Thu nhận và mô tả đặc tính của Enzyme Chitosanasse từ Vi khuẩn Bacilus Licheniforrmis NN1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------
--------- NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NHUNG THU NHẬN VÀ MÔ TẢ ðẶC TÍNH CỦA ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS NN1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I ---------
--------- NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NHUNG THU NHẬN VÀ MÔ TẢ ðẶC TÍNH CỦA ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS NN1 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Mã số: 60.54.10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ XUÂN MẠNH HÀ NỘI - 20112 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện khoá luận này ñã ñược cảm ơn và các thông tin ñược trích dẫn trong khoá luận này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Nhung Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự ñộng viên và giúp ñỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh, Trưởng khoa - Khoa công nghệ thực phẩm - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ, tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô trong Khoa Công nghệ thực phẩm, Khoa công nghệ sinh học, Viện ñào tạo sau ñại học trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội, ths. Nguyễn ðức Hạnh - Viện nghiên cứu rau quả ñã tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Mặc dù ñã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của tôi không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế. Vì vậy tôi kính mong nhận ñược sự góp ý, chỉ bảo của thầy cô ñể giúp tôi có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả sau khi ra trường. Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và tất cả bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 28 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Nhung Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN..........................................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................................ii MỤC LỤC.....................................................................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................................................. vii DANH MỤC BẢNG...............................................................................................................................viii DANH MỤC HÌNH VÀ ðỒ THỊ...........................................................................................................ix PHẦN MỘT: MỞ ðẦU.............................................................................................................................1 1.1. ðặt vấn ñề................................................................................................................................................1 1.2. Mục ñích và yêu cầu.............................................................................................................................2 1.2.1. Mục ñích...............................................................................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu.................................................................................................................................................2 PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................................3 2.1. Khái niệm enzyme chitosanase...........................................................................................................3 2.2. Một số ñặc tính của enzyme chitosanse.............................................................................................3 2.2.1. Khối lượng phân tử.............................................................................................................................3 2.2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase.........................................................................................4 2.2.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase.............................................................................5 2.2.4. Ảnh hưởng nhiệt ñộ và pH tới sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase..........................6 2.2.5. Ảnh hưởng của ion kim loại ñến hoạt tính của enzyme chitosanse ..................................7 2.3. Ứng dụng của enzyme chitosanse và chitosan oligosaccharide....................................................8 2.3.1. Ứng dụng của chitosanase.................................................................................................................8 2.3.2. Ứng dụng của chitosan oligosaccharide.........................................................................................9 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iv 2.4. Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase.................................................................................... 17 2.4.1. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme chitosanase..................................................................... 17 2.4.1.1. Các nguồn vi sinh vật ñã ñược nghiên cứu trong sản xuất chitosanase.............................. 17 2.4.1.2. Vi khuẩn Baccilus lichenifomis.................................................................................................. 19 2.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật21 2.4.2.1. Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường...................................................................... 21 2.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy............................................................................................ 24 2.4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường......................................................................................... 25 2.4.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy................................................................................. 26 2.4.3. Một số phương pháp sử dụng trong thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase................. 27 2.5. Các nghiên cứu chitosan, COS, chitosanase ở Việt Nam............................................................ 29 PHẦN BA: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 31 3.1. Vật liệu.................................................................................................................................................. 31 3.1.1. ðối tượng........................................................................................................................................... 31 3.1.2. Vật liệu............................................................................................................................................... 31 3.1.3. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................................................... 31 3.1.4. ðịa ñiểm nghiên cứu....................................................................................................................... 32 3.2. Quy trình thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1................. 32 3.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................................... 32 3.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................................... 33 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm...................................................................................................... 33 3.4.2.Các phương pháp nuôi cấy và làm sạch enzyme........................................................................ 35 3.4.2.1. Giữ giống và bảo quản giống..................................................................................................... 35 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. v 3.4.2.2. Nuôi cấy......................................................................................................................................... 35 3.4.2.3. Xác ñịnh ñường cong sinh trưởng của vi khuẩn..................................................................... 35 3.4.2.4. Làm sạch enzyme chitosanase................................................................................................... 36 3.4.2.5. Phương pháp ñiện di.................................................................................................................... 37 3.4.3. Các phương pháp phân tích ........................................................................................................... 38 3.4.3.1. Xác ñịnh hoạt tính enzyme chitosanase.................................................................................... 38 3.4.3.2. Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein............................................................................... 39 3.4.4. Các phương pháp xác ñịnh tính chất của enzyme..................................................................... 39 3.4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới hoạt tính của enzyme..................................................... 39 3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới tính ổn ñịnh của enzyme............................................... 39 3.4.4.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tính của enzyme............................................. 39 3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................................................. 39 PHẦN BỐN: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................... 40 4.1. Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ñể sinh tổng hợp cao chitosanase ................................................................................................................................................... 40 4.1.1. Kết quả thực nghiệm thăm dò ñơn yếu tố................................................................................... 40 4.1.2. Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................ 41 4.1.3 Xác ñịnh ñường cong sinh trưởng của vi khuẩn......................................................................... 49 4.2.Tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1................................................. 50 4.2.1. Làm sạch sơ bộ bằng phương pháp tủa muối amoni sunphate............................................... 50 4.2.2. Làm sạch bằng phương pháp sắc ký trao ñổi ion....................................................................... 52 4.2.3. Kết quả ñiện di sau các bước làm sạch dịch enzyme chitosanase................................ 54 4.3. Một số tính chất của enzyme chitosanase....................................................................................... 