªn kÕt gi÷a måi vµ khu«n; tÝnh ®Æc hiÖu cña s¶n phÈm, ho¹t ®éng vµ sù chÝnh x¸c cña enzyme. Taq cÇn Mg2+ tù do, do ®ã, cÇn ph¶i t¹o ra lîng khÊu hao cho dNTP’s, måi vµ khu«n, tÊt c¶ chóng ®Òu c« lËp cation, vµ trong sè ®ã th× dNTP’s cã nång ®é cao nhÊt, do ®ã, nång ®é Mg2+ nªn cao h¬n nång ®é dNTP 0,5 - 2,5mM. §èi víi mçi tæ hîp khu«n-måi míi, nång ®é Mg2+ thay ®æi nªn cÇn ph¶i ®Þnh lîng l¹i, v× nhu cÇu cña chóng sÏ kh¸c nhau ®¸ng kÓ thËm chÝ díi cïng ®iÒu kiÖn nång ®é vµ thêi gian hay nhiÖt ®é cña chu tr×nh.
Nång ®é ion Mg++ lµ thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu ®îc cña ph¶n øng PCR. Tuy nhiªn kh«ng cã mét qui luËt chung cho vÊn ®Ò nµy. Nång ®é tèi u ph¶i ®îc x¸c ®Þnh cho tõng ph¶n øng qua nhiÒu thö nghiÖm.
Mét sè enzyme kh«ng cÇn protein bæ sung, trong khi sè kh¸c l¹i phô thuéc vµo chóng. Mét vµi enzyme ho¹t ®éng tèt h¬n râ rÖt khi cã mÆt chÊt tÈy (detergent), cã thÓ bëi v× chÊt tÈy ng¨n c¶n xu híng tù nhiªn lµ co côm l¹i cña enzyme.
Nång ®é måi kh«ng nªn vît qu¸ 1mM trõ phi møc ®é tho¸i ho¸ cao; 0,2mM lµ ®ñ ®èi víi c¸c måi t¬ng ®ång.
Nång ®é nucleotide kh«ng cÇn nhiÒu h¬n 50mM ®èi víi mçi lo¹i; tuy nhiªn c¸c s¶n phÈm dµi cã thÓ cÇn nång ®é cao h¬n.
5. Thµnh phÇn dNDP
Bèn lo¹i nucleotide trong ph¶n øng PCR thêng ®îc sö dông ë d¹ng deoxynucleotide (dNTP’s bao gåm dATP; dGTP; dCTP vµ dTTP). Thêng ®îc sö dông ë nång ®é 20-200 mM / mçi lo¹i nucleotide. Nång ®é cao h¬n hay thÊp h¬n dÔ dÉn ®Õn sù t¹o nªn s¶n phÈm PCR gi¶. Sù mÊt c©n b»ng trong thµnh phÇn c¸c nucleotide l¹i lµm t¨ng c¸c lçi sao chÐp cña enzyme ADN polymerase.
6. Thêi gian
6.1. Thêi gian vµ nhiÖt ®é biÕn tÝnh:
Hai tr×nh tù bæ sung liªn kÕt víi nhau bëi liªn kÕt hydro gi÷a c¸c baz¬ bæ sung cña chóng (G víi C vµ A víi T hay U), h×nh thµnh ph©n tö m¹ch kÐp æn ®Þnh. Ph¶n øng PCR cÇn c¸c sîi ADN m¹ch ®¬n lµm khu«n, do ®ã nÕu ADN khu«n ban ®Çu kh«ng ph¶i lµ d¹ng sîi ®¬n, nh hÇu hÕt c¸c virus ARN, th× cÇn ph¶i lµm nãng nã ®Õn trªn “nhiÖt ®é nãng ch¶y” (melting temperature) cña d¹ng sîi kÐp hoÆc “nhiÖt ®é nãng ch¶y” cña mét phÇn d¹ng sîi kÐp. Råi sau ®ã lµm l¹nh nhanh nã. ViÖc lµm l¹nh nhanh lµ ®Ó ch¾c ch¾n c¸c sîi ®· ®îc lµm biÕn tÝnh, tøc lµ c¸c sîi ®· t¸ch nhau ra, kh«ng cßn liªn kÕt l¹i víi nhau n÷a. Ngoµi ra, nÕu acide nucleic ®îc ®un nãng trong dung dÞch ®Öm chøa c¸c ion cã nång ®é thÊp h¬n 150mM NaCl th× nhiÖt ®é nãng ch¶y th«ng thêng sÏ thÊp h¬n 100oC. §©y chÝnh lµ kho¶ng nhiÖt ®é lµm viÖc cña PCR, nhiÖt ®é biÕn tÝnh n»m trong kho¶ng tõ 91oC ®Õn 97oC.
