Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam

YỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2009 i NHỮNG NGƢỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI STT Tên ngƣời tham gia Tên cơ quan 1 ThS. Phạm Văn Phúc Trƣờng ĐH KHTN TPHCM 2 CN. Đô Ngọc Hân Trƣờng ĐH KHTN TPHCM 3 CN. Trƣơng Văn Trí Trƣờng ĐHSP TPHCM CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP • Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM • Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. HCM ii MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG.................................................................................................................. v DANH MỤC HÌNH .................................................................................................................. vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ ......................................................................................................... viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... ix TÓM TẮT .................................................................................................................................. x PHẦN MỞ ĐẦU........................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................. 1 2.Mục tiêu đề tài ................................................................................................................ 2 3. Cách tiếp cận đề tài ........................................................................................................ 2 4. Phƣơng phảp nghiên cứu ............................................................................................... 3 5. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................................... 3 6. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 3 7. Sản phẩm đề tài .............................................................................................................. 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 5 1.1. Tình hình nghiên cứu về đông lạnh trứng ................................................................... 5 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................................ 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ....................................................................... 7 1.2. Sinh lý buồng trứng .................................................................................................... 8 1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng ..................................................... 8 1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng .................................................................. 9 1.2.3. Cấu tạo của trứng ............................................................................................... 12 1.3. Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng ........................................................................ 13 1.3.1. Các phƣơng pháp đông lạnh .............................................................................. 13 1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA) ........................................ 15 1.3.2. 1. Các chất bảo quản thƣờng sử dụng cho phƣơng pháp thủy tinh hóa ......... 15 1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử .............................................................. 16 iii 1.3.3. Các yếu tổ ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng sau khi bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa ................................................................................................................ 18 1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh ................................................................. 19 1.3.3.2. Tính an toàn khi đông lạnh trứng trƣởng thành .......................................... 21 1.4. Ứng dụng của đông lạnh trứng ................................................................................. 23 1.4.1. Ở ngƣời .............................................................................................................. 23 1.4.2. Ở động vật .......................................................................................................... 24 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 25 2.1. Nội dung 1: Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa ... 25 2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng ................................................................................ 25 2.1.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị ...................................................................... 26 2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đông lạnh ......................................... 28 2.1.4. Đông lạnh trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) ............. 29 2.1.5. Phƣơng pháp giải đông các vi giọt đƣợc đông lạnh ........................................... 31 2.1.6. Đông lạnh trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) ............ 33 2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng .................................................................... 35 2.2. Nội dung 2: Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) .......................................................................................................... 35 2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng ............................................................................... 35 2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng ............................................................................... 35 2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 2 ............................................................... 37 2.3. Nội dung 3: Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa .................................................................................................................... 38 2.3.1.Thu nhận buồng trứng ......................................................................................... 38 2.3.2.Thu nhận trứng .................................................................................................... 38 2.3.3.Đông lạnh trứng .................................................................................................. 38 2.3.4. Phƣơng pháp giải đông ...................................................................................... 39 2.4. Xử lý số liệu .............................................................................................................. 39 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN........................................................................ 40 3.1. Kết quả nội dung 1 .................................................................................................... 40 3.1.1. Kết quả thu nhận trứng ...................................................................................... 40 iv 3.1.2. Kết quả nuôi trứng trong ống nghiệm (IVM) .................................................... 41 3.1.3. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1 .................................................................... 44 3.1.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2 ............................................................. 48 3.1.5. Kết quả so sánh giữa 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa trứng heo .......................... 50 3.2. Kết quả nội dung 2 .................................................................................................... 51 3.2.1. Kết quả thu nhận trứng ...................................................................................... 51 3.2.2. Kết quả nuôi trứng bò ........................................................................................ 