55 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vi 4.3.1. Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính của enzyme chitosanase............................................................. 55 4.3.2. Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính của enzyme chitosanase.................................................... 56 4.3.3. Ảnh hưởng pH và nhiệt ñộ ñến ñộ bền của enzyme chitosanase........................................... 56 4.3.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tính của enzyme chitosanase.......................... 57 PHẦN NĂM: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ......................................................................................... 59 5.1. Kết luận................................................................................................................................................. 59 5.2. ðề nghị.................................................................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................................... 60 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ COS Chitosan oligosaccharide DA Degree of deacetylation DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisilic GlcN D- Glucosamine GlcNAc N- acetyl-D- Glucosamine Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khối lượng phân tử của chitosanase từ một số nguồn vi sinh vật.... 3 Bảng 2.2. Phân loại enzyme chitosanase dựa vào kiểu phân cắt ...................... 4 Bảng 2.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của chitosanase từ Bacillus sp. strain KCTC 0377BP.. 5 Bảng 2.4. pH và nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt ñộng của một số enzyme ......................... 7 Bảng 2.4. Một số chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase ñã ñược nghiên cứu .... 18 Bảng 2.5. ðiều kiện nhiệt ñộ và pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh vật sinh chitosanase ................................................................................. 26 Bảng 3.2. Ma trận kế hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai của Doehlert...... 34 Bảng 3.3. Thành phần bản ñiện di theo phương pháp Schägger và Von Jagow (1987).37 Bảng 4.1. Bố trí thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai của Doehlert .... 42 Bảng 4.2. Kết quả của các thực nghiệm trong ma trận thực nghiệm.............. 43 Bảng 4.3. Hệ số của phương trình hồi quy ..................................................... 44 Bảng 4.4 Bảng biến mã và biến thực tương ứng của ñiều ñiện nuôi cấy tối ưu ..... 48 Bảng 4.5. Hoạt tính của enzyme sau quá trình tủa muối và lọc muối ............ 51 Bảng 4.6. Hoạt tính của enzyme chitosanase sau quá trình sắc ký trao ñổi ion.... 53 Bảng 4.7. Hoạt tính của enzyme sau quá trình sắc ký trao ñổi ion lần hai ......... 54 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase ............. 55 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới hoạt tính xúc tác của enzyme ............. 56 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. ix DANH MỤC HÌNH VÀ ðỒ THỊ Hình 2.1 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase ............................................ 5 Sơ ñồ 2.1. Các phương pháp sản xuất chitosanase .......................................... 8 ðồ thị 4.1. Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 .................................................................. 40 ðồ thị 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 .............................................................. 40 ðồ thị 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 .............................................................. 41 ðồ thị 4.4. Sự tác ñộng của nhiệt ñộ (X1) và pH (X2) tới hoạt tính chitosanase khi nồng ñộ chitosan (X3) là tâm.................................................................... 45 ðồ thị 4.5. Sự tác ñộng của nồng ñộ chitosan (X3) và pH (X2) tới hoạt tính chitosanase khi nhiệt ñộ (X1) là tâm............................................................... 46 ðồ thị 4.6. Sự tác ñộng của nồng ñộ chitosan (X3) và nhiệt ñộ (X1) tới hoạt tính chitosanase khi pH (X2) là tâm................................................................ 47 ðồ thị 4.7. ðường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus lichenifomis ...... 49 Hình 4.8. Sắc ký ñồ của sự loại muối trên cột Sephadex G25........................ 51 Hình 4.9. Sắc ký ñồ chitosanase trên cột trao ñổi ion CMFF ........................ 52 Hình 4.10. Sắc ký ñồ pic 2 trên cột trao ñổi ion CMFF ................................. 53 Hình 4.11. ðiện di ñồ protein chitosanase qua các bước làm sạch ............... 54 ðồ thị 4.12. Ảnh hưởng của pH và nhiệt ñộ ñến ñộ bền của enzyme chitosanase ...................................................................................................... 57 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 1 PHẦN MỘT: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Trong công nghệ thực phẩm, các chất phụ gia càng ngày càng bị người tiêu dùng dè dặt, do vậy các hợp chất saccharide tự nhiên như prebiotics hay các chất bảo quản sinh học oligosaccharide ñang rất ñược quan tâm. Oligosaccharide là các polymer của các monosaccharide có mức ñộ polymerization (DP) từ 2 -10 (hay từ 3 -10 theo danh pháp IUB-IUPAC) và cả các DPs từ 20-25 cũng thường ñược xếp vào nhóm này. Prebiotic oligosaccharide là các thành phần chống sâu răng, không bị tiêu hóa, có năng lượng thấp hay tăng cường sự phát triển của hệ sinh vật ñường ruột như các vi khuẩn probiotic.Theo theo thống kê hiện nay các dòng sản phẩm chức năng ñang ñược thương mại hóa trên toàn thế giới với doanh số hơn 33 tỉ USD và giữ vai trò quan trọng như các sản phẩm probiotic, chất xơ, ñường alcohol, peptids, các chất béo không bão hòa. Một trong các oligomer ñang ñược quan tâm ñặc biệt hiện nay là các chitosan oligosaccharide (COS) hay các chitosan khối lượng phân tử nhỏ (LMMC). Ngoài những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm như một chất phụ gia, kháng khuẩn, COS còn có nhiều ñặc tính sinh học quan trọng như khả năng kháng oxi hóa, chống ung thư, làm lành vết thương, vv... COS là sản phẩm thủy phân từ chitosan một chất tạo ra sau quá trình deacetyl hóa từ chitin - một polymer sinh học có nhiều trong vỏ các loại sinh vật biển, sinh vật giáp xác như tôm, cua. COS có thể ñược thu nhận bằng phương pháp hoá học và phương pháp vật lý, nhưng do chi phí lớn, hiệu suất thấp, sản phẩm có hoạt tính không cao nên phương pháp sinh học sử dụng các enzyme thủy phân chitosan là phương pháp Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 2 ñang ñược áp dụng. Các enzyme có thể dùng như: papain, hemicellulase, cellulase, lipase ...tuy nhiên hiệu quả nhất là enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase thu nhận ñược từ vi khuẩn, nấm, một số thực vật, ñộng vật…. Nhưng chitosanase thu nhận từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm thường có hoạt tính cao hơn và ñặc biệt có ưu thế trong sản xuất công nghiệp. Do vậy, chúng tôi thực hiện ñề tài: “Thu nhận và mô tả ñặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1" 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục ñích Nuôi cấy, thu nhận, làm sạch enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 và xác ñịnh một số các ñặc tính của enzyme này. 1.2.2. Yêu cầu - Xác ñịnh và xây dựng quy trình nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 sinh tổng hợp cao enzyme chitosanase. - Lựa chọn ñiều kiện thu nhận enzyme chitosanase thô và tinh chế ñể thu nhận chitosanase tinh sạch. - Xác ñịnh một số ñặc tính của enzyme chitosanase. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 3 PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái niệm enzyme chitosanase Enzyme chitosanase có danh pháp quốc tế: (Chitosan N - acetylglucosaminohydrolase - EC 3.2.1.132), là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân chitosan bằng cách cắt ñứt các liên kết β-1,4-glycoside giải phóng ra các chitosan oligosaccharide. Hoạt tính của chế phẩm enzyme ñặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải chitosan thành các COS có khối lượng phân tử thấp hơn. 2.2. Một số ñặc tính của enzyme chitosanse 2.2.1. Khối lượng phân tử Chitosanase hầu hết là các enzyme ngoại bào, có cấu tạo ñơn phân tử, khối lượng phân tử khoảng từ 30 – 90kDa. Khối lượng phân tử của enzyme chitosanase sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Bảng 2.1. Khối lượng phân tử của chitosanase từ một số nguồn vi sinh vật Nguồn Chitosanase Khối lượng phân tử - Bacillus circulans 31 kDa - Streptomyces griceus HUT 6037 34 kDa - Acinebacter sp. Strain CHB101 ( chitosanase I và II) 37 kDa 34 kDa - Bacillus megaterium P1 43 kDa - Sphingomonas sp. CJ-5 45 kDa - Bacillus sp. KCTC 0377BP 45 kDa - Bacillus cereus 47 kDa - Bacillus sp.16 45 kDa - Streptomyces cyaneogriseus 46 kDa - Aeromonas sp. HG08 70 kDa - Gongnella sp. JG 90 kDa - Trichoderma reesei PC-3-7 93 kDa Nguồn: [29, 17, 43, 45, 14, 28, 39, 26, 13, 49] Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 4 2.2.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase Dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase, chitosanase phân thành 3 loại: loại I, loại II, loại III Bảng 2.2. Phân loại enzyme chitosanase dựa vào kiểu phân cắt Chitosanases Kiểu phân cắt ðặc ñiểm Loại I -Bacillus pumilus BN-262 -Penicillium islandicum Streptomyces sp. N174 Phân cắt liên kết GlcNAc – GlcN và GlcN – GlcN. Loại II -Bacillus sp. No 7-M Phân cắt liên kết GlcN – GlcN Loại III -Streptomyces griseus HUT 6037 -Bacillus circulans MH-K1 -Nocardia orientalis -Bacillus circulans WL-12 Phân cắt liên kết GlcN – GlcNAc và GlcN – GlcN Nguồn: [53] Theo Fukamizo (1999) ñã xác ñịnh ñược các sản phẩm dị vòng thu ñược từ quá trình thuỷ phân chitosan ñều là dạng α, ñiều ñó cho thấy rằng chitosanase là một enzyme chuyển hoá. Cùng với những kết quả thu ñược khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến ñổi cho phép kết luận rằng ñầu Glu22 hoạt ñộng như là nơi cho proton, trong khi ñầu Asp40 hoạt hoá 1 phân tử nước sau ñó tấn công vào vị trí C-1 của phân tử ñường khử tại vị trí xúc tác. Cơ chế chuyển hoá này ñược duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 ñầu xúc tác có khoảng cách 13,8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å [55]. Cơ chế xúc tác của chitosanase ñược thể hiện trong hình sau: : GlcNAc : GlcN Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 5 Hình 2.1 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 2.2.