Taq polymerase cã thêi gian b¸n huû ë 95oC lµ 30 phót. §©y chÝnh lµ lý do t¹i sao kh«ng nªn thùc hiÖn qu¸ 30 chu tr×nh khuÕch ®¹i. Tuy nhiªn còng cã thÓ gi¶m nhiÖt ®é biÕn tÝnh xuèng sau kho¶ng 10 chu tr×nh, khi mµ chiÒu dµi trung b×nh cña ADN ®Ých ®· gi¶m xuèng. VÝ dô, ®èi víi khu«n dµi kho¶ng 300 cÆp baz¬ hay ng¾n h¬n, nhiÖt ®é biÕn tÝnh cã thÓ ®îc gi¶m xuèng ®Õn 88oC cho khu«n chøa 50% (G+C) (Yap vµ McGee, 1991). §iÒu nµy ®ång nghÜa víi viÖc cã thÓ tiÕn hµnh ®Õn 40 chu tr×nh mµ kh«ng sî lµm gi¶m hiÖu suÊt cña enzyme.
“Thêi gian t¹i nhiÖt ®é” lµ nguyªn nh©n chÝnh cho sù biÕn tÝnh hay lµ bÊt ho¹t cña Taq. Do ®ã, nÕu ta cã thÓ gi¶m ®iÒu nµy, ta sÏ cã thÓ t¨ng sè chu tr×nh ph¶n øng mµ bÊt kÓ lµ nhiÖt ®é cã gi¶m hay kh«ng. Th«ng thêng, thêi gian biÕn tÝnh lµ 1 phót ë 94oC: ®èi víi nh÷ng tr×nh tù khu«n ng¾n thêi gian nµy cã thÓ ®îc gi¶m xuèng ®Õn 30 gi©y hay thÊp h¬n n÷a. Ngêi ta còng cã thÓ võa t¨ng nhiÖt ®é biÕn tÝnh, võa gi¶m thêi gian biÕn tÝnh: Innis vµ GelfDNA (1990) ®· ®Ò xuÊt thêi gian lµ 15 gi©y khi nhiÖt ®é lµ 96oC.
6.2 Thêi gian g¾n måi vµ viÖc thiÕt kÕ måi.
ChiÒu dµi vµ tr×nh tù måi lµ mét tham sè cã ý nghÜa v« cïng quan träng ®¶m b¶o sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i. NhiÖt ®é nãng ch¶y cña mét acide nucleic m¹ch kÐp t¨ng lªn theo chiÒu dµi cña nã còng nh lµ sè lîng (G+C). C«ng thøc ®¬n gi¶n ®Ó tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (temperature melting-Tm) cña mét ®o¹n DNA kÐp lµ:
Tm (oC) = 4(G + C) + 2(A + T)
Do ®ã, nhiÖt ®é g¾n måi (annealing temperature-Ta) cho mét ph¶n øng PCR nhÊt ®Þnh phô thuéc trùc tiÕp vµo thµnh phÇn vµ chiÒu dµi måi. NhiÖt ®é Ta nªn chän thÊp h¬n kho¶ng 5oC so víi nhiÖt ®é Tm thÊp nhÊt cña cÆp måi ®îc sö dông (Innis vµ GelfDNA, 1990). Rychlik vµ nhiÒu ngêi kh¸c (1990) ®· chØ ra c¸ch xö sù cña Ta. Hä cho r»ng nÕu t¨ng nhiÖt ®é Ta lªn 1oC sau mçi chu tr×nh th× tÝnh ®Æc hiÖu cña qu¸ tr×nh khuÕch ®¹i vµ sè lîng s¶n phÈm (1kb chiÒu dµi) ®Òu t¨ng lªn. Mét hÖ qu¶ cña viÖc sö dông nhiÖt ®é Ta qu¸ thÊp lµ mét hay c¶ hai ®o¹n måi l¹i g¾n vµo c¸c tr×nh tù kh¸c chø kh«ng ph¶i tr×nh tù ®Ých, do c¸c b¾t cÆp sai mét baz¬ hay sù g¾n måi mét phÇn. §iÒu nµy kh«ng g©y ¶nh hëng g× nÕu ta chØ khuÕch ®¹i c¸c tr×nh tù ®Ých th©n thuéc hoÆc t¬ng tù nhau. Tuy nhiªn, ®iÒu nµy cã thÓ dÉn ®Õn viÖc khuÕch ®¹i “kh«ng ®Æc hiÖu” vµ hËu qu¶ lµ sè lîng c¸c s¶n phÈm mong muèn bÞ gi¶m xuèng.