53 3.2.3. Kết quả đông lạnh trứng bò ............................................................................... 55 3.3. Kết quả nội dung 3 .................................................................................................... 57 3.3.1. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1 .................................................................... 57 3.3.2. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP2 .................................................................... 59 3.3.3. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành theo 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa......................................................................................................................... 61 3.4. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ ......................................................................................................... 63 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò và heo đã trƣởng thành bằng PP2 ................ 64 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 65 4.1. Kết luận ..................................................................................................................... 65 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 67 PHỤ LỤC................................................................................................................................. 75 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Môi trƣờng chuẩn bị thu trứng ................................................................................ 27 Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo ..................................................................................... 40 Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng heo ............................................................................................ 42 Bảng 3.3. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP1 ................................................................... 44 Bảng 3.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2 ................................................................... 48 Bảng 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng heo ....................................................................... 50 Bảng 3.6. Kết quả thu nhận trứng bò ....................................................................................... 51 Bảng 3.7. Kết quả nuôi trứng bò .............................................................................................. 54 Bảng 3.8. Kết quả đông lạnh trứng bò chín bằng PP2 ............................................................. 56 Bảng 3.9. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP1 ..................................................................... 57 Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP2 ................................................................... 59 Bảng 3.11. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành ........................................ 61 Bảng 3.12. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau ............................... 63 Bảng 3.13. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trƣởng thành bằng PP2 ......................... 64 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng ...................................................................... 9 Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng .................................................................. 10 Hình 1.3. Tế bào trứng ............................................................................................................. 12 Hình 1.4. Ảnh hƣởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tính thể đá............................... 19 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 .......................................................................... 25 Hình 2.2: Mầu buồng trứng heo ............................................................................................... 26 Hình 2.3. Thao tác chọc hút trứng từ buồng trứng .................................................................. 28 Hình 2.4. Soi tìm và thu trứng bằng hệ thống kính đảo ngƣợc ................................................ 28 Hình 2.5. Sơ đồ bổ trí đĩa vi giọt đông lạnh ............................................................................ 30 Hình 2.6. Cách tạo vi giọt đông lạnh ....................................................................................... 30 Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN2 .................................................................................. 31 Hình 2.8. Chuyển vì giọt vào cryotube .................................................................................... 31 Hình 2.9. Thao tác đổ vị giọt ra khỏi cryotube ........................................................................ 32 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đông .............................................................................. 32 Hình 2.11. Cọng rạ chứa trứng ................................................................................................ 33 Hình2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng ....................................................... 34 Hình 2.13. Giải đông cọng rạ trong nƣớc ấm .......................................................................... 34 Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng ........................................................................................... 34 Hình 2.15. Chuyển trứng vào môi trƣờng RĐ ......................................................................... 34 Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 ........................................................................ 35 Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 ........................................................................ 38 Hình 3.1. Trứng heo đƣợc thu nhận từ buồng trứng (X100) ................................................... 40 Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất ........................................................... 42 Hình 3.3. Trứng sống ............................................................................................................... 46 Hình 3.4. Trứng có tế bào chất phân mảnh .............................................................................. 46 Hình 3.5. Trứng chết do tế bào chất co lại ............................................................................... 46 vii Hình 3.6. Trứng bò thu nhận từ dịch nang trứng theo phƣơng pháp chọc hút (X40) .............. 51 Hình 3.7. Trứng bò sau khi IVM có lớp cumulus giãn nở (X100) .......................................... 54 Hình 3.8. Trứng bò sau khi IVM xuất hiện thể cực I (X400) .................................................. 54 Hình 3.9. Trứng sống sau giải đông (X100) ............................................................................ 55 Hình 3.10. Trứng chết sau giải đông ........................................................................................ 55 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng ........................................................ 41 Biểu đồ 3.2. Kết quả nuôi trứng heo ........................................................................................ 42 Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đông lạnh theo PP1 ............................................... 45 Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ sổng, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP1 ........................................................................................................................................... 46 Biểu đồ 3.5. Kết quả thu hồi trứng từ đông lạnh theo PP2 ...................................................... 