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase Trong các ñối tượng vi sinh vật ñã ñược nghiên cứu thì chitosanase thường thể hiện hoạt tính cao nhất với chitosan hòa tan, còn ñối với một số cơ chất khác như: COS, dịch keo chitin, carboxymethyl cellulose (CMC) và peptidoglucan thì enzyme chitosanase thường thể hiện hoạt tính thấp hơn hoặc không thể hiện hoạt tính, ñiều này cũng phụ thuộc vào các nguồn thu nhận vi sinh vật khác nhau. Bảng 2.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của chitosanase từ Bacillus sp. strain KCTC 0377BP Cơ chất Hoạt tính tương ñối (%) Chitobiose, Chitotriose Chitotetraose Chitopentaose - 15,0 16,8 Chitosan hoà tan 100 Dịch keo chitin 2,8 CMC 2,5 Peptidoglycan - Tinh bột hoà tan - Nguồn: [45] Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 6 Mặt khác, hoạt tính của chitosanase còn phụ thuộc vào mức ñộ deacetyl hóa của chitosan hòa tan nhưng các chitosanse có nguồn gốc khác nhau thì sự phụ thuộc này là khác nhau. Ví dụ như hoạt tính 2 chitosanase từ Aspergillus fumigatus KB-1 thể hiện hoạt tính tăng dần theo mức ñộ tăng của acetyl hóa của chitosan và ñạt hoạt tính cao nhất khi mức ñộ acetyl hóa là 100% [37] nhưng với chitosanase thu từ Acinetobacter sp. Strain CHB101 thì enzyme có hoạt tính cao nhất khi sử dụng chitosan chỉ với mức deacetyl hóa là 20% với chitosanase I nhưng với chitosanase II thì có hoạt tính cao nhất lại là với glycol chitin [27]. 2.2.4. Ảnh hưởng nhiệt ñộ và pH tới sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase Tính bền nhiệt và nhiệt ñộ tối ưu cho sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein nên nó chịu ảnh hưởng rất lớn của nhiệt ñộ. Với vai trò là chất xúc tác thì khi nhiệt ñộ tăng sẽ làm gia tăng tốc ñộ phản ứng, nhiệt ñộ cho chitosanase hoạt ñộng trong khoảng 30-70oC và ña số hoạt ñộng tốt nhất ở 40-60oC. Nhiệt ñộ tối ưu của chitosanase khác nhau tùy theo nguồn thu enzyme và có thể thay ñổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng. Nhưng do bản chất protein nên enzyme lại dễ dàng biến tính do nhiệt ñộ môi trường. Nhìn chung chitosanase khá ổn ñịnh khi nhiệt ñộ dưới 60oC và bị bất hoạt khi nhiệt ñộ tăng trên 70oC (trừ một số enzyme chịu nhiệt). Tính ổn ñịnh và pH tối ưu cho sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase ðộ pH ảnh hưởng rất lớn tới khả năng phản ứng của enzyme, pH thích hợp cho hoạt ñộng của chitosanase khoảng 4,0 - 8,0 và giá trị pH tối ưu cho enzyme hoạt ñộng cũng khác nhau giữa các nguồn thu enzyme. Khi xét tính ổn ñịnh của enzyme trong các dung dịch ñệm có pH khác nhau thấy rằng chitosanase có tính ổn ñịnh trong những khoảng pH xác ñịnh thường từ 4 – 9, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 7 ñiều này cũng phụ thuộc vào từng nguồn thu enzyme, thời gian ủ và loại ñệm sử dụng. Bảng 2.4. pH và nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt ñộng của một số enzyme Nguồn thu enzyme pH tối ưu Nhiệt ñộ tối ưu Aspergillus fumigatus KB-1 Chitosanase I Chitosanase II 8,5 5,5 80 70 Trichoderma reesei PC-3-7 4,5 50 Streptomyces griseus HUT 6037 6 60 Gongronella sp.JG 4,6 - 4,8 50 Bacillus sp. Strain CK4 6,5 60 Bacillus sp. Strain KCTC 0377BP 4,0 - 6,0 60 Bacillus sp. P16 5,5 60 Nguồn: [37, 26, 17, 39] 2.2.5. Ảnh hưởng của ion kim loại ñến hoạt tính của enzyme chitosanse Các ion kim loại là những yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme, nó có thể làm tăng hoạt tính lên nhiều lần nhưng cũng có thể làm bất hoạt hoàn toàn, ñiều này có ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng sản xuất và tránh các yếu tố làm bất hoạt enzyme từ dụng cụ, thiết bị… Theo một số nghiên cứu, các ion Ca2+ , Mg2+, Mn2+ có khả năng làm tăng hoạt tính của enzyme chitosanase, trong khi ñó các ion Hg2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Ag+ , Fe3+ , Ni2+, Pb2+, Sn2+, ức chế hoạt tính của enzyme này. Tuy nhiên khả năng bất hoạt không như nhau với các enzyme từ các nguồn khác nhau và nồng ñộ các ion khác nhau cũng ảnh hưởng khác nhau. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 8 2.3. Ứng dụng của enzyme chitosanse và chitosan oligosaccharide 2.3.1. Ứng dụng của chitosanase ðể thủy phân chitosan tạo COS hiện nay có thể sử dụng 3 nhóm phương pháp cơ bản: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Các nhóm phương pháp ñược thể hiện ở sơ ñồ dưới ñây: Sơ ñồ 2.1. Các phương pháp sản xuất chitosanase Trong các phương pháp này thì phương pháp vật lý sử dụng các tia bức xạ như tia UV, γ, sóng siêu âm, tia viba, xử lý nhiệt, phương pháp này hứa hẹn khả năng tái sử dụng cao tài nguyên sinh học, giảm ô nhiễm môi trường. Trong phương pháp hóa học, có thể sử dụng các acid và các gốc tự do. Các acid ñể thủy phân chitosan như hydrochloric acid (Horowitz et al., 1957), nitric acid (Tømmeraas et al., 2001) và phosphoric acid (Jia and Shen, 2002). Nhưng phương pháp này phải sử dụng một lượng acid lớn, hiệu suất thấp, tạo lượng lớn monomer, ñồng thời tạo ra chất ñộc và chất thải lớn. Một số kết quả nghiên cứu khác thực hiện thủy phân chitosan bằng các gốc tự do như Chitin Depolymeration Phương pháp sinh học Phương pháp hóa học Phương pháp vật lý • Acids (HCl, HNO3, etc.) • Free radicals (H2O2, K2S2O8) Deacetyl Chitosan • Radiations (UV,γ) • Ultrasound • Microwave • Thermal treatments • Chitosanase • Non-specific enzymes (Lipase, protease, lypozyme, cacbohydrase) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 9 hydrogen peroxide (H2O2) (Nordtveit, Varum, and Smidsord, 1994), Cu (II) cùng hệ thống UV - H2O2 (Tanioka et al., 1996) [23]. Song có thể thấy cả phương pháp vật lý hay hóa học cần có những yêu cầu nghiêm ngặt về thiết bị và vận hành, ñiều này làm cho chi phí sản xuất cao, xây dựng hay mở rộng quy mô sản xuất là rất khó khăn. Do vậy, phương pháp ñang ñược sử dụng hiện nay là phương pháp sinh học sử dụng các nguồn enzyme có khả năng thủy phân chitosan. Có rất nhiều loại enzyme có thể thủy phân chitosan như: cellulase, pectinase, lipase và papain…(Pantaleone et al., 1992; Yalpani et al., 1994), cellulose (Muraki et al., 1993), papain (Terbojevich et al.,1996; Lin et al., 2002), lipase (Muzzarelli et al., 1995), pectinase (Shin et al., 1998; Shin et al., 2001; Kittur et al., 2003a; Kittur et al., 2003b), glycosidase (Zhang and Neau, 2001) và hỗn hợp của cellulase, α-amylase và protease (Zhang et al., 1999). Tuy nhiên khả năng thủy phân của những enzyme này không cao, phải dùng một lượng lớn enzyme với thời gian phản ứng dài. Enzyme hiệu quả nhất cho việc thủy phân chitosan là chitosanase [30]. 2.3.2. Ứng dụng của chitosan oligosaccharide * Ứng dụng trong y học của chitosan oligosaccharide Chitosan ñã ñược nghiên cứu khá rộng rãi và thể hiện những ñặc tính vô cùng quý giá như: khả năng thích ứng sinh học, khả năng phân hóa sinh học, tính không gây ñộc, giảm ñau, kháng u, cầm máu, giảm cholesterol, kháng khuẩn, kháng oxi hóa,... Các hoạt tính sinh học này quyết ñịnh bới 3 yếu tố quan trọng nhất là: mức ñộ deacetyl hóa; khối lượng phân tử và sự phân bố của các nhóm acetyl trong phân tử. COS là sản phẩm của quá trình thủy phân chitosan nên nhìn chung các ñặc tính sinh học của chitosan hầu hết ñều thể hiện trên COS. Tuy nhiên do khối lượng phân tử của COS nhỏ hơn rất nhiều so với chitosan tức Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 10 nó thay ñổi yếu tố quan trọng là khố._.i lượng phân tử, chính ñiều này ñã làm thay ñổi mức ñộ thể hiện các ñặc tính cũng như tạo nên những cải tiến và tính chất mới cho COS. Khả năng ñiều hòa miễn dịch và kháng ung thư Oligochitosan gồm chitohexaose thể hiện khả năng kích thích giải phóng interleukin 1β (IL-1β) - một chất làm tăng tính chống khuẩn của bạch cầu và necrosis factor-alpha (TNF-α) - một yếu tố liên quan ñến quá trình hoại tử của các ñại thực bào in vitro (Feng et al, 2004). Một số nghiên cứu cho thấy chức năng ñiều hòa miễn dịch các polysaccharide là do sự kết hợp của chúng và cơ quan thụ cảm trên bề mặt tế bào bạch cầu, cụ thể là thụ quan III (CR3). Tuy nhiên, cơ chế miễn dịch mới chỉ nghiên cứu trên các COS có mức ñộ depolymerization cao ((GLcN) 5 và (GLcN) 6 ) [21]. Khả năng kháng khối u của chitosan và COS cũng ñược giải thích do khả năng kích thích tự miễn dịch của cơ thể. Jeon và Kim ñã thực hiện các thí nghiệm in vitro và in vivo trên chuột khi cho chúng ăn chitosan có khối lượng phân tử thấp (LMMC) cho thấy khả năng kháng di căn của ung thư biểu mô phổi Lewis. Một số nghiên cứu cũng cho thấy sự kích thích miễn dịch của chitin và các dẫn xuất của chúng liên quan ñến sự tăng sinh lymphokines, hoạt tính này tăng với các dẫn xuất có khối lượng phân tử nhỏ [19]. Cũng một kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy, những con chuột ñược ñiều trị bằng COS sẽ kích hoạt và ñiều chỉnh các thành phần của hệ thống miễn dịch, ñẩy nhanh các phản ứng trung gian như phản ứng oxygen và NO. Các COS có thể trực tiếp tiêu diệt mầm bệnh vi sinh vật hay các tế bào u bằng cách tăng cường miễn dịch hay các hoạt ñộng gây ñộc cho tế bào và sau ñó ức chế sự sản xuất tế bào khối u bằng cách kích hoạt tế bào T (T-cells), Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 11 tế bào NK (NK-cells) và một số tế bào miễn dịch khác thông qua một vài cytokines như IL-1 và TNF-α [21]. Giảm cholesterol Có nhiều giả thuyết giải thích khả năng làm giảm cholesterol của chitosan cũng như các dẫn xuất của chúng. Ví dụ như: tính nhớt của dung dịch polysaccharide giống như một cái bẫy hấp phụ chất béo và cholesterol; sự có mặt của các nhóm amino trong cấu trúc phân tử tạo lực hút giữa phân tử chitosan và các cơ chất mang ñiện âm như các acide béo và các acide mật. Muzzarelli et al. (2006) ñã chỉ ra sự hình thành các muối không tan của chitosan với acid mật cho phép tập hợp các phân tử cholesterol và các lipid. Sự tương tác giữa chitosan và các anion hoạt ñộng bề mặt phospholipid, acid mật phụ thuộc vào 3 nhóm hoạt ñộng của chúng: nhóm amino ở vị trí C2, nhóm hydroxyl ở C3, C6. Thonggam et al. (2004) cũng ñưa ra những thông tin về sự hình thành các cụm giống như micell khi chitosan liên kết với các acid mật. Một giả thuyết khác về sự hấp phụ của chitosan tới bề mặt các lipid chuyển thành thể sữa, tạo nên lớp bảo vệ ngăn enzyme lipase ñi vào thực hiện quá trình thủy phân (Ogawa et a.l, 2003). Trong một nghiên cứu, chitosan ñược chiếu xạ và siêu âm tạo ra 5 loại chitosan có khối lượng phân tử từ 25 - 400 kDa (LMMC). Các mẫu cho thấy khả năng gắn chất béo trong quá trình tiêu hóa tăng khi khối lượng phân tử chitosan giảm (Czechowska et al., 2005). Kết luận này cũng ñược khẳng ñịnh trong nghiên cứu của Zeng L et al. (2008), ñiều này giải thích là do chitosan có phân tử lớn khó hấp thụ vào máu hơn các COS - có khối lượng phân tử nhỏ sẽ hấp thu nhanh hơn và ñi tới ñược các bộ phận [19]. Khả năng kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của chúng ñã ñược phát hiện và ñược coi là một trong những ñặc tính sinh học quan trọng nhất. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 12 Nghiên cứu ñầu tiên của Allan và Hadwiger (1979) ñã khẳng ñịnh khả năng kháng khuẩn rộng của chitosan và các dẫn xuất của chúng. Kể từ ñó rất nhiều những nghiên cứu ñã ñược thực hiện kết luận khả năng này của chitosan và các dẫn xuất của chúng trên vi khuẩn, nấm mốc và nấm men. Các nghiên cứu ñều chỉ ra khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố: khối lượng phân tử, mức ñộ deacetyl hóa, loại vi sinh vật và các ñiều kiện môi trường thử nghiệm. Trong ñó mức ñộ depolymerization là yếu tố quan trọng nhất ñược khảo sát mà cho ñến nay các kết quả này vẫn còn tranh cãi. Hoạt tính kháng khuẩn của sáu chitosan oligomer với khối lượng phân tử khác nhau ñược kiểm tra trên bốn vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas fluoresens, Salmonella typhimurium, và Vibrio parahaemolytius) và bảy vi khuẩn Gram dương (Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, and Lactobacillus bulgaricus) (No et al., 2002) cho thấy: chitosan thể hiện tính kháng vi khuẩn cao hơn so với các oligomer và kìm hãm rõ rệt sự phát triển trên các vi khuẩn nghiên cứu. Hirano và Nagao (1989) khi nghiên cứu mối quan hệ của khối lượng chitosan tới các yếu tố gây bệnh trên cây trồng chỉ ra rằng các chito oligosaccharide có khả năng kìm hãm cao sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum, Phomopsis fukushi và Alternaria alternata hơn chitosan có khối lượng phân tử cao, hiệu quả kháng nấm này cũng cao hơn khi tăng mức ñộ deacetyl hóa. Kết luận này cũng ñược khẳng ñịnh trong nghiên cứu sau ñó của Jong & Kim (2000, 2001) khi sản xuất và phân tách ba loại COS có khối lượng phân tử 5000 - 10000 Da cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất với các mầm bệnh, và các COS có mức ñộ depolymer từ 3-6 cho hoạt tính kháng E. coli tăng khi tăng nồng ñộ COS và ở nồng ñộ 0.5% COS thì kìm hãm hoàn toàn sự phát triển của E.coli [24]. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 13 ðể giải thích cho khả năng kháng khuẩn của chitosan và COS cũng có nhiều giả ñịnh: Do tương tác ion giữa các nhóm tích ñiện dương của chitosan và các nhóm tích ñiện âm ở màng tế bào vi sinh vật, làm phá vỡ màng tế bào (He lander et al., 2001); chúng tác ñộng như tác nhân gắp ñối với một số kim loại, can thiệp vào sự hình thành các ñộc tố và sự phát triển của vi sinh vật (Cuero et al., 1991); COS có phân tử nhỏ hơn nên chúng còn dễ dàng thâm nhập qua màng tế bào, tương tác với DNA trong tế bào chất dẫn ñến sự sao chép bị lỗi, kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật [30]. Khả năng kháng virus Chitosan và COS có khả năng ngăn cản sự xâm nhiễm của virus trong các hệ thống sinh học khác nhau. Các nghiên cứu trên cây trồng cho thấy xử lý chitosan trên bề mặt lá làm giảm sự hoại tử cục bộ do một số virus gây bệnh khảm (Pospiezzy et al, 1991). COS còn kích thích hệ thống miễn dịch và ñề kháng trong tế bào ñộng vật, Bacon et al (2000) cho thấy khi ñồng ñiều trị chitosan với kháng nguyên cho chuột có thể tăng miễn dịch cơ thể và phản ứng bảo vệ trước ảnh hưởng của virus A và B. COS cũng có khả năng ngăn ngừa một số xâm nhiễm virus khác [31]. Khả năng kháng oxi hóa Chitosan có khả năng ñáng kể trong việc loại bỏ nhiều loại gốc tự do khác nhau, các nghiên cứu ñánh giả khả năng chống oxi hóa dựa trên khả năng loại ñi các gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl, gốc superoxi cho thấy các chitosan có mức ñộ deacetyl hóa cao có khả năng lọc bỏ cao nhất (Park PJ et al, 2004). Mặt khác các chitosan có kích thước phân tử khác nhau có mối tương quan nghịch với khả năng chống oxi hóa. Khi khối lượng phân tử tăng sẽ làm giảm hiệu quả lọc bỏ và tạo phức với các ion và ngược lại. Tạo phức với các ion kim loại là Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 14 một trong các nguyên nhân tạo nên tính kháng oxi hóa của chitosan, ổn ñịnh hàm lượng lipid trong thực phẩm ñể kéo dài thời gian bảo quản [19]. * Các ứng dụng của chitosan oligosaccharide trong công nghệ thực phẩm Chitosan hay COS ñược ñưa vào thực phẩm với hai mục ñích quan trọng, một là thành phần của thực phẩm chức năng dựa trên khả năng kháng oxi hóa, giảm cholesterol, ñiều hòa miễn dịch và hai là với mục ñích bảo quản dựa trên khả năng kháng khuẩn và kháng oxi hóa của chúng. Các ứng dụng của chúng ñược cụ thể dưới các sản phẩm như sau. Thành phần ăn kiêng Như ñã trình bày, chitosan và COS khả năng kháng cholesterol, gắn kết lipid và ñây là cơ sở cho việc sử dụng chitosan và COS trong các sản phẩm thực phẩm chức năng. Sumiyoshi và Kimra (2006) ñã thử nghiệm hiệu quả của các chitosan khối lượng phân tử thấp (LMMC) có khối lượng trung bình 21, 46 và 130 kDa với hoạt tính lipase tuyến tụy, chitosan 46 kDa có hiệu quả trong việc kìm hãm hoạt ñộng của enzyme này. Chitosan này sẽ ngăn sự tăng cân; tăng mô mỡ, lipid trong gan (cholesterol và triacylglycerol) và giảm các acid dư thừa và chất béo. Nhóm chitosan có kích thước phân tử nhỏ ñã ñược Bộ y tế Nhật Bản chấp thuận là thực phẩm chức năng, ngăn ngừa sự tăng cân và tăng mô mỡ, tăng mỡ máu và mỡ gan.(Han L et al, 1999) [19]. Choi et al (2006) cũng nghiên cứu sử dụng COS vào sữa cho thấy COS có thể sử dụng trong các sản phẩm sữa thương mại có lợi cho sức khỏe mà rất ít ảnh hưởng tới các ñặc tính vật lý và cảm quan của sản phẩm. Tuy nhiên các nghiên cứu sâu hơn vẫn cần ñược thực hiện ñể nâng cao tính chất vật lý và cảm quan cho các sản phẩm thực phẩm có lợi cho sức khỏe con người. Tăng cường khả năng hấp thu canxi Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 15 Trong các nghiên cứu trên ñông vật, các nhà nghiên cứu cho rằng hiệu quả hấp thu canxi với chế ñộ ăn chứa chitosan bị hạn chế ñã giới hạn các ứng dụng của chitosan trong công nghiệp thực phẩm [35]. Mặc dù vậy các sản phẩm oligosaccharide của chúng lại làm tăng sự hấp thu canxi từ ruột. Tính chất ñặc biệt này của COS có thể ñược ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm ñể sản xuất các thực phẩm chức năng. Các nhà khoa học ñã có các công bố về sự tăng hiệu quả hấp thu COS trong in vivo. Các COS từ trimer tới heptamer tăng khả năng hấp thu canxi ñược xác ñịnh do sự giảm hàm lượng canxi bài tiết qua phân và tăng lực ñể làm vỡ xương ñùi của chuột . Nghiên cứu của Jung et al (2006) cũng cho các kết quả tương tự. Hơn thế, họ cũng quan sát thấy sự kìm hãm của cấu trúc không tan muối canxi bởi COS trong môi trường thí nghiệm pH trung tính in vitro [22]. Sản xuất nước quả Một trong những vấn ñề lớn của sản xuất nước quả là các phản ứng oxi hóa làm biến màu sản phẩm và giảm chất lượng sản phẩm. Do có khả năng chống oxi hóa nên COS ñược nghiên cứu trong sản xuất nước táo, khi sử dụng chitosan với khối lượng phân tử khác nhau cho thấy các chitosan có khối lượng phân tử thấp (COS) có hoạt tính loại bỏ tốt hơn so với các chitosan có khối lượng phân tử lớn hay trung bình và acid ascobic [19]. Nghiên cứu của Wei & Xia (2003) cũng sử dụng COS trong bảo quản nước táo ñã kéo dài thời gian bảo quản ở 37 oC từ 9 ngày ñến 70 ngày với nồng ñộ COS là 4g/l [40]. Giữ trạng thái rắn Sắt từ các protein trong thịt cá như myoglobin, hemoglobin, ferritin và tranferrin có thể giải phóng trong quá trình bảo quản và chế biến, từ ñó kích hoạt quá trình oxi hóa chất béo. Kim và Thomas (2007) ñã thí nghiệm các chitosan có khối lượng phân tử khác nhau như một chất chống oxi hóa trên cá Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 16 hồi cho thấy các chitosan có khối lượng phân tử 30 kDa cho khả năng kháng cao nhất khi so sánh với chiosan khối lượng 90 và 120 kDa. Khi tăng nồng ñộ chitosan 30kDa cũng làm tăng các nhóm amino và tăng hiệu quả lọc bỏ các gốc tự do. Như vậy, giảm thiểu quá trình oxi hóa, ñặc biệt oxi hóa chất béo, kéo dài thời gian bảo quản, chất lượng và trạng thái cho sản phẩm [19]. Màng bao thực phẩm Màng bao có thể làm giảm quá trình thoát hơi nước, giảm hư hỏng và giữ hương cho sản phẩm. Các màng bao như chitosan có khả năng cải tiến khí quyển bảo quản tương tự như ñiều chỉnh khí quyển bảo quản nhưng với giá thành thấp hơn. Một số nghiên cứu sử dụng chitosan có khối lượng phân tử thấp (LMMC) cho thấy các LMMC làm chậm quá trình chín, thoát hơi nước và thối hỏng. Các mẫu có màng bảo vệ có khả năng chống chịu nấm tốt hơn khi xử lý bằng thiabendazol (Chien PJ, 2007). Sử dụng chitosan làm màng bọc cho trứng cũng ñược quan tâm, chitosan có khả năng ngăn cản sự vận chuyển carbon dioxide và hơi ẩm qua vỏ trứng. Màng bọc này cũng hiệu quả ñể giữ sức căng và trạng thái của lòng ñỏ mà thường bị giảm do sự khuếch tán của nước từ lòng trắng trứng. Trong ñó, kết quả nghiên cứu của Kim S et al (2007) khi sử dụng chitosan có khối lượng phân tử khác nhau cho thấy các LMMC thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kéo dài chất lượng sản phẩm tốt nhất [19]. Các ứng dụng khác Ngoài các ứng dụng nêu trên, COS còn có rất nhiều các ứng dụng khác trong công nghệ thực phẩm trong các sản phẩm thịt xay như xúc xích, các sản phẩm mỳ, bánh gạo hay các sản phẩm lên men như kim chi nhằm kéo dài thời gian sử dụng do hiệu quả kháng khuẩn và tăng cấu trúc giòn, dai cho sản Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 17 phẩm. ðặc biệt, COS có thể dùng ñể bổ sung trong khẩu phần ăn của ñộng vật nuôi như lợn gà ñể nâng cao chất lượng nguyên liệu thịt. 2.4. Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 2.4.1. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme chitosanase Enzyme chitosanase ñược tìm thấy từ: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, virus, sâu bọ, côn trùng và một số loài thực vật, song hiện nay nguồn cung cấp chủ yếu là vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm, chúng ñược phân lập từ ñất, nơi có xác của các loài giáp xác (tôm, cua…) phân huỷ. Cơ sở của sự phân lập này dựa trên nguyên tắc ở ñâu có cơ chất ở ñó có vi sinh vật phân giải cơ chất ñó. Nhìn chung ñể lựa chọn vi sinh vật làm nguồn thu nhận enzyme phải thỏa mãn ñiều kiện quan trọng là: Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong thời gian ngắn, có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm; Không tạo ra các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sản xuất; Tách chiết sản phẩm dễ dàng. 2.4.1.1. Các nguồn vi sinh vật ñã ñược nghiên cứu trong sản xuất chitosanase Dựa vào sự tương ñồng của chuỗi acid amin, chitosanase ñược phân loại thành 5 họ: GH-5, GH-8, GH-46, GH-75. Trong ñó, họ GH-46 nhất là các chitosanase từ Bacillus và Streptomyces ñã ñược nghiên cứu rộng rãi nhất về ñặc tính xúc tác, cơ chế phản ứng, cấu trúc protein, chuỗi amino acid …trong khi các họ khác mới chỉ có những nghiên cứu bước ñầu về tinh sạch protein và tách enzyme. GH-5 bao gồm các enzyme có khả năng thủy phân chitosan, carboxymethylcellulose và hoạt tính transglycosylation, GH-8 lại gồm có các enzyme có khả năng thủy phân nhiều loại cơ chất ngoài chitosan, nó còn có hoạt tính cellulases, licheninases và endo-xylanases. ðặc biệt, họ GH-75 ñều là các enzyme từ nấm và không có tính ñồng ñẳng với enzyme thuộc GH-46. ðối với họ GH-80 thì sự khác nhau cơ bản nhất giữa enzyme thuộc GH-80 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 18 (chitosanase từ Matsuebacter chitosanotabidus) và GH-46 có ñầu xúc tác là Gl 141 trong khi GH- 46 là Asp 80 (chitosanase từ Streptomyces sp. N174) (Shimono et al., 2002) [52]. Bảng 2.4. Một số chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase ñã ñược nghiên cứu Họ enzyme Nguồn vi sinh vật GH-5 - Streptomyces griceus HUT 6037 - Thermomonospora fusca GH-8 - Bacillus circulans WL-12 - Paenibacillus fukuinnensis D-2 - Bacillus sp. No.7M GH-46 - Nocardioides sp. strain N106 - Amycolatopsis sp. strain CsO-2 - Streptomyces coelicolor A3(2), SCO0677 hay SCF91.37 - Streptomyces coelicolor A3(2),SCO2024 hay SC3A3.02 - Chlorella virus PBCV-1 - Bacillus coagulans - Burkholderia gladioli - Bacillus circulans MH-K1 - Bacillus subtilis - Bacillus amyloliquefaciens - Bacillus sp. strain CK4 GH-75 Tất cả các enzyme chitosanase thuộc họ GH-75 ñều là các enzyme từ nấm như: Aspergillus (Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus), Penicillium, Beauveria, Cordyceps, Fusarium (Fusarium solani), Hypocrea, Magnaporthe, Metarhizium(Metarhizium anisopliae) và Neurospora GH-80 - Matsuebacter chitosanotabidus - Sphingobacterium multivorum Nguồn: [53] Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 19 Trong các nguồn thu nhận thì chitosanase thu từ nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn cho hoạt tính enzyme tốt hơn, ñặc biệt với sự phát triển của công nghệ sinh học trong việc tái tổ hợp gen ñang hứa hẹn việc tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme với những ñặc tính quý báu như khả năng chịu nhiệt, khả năng phân giải cơ chất ở các mức ñộ khác nhau ñể thu các sản phẩm với ñộ chọn lọc và tinh khiết cao. 2.4.1.2. Vi khuẩn Baccilus lichenifomis Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn hình que, gram dương, có khả năng hình thành các bào tử trong ñất, kỵ khí tùy tiện và thuộc giống bacilli (trực khuẩn). Trong tự nhiên có thể ñược phân lập ở khắp nơi từ ñất, nước, cây trồng, vv.. [54]. Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của nó là 50°C, nhưng nó cũng có thể tồn tại ở nhiệt ñộ cao hơn nhiều. Tuy nhiên, nhiệt ñộ tốt nhất của nó ñể tiết một số enzyme là 37°C. Khi ñiều kiện môi trường khắc nghiệt nó sẽ chuyển sang dạng bào tử ñể chống chịu tốt hơn và quay về trạng thái sinh dưỡng khi gặp ñiều kiện thuận lợi. Một số ứng dụng của Bacillus licheniformis Hiện nay vi khuẩn này ñang ñược chú ý và sử dụng cho mục ñích công nghiệp như sản xuất các enzym, kháng sinh, và các chất chuyển hóa. Nó có khả năng sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào có liên quan tới các chu trình dinh dưỡng trong tự nhiên. Bacillus licheniformis thường ñược tìm thấy trên lông chim và thực hiện quá trình lên men, chúng có khả năng chuyển hóa một số lượng lớn protein không thể tiêu hóa thành các protein dễ tiêu hơn. Do vậy, các nhà nghiên cứu ñang cố gắng ñể tái sử dụng lông chim bằng cách chuyển chúng thành các thực phẩm dinh dưỡng cho gia súc. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 20 Bacillus licheniformis cũng ñược ứng dụng là một thành phần quan trọng trong chất giặt tẩy. Do nó có khả năng phát triển trong môi trường kiềm và sản sinh ra một protease có thể tồn tại ở pH cao. Protease có pH tối ưu ở khoảng 9 và 10, do vậy nó có khả thể loại bỏ protein, bao gồm bụi bẩn trong quần áo [38]. Bacillus licheniformis ñược sử dụng ñể sản xuất kháng sinh Bacitracin. Bacitracin bao gồm một hỗn hợp của các polypeptide tuần hoàn do Bacillus licheniformis tạo ra nhưng nó lại ñược tạo ra ñể ức chế sự tăng trưởng của Bacillus licheniformis [34]. Ngoài ra, Bacillus licheniformis cũng ñược sử dụng ñể sản xuất penicillinase, pentosanases, proticin, 5′inosinic acid and inosine, citric acid [54]. Bacillus licheniformis trong sản xuất chitosanase Hiện nay ñã có rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới thu nhận chitosanase từ Bacillus sp. như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei,.. và Bacillus licheniformis. Theo Yasushi Uchida et al (1994), Bacillus licheniformis UTK ñược phân lập từ ñất ñã cho thấy khả năng sinh chitosanase ngoại bào. Sau khi nuôi cấy và thu dịch thô enzyme, thực hiện các bước làm sạch ñã thu ñược hai enzyme chitosanase C1, C2 có phân tử khối khoảng 31 và 26 kDa. Nhiệt ñộ tối ưu khoảng 40 - 450C và pH tối ưu khoảng 4.6 - 4.9. Một nghiên cứu gần ñây hơn của Ekowati et al (2006) cũng thực hiện thu nhận chitosanase từ Bacillus licheniformis MB2 ñược phân lập từ suối nước nóng ở Manado, Indonesia. Cũng sau quá trình làm sạch thu ñược hai enzyme chitosanse. Chitosanase thứ hai thu ñược có khối lượng phân tử khoảng 75 kDa, nhiệt ñộ hoạt ñộng tối ưu là 70oC và khoảng pH tối ưu là 6 - 7. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 21 Nhìn chung, chưa có nhiều nghiên cứu ñược công bố về khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ Bacillus licheniformis nhưng do vi khuẩn này có khả năng chịu nhiệt cao, phát triển tốt khi nhiệt ñộ môi trường có thể lên tới 55 oC, do vậy nó cũng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase chịu nhiệt, theo kết quả nghiên cứu của Ekowati thì Bacillus licheniformis MB2 ñang thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitosanase có nhiệt ñộ hoạt ñộng cao nhất so với chitosanase chịu nhiệt có ñược từ nuôi cấy vi khuẩn. 2.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật Vi sinh vật sau khi ñược lựa chọn sẽ ñược ñưa ñi nuôi cấy ñể thu enzyme. Có hai phương pháp nuôi cấy là phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn và phương pháp nuôi cấy bề sâu trên môi trường lỏng. Do thường thu nhận chitosanase ngoại bào nên sử dụng phương pháp nuôi cấy sâu, thu canh trường ñể chuẩn bị cho các bước làm sạch tiếp theo. Trong quá trình nuôi cấy có rất nhiều các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh tổng hợp enzyme như thành phần môi trường, pH môi trường, nhiệt ñộ nuôi cấy, khoáng chất… 2.4.2.1. Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường Thành phần môi trường là các nhân tố có tác dụng ñến hoạt ñộng sống của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme của chúng. ðứng trên quan ñiểm ñiều khiển sinh tổng hợp theo chủ ñích thì các thành phần dinh dưỡng phải ñáp ứng ñược yêu cầu chính là có ñộ hoàn thiện ñảm bảo. Trong thành phần môi trường phải có ñầy ñủ các chất ñảm bảo việc sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Môi trường cần có các nguồn cung cấp C, N, H, O và các chất khoáng như: Mg, Ca, P, S, Fe, K ... Thành phần và tỉ lệ các chất trong môi trường là khác nhau với mỗi loại vi sinh vật, song tất cả các vi sinh vật ñều hấp thụ Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 22 cacbon chủ yếu dạng hợp chất hữu cơ, ñồng hóa hydro chủ yếu ở dạng nước và hydro có trong các thành phần và hợp chất hữu cơ, ñồng hóa oxy có trong các thành phần cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Các chất dinh dưỡng của môi trường không chỉ tiêu thụ cho việc xây dựng tế bào mà còn ñáp ứng nhu cầu về năng lượng cho các quá trình sống của vi sinh vật. Nguồn nitơ Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ñối với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Các nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật bao gồm nitơ vô cơ (NH4 +, NO3 -…) và nitơ hữu cơ ( peptone, cao thịt, cao men, các acid amin…) và các vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng nguồn nitơ là khác nhau. Nguồn nitơ vô cơ thường dùng là các muối amon, nitrat, trong ñó các muối amon có chứa nitơ dạng khử nên vi sinh vật dễ dàng và nhanh chóng sử dụng. Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật nitơ thường ñược bổ sung trong các muối như: KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4,... Với nguồn nitơ hữu cơ thì nguồn thức ăn nitơ thuận lợi nhất ñối với các vi sinh vật là các acid amin. Các nguồn thức ăn nitơ phức tạp thường dùng là dịch thủy phân protein, polipepid, pepton, protein và protein trong các nguyên liệu như: cao nấm men, khô lạc, bột ñậu, bột cá... Với các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitosanase thì nguồn nitơ cung cấp trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh enzyme. Khi so sánh ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau tới khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ Gongronella sp. JG (W.Zhou et al, 2007) thấy rằng: peptone, glutamic acid và aspartic acid làm tăng khả năng sinh enzyme chitosanase, phenyl alanine, amoni sunfate và cao men thì không ảnh hưởng lớn tới khả năng sinh enzyme, trong khi ñó tyrosine, ure, ammonium nitrate và amonium chloride cho khả năng sinh enzyme thấp hơn [39]. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 23 Nguồn cacbon Hợp chất cacbon là nguồn năng lượng quan trọng trong hoạt ñộng sống của vi sinh vật. ðối với vi sinh vật dị dưỡng, các nguồn cacbon thường dùng như: glucose, saccharose, manitol, tinh bột tan. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon này phụ thuộc vào hệ enzyme mà vi sinh vật có khả năng sinh ra ñể ñồng hóa cho cơ thể. Việc lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật có ý nghĩa trong nuôi cấy ñể thu sinh khối, trong ñó hướng tới các nguồn cacbon dễ kiếm và giá thành rẻ. Mặt khác, chitosanase cũng là một enzyme cảm ứng, và chất cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase của các vi sinh vật thường chính là cơ chất chitosan. Do vậy, trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật chitosan ñược bổ sung với vai trò là cơ chất cảm ứng và nồng ñộ của chitosan ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng sinh tổng hợp chitosanase của vi sinh vật. Thông thường, chitosan bổ sung trong môi trường nuôi cấy là từ 0,2 - 2,5 %, và các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Sự tăng quá mức nồng ñộ chitosan trong môi trường ñến một giới hạn nhất ñịnh cũng sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme, ñiều này có thể do: tính kháng khuẩn của chitosan; cấu tạo mạch polymer của chitosan làm ñộ nhớt môi trường tăng gây hạn chế tới bề mặt trao ñổi chất của vi sinh vật và giảm khả năng hòa tan oxy trong môi trường; và ở nồng ñộ chitosan cao còn làm tăng áp suất thẩm thấu gây co nguyên sinh chất, hạn chế quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng hợp chitosanase của vi sinh vật [33, 42]. Ngoài ra, chitosan còn có một giá trị ñặc trưng là mức ñộ deacetyl hóa, chính yếu tố này cũng ảnh hưởng không nhỏ tới việc sinh tổng hợp chitosanase. Nhìn chung thì mức ñộ deacetyl hóa của chitosan bổ sung trong môi trường nuôi cấy càng cao thì hoạt tính của chitosanase ñược sinh ra càng lớn. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 24 Các chất khoáng Ngoài nước, chất hữu cơ…trong tế bào vi sinh vật còn chứa rất nhiều khoáng chất, lượng khoáng chất này thay ñổi tùy theo loài, tùy từng giai ñoạn phát triển và ñiều kiện sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Các nguyên tố cần thiết với lượng có thể rất nhỏ nhưng không thể thay thế do chúng tham gia vào rất nhiều các quá trình chuyển hóa và sinh tổng hợp enzyme. Các nguyên tố quan trọng là: P, S, Na, K, Fe, Mg… Trong nhiều trường hợp, sự có mặt của các chất này và ñặc biệt là nồng ñộ của chúng có ảnh hưởng mạnh mẽ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme. Ví dụ như với Gongronella sp. JG: Mn2+ là chất hoạt hóa mạnh chitosanase ở cả hai nồng ñộ 1 và 10 mmol/l; Cu2+ có tác dụng kích thích ở 1 mmol nhưng ở 10 mmol/l lại kìm hãm ñến 90% hoạt tính của enzyme; Ag+ bất hoạt hầu như hoàn toàn bất kể 1 hay 10 mmol/l. Ngược lại, Mg2+, Ni2+, Ca2+, Ba2+ không thấy ảnh hưởng khi nồng ñộ 1 mmol/l nhưng ở nồng ñộ 10 mmol/l chúng bất hoạt enzyme từ 50-70%; trong khi ñó sự có mặt của Sr2+, Na+ và K+ không ảnh hưởng tới chitosanase ở cả hai nồng ñộ 1 và 10 mmol/l [39]. 2.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Trong quá trình nuôi cấy, toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gắn liền với sự thay ñổi theo thời gian. Chitosanase từ vi sinh vật là sản phẩm của quá trình trao ñổi chất của vi sinh vật, do vậy quá trình sinh tổng hợp enzyme có liên hệ mật thiết với quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ta biết rằng sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong môi trường tĩnh lỏng sẽ cho một ñường cong sinh trưởng của quần thể bao gồm 4 pha: pha tiềm phát, pha log, pha cân bằng và pha tử vong. Trong pha tiềm phát hay pha lag, tế bào sẽ ñiều chỉnh theo môi trường nuôi cấy, hầu hết chúng không sinh trưởng ngay mà ngược lại tổng hợp nên Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 25 các enzyme ñể sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường. Tiếp theo là pha log, trong ñiều kiện thích hợp, quần thể sẽ tăng theo cấp số mũ và tốc ñộ sinh sản ñạt ñến một hằng số. Trong giai ñoạn này, tốc ñộ trao ñổi chất của các tế bào riêng lẻ ñạt cực ñại tương ứng với sản phẩm của quá trình trao ñổi chất tạo ra mạnh mẽ. Sang pha ổn ñịnh, lúc này dinh dưỡng giảm dần, các chất thải ñược tích lũy làm tốc ñộ sinh sản tế bào sẽ giảm xuống. Cuối cùng số tế bào chết sẽ bằng số tế bào mới ñược sinh ra, do vậy ñộ lớn của quần thể ổn ñịnh. Khi ñó tốc ñộ trao ñổi chất của các tế bào sống sót cũng giảm xuống. Quá trình vẫn tiếp tục nếu các chất dinh dưỡng không ñược bổ sung và các chất thải không ñược lấy ra thì quần thể sẽ ñạt tới thời ñiểm số tế bào chết sẽ nhanh hơn số tế bào sinh ra và như vậy quần thể ñi vào pha tử vong. Chitosanase là sản phẩm của quá trình trao ñổi chất, nó vừa có nhiệm vụ phân giải cơ chất của môi trường làm nguồn dinh dưỡng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể mặt khác ở một số loại vi sinh vật chitosan cũng là một thành phần trong thành tế bào nên sự sản sinh chitosanase của chúng có ý nghĩa sinh lý quan trọng ñặc biệt trong quá trình phân chia tế bào [39]. Chính vì vậy, quá trình sinh sinh tổng hợp chitosanase theo thời gian cũng biến thiên theo ñường cong sinh trưởng của vi sinh vật. Và việc nghiên cứu quá trình này có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn ñiểm thích hợp ñể thu hồi enzyme. 2.4.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường Nhiệt ñộ giữ vai trò quan trọng trong ñời sống của vi sinh vật, nhiệt ñộ khác nhau có hiệu quả khác nhau tới sự sống sót và sinh trưởng của vi sinh vật. Trong ñó nhiệt ñộ thấp nhất mà vi sinh vật có thể tiến hành trao ñổi chất ñược gọi là nhiệt ñộ sinh trưởng cực tiểu. Nhiệt ñộ cao nhất mà ở ñó một sinh vật có thể tiếp tục trao ñổi chất ñược gọi là nhiệt ñộ sinh trưởng cực ñại. Trong biên ñộ nhiệt ñộ này, có nhiệt ñộ mà ở ñó các hoạt ñộng trao ñổi chất Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 26 của sinh vật tạo nên tốc ñộ sinh trưởng cao nhất là nhiệt ñộ tối ưu. Và dựa trên biên ñộ nhiệt ñộ thích h._.ăn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 51 trong dịch enzyme này ta dùng phương pháp sắc ký lọc gel, sử dụng gel Sephadex G25. Kết quả ñược thể hiện trên sắc ký ñồ hình 4.8 và bảng tổng hợp 4.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 mV Hình 4.8. Sắc ký ñồ của sự loại muối trên cột Sephadex G25 Dựa vào sắc ký ñồ cho thấy 3 ñỉnh tương ứng với 3 phân ñoạn protein ñược tách ra trong quá trình lọc muối, thực hiện thu hồi các pic và xác ñịnh hoạt tính chitosanase. Bảng 4.5. Hoạt tính của enzyme sau quá trình tủa muối và lọc muối Hoạt tính (U/ml) Nồng ñộ protein (mg/ml) Hoạt ñộ riêng (U/mg) Dịch thô 0,0702 0,1382 0,5080 Tủa amoni sunfate 0,2765 0,4840 0,5713 Sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G25 Pic 1 Pic 2 Pic 3 0,1806 0,0113 0,0029 0,1308 0,0463 0,0221 1,3807 0,2440 0,1312 A280 Thời gian (phút) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 52 Trong 3 ñỉnh phân tách thu ñược thì ñỉnh ñầu tiên (pic 1) có hoạt tính cao nhất cũng như hàm lượng protein lớn nhất, hoạt tính riêng có ñược là 1,3807 U/ml. Lựa chọn pic này ñể tiếp tục thực hiện các bước làm sạch tiếp theo. 4.2.2. Làm sạch bằng phương pháp sắc ký trao ñổi ion Phân ñoạn sau khi ñược lọc muối tiếp tục tiến hành phân chia bằng sắc ký trao ñổi ion với các ñiều kiện ñã nêu trong phương pháp 3.4.2.4. Sắc ký ñồ ñược trình bày ở hình 4.9. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 mV Hình 4.9. Sắc ký ñồ chitosanase trên cột trao ñổi ion CMFF Từ sắc ký ñồ trên hình 4.9 cho thấy, sau quá trình sắc ký cũng thu ñược 2 pic chính, tuy nhiên ñường biểu diễn của pic thứ nhất ghi lại sự xuất hiện của các pic khác chồng lên nhau, ñiều này chứng tỏ có chứa nhiều protein khác nhau. Thực hiện thu nhận dịch protein của 2 pic ñể xác ñịnh hoạt tính chitosanase. Kết quả thu ñược trình bày trên bảng 4.6 A280 Thời gian (phút) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 53 Bảng 4.6. Hoạt tính của enzyme chitosanase sau quá trình sắc ký trao ñổi ion Hoạt tính (U/ml) Nồng ñộ protein (mg/ml) Hoạt ñộ riêng (U/mg) Sau khi loại muối trên cột Sephadex G25 0,1806 0,1308 1,3807 CMFF Pic 1 Pic 2 0,0488 0,1360 0,0261 0,0445 1,1897 3,0561 Tiếp tục thu nhận pic 2 và tiếp tục sắc ký lần hai. Sắc ký ñồ thu ñược trình bày trên hình 4.10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 mV Hình 4.10. Sắc ký ñồ pic 2 trên cột trao ñổi ion CMFF A280 Thời gian (phút) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 54 Bảng 4.7. Hoạt tính của enzyme sau quá trình sắc ký trao ñổi ion lần hai Hoạt tính (U/ml) Nồng ñộ protein (mg/ml) Hoạt ñộ riêng (U/mg) CMFF (1) 0,1360 0,0445 3,0561 CMFF (2) Pic 1 Pic 2 0,0017 0,0539 0,0203 0,0191 0,0837 2,8220 Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy, sau khi thực hiện chạy sắc ký lần thứ hai, hỗn hợp protein ñược làm sạch tốt hơn, ta loại ñi ñược một số protein ở pic 1 và thu ñược pic 2 có hoạt tính riêng cao hơn hẳn so với pic 1, có giá trị là 2.8220 U/mg. Tuy nhiên sau bước sắc ký lần 2, hàm lượng protein ñã giảm ñi rất lớn. Kết quả ñiện di cũng cho thấy sau bước làm sạch này ñã thu ñược protein có ñộ sạch cao. Bước làm sạch dừng lại sau khi thực hiện sắc ký lần thứ hai trên cột sắc ký trao ñổi ion CMFF. 4.2.3. Kết quả ñiện di sau các bước làm sạch dịch enzyme chitosanase Sau mỗi bước làm sạch thực hiện ñiện di ñể kiểm tra hiệu quả của quá trình, mặt khác dựa trên thang protein chuẩn, ước lượng khối lượng phân tử của enzyme chitosanase. Quá trình ñiện di ñược thực hiện theo phương pháp ñã nêu, kết quả thu ñược trình bày trên hình 4.11 Hình 4.11. ðiện di ñồ protein chitosanase qua các bước làm sạch 1 2 3 4 5 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 55 Giếng 1: Thang protein chuẩn (kDa) Giếng 2: Dịch thô enzyme Giếng 3: Protein thu ñược sau quá trình lọc muối Giếng 4: Protein thu ñược sau quá trình sắc ký trao ñổi ion lần 1 Giếng 5: Protein thu ñược sau quá trình sắc ký trao ñổi ion lần 2 Từ kết quả ñiện di ñồ trên hình 4.8 cho thấy hiệu quả làm sạch sau các bước sắc ký, sau sắc ký trao ñổi ion lần thứ hai thu ñược một chitosanase tương ñối sạch (giếng 5), khi so sánh với thang protein chuẩn ước lượng khối lượng phân tử của chitosanase này khoảng 75kDa. Kết quả này tương tự với chitosanase thu ñược từ Aremonas sp.HG80 [49] và Bacillus licheniformis MB2 [11]. 4.3. Một số tính chất của enzyme chitosanase 4.3.1. Ảnh hưởng pH ñến hoạt tính của enzyme chitosanase pH là yếu tố ảnh hưởng lớn tới khả năng xúc tác của enzyme, xác ñịnh hoạt tính enzyme ở pH phản ứng khác nhau, kết quả ñược thể hiện trên bảng 4.8. Bảng 4.8. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase pH Hoạt tính chitosanase (U/ml) 3 0,0095 f 4 0,0524 d 5 0,0737 a 6 0,0588 b 7 0,0558 c 8 0,0228 e 9 0,0059 g 10 0,0010 h Từ ñồ bảng 4.8 thấy khoảng pH 5 cho enzyme có hoạt tính cao nhất, pH này cũng là pH tối ưu của chitosanse từ Streptomysces aureocirculatus Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 56 [13], Bacillus sp.16 [46] và Bacillus sp. Strain KCTC 0377BP [45]. Hoạt tính của enzyme giảm mạnh khi pH phản ứng lớn hơn 7 và gần như không phản ứng khi pH ñến 10. 4.3.2. Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt tính của enzyme chitosanase Thực hiện phản ứng trong các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau, kết quả ñược thể hiện trong bảng 4.9. Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới hoạt tính xúc tác của enzyme Nhiệt ñộ (oC) Hoạt tính chitosanase (U/ml) 30 0,0206 g 40 0,0555 d 45 0,0842 a 50 0,0721 b 55 0,0593 c 60 0,0500 e 70 0,0467 f 80 0,0166 h Từ kết quả trên cho thấy nhiệt ñộ tối ưu cho enzyme hoạt ñộng là 45oC, ở nhiệt ñộ này hoạt tính enzyme ñạt ñược là 0,0842 U/ml. Khoảng nhiệt ñộ từ 40-50 cũng là khoảng nhiệt ñộ hoạt ñộng của nhiều chitosanse như enzyme thu nhận từ Bacillus licheniformis UTK [47], Bacillus sp. Strain KCTC 0377BP [45], Baccilus megaterim P1 [32]. 4.3.3. Ảnh hưởng pH và nhiệt ñộ ñến ñộ bền của enzyme chitosanase Thực hiện theo phương pháp ñã nêu, ñánh giá khả năng bền pH và nhiệt ñộ của chitosanase dựa trên hoạt tính tương ñối, coi enzyme có ñộ bền cao nhất (100%) ở ñiều kiện phản ứng nhiệt ñộ và pH tối ưu, từ ñó suy ra hoạt tính tương ñối của enzyme trong các ñiều kiện còn lại. Kết quả ñược thể hiện ở ñồ thị 4.12 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 57 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH ho ạ t t ín h tư ơ n g ñ ối ( % ) 0 10 20 30 40 50 60 70 30 40 50 60 70 80 nhiệt ñộ oC ho ạt tí nh tư ơ ng ñ ối ( % ) ðồ thị 4.12. Ảnh hưởng của pH và nhiệt ñộ ñến ñộ bền của enzyme chitosanase Từ ñồ thị 4.12 chúng ta thấy enzyme chitosanase ổn ñịnh trong khoảng pH từ 4-8 và nhiệt ñộ 45-60oC. Khoảng pH ổn ñịnh này tương tự với enzyme thu từ Bacillus cereus TP 12.24 (pH 3-8), Streptomyces cyaneogriseus (pH 5-8), Aspergillus fumigatus KB-1 (pH 3,5-8,5) [36,13,37]. Khoảng nhiệt ñộ (45-55oC) cũng là khoảng nhiệt ñộ mà chitosanase từ Gongronella sp. JG và Streptomyces aureocirculatus khá ổn ñịnh [39,12]. 4.3.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tính của enzyme chitosanase Các ion kim loại cũng và yếu tố ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của enzyme. Xác ñịnh hoạt tính tương ñối của enzyme khi có mặt của một số ion kim loại ở nồng ñộ 1mM và 10 mM, hoạt tính của enzyme khi không có mặt của các ion kim loại là 100%. Kết quả ñược thể hiện trong bảng 4.8 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 58 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của các ion kim loại tới hoạt tính của enzyme chitosanase 1mM 10mM Cu2+ 121,9 28,2 Mg2+ 121,3 102,4 Al3+ 73,9 11,.7 Fe3+ 17.2 79,0 Zn2+ 2,0 19,5 Li2+ 149,8 61,6 Pb2+ 66,8 141,9 K+ 127,5 61,4 Fe2+ 4,2 10,8 Ca2+ 56,8 55,8 ðối chứng 100,0 100,0 Từ kết quả trên cho thấy các ion kim loại Fe3+, Fe2+, Zn2+, Ca2+ làm bất hoạt enzyme ở cả 2 nồng ñộ, trong khi ñó các ion Li2+, K+, Cu2+ lại kích thích hoạt ñộng của enzyme ở nồng ñộ thấp 1mM nhưng ở nồng ñộ 10mM lại kìm hãm sự hoạt ñộng của enzyme. ðiều này lại diễn ra ngược lại với các ion Al3+, Pb 2+, Mg2+ kích thích hoạt ñộng của enzyme ở nồng ñộ 1mM và không ảnh hưởng ñáng kể tới hoạt ñộng của enzyme ở nồng ñộ 10mM. Sự tác ñộng của Cu tới tính ổn ñịnh của chitosanase tương tự như kết quả của W.Zhou et al (2008) với chitosanase thu nhận từ Gongronella sp.JG. Ở nồng ñộ 10mM chitosanase từ Bacillus sp. 16 cũng bị bất hoạt ñáng kể [46]. Zn cũng gây bất hoạt chitosanase thu nhận từ Gongronella sp.JG, Bacillus circulans MH-K1, Acinobacter sp. strain CHB101 [39, 20]. Sự kìm hãm hoạt ñộng của Fe3+, Fe2+ tới chitosanase ở nồng ñộ 1mM cũng ñược Tae Kyuong Eorn và Kang Man Lee khẳng ñịnh trên chitosanase thu ñược từ Aspergillus fumigatus KB-1 [37]. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 59 PHẦN NĂM: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Trên cơ sở các kết quả thu ñược chúng tôi ñi ñến một số kết luận sau: 1. ðã xác ñịnh ñược các ñiều kiện nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 sinh tổng hợp chitosanase cao: + Nhiệt ñộ nuôi cấy là: 36,20C + pH môi trường nuôi cấy là: 7,08 + Nồng ñộ chitosan: 0,2% 2. ðã lựa chọn ñược ñiều kiện thu nhận và tinh chế chế phẩm enzyme chitosanase có ñộ sạch cao: - Làm sạch sơ bộ bằng tủa muối amoni sunphate phân ñoạn 30-80% - Phân chia bằng phương pháp sắc ký trao ñổi ion - Hoạt tính riêng của enzyme chitosanase sau quá trình làm sạch là 2.822 U/m - Khối lượng phân tử của chitosanase là khoảng 75 kDa xác ñịnh bằng ñiện di SDS-PAGE. 3. Xác ñịnh ñược một số tính chất của enzyme: - Nhiệt ñộ và pH tối ưu cho enzyme hoạt ñộng là 45oC và pH=5 - Enzyme chitosanase ổn ñịnh trong khoảng pH 4-8 và nhiệt ñộ 45-60oC - Một số ion kim loại ảnh hưởng lớn tới sự ổn ñịnh của chitosanase: Các ion Fe3+, Fe2+, Zn2+, Ca2+ làm bất hoạt enzyme, các ion Al3+, Pb2+, Mg2+ kích thích hoạt ñộng của enzyme. 5.2. ðề nghị - Nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận trên quy mô lớn. - Nghiên cứu hoàn thiện hơn quy trình thu nhận ñể nâng cao hiệu quả thu hồi của enzyme. -Nghiên cứu quy trình thu nhận ñường COS sử dụng enzyme chitosanase. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Cao Minh Hậu (2006), “Những ứng dụng mới của chất xơ trong thực phẩm: chất bổ sung vào sản phẩm hải sản”. Tạp chí Khoa học- Công nghệ thủy sản, 2. 2. ðặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, PGS. TS Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ Enzyme, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội. 3. Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Phương Nhung (2010), " Lựa chọn ñiều kiện tối ưu ñể sản xuất chitosanase từ Streptomyces Griseus (Chủng NN2)". Tạp chí Khoa học và Phát triển, ðại học Nông nghiệp Hà Nội, 7 (6), 708-787. 4. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 5. Phạm Ngọc Thùy (2008), “Bước ñầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase ký thuật từ Streptomyces griseus”. Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 03. 6. Phạm Thị Chân Châu, PGS. TS Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục. 7. Trần Anh Tuấn, Phạm Văn Cường (2008), “Ảnh hưởng của chitosan ñến sinh trưởng và năng suất của lúa giống trong ñiều kiện bón ñạm thấp”. Tạp chí Khoa học và phát triển, VI (5), 415-417. 8. Trần Thái Hòa (2005), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình deacetyl hóa và cắt mạch chitin ñể ñiều chế glucosamine”.Tạp chí khoa học, ðại học Huế, 47. 9. Trần Thái Hòa (2005), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình deacetyl hóa và cắt mạch chitin ñể ñiều chế glucosamine”.Tạp chí khoa học, ðại học Huế, 47. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 10. A. Pelletier and J. Sygusch (1990), " Purification and Characterization of three chitosanse activities from Bacillus megaterium P1". Applied and invironmental Microbiology, 844-848. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 61 11. Chasanah Ekowati, Purwiyatno Hariyadi, Arief B. Witarto, Jae Kwan Hwang and Maggy Thenawidjaja Suhartono (2009), "Biochemical Characteristics of Chitosanase From the Indonesian Bacillus licheniformis MB-2". Molecular biotechnology, vol 33, 93-101. 12. El-S. A. El-Shirbiny; I.M. El-Azouni; M. F. Ghaly and E. Ghaly and E. Abdel-Hamid (2007), " Optimization and characterization purified chitosanase enzyme from Streptomyces Aureocirculatus". Proceeding of the second scientfic enviromental conffer, Zagazig Uni, 9-22. 13. El-Sayed Ali El-Sherbiny (2011), "Purification and Characterization of Chitosanase Enzyme from Streptomyces cyaneigriseus". Asian Journal of Biological Sciences, ISSN 1996-3351. 14. F. A. T. Piza, A. P. Siloto, C. V. Caravalho, T.T. Franco (1999). “Production, characterization and purification of chitosanase from Bacillus cereus”. Braz. J. Chem. Eng, 16 (2). 15. H. Barreteau et al.(2006),” Oligosaccharides as Food Additives”. Food Technol. Biotechnol, 44 (3), 323–333. 16. Hermann Sch.&Gger and Gebhard Von Jagow (1987). "Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Range from 1 to 100 kDa". Analytical Biochemistry, 166, 368-379. 17. Ho Sup Jung, Jeong Woo Son, Hong Seok Ji, and Wang Kim (1999), “ Effective production of chitosanase and chitinase by Streptomyces griseus HUT 6037 using colloidal chitin and various degrees of deacetylation of chitosan”. Biotechnol. Bioprocess Eng, 4, 26-31. 18. Ho-Geun Yoon, Hee-Yun Kim, Hye-Kyung Kim, Bum-Shik Hong, Dong-Hoon Shin, and Hong-Yun Cho (2001), “ Thermostable Chitosanase from Bacillus sp. Strain CK4: Its purification, characterization, and reaction patterns”. Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (4), 802-809. 19. Immaculada Aranaz (2009), "Functional Characterization of chitin and chitosan, Current Chemical Biology, 3, 203-230. 20. J.K. Park, K. Shimono, N. Nobuhisa, K. Shigeru, M. Kurita, Y. Ohta, K. Tanaka, H. Matsuda, and M. Kawamukai ( 1999), “Purification, Characterization, and Gene Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 62 Analysis of a Chitosanase (ChoA) from Matsuebacter chitosanotabidus 3001”. Journal of Bacteriology,181 (21), 6642-6649. 21. Jiali Zhang, Wenshui Xia, Ping Liu, Qinyuan Cheng, Talba Tahirou, Wenxiu Gu, Bo Li (2010), "Chitosan Modification andharmaceutical/Biomedical Applications". Marine Drugs, 8, 1962-1987 22. Jung, W. K., Moon, S. H., and Kim, S. K. (2006), "Effect of chitooligosaccharide on calcium bioavailability and bone strength in ovariectomized rats". Life Sciences, 78:970–976. 23. K.V. Harish Prashanth and R. N. Tharanathan (2007), "Chitin/chitosan: modifications and their unlimited application potential - an overview". Food Science & Techonology, 18, 117 - 131. 24. L. Ramı´rez-Coutin˜o et al (2006), “ Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases”. Process Biochemistry, 41, 1106–1110. 25. Lin CW, Lin JC (2003), “Characterization and blood coagulation evaluation of the water-soluble chitooligosaccharides prepared by a facile fractionation method”. Biomacromol , 4, 1691-1697. 26. M. Nogawa, H. Takahasi, A. Kashiwagi, K. Ohshima, H. Okada, and Y. Morikawa (1998), “Purification and Characterization of Exo-b-D-Glucosaminidase from a Cellulolytic Fungus, Trichoderma reesei PC-3-7”. Applied and environmental microbiology , 64 (3), 890-895. 27. M. Shimosaka, M. Nogawa, X.Y. Wang, M. Kumehara, and M. Okazaki (1995), “Production of Two Chitosanases from a Chitosan-Assimilating Bacterium, Acinetobacter sp. Strain CHB101”.Applied and Environmental Microbiology, 61 (2), 438-442. 28. M. Shimosaka, Y. Fukumori, X.-Y. Zhang, N.-J. He, R.Kodaira. M, Okadaki (2000). " Molecular cloning and characterization of chitosanse from the chitosanolytic bacterium Burkholderia gladioli strain CHB101". Appl Microbiol Biotechnol, 54, 354- 360. 29. M. Yabuki, A. Uchiyama, K. Suzuki (1999). “Purification and properties of chitosanase from Bacillus circulands MH-K1”. Biosci. Biochem., 21, 246-248. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 63 30. Mei Ming (2006). Production of Physiologically Active Chitosan Oligosaccharides at High Concentration by Immobilized Chitosanase. University of Tsukuba, Japan. 31. Ministry of Heath, Labour and Walfare of Japan (2002), Food for Specified Heath Use's in Japan, Functinal Food. 32. Pelletier and J.Sygusch (1990). “Puification and chacracterization of three chitosanase activities from Baccilus megaterim P1”. Applied and environmental microbiology , 54 (4), 844 - 848. 33. Shadia M. Abdel-Aziz, Yomna A. Mostafa and Foukia E. Moafi, Partial Purification and Some Properties of the Chitosanases Produced by Bacillus Alvei Nrc-14 (2008). Journal of Applied Sciences Research, 4(10): 1285-1290. 34. Snoke J.E. and Cornell N (1965), "Protoplast Lysis and Inhibition of Growth of Bacillus licheniformis by Bacitracin". J Bacteriol, 89(2), 415–420. 35. Sun-Ok Fernandez-KimB.S. (2004). Physicochemical and functional properties of crawfish chitosan as affected by different processing protocols. Seoul National University. 