Mét hËu qu¶ cña viÖc sö dông nhiÖt ®é Ta qu¸ cao lµ rÊt Ýt s¶n phÈm ®îc t¹o ra do kh¶ n¨ng g¾n måi bÞ gi¶m xuèng. Mét ®iÒu quan träng kh¸c cÇn c©n nh¾c lµ mét cÆp måi víi nhiÖt ®é Ta kh«ng thÝch hîp sÏ kh«ng bao giê cho s¶n phÈm duy nhÊt víi sè lîng ®¸ng kÓ, vµ cßn cã thÓ dÉn ®Õn sù khuÕch ®¹i kh«ng ®èi xøng cã nghÜa lµ sù khuÕch ®¹i sîi ®îc g¾n måi hiÖu qu¶ h¬n.
Sù g¾n måi kh«ng thÓ diÔn ra trong thêi gian dµi: hÇu hÕt c¸c måi chØ g¾n hiÖu qu¶ ®îc trong 30 gi©y hay Ýt h¬n, trõ trêng hîp nhiÖt ®é Ta rÊt gÇn nhiÖt ®é Tm hoÆc c¸c måi dµi bÊt thêng.
H×nh trªn minh ho¹ ¶nh hëng cña nhiÖt ®é g¾n måi dÕn tÝnh ®Æc hiÖu vµ hiÖu suÊt khuÕch ®¹i cña papillomavirus ngêi type 16 (Human papillomavirus type 16, HPV-16) (Williamson vµ Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171).
Plasmide vµ khu«n DNA mÉu ®îc khuÕch ®¹i ë c¸c nhiÖt ®é g¾n måi kh¸c nhau nh ®· chØ ra ë trªn. Chó ý r»ng trong khi plasmide ®îc khuÕch ®¹i trong kho¶ng tõ 37oC ®Õn 55o C th× HPA, ADN chØ ®îc khuÕch ®¹i ®Æc hiÖu ë 50oC.
6.4 Thêi gian vµ nhiÖt ®é kÐo dµi m¹ch:
Th«ng thêng ngêi ta tiÕn hµnh ë 70oC - 72oC trong 0,5 ®Õn 3 phót. Trong khi ®ã, Taq ho¹t ®éng thùc sù ®Æc hiÖu ë 37oC, nhiÖt ®é rÊt gÇn víi nhiÖt ®é ho¹t ®éng cña ®o¹n Klenow cña E.coli DNA polymerase I. §©y qu¶ lµ mét nghÞch lý, lµm thÕ nµo mµ c¸c ®o¹n måi chØ g¾n vµo m¹ch khu«n ë nhiÖt ®é tèi u cña nã l¹i cã thÓ ®îc kÐo dµi ë nhiÖt ®é cao mét c¸ch ®¸ng kÓ nh vËy. C©u tr¶ lêi lµ sù kÐo dµi m¹ch x¶y ra ngay tõ khi b¾t ®Çu cã sù g¾n måi, thËm chÝ nÕu ®iÒu nµy chØ x¶y ra trong thêi gian rÊt ng¾n ngñi, th× nã còng dÉn ®Õn sù æn ®Þnh ®¸ng kÓ. Ho¹t ®éng nµy x¶y ra tèi u ë kho¶ng 70oC vµ sù më réng måi diÔn ra víi tèc ®é tèi ®a lµ 100 baz¬/gi©y. Thêi gian kho¶ng mét phót lµ ®ñ ®Ó sù khuÕch ®¹i tr×nh tù 2kb lµ ®¸ng tin cËy (Innis vµ GelfDNA, 1990). C¸c s¶n phÈm dµi h¬n th× cÇn thêi gian l©u h¬n: 3 phót cho s¶n phÈm 3kb hay dµi h¬n. ViÖc kÐo dµi thêi gian lµ cÇn thiÕt trong nh÷ng chu tr×nh cuèi khi mµ nång ®é s¶n phÈm vît qu¸ nång ®é enzyme (>1nM), vµ khi dNTP vµ/hoÆc sù suy gi¶m sè lîng måi cã thÓ trë nªn h¹n chÕ.