49 Biểu đồ 3. 6. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so vói tổng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 ........................................................................................................................................... 49 Biểu đồ 3.7. Kết quả so sánh bảo quản trứng heo theo 2 phƣơng pháp ................................... 50 Biểu đồ 3.8. Kết quả thu nhận trứng bò từ mẫu buồng trứng .................................................. 52 Biểu đồ 3.9. Kết quả nuôi trứng bò .......................................................................................... 54 Biểu đồ 3.10. Kết quả thu hồi trứng bò chín sau giải đông ..................................................... 56 Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 ... 57 Biểu đồ 3.12. Kết quả thu hồi trứng chƣa chín đƣợc bảo quản theo PP1 ................................ 58 Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP1 ... 59 Biểu đồ 3.14. Kết quả thu hồi trứng chƣa chín đƣợc bảo quản theo PP2 ................................ 60 Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 ... 61 Biểu đồ 3.16. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành .................................... 62 Biểu đồ 3.17. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau ........................... 63 Biểu đồ 3.18. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trƣởng thành bằng PP2 ..................... 64 ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BSA Bovine Serum Albumin DMSO Dimethylsulphoxide CPA Cryoprotective Additive Chất bảo quản lạnh Cs. cộng sự EG Ethylene glycol EGF Epiderman Growth factor Nhân tố tăng trƣởng biểu mô FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum GV Germinal Vesicle Giai đoạn túi mầm GVBD Germinal Vesicle Breakdovvn Giai đoạn phá vỡ túi mầm IIF Intracellular Ice Formation Sự hình thành đá nội bào LH Luteinizing hormone Hormone hoàng thể hóa MU Metaphase II Kì giữa giảm phân II IVM In vitro Maturaration Nuôi trƣởng thành trong ống nghiệm IVF In Vitro Fertilỉzation Thụ tinh trong ống nghiệm PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol PTN Phòng thí nghiệm PP1 Thủy tinh hóa trong vi giọt PP2 Thủy tinh hoa trong cọng rạ PVP Polyvinylpirrolidone x TÓM TẮT Tên đề tài: "Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam " Mã số: CS.2008.19. Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Thị Thƣơng Huyền Tel.: 0918605081 Email: thuonghuyen78@,yahoo.com; huyenntth@,hcmup.edu.vn Cơ quan chủ trì: Trƣờng Đại học Sƣ phạm Tp. HCM Cơ quan phối hợp thực hiện • Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM • Viện Sinh học nhiệt đới Tp. HCM Cá nhân phối họp thực hiện STT Tên ngƣời tham gia Tên cơ quan 1 ThS. Phạm Văn Phúc Trƣờng ĐH KHTN TPHCM 2 CN. Đỗ Ngọc Hân Trƣờng ĐH KHTN TPHCM 3 CN. Trƣơng Văn Trí Trƣờng ĐHSP TPHCM Thời gian thực hiện: tháng 04 - 2008 đến 04 - 2009 1. Mục tiêu Sự phát triển của Công nghệ hỗ trợ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về khoa học. Đề tài tiến hành nhằm mục tiêu thu nhận nguồn giao tử cái (trứng) bò và heo phục vụ cho quá trình bảo quản trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa; đồng thời làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản. 2. Nội dung chính Nội dung 1: Buồng trứng heo đƣợc thu nhận tại lò mổ và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nƣớc muối sinh lý, dùng kim tiêm 18G và xi lanh 5ml thu nhận trứng bằng phƣơng pháp chọc hút. Trứng đƣợc nuôi trong môi trƣờng IVM1 ở 38,5 0 C, 5%CO2, hơi nƣớc bão hòa sau 22 - 24 giờ nuôi, chuyển trứng sang môi trƣờng IVM2 nuôi tiếp cho tới 42 - 44 giờ. Các trứng chín sau khi nuôi đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ theo 2 bƣớc: trứng đƣợc cho vào dung dịch thủy tinh hóa chứa 10% DMSO + 10% EG để trong 45 giây, tiếp theo cho vào dung dịch thủy tinh hóa chứa 20% DMSO + 20% EG + 1M sucrose để trong 25 giây, sau đó cho vào vi giọt hoặc cọng rạ (0,25ml) và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 25 - 40 giây kể từ khi trứng tiếp xúc với dung dịch bảo quản). Giải đông trứng theo 3 bƣớc. Nôi dung 2: Buồng trứng bò đƣợc thu nhận tại lò mổ và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nƣớc muối sinh lý. Trứng đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chọc hút, chọn những trứng có ít nhất 3 lớp cumulus cho vào nuôi trong môi trƣờng C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF). Sau 22 - 24 giờ, chọn những trứng chín đem bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ. Nội dung 3: Trứng bò sau khi đƣợc thi nhận từ buồng trứng bằng phƣơng pháp chọc hút, tiến hành bảo quản những xi trứng tốt (có từ 3 lớp cumulus trở lên) bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ. Các trứng sau giải đông đƣợc đánh giá sống chết bằng quan sát hình thái dƣới kính hiển vi soi nổi (hoặc kính vi thao tác). Tất cả sổ liệu thu nhận đƣợc xử lý bằng phần mền Excel ở độ tin cậy 95%. 3. Kết quả chính đạt đƣợc Kết quả nội dung 1: Đã thu đƣợc 1733 trứng/80 buồng trứng, trung bình 21,66 trứng/buồng; Chọn đƣợc 1189 trứng để nuôi chín, tỷ lệ chín đạt 65,42 ± 0,79% (779 trứng); Có 305 trứng đƣợc đông lạnh theo vi giọt, tỷ lệ sống đạt 46,15 ± 5,63%; 386 trứng đƣợc đông lạnh bằng cọng rạ, tỷ lệ sống đạt 47,54 ± 0,60%. Kết quả nội dung 2: Thu đƣợc 909 trứng/50 buồng trứng, trung bình đạt 18,55 trứng/buồng; Chọn đƣợc 684 trứng đem nuôi, tỷ lệ chín đạt 84,92 ± 0,63% (580 trứng); Đông lạnh 197 trứng bằng cọng rạ, tỷ lệ trứng sống sau giải đông đạt 79,90 ± 2,33%. Kết quả nội dung 3: Đông lạnh 477 trứng bằng vi giọt, tỷ lệ trứng sống sau giải đông là 71,92 ± 2,20%; 365 trứng đông lạnh bằng cọng rạ, tỷ lệ trứng sống sau giải đông là 65,31 ± 2,69%. Từ khóa: nuôi chín trứng, đông lạnh trứng, thủy tinh hóa xii SUMMARY Project Title: "Collected bovine and porcine oocytes to improve oocyte cryopreserved protocol in Vietnamese condition" Code number: CS. 2008.19. Coordinator: MSc. Nguyen Thi Thuong Huyen Tel. 0918605081 Implementing Institution: University of Pedagogy HCMC • Cooperating Institution(s): • University of Natural Science HCMC Intistute of Tropical Biology Ordinal number Full name Office 1 MSc. Pham Van Phuc University of Natural Science HCMC 2 BA. Do Ngoc Han University of Natural Science HCMC 3 BA. Truong Van Tri University of Pedagogy HCMC Duration: from 04-2008 to 04 - 2009 1. Objectives The development of the Assisted reproductive technology and freezing techonology has brought many potential economical and scientific applications. The goal of this study is collecting bovine and porcine oocytes which were then preserved by vitrification methods to be materials for further studies in the field of assisted reproductive technology. 2. Main contens In the first experiment, porcine ovaries were obtained from shaughter house and transferred to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were aspirated from 2 to 8 mm follicles with an 18-gauge needle attached to 5ml syringe. Maturation culture was performed in IVM1 medium under sterile mineral oil at 38.5°C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air for 22-24h. The COCs were subsequently cultured in IVM2 medium under same gas conditions for 20-22h. After 42-44h incubation, matured oocytes (with visible first body and expanded cumulus) were preserved by vitrification in microdrops or straws in two steps, (i) oocytes were incubated in the vitrification solutions containing 10% DMSO + 10% EG in 45 seconds; (ii) oocytes were then subjected in the solution containing 20% DMSO + 20% EG + 1M sucrose in 25 seconds and then were loaded into microdrops or straws (0,25ml) by mouth pipette and pipette Pasteur and the mircrodrops or straws were plunged directly into liquid nitrogen within 25 - 40 seconds after the exposure of eggs to preservation solution. In the second experiment, bovine ovaries were obtained from shaughter house and transferred to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were aspirated in the same way of porcine COCs. Maturation culture was performed in C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF ) medium under xiii sterile mineral oil at 38.5°C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2 in air. After 20- 24h incubation, matured oocytes (with visible first body and expanded cumulus) were preserved by vitrification in straws. In the last experiment, the immatures bovine oocytes were preserved by vitrification in straws. After thrawed, oocytes could be recovered after cryopreservation and were evaluated by morphological examination under a stereomicroscope (confidence level 95%). 