36. Sutee Wangtueai, Wanchai Worawattanamateekul, Mathana Sangjindavong, Nuanphan Naranong and Sarote Sirisansaneeyakul (2007). “Production and partial Characterization from a newly isolated Bacillus cereus”. Nat. Sci, 41, 346-355. 37. Tae Kyoung Eom and Kang Man Lee (2003), “Characteristics of Chitosanases from Aspergillus fumigatus KB-1”.Arch Pharm Res , 26 (12), 1036- 1041. 38. Veith, B., Herzberg, C., Steckel, S., Feesche, J., Maurer, K. H., Ehrenreich, P., Bäumer, S., Henne, A., Liesegang, H., Merkl, R., Ehrenreich, A., Gottschalk, G. (2004), "The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential". J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7(4):204- 211. 39. W. Zhou, H. Yuan, J. Wang and J. Yao (2008), “Production, purification and characterization of chitosanase produced by Gongronella sp. JG”. Letters in Applied Microbiology, 46, 49–54. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 64 40. Wenshui Xia et al (2010), "Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides". Food Hydrocolloids , 1-10. 41. Woo-Jin Jung, Ju-Hee Kuk, Yu-Lan Jin and Ro-Dong Park (2005), " Purification and properties of chitoanase fron Bacillus cereus P16". Journal of Metals, Minerials and Minerials. 15 (1), 27-32. 42. Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang and Wen-Sui Xia (2008), “Strain improvement and optimization of the mediacomposition of chitosanase-producing fungus Aspergillus sp.CJ 22-326”. African Journal of Biotechnology ,7 (14), 2501-2508. 43. Xu-fen Zhu, Ying Zhou, Jun-li Feng (2007). “Analysis of both chitinase and chitosanase produced by Sphingomonas sp. CJ-5”. J. Zhejiang Univ Sci B. November, 8(11): 831–838. 44. Y Wang, P Zhou, J Yu, X Pan, W Lan and S Tao (2007), “Antimicrobial effect of Chitooligosaccharides Produced by Chitosanase from Pseudomonas CUY8”. Asia Pac J Clin Nutr, 16 (Suppl 1), 174-177. 45. Y. J. Choi, E. J. Kim, Z. Piao (2004). “Purification and Characterization of Chitosanase from Bacillus sp. Strain KCTC 0377BP and Its Application for the Production of Chitosan Oligosaccharides”. Applied and environmental microbiology, 70 (8), 4522–4531. 46. Y.Y. Jo, K.J. Jo, Y.L. Jin, J.H. Jim, Y.W. Kim, and R.Y. Park (2003), “ Characterization and Kinetics of 45 kDa chitosanase from Bacillus sp. P16”. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (9), 1875-1882. 47. Yasushi Uchida, Koji Tateishi, Kenichi Yamagushi and Hidenori Takeda (1994), "Purification and Characterization of Chitosanase produced by Bacillus licheniformis UTK". Bull.Fac.Agr., Saga Univ , 77, 53-63. 48. Yu-Wei Lin, Yi-Chien Hsiao, Been-Huang Chiang (2009), "Production of high degree polymerized chitoolygosaccharides in membrane reactor using purified chitosanase from Bacillus cereus". Food research International, 42, 1355-1361. 49. Yuying Sun, J. Zhang, S. Wang (2009), “Purification and Characterization of Chitosanase from Aeromonas sp. HG08". African Journal of Biotechnology, 8 (12), 2830-2834. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 65 TÀI LIỆU TRÊN MẠNG 50. Chất giáp xác Tianshi. truy cập ngày 12/04/2010. 51. Chitosan oligochacharide. truy cập ngày 20/03/2009. 52. Chitosanases: Cleavage specificity truy cập ngày 10/04/2010. 53. Chitosanases: Molecular sequence data. truy cập ngày 15/04/2010. 54. truy cập ngày 20/09/2011 55. Mechanism of catalysis. truy cập ngày 15/04/2010. 56. Một số thuốc BVTV nguồn gốc sinh học thế hệ mới. truy cập ngày 20/04/2009. 57. Những ñặc ñiểm của chitin, chitosan và dẫn xuất của chúng. cua-Chitin-Chitosan-va-dan-1.html, truy cập ngày 20/03/2009 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 66 PHỤ LỤC ðường chuẩn Glucosamine y = 3.167x - 0.1848 R2 = 0.999 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Nồng ñộ (mg/ml) A 54 0 ðường chuẩn protein y = 3.3736x R2 = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 nồng ñộ (mg/ml) A 59 5 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 67 Kết quả chạy mô hình thực nghiệm trên chương trình Memrodw Fichier RTF généré par le logiciel NEMRODW le : 27/09/2011 Nom de l’étude créée le 27/09/2011 : nhung Titre de l’étude Qui hoach Plan d’expérimentation N°Exp Rand Nhiet do pH Nong do chitosan oC pH % 1 49.0 7.00 0.20 2 25.0 7.00 0.20 3 43.0 7.87 0.20 4 31.0 6.13 0.20 5 43.0 6.13 0.20 6 31.0 7.87 0.20 7 43.0 7.29 0.28 8 31.0 6.71 0.12 9 43.0 6.71 0.12 10 37.0 7.58 0.12 11 31.0 7.29 0.28 12 37.0 6.42 0.28 13 37.0 7.00 0.20 14 37.0 7.00 0.20 15 37.0 7.00 0.20 Analyse de la variance : réponse Y1 : Hoat luc enzym Source de variation Somme des carrés Degrés de liberté Carré moyen Rapport Signif Régression 2.73637E-0003 9 3.04041E-0004 912.1239 0.0975 *** Résidus 1.46772E-0003 5 2.93544E-0004 Validité 1.46705E-0003 3 4.89018E-0004 1467.0550 0.0600 *** Erreur 6.66667E-0007 2 3.33333E-0007 Total 4.20409E-0003 14 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 68 Estimations et statistiques des coefficients : réponse Y1 : Hoat luc enzym Ecart Type de la réponse 0.00058 R2 0.651 R2A 0.022 R2 pred N.D. PRESS 0.015 Nombre de degrés de liberté 2 Nom Coefficient F.Inflation Ecart-Type t.exp. Signif. % b0 0.06923 0.00033 207.70 < 0.01 *** b1 -0.01064 1.00 0.00029 -36.85 0.0493 *** b2 0.00301 1.00 0.00029 10.42 0.649 ** b3 0.00190 1.00 0.00029 6.58 1.89 * b11 -0.02238 1.19 0.00053 -42.47 0.0395 *** b22 -0.03345 1.19 0.00053 -63.47 0.0227 *** b33 -0.01541 1.20 0.00050 -30.83 0.0667 *** b12 -0.00924 1.11 0.00067 -13.86 0.337 ** b13 0.03101 1.11 0.00075 41.60 0.0407 *** b23 -0.00572 1.11 0.00075 -7.67 1.32 * Tableau des résidus : réponse Y1 : Hoat luc enzym N°Exp Yexp. Ycalc. Différence Normée dU 1 0.03480 0.03621 -0.00141 -2.447 0.750 2 0.05890 0.05749 0.00141 2.447 0.750 3 0.03910 0.03184 0.00726 12.581 0.750 4 0.03000 0.03726 -0.00726 -12.581 0.750 5 0.02320 0.03463 -0.01143 -19.790 0.750 6 0.06190 0.05047 0.01143 19.790 0.750 7 0.05180 0.05765 -0.00585 -10.132 0.750 8 0.06930 0.06345 0.00585 10.132 0.750 9 0.04300 0.03016 0.01284 22.235 0.750 10 0.03200 0.05069 -0.01869 -32.367 0.750 11 0.03280 0.04564 -0.01284 -22.235 0.750 12 0.06900 0.05031 0.01869 32.367 0.750 13 0.06890 0.06923 -0.00033 -0.577 0.333 14 0.06990 0.06923 0.00067 1.155 0.333 15 0.06890 0.06923 -0.00033 -0.577 0.333 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 69 Coordonnées du maximum Variable Valeur Facteur Valeur X1 -0.065350 Nhiet do 36.2 X2 0.080023 pH 7.08 X3 0.010479 Nong do chitosan 0.20 Caractéristiques du maximum Réponse Nom de la réponse Valeur di % Poids di min % di max % Y1 Hoat luc enzym 0.0699 100.00 1 0.00 100.00 Y2 Réponse Y2 0.07 100.00 1 0.00 100.00 DESIRABILITE 100.00 0.00 100.00 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 70 Bảng tính khối lượng (NH4)2SO4 bão hòa kết tủa protein Khối lượng (NH4)2SO4 ñược tính theo công thức M= (V.a)/1000 Trong ñó M: khối lượng (NH4)2SO4 cần thiết V: thể tích dịch protein cần kết tủa a: giá trị ghi trên bảng 0 10 15 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 0 56 84 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 610 662 713 767 10 28 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 540 592 640 694 15 28 57 88 107 120 153 185 220 256 294 333 373 445 459 506 556 605 657 20 29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 471 520 569 619 25 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 436 485 533 583 30 14 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 401 449 496 596 33 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 378 426 472 522 35 31 63 94 129 164 200 138 278 319 364 411 457 506 40 31 63 97 132 168 205 245 285 328 375 420 469 45 32 65 99 134 171 210 250 293 339 383 413 50 33 66 101 137 176 214 156 302 345 392 55 33 67 103 141 179 220 264 307 353 60 34 69 105 143 183 227 267 314 65 34 70 107 147 190 232 275 70 35 72 111 153 194 237 75 36 74 115 155 198 80 38 77 117 157 85 39 77 118 90 38 77 95 39 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 71 ẢNH HƯỞNG CỦA pH TỚI HOẠT TÍNH CỦA CHITOSANASE BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE NHUNG 21/ 9/** 22:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ========================================================================= ==== 1 PH 7 .168225E-01 .240322E-02 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 16 .447010E-06 .279381E-07 ------------------------------------------------------------------------ ----- * TOTAL (CORRECTED) 23 .168230E-01 .731433E-03 ------------------------------------------------------------------------ ----- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NHUNG 21/ 9/** 22:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT PH ------------------------------------------------------------------------ ------- PH NOS KQ 3 3 0.950000E-02 f 4 3 0.524333E-01 d 5 3 0.737000E-01 a 6 3 0.588333E-01 b 7 3 0.558333E-01 c 8 3 0.228000E-01 e 9 3 0.586667E-02 g 10 3 0.100000E-02 h SE(N= 3) 0.965024E-04 5%LSD 16DF 0.289316E-03 ------------------------------------------------------------------------ ------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NHUNG 21/ 9/** 22:49 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |PH | (N= 24) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 24 0.34996E-010.27045E-010.16715E-03 0.5 0.0000 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 72 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ðỘ TỚI HOẠT TÍNH CỦA CHITOSANASE BALANCED ANOVA FOR VARIATE HOATTINH FILE NHIETDO 21/ 9/11 11: 8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 HOATTINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ========================================================================= ==== 1 CT 7 .113010E-01 .161444E-02 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 16 .315367E-05 .197105E-06 ------------------------------------------------------------------------ ----- * TOTAL (CORRECTED) 23 .113042E-01 .491487E-03 ------------------------------------------------------------------------ ----- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NHIETDO 21/ 9/11 11: 8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT ------------------------------------------------------------------------ ------- CT NOS HOATTINH 30 3 0.205667E-01 g 40 3 0.554667E-01 d 45 3 0.842333E-01 a 50 3 0.721000E-01 b 55 3 0.593333E-01 c 60 3 0.499667E-01 e 70 3 0.467000E-01 f 80 3 0.166000E-01 h SE(N= 3) 0.256323E-03 5%LSD 16DF 0.768461E-03 ------------------------------------------------------------------------ ------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NHIETDO 21/ 9/11 11: 8 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT | (N= 24) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HOATTINH 24 0.50621E-010.22170E-010.44396E-03 0.9 0.0000 ._.