6.6 Sè chu tr×nh.
Sè lîng chu tr×nh cÇn thiÕt ®Ó t¹o ra b¨ng nh×n thÊy ®îc trªn gel phô thuéc phÇn lín vµo nång ®é ADN ®Ých ban ®Çu: Innis vµ GelfDNA (1990) ®Ò xuÊt khuÕch ®¹i 40 - 45 chu tr×nh ®èi víi 50 ph©n tö ®Ých, vµ 25-30 chu tr×nh cho 3x105 ph©n tö cïng nång ®é. Sù kh«ng t¬ng xøng nµy do c¸i gäi lµ hiÖu øng b»ng (plateau effect) g©y nªn. §©y lµ sù gi¶m tèc ®é t¨ng cña sù tÝch luü s¶n phÈm theo cÊp sè mò ë nh÷ng giai ®o¹n cuèi cña PCR, khi mµ nång ®é s¶n phÈm ®¹t ®Õn 0,3 - 1,0 nM. Cã thÓ sù ph©n r· cña c¸c chÊt ph¶n øng (dNTPs, enzyme), sù depletion cña chÊt ph¶n øng (måi, dNTPs - c¸i ®Çu lµ trôc trÆc ®èi víi c¸c s¶n phÈm ng¾n, c¸i sau lµ trôc trÆc ®èi víi c¸c s¶n phÈm dµi), sù øc chÕ ®Çu s¶n phÈm (end-product) (sù h×nh thµnh Pyrophosphate), sù c¹nh tranh cña c¸c s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu víi chÊt tham gia ph¶n øng, sù c¹nh tranh cña viÖc t¸i g¾n måi cña c¸c s¶n phÈm nång ®é cao (10nM) víi viÖc g¾n måi (Innis vµ GelfDNA, 1990).
NÕu s¶n phÈm mong muèn kh«ng ®îc t¹o ra sau 30 chu tr×nh, tèt h¬n lµ lÊy mét mÉu nhá (1ml) cña hçn hîp ®· khuÕch ®¹i lµm hçn hîp ph¶n øng míi, ®em khuÕch ®¹i 20-30 lÇn chø kh«ng nªn tiÕp tôc ch¹y thªm nhiÒu chu tr×nh. Trong mét sè trêng hîp khi mµ nång ®é khu«n h¹n chÕ, ®iÒu nµy cã thÓ t¹o ra s¶n phÈm tèt trong khi viÖc tiÕp tôc chu tr×nh ®Õn 40 lÇn hay h¬n kh«ng lµm ®îc.
Mét biÕn sè quyÕt ®Þnh sè lîng chu tr×nh lµ PCR måi lµm tæ. Sù khuÕch ®¹i PCR ®îc thùc hiÖn víi mét tËp hîp c¸c måi, sau ®ã s¶n phÈm nµo ®ã ®îc lÊy ra - cã hay kh«ng cã sù bá thuèc thö- ®Ó khuÕch ®¹i l¹i, vãi tËp hîp c¸c måi n»m bªn trong, hay cßn gäi lµ måi lµm tæ. Qu¸ tr×nh nµy lµm t¨ng møc ®é cña tÝnh ®Æc hiÖu, cã nghÜa lµ tÊt c¶ c¸c s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu ®îc khuÕch ®¹i trong lÇn ch¹y ®Çu tiªn sÏ kh«ng ®îc khuÕch ®¹i trong lÇn ch¹y thø hai. §iÒu nµy ®îc minh ho¹ nh sau:
Thêi gian cho mét chu kú khëi ®Çu môc ®Ých bung liªn kÕt cña chuçi xo¾n kÐp ADN lµ kh«ng vît qu¸ 5 phót. §èi víi 25-40 chu kú tiÕp theo, thêi gian cho giai ®o¹n 1 (bung liªn kÕt ) lµ 10 gi©y – 2 phót; thêi gian cho giai ®o¹n 2 (måi b¸m) kh«ng qu¸ nhanh hoÆc qu¸ l©u, th«ng thêng díi 1 phót; thêi gian cho giai ®o¹n 3 (tæng hîp) tuú thuéc vµo ®é dµi vïng ADN cÇn nh©n lªn, n._.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 35573.doc