3. Results obtained In the first experiment, collected 1733 oocytes from 80 ovaries porcine, average 21.66 oocytes/ovary; 1189 oocytes were cultured, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after in vitro maturation (IVM) are 65.42 ± 0.79% (779 oocytes); 305 oocytes were preserved by vitrification in microdrops, the rates of viability of oocytes are 46.15 ± 5,63%. 386 oocytes were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 47.54 ± 0.60%. In the second experiment, collected 909 oocytes from 50 ovaries bovine, average 18.55 oocytes/ovary; 684 oocytes were cultured, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after IVM are 84.92 ± 0.63% (580 oocytes); 197 oocytes were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 79.90 ± 2.33%. In the last experiment: 477 oocytes were preserved by vitrification in microdrops, the rates of viability of oocytes are 71.92 ± 2.20%. 365 oocytes were preserved by vitrification in straws, the rates of viability of oocytes are 65.31 ± 2.69%. Keywords: in vitro maturation, cryopreservation, vitrification 1 Mở đầu PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sự phát triển của Công nghệ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về khoa học. Đặc biệt, kỹ thuật đông lạnh trứng ngoài việc ứng dụng trong điều trị vô sinh còn là nền tảng cho những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận tế bào gốc phôi, nhân giống vật nuôi, bảo quản nguồn gen in vỉtro, chuyển gen, sinh sản vô tính Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đƣợc triển khai nhằm nhân nhanh đàn bò để thực hiện "Chiến lƣợc phát triển chăn nuôi đến năm 2020 do Thủ tƣớng chính phủ đề ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp khó khăn do nguồn trứng không đủ để tiến hành các thí nghiệm nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro ferttilization_IVF) Nguyên nhân của vấn đề này là do hạn chế trong việc vận chuyển và chi phí. Do đó, cung cấp nguồn trứng có chất lƣợng cao với giá thành thấp đang đƣợc quan tâm. Heo là đối tƣợng động vật quan trọng cho việc nghiên cứu sinh lý và bệnh học ở ngƣời. Kỹ thuât chuyển gen đang đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo ra heo có kiểu gen cho các hƣớng nghiên cứu khác: khai thác tế bào gốc phôi, cắt phôi Xa hơn nữa, công nghệ này còn có khả năng ứng dụng trong Y sinh: cấy ghép cơ quan, nội tạng Bảo quản lạnh giao tử và phôi từ heo có thể là một phƣơng pháp thay thế hữu hiệu trong việc duy trì những cá thể sinh sản nhằm bảo tồn các kiểu gen quý hiếm. Đây là một cuộc cách mạng không chỉ với việc kiểm soát khả năng sinh sản ở heo mà còn với sự gia tăng sử dụng heo trong các ứng dụng về công nghệ Y sinh học. Hiện nay nguồn trứng chủ yếu đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp đông lạnh, song tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông theo tổng kết của các chuyên gia thế giới 2 Mở đầu chƣa cao (bò 30%, ngƣời 10%,). Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc của nhiều nƣớc. Một trong những tác nhân giới hạn thành công của kỹ thuật đông lạnh trứng là xảy ra tổn thƣơng lạnh trong suốt quá trình đông lạnh. Trứng rất dễ tổn thƣơng khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp của quá trình đông lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa (Ruffing và cs., 1993; Martino và cs., 1996). Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đề tài "Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam". 2.Mục tiêu đề tài - Thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trƣởng thành (In vitro Maturaration_IVM) - Thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trƣởng thành sau khi đông lạnh bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa. 3. Cách tiếp cận đề tài • Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề này trong cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phòng thí nghiệm cho phép ứnng dụng Công nghệ Sinh học. • Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm: Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tƣợng bò heo tại Viện Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS. Otoi (Ngƣời Nhật) và các cán bộ của viện đảm trách • Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nƣớc • Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR 3 Mở đầu 4. Phƣơng phảp nghiên cứu • Phƣơng pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông lạnh trứng, giải đông trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông. • Phƣơng pháp tổng họp • Phƣơng pháp so sánh 5. Phạm vi nghiên cứu • Trứng bò từ các nguồn khác nhau: từ viện chăn nuôi quốc gia, lò mổ Vissan Tp. HCM • Trứng heo từ lò mổ Vissan Tp. HCM 6. Nội dung nghiên cứu • NỘI DUNG 1 : Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp ._.thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2) • NỘI DNG 2 : Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) • NỘI DNG 3 : Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2) 7. Sản phẩm đề tài Kết quả khoa học Đã tiến hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bò, heo thu nhận từ lò mổ bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ. Kết quả sản phẩm Đã bảo quản đƣợc số lƣợng trứng vƣợt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh: • 71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM • 36 cọng rạ chứa 197 trứng bò đã IVM 4 Mở đầu • 70 cọng rạ chứa 365 trứng bò chƣa trƣởng thành • 305 trứng heo đã IVM trong vi giọt • 477 trứng bò chƣa trƣởng thành trong vi giọt Kết quả đào tạo 02 cử nhân • Phan Bá Quy: Thử nghiệm bảo quản trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (vitrification)- 2008 • Nguyễn Quốc: Bảo quản trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa (vitrification) - 2009. 01 SV nghiên cứu khoa học đạt giải nhì cấp trƣờng Đỗ Hoàng Hùng: Thử nghiệm bảo quản trứng bò, heo bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (microdrop vitrification) - 2009. Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố • 01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ) • 01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện) 5 Chƣơng I CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu về đông lạnh trứng 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Khái niệm thủy tinh hóa hay toàn bộ vật chất có trạng thái trong suốt giống thủy tinh đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1890, sau đó đƣợc Luyet mô tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937) [46]. Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp [3]. Đến năm 1949, Polge và cs. phát hiện ra glycerol có thể giữ đƣợc sức sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ đƣợc hạ xuống -700C [65]. Phát hiện này mở ra khả năng có thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn. Smith (1952) đã đông lạnh phôi thỏ ở nhiệt độ -790c và -1960c nhƣng đạt kết quả không cao. Sau khi rã đông, chỉ có 1% số phôi đƣợc bảo quản còn giữ đƣợc một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia [76]. Năm 1976, Parkening và cs. tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -300C và -500C có tỉ lệ sống đạt 51 - 56%; ở -750C chỉ đạt 18% trứng sống [60]. Một loạt nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977) [85], Trouson (1977) [77], Massip (1979) [52], đã cải tiến phƣơng pháp đông lạnh và rã đông theo phƣơng pháp giảm từng bƣớc một, nhằm pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn bảo tồn sức sống của phôi, thu đƣợc kết quả tốt ở bò và chuột. Những cải tiến này cũng hạn chế đƣợc sự biến đổi về hình thái học của phôi. Ngày nay, việc đơn giản hóa kĩ thuật đông lạnh và rã đông theo phƣơng pháp một bƣớc (one - step method) do Leibo (1980) đề xuất đã thực sự thúc đẩy việc sử dụng phôi cũng nhƣ tinh trùng đông lạnh rộng rãi trong sản xuất. Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỉ lệ thụ thai đạt 50 - 60% [40]. 6 Chƣơng I Đến năm 1985, Rall và Fahy đã công bố phƣơng pháp đông lạnh cực nhanh còn gọi là phƣơng pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 00C, do đó chỉ mất vài giây để đông lạnh. Và ông đã thực hiện thành công trong trữ lạnh phôi gia súc (bò) [66]. Phƣơng pháp này không yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt tiền hay kĩ năng đặc biệt mà có thể tiến hành rất nhanh. Mặt khác, phƣơng pháp thủy tinh hóa đơn giản hơn phƣơng pháp đông lạnh thông thƣờng. Từ đó, phƣơng pháp thủy tinh hóa đƣợc sử dụng rộng rãi và bây giờ đƣợc xem nhƣ là phƣơng pháp thay thế phƣơng pháp đông lạnh chậm. Mặc dù, phƣơng pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa đƣợc Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [66]. Tuy nhiên, quy trình này chỉ đƣợc Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng ngƣời vào năm 1999 [37] và sau đó vài tháng, quy trình này cũng đƣợc thực hiện đầu tiên trên phôi ngƣời đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane [38]. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời [90]. Kỹ thuật đông lạnh bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa áp dụng thành công trên trứng bò (Martino và cs.,1996) [51]. Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã đông bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991) [72]; 99% (Lane, 2001) [39]; 90% (Kim, 2007) [36]. Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt Chian (2004) thu đƣợc tỷ lệ trứng bò sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)...[17]. Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng heo bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong 7 Chƣơng I dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu đƣợc tỷ lệ sống sau rã đông là 54 - 56% [24]. Trong năm này Martins R.D. và cs. đã đông lạnh trứng bò chƣa chín bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối chứng là 74,6% [50]. Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan Ayhan đã bảo quản trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6% [18]. Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hƣởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy tinh hóa trứng heo sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kim loại. Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bƣớc (trong EG 4% khoảng 10-15 phút ở 370C, sau đó trong dung dịch thủy tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0.3M) [75]. Gupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tinh hóa tƣơng tự với quy trình trên. Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả đƣợc cải thiện khi kết hợp sử dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp 2 chất này trên đổi tƣợng trứng MII. Tuy nhiên phƣơng pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng (chỉ 3.4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20.1%) [28]. Morató và cs. (2008) đã bảo quản trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tƣơng ứng là 88,4% và 94,5% [54]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã đƣợc tiến hành vào năm 1984. Phƣơng pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 120C/phút) sau khi khử nƣớc cục bộ ở nhiệt độ phòng trên phôi bò đã thành công với 63,4% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,2% (23/52) phôi nang thoát màng và tỷ lệ có thai sau khi cấy phôi đông lạnh - rã đông là 33,3% (7/21) [3]. 8 Chƣơng I Năm 1990, con bê Charolais đầu tiên đƣợc sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu [2]. Năm 2003, Lƣu Công Khánh và cs. đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng phôi bò đông lạnh bằng glycerol [5]. - Ngày 24/05/2004, trƣờng hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ [90]. - 2008, Nguyễn Thị Thƣơng Huyền và cs. đã bảo quản thành công trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải đông 58,83% [4]. - Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu nhũ, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (trứng) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi 1.2. Sinh lý buồng trứng 1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng Hình thành nang trứng là quá trình tiếp nối của các giai đoạn từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp và sau đó thành nang thứ cấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy dịch, phồng lên và di chuyển ra ngoài buồng trứng để chuẩn bị rụng trứng - đó là nang trứng chín (Hình 1.1). Và quá trình phát triển này ở gia súc từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn trƣớc rụng trứng mất khoảng 180 ngày (Lussier và cs., 1987) [45]. Từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng đƣờng kính nang trứng bò tăng 30 đến 400 lần (từ 50 μm lên 15 đến 20mm). Trong quá trình này trứng hình thành màng trong suốt, tích lũy một số sản phẩm cần thiết cho sự thụ tinh và các giai đoạn đầu của sự phát triển phôi. Sau khi rụng nang trứng sẽ hình thành thể vàng. 9 Chƣơng I Số lƣợng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và thoái hóa dần trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng có hiệu quả càng ít. Ở bò, bê con lúc mới sinh ra có hơn 100.000 nang trứng và số lƣợng này giảm dần theo độ tuổi. Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng 1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng Một trứng trƣởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó đƣợc phóng thích từ nang trứng trƣởng thành của buồng trứng. Sự trƣởng thành của trứng liên quan mật thiết với sự trƣởng thành của các nang trứng (Hình 1.2). Quá trình phát triển của trứng gồm 4 giai đoạn: Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục- Sự gia tăng số lƣợng tế bào mầm bằng nguyên phân; Sự giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân; Sự trƣởng thành về cấu trúc và chức năng của trứng. Trong quá trình giảm phân của trứng có 2 giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trƣởng (block): 10 Chƣơng I • Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trƣởng lần thứ nhất: khi trứng bƣớc vào giai đoạn prophase của giảm phân I, cho ra trứng sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (Germinal Vesicle_GV). Các trứng sẽ vƣợt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH (Luteinizing hormone) tức khi cá thể đến tuổi trƣởng thành sinh dục. • Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trƣởng lần thứ hai: khi ở giai đoạn metaphase-M của giảm phân II (MU), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MU. Trứng chỉ vƣợt qua đƣợc giai đoạn MU khi có sự thụ tinh của tinh trùng. Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng Sự trƣởng thành của trứng bao gồm những biến đổi ở mức tế bào để hỗ trợ cho sự thụ tinh và thời kỳ đầu của sự phát triển phôi thai (Sirard và cs., 1989) [73]. Sự trƣởng thành trứng bao gồm: 11 Chƣơng I ❖ Sự trƣởng thành về nhân Quá trình trƣờng thành trong nhân trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mầm (Germinal Vesicle Breakdown_GVBD), cô đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi vô sắc, phân chia nhiễm sắc thể tƣơng ứng với việc tách ra của thể cực thứ I và dừng ở metaphase II. Ở bò, các nang trƣởng thành đạt kích thƣớc từ 2 -3mm, một số trứng có khả năng xảy ra hiện tƣợng GVBD và hoàn tất quá trình giảm phân sau đó (Lonergan và cs., 1994 [42]; Fulka và Motlik., 1986 [25]). Và khi trứng đạt đến giai đoạn metaphase II sẽ đạt đƣờng kính là 110μm. Điều này giống với trứng thu từ nang nguyên thủy hoặc sơ cấp (chƣa đạt đến kích thƣớc khảo sát là tối ƣu) không thể tiếp tục hay hoàn tất quá trình giảm phân và sẽ không có khả năng trƣởng thành nhân. Do đó, đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho việc nuôi trƣởng thành in vitro nhẳm đạt kết quả cao nhất. ❖ Sự trƣởng thành về tê bào chất Sự trƣởng thành của tế bào chất bao gồm sự thay đổi toàn diện cấu trúc để trứng tiến từ giai đoạn túi mầm đến giai đoạn metaphase II (Shamsuddin và cs., 1993) [70]. Trong quá trình này, các bào quan đƣợc tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển của phôi. Các ti thể thay đổi theo sự lớn lên của trứng. Khi trứng có kích thƣớc nhỏ hơn 100mm, ti thể có dạng cầu và định vị tại trung tâm trứng. Nhƣng khi trứng có đƣờng kính 100mm, ti thể có hình trứng và di chuyển ra xa vị trí trung tâm, chúng có dạng hình túi và nằm tại vùng ngoại vi của trứng khi tế bào đạt đến kích thƣớc 100mm. Các ti thể di chuyển dọc theo các vi ống đƣợc hình thành trong tế bào chất. Tƣơng tự, các túi mầm sẽ di chuyển ra phía màng trong suốt khi trứng phát triển với kích thƣớc hơn 110mm. Bộ Golgi chịu trách nhiệm hình thành các thể hạt vỏ của màng trong suốt. Và số lƣợng Golgi trong trứng tăng theo đƣờng kính của nang. Có thể dễ dàng quan sát sự thay đổi vị trí của hạt vỏ trong suốt quá tình trƣởng thành của tế bào chất. Cùng với sự thay đổi vị trí, sự thay đổi cấu trúc hạt vỏ là hai yếu tố có ý nghĩa đặc biệt đối với sự thụ tinh của trứng. Các thể hạt vỏ di chuyển ra phía màng trong suốt, giải phóng các chất bên trong làm cho màng 12 Chƣơng I trong suốt thay đổi cấu trúc, tăng kích thƣớc nội bộ và hạn chế sự thụ tinh đa tinh trùng (polyspermy). Do vậy, sự trƣởng thành về tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng của trứng khi thụ tinh, phân chia tế bào và phát triển đến giai đoạn phôi nang. 1.2.3. Cấu tạo của trứng Hình 1.3. Tế bào trứng Xung quanh trứng là lớp tế bào cumulus (granulose cell) kết hợp một cách chuyên biệt với trứng, giữa chúng có khe nối giúp duy trì quá trình trao đổi chất của trứng. Các lớp tế bào cumulus này vừa bảo vệ trứng, vừa cung cấp chất dinh dƣỡng nuôi trứng. Đặc biệt là khi trứng rụng, trứng không còn nguồn cung cấp chất dinh dƣỡng nào khác ngoài tế bào hạt. Tiếp đến là màng phóng xạ tỏa tròn. Bên trong màng phóng xạ là màng trong suốt của trứng, đóng vai trò rất quan trọng trong thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng tế bào chính là khoảng không quanh noãn. Trong màng tế bào chất là bào tƣơng và nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội của loài. Trứng chín là trứng đang ở giai đoạn metaphase II với thể cực thứ nhất. (Hình 1 .3) Hình 1.3. Tế bào trứng 13 Chƣơng I 1.3. Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng 1.3.1. Các phương pháp đông lạnh Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng bình thƣờng của trứng khi giảm nhiệt độ dƣới mức phản ứng hóa học bình thƣờng xảy ra (từ 37°C, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 1960c (nhiệt độ không sinh lý)). Đông lạnh trứng có thể phân loại theo hai cách chung là đông lạnh cân bằng "equilibrium" với phƣơng pháp đông lạnh chậm (slow freezing) hay đông lạnh không cân bằng "nonequilibrium" với phƣơng pháp đông lạnh nhanh (rapid freezing) và phƣơng pháp thủy tinh hóa (vitrification), tùy theo tốc độ làm lạnh và chất bảo quản đông lanh sử dụng. Tuy nhiên, bản chất của các phƣơng pháp này là giống nhau, cụ thể là đều có mục đích chung nhằm bảo vệ tế bào khỏi ảnh hƣởng của tinh thể đá nội bào, sự khử nƣớc và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp. ❖ Phƣơng pháp thủy tinh hóa (Vitrification) Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống nhƣ thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng nhƣ môi trƣờng bên ngoài trong quá trình làm lạnh. [50, 54] Phƣơng pháp này loại trừ hạn chế của quá trình đông lạnh chậm là cần thiết bị phức tạp. Một thuận lợi nữa của phƣơng pháp này là khả năng sống của tế bào cao nếu điều kiện tối ƣu do không có tinh thể đá ngoại bào. Gần đây hơn, những phƣơng pháp thủy tinh hóa cải tiến đã đƣợc phát triển, có khả năng làm lạnh và làm ấm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể tích của dung dịch bảo quản. Phƣơng pháp này hy vọng có khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thƣơng do đông lạnh. 14 Chƣơng I Trong phƣơng pháp thủy tinh hóa, tế bào cần đƣợc xử lí theo các bƣớc đông lạnh thông thƣờng nhƣ cân bằng trong dung dịch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm trong dung dịch đông lạnh nhanh một khoảng thời gian ngắn trƣớc khi đƣợc làm lạnh trong nitơ lỏng. Thời gian tiếp xúc trong dung dịch của phƣơng pháp thủy tinh hóa không chỉ phụ thuộc vào dung dịch bảo vệ đông lạnh mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thấm của tế bào và độc tính của chất bảo quản lạnh chịu ảnh hƣởng rộng bởi nhiệt độ. Tế bào đƣợc huyền phù trong một dung dịch chất bảo quản thấm có nồng độ rất cao ở nhiệt độ phòng. Bởi vì sự hiện diện với nồng độ cao các chất bảo quản có khả năng gây độc cho tế bào nên trứng không đƣợc phép giữ lâu tại nhiệt độ này mà thay vào đó chỉ đƣợc cân bằng đông lạnh trong khoảng thời gian rất ngắn trƣớc khi chúng đƣợc nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. [48] Khác với các phƣơng pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh, trong phƣơng pháp đông lanh cực nhanh, thể tích của dung dịch đông lạnh nhanh đƣợc giảm đến mức tối thiểu sử dụng nhiều công cụ khác nhau. Ví dụ, tế bào đƣợc đặt ở đầu loop hay đƣợc đặt dính ở ống bảo quản lạnh (cryotube hay cryoloop), ống mao dẫn mở (cọng rạ hở "open pulled straw"), hay đông lạnh không có dụng cụ chứa (vi giọt). Mục đích của phƣơng pháp này là làm lạnh và rã đông trứng với thể tích tối thiểu cần cho đông lạnh nhanh. Phƣơng pháp đông lạnh cực nhanh cũng đƣợc đƣa ra để cải tiến sự sổng sót của tế bào sau khi rã đông bởi vì nhiệt độ tới hạn có thể vƣợt qua nhanh chóng trƣớc khi tế bào bị tổn thƣơng. Tuy nhiên chất bảo quản đƣợc dùng trong kỹ thuật này có nồng độ rất cao, có khả năng gây nên những tổn thƣơng về cấu trúc di truyền cho tế bào. Có lẽ đây là lý do tại sao phôi sau trữ lạnh có cấu trúc và phát triển rất tốt khi nuôi trong ống nghiệm nhƣng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phôi vẫn còn rất thấp. Ngƣời ta cho rằng thành công của phƣơng pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng nhƣ thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trƣớc khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tƣợng chuyển dạng từ kính sang nƣớc đá. Hiện tại tuy chƣa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực 15 Chƣơng I tế nhƣng tiềm năng của nó rất lớn vì tính đơn giản và những ƣu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm đang đƣợc sử dụng. [11, 13, 48] 1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA) Các chất bảo quản lạnh đƣợc sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống nhƣ trong kỹ thuật đông lạnh chậm trƣớc đây, nhƣng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm một hoặc hai chất bảo quản lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nƣớc bên trong tế bào và một chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nƣớc bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. [11, 13] 1.3.2. 1. Các chất bảo quản thƣờng sử dụng cho phƣơng pháp thủy tinh hóa ❖ Chất bảo quản lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (đƣợc sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2 - propanediol (PrOH). • Ethylene glycol (EG): Phổ biến nhất và đã đƣợc sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít ảnh hƣởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện vào khoảng 38oC. EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phôi nang và khuếch tán nhanh, cân bằng nhanh chóng với tế bào qua màng trong suốt và màng tế bào. Sau khi đông lạnh trứng và phôi bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa bằng EG đã có sự mang thai bình thƣờng trên động vật và ngƣời. [11] • Dimethyl sulfoxide (DMSO): DMSO đƣợc phát hiện vào năm 1959 nhƣ là một chất bảo quản hiệu quả. Chất này xuyên qua màng dễ dàng hơn glycerol nhƣng tính độc của nó lại cao hơn ở nhiệt độ cao. • Propylene glycol (PG): cũng là một chất tƣơng tự nhƣ glycerol, nhƣng nồng độ của nó đƣợc yêu cầu thấp hơn trong chất đông lạnh, và độc hơn glycerol. 16 Chƣơng I ❖ Chất bảo quản lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose. Các saccharide khác nhau thƣờng đƣợc sử dụng, bao gồm mono-, di- và trisaccharides. Các monosaccharide gồm fructose, glucose, và galactose. Các disaccharide nhƣ sucrose, ƣehalose và lactose. Những sucrose không thấm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẩy nƣớc ra khỏi tế bào. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc nồng độ sucrose cao (1mol/lít) thực sự không gây độc cho phôi và trứng (Kuleshova và cs., 1999) [37]. Trahelose đã đƣợc xem là chất bổ sung của chất bảo quản đông lạnh rất có hiệu quả (Begin và cs., 2003) [14]. Cả sucrose và trehalose ức chế màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ bền của enzyme và màng tế bào. Trong một số trƣờng họp, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơn cả sucrose. [11] Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đòi hỏi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nồng độ cao để làm giảm tinh thể đá. Kết quả là với nồng độ cao có thể dẫn đến sốc thẩm thấu và gây độc hóa học. Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nồng độ cao: (i) Giảm bớt chất bảo quản đông lạnh, (ii) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đông. [54] Trong thành phần môi trƣờng thủy tinh hóa hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng ethylene glycol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thƣờng là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm đƣợc khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm đƣợc độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. [60] 1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử Dung dịch chất bảo quản chứa nhiều hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông. Chẳng hạn nhƣ những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng trứng. Dung dịch bảo quản đông lạnh thƣờng đƣợc 17 Chƣơng I tạo bằng cách thêm vào một lƣợng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trƣờng cấy giao tử và phôi. ❖ Dung dịch đệm Dung dịch thủy tinh hóa là dung dịch chất bảo quản đông lạnh mà không bị đông đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp vói tốc độ làm lạnh cao. Vì vậy môi trƣờng đệm cơ bản sử dụng cho thủy tinh hóa là đệm muối photphat hay đệm HEPES. ❖ Các đại phân tử Các hợp chất đại phân tử đƣợc thêm vào dung dịch chất bảo quản đông lạnh: polyvinylpirrolidone (PVP) nhƣng không thành công trong trong đông lanh phôi và gây độc cao đối với phôi (Wilmut và Rowson, 1973). Polyethylene glycol (PEG) cũng đƣợc sử dụng nhƣ chất bổ sung (Rall và Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), Ficoll. Ngoài ra, còn có các protein lớn gồm albumin huyết thanh bò - Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bò mang thai -Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biến khác là các protein giảm nhiệt -Thermal Hysteresis Proteins (THPs). [55, 66, 86] Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lƣợng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tinh hóa. Thủy tinh hóa ngoại bào cần nồng độ chất bảo quản cao hơn nội bào. Việc thêm polymer có phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Ficoll có khả năng đẩy mạnh thủy tinh hóa ngoại bào với nồng độ chất bảo quản đông lanh giống nhƣ thủy tinh hóa nội bào. Hơn nữa, các polymer có thể tạo ra chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tinh thể đá trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông.Vì thế, các đại phân tử hoạt động nhƣ chất thay thế ngoại bào để làm tăng chất bảo quản đông lạnh bên ngoài, từ đó làm giảm độc cho tế bào. [55, 66] 18 Chƣơng I 1.3.3. Các yếu tổ ảnh hưởng đến chất lượng trứng sau khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thƣơng trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong đó, tổn thƣơng lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thƣơng bởi quy trình đông lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó (Vincent và Johnson, 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa tránh đƣợc sự hình thành đá nội bào (Intracellular Ice Formation_IIF) - ảnh hƣởng đến khả năng sống của trứng sau rã đông - nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn (Rall và Fahy, 1985; Vajta và Kuwayama, 2006). [66, 79,81] Bên cạnh đó, phƣơng pháp thủy tinh hóa dƣờng nhƣ đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996). Ngoài ra, chất lƣợng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố nhƣ những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (Bernard A. và Fuller B.J., 1996). Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái trƣởng thành của chúng, chất lƣợng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng. Ví dụ, khi trƣởng thành, chất lƣợng và kích thƣớc trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hƣởng đến kết quả đông lạnh. [15,29] Phƣơng pháp thủy tinh hóa đã đƣợc áp dụng trên phƣơng diện lâm sàng (Kuleshova và Lopata, 2002). Một vài điều cần lƣu ý có thể dẫn tới tỷ lệ thành công thấp là chất lƣợng nitơ lỏng, thời gian thao tác, tốc độ đông lạnh, ảnh hƣởng chất bảo quản đông lạnh [37] 19 Chƣơng I 1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh ♦ Sự hình thành tinh thể đá Sự hình thành tinh thể nƣớc đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tế bào trong đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nƣớc đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nƣớc đá hình thành có dạng sáu cạnh, hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu khi tốc độ làm lạnh đƣợc đẩy lên (Hình 2.4). [55, 60] Hình 1.4. Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tính thể đá Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.0000 C/giây, nƣớc nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nƣớc đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào. [55, 60] 20 Chƣơng I Ở môi trƣờng đẳng trƣơng (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thƣờng đƣợc hình thành ở nhiệt độ -5 đến -150C. Tuy nhiên, tinh thể nƣớc đá chỉ đƣợc hình thành ở nhiệt độ -100C khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -1300C, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tƣợng thủy tinh hóa (vitrification). Hiện tƣợng này xảy ra khi trong môi trƣờng đông lạnh có các chất hòa tan cũng nhƣ các chất bảo quản có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thƣờng. [55, 60] ♦ Sự khử nƣớc Sự khử nƣớc của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Thông thƣờng các tế bào sẽ có thể bị tổn thƣơng ở nhiệt độ 15 đến -900C. Một khi tế bào không đƣợc khử nƣớc thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dƣới 00C. Tốc độ khử nƣớc của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nƣớc của màng, năng lƣợng hoạt hóa của tính thấm và tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tổ này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong xác định quá trình đông lạnh thích họp nhất. ♦ Độ pH của dung dịch Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid - base của môi trƣờng biến đổi theo hƣớng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trƣờng dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo quản đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid -base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động nhƣ những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động nhƣ những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào đƣợc bảo quản. Ngƣời ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 00C với độ pH lớn hơn 9. 21 Chƣơng I ♦ Sự hình thành bọt khí Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thƣơng và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thể đá. Thể tích nƣớc bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nƣớc đá thấp hơn tỷ trọng của nƣớc) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thƣớc của bọt khí thay đổi từ 25 - 100μm và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lƣợng bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh. Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trƣờng nuôi cấy còn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid - base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thƣơng cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có thể đƣợc hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trƣờng sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trƣờng PBS có thể hạn chế số lƣợng bọt khí. [7, 9] 1.3.3.2. Tính an toàn khi đông lạnh trứng trƣởng thành Nghiên cứu sử dụng trứng trƣởng thành cho thấy khả năng sống của trứng sau đông lạnh và rã đông bị ảnh hƣởng bởi một số các nhân tố. Giữa các nhân tố hình thái, sự có mặt hay vắng mặt các tế bào hạt cumulus trong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên khả năng sống của trứng sau rã đông. Hơn nữa, tổn hại tế bào sau rã đông gần ngƣỡng gây chết sẽ ảnh hƣởng tới khả năng phát triển của chúng. Trứng trƣởng thành không đồng nhất trong sự phân bố và tổ chức các bào quan trong bào tƣơng có thể ảnh hƣởng đến kết quả của quy trình đông lạnh. Trứng ở giai đoạn metapha._.lowing vitrification of a small number of human oocytes. Hum Reprod, 14: 3077 - 3079. 38. Lane M., Schoolcraft WB, Garner DK. (1999). Vitrification of mouse and human blastocysts using novel cryoloop container-less technique. Fertile Steril, 72: 1073 - 1078. 39. Lane, M. and D.K. Gardner. (2001). Vitrification of mouse oocytes using a nylon loop. Mol. Reprod. Devel. 58:342-347. 40. Leibo, S.P. (1980). Water permeability and its activation energy of fertilized and unfertilized mouse ova. J. Memb. Biol. 53:179-188. 41. Longergan, P., Vergos, E., Kinis, A., Sharif, H., Gallagher, M., Gordon, I. (1991). The effect of recovery method on the type of bovine oocyte obtained for in-vitro maturation. Theriogenology 35: 231 (abstr.). 42. Lonergan P., Carolan C. Mermillod P. (1994). Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions. Reprod Nutr Dev, 34: 329. 43. Lonergan Pat, Carolan Catherine, Langendonckt Anne Van, Donnay Isabelle, Khatir Hadj, and Mermillod Pascal (1996). Role of Epidermal Growth Factor in Bovine Oocyte Maturation and Preimplantation Embryo Development In Vitro. Biology of Reproduction 54, 1420-1429. 44. Loos, de F., van Vliet, C, van Maurik, P. and Kruip, Th.A.M. (1989) Morphology of immature bovine oocytes. Gamete Research 24: 197-204. 45. Lussier J.G., Matton P., Dufour J.J. (1987). Growth rates of follicles in the ovary of the cow. J. Reprod Fertil, 81: 301. 46. Luyet B.J. (1937). Differential Staining for Living and Dead Cells. Journal Science, Volume 85,106 47. Maedomari N., Kikuchi K., Ozawa M., Noguchi J., Kaneko H., Ohnuma K., Nakai M., Shino M., Nagai T., Kashiwazaki N. (2007). Cytoplasmic glutathione regulated by cumulus cells during porcine oocyte maturation affects fertilization and embryonic development in vitro Theriogenology, Volume 67, Issue 5, Pages 983-993 48.Magistrini, M. and D. Szollosi. (1980). Effects of cold and isopropyl-N-phenylcarbamate on the second meiotic spindle of mouse oocytes. Europ. J. Cell. Biol. 22:699-707. 49. Mariana Groke Marques, Alessandra Corallo Nicacio, Viviane Purri de Oliveira, Anibal Ballarotti Nascimento, Heloisa Vasconcelos Amaral Caetano, Camilla Mota Mendes, Marco Roberto Bourg Mello, Marcella Pecora Milazzotto, Mayra Elena Ortiz D'Avila Assumpc, - ao, Jos'e Ant^onio Visintin. (2006). In vitro maturation of 71 pig oocytes with different media, hormone and meiosis inhibitors. Animal Reproduction Science. 50. Martins R. D., CostalE. P., ChagaslJ. S. C, Ignácio F. S., Torres C. A. A., McManus C. (2005). Effects of vitrification of immature bovine oocytes on in vitro maturation. Anim. Reprod., v.2, n.2, p. 128-134. 51. Martino A., Songsasen N., Leibo SP. (1996). Develoopment into blsatocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Boil Reprod, 54: 1059 -1069. 52. Massip A., Van der Zwalmen P., Ectors F., De coster R., D'leteren G., Hanzen C. (1979). Deep freezing of cattle embryos in glass ampules or French straws. Journal Theriogenology, Volume 12, pages 79 - 84. 53. Men, H., Monson, R.L., Rutledge, J.J., (2002). Effect of meiotic stages and maturation protocols on bovine oocyte's resistance to cryopreservation. Theriogenology 55, 1095 1103. 54. Morat6 Roser, Izquierdo Dolors, Paramio Maria Teresa, Mogas Teresa (2008). Cryotops versus open-pulled straws (OPS) as carriers for the cryopreservation of bovine oocytes: Effects on spindle and chromosome configuration and embryo development. Cryobiology 57: 137 141. 55. Nakagata, N. (1989). High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fertil. 87:479-483. 56. Ocana-Quero, J. M., Pinedo-Merlm M., Ortega- Mariscal M. and Moreno-Millan M. (1998). Influence of Human and Bovine insulin on In Vitro Maturation, Fertilization and Cleavage rates of Bovine Oocytes. Archivos de zootecnia vol. 47, núm. 177, p 85 - 93. 57. Otoi, T., Yamamoto, K., Koyama, N., Tachikawa, S., and Suzuki, T. (1997) Bovine oocyte diameter in relation to developmental competence. Theriogenology 48:769- 774. 58. Otoi, T., K. Yamamoto, N.Koyama, S. Tachikawa and T. Suzuki. (1998). Cryopreservation of mature bovine oocytes by vitrification in straws. Cryobiology 37:77-85. 59. Park, Y.S., Kim, S.S., Kim, J.M., Park, H.D. and Byun M.D. (2005) The effects of duration of in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent developmet, quality and transfer of embryos. Theriogenology 64:123-134. 60. Parkening T. A., Tsunoda Y. Chang M. C. (1976). Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and evelopment of frozen-thawed mouse eggs. Journal J Exp Zool, Volume 197, pages 369. 61. Parks, J.E. and N.A. Ruffing. (1992). Factors affecting low temperature survival of mammalian oocytes. Theriogenology 37:59-73. 62. Pavlok A., Lucas-Hahn A., Niemann H. (1991). Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different 72 categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. Volume 31 Issue 1, Pages 63 - 67 63. Pereira, D.C., Dode, M.A.N, and Rumpf, R. (2005). Evaluation of different culture systems on the in vitro production of bovine embryos. Theriogenology 63: 1131-1141. 64. Pickering, S.J., P.R. Braude, M.H. Johnson, A. Cant and J. Currie. (1990). Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption ofthe meiotic spindle in the human oocyte. Fertil. Steril. 54:102-108. 65. PoIge C, Smith A. U., Parkes A. S. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Journal nature, Volume 164, page 666. 66. Rail WF, Fahy GM (1985). Ice-free cryopreservation of mouse embryo at -I96°C by vitrification. Nature 313: 573 - 575. 67. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P. and Lonergan, P. (2005) Comparisions between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 63: 939-949 68. Saeki K., Hoshi M., Leibfried-Rutledge M. L. and First N. L. (1991). In Vitro Fertilization and Development of Bovine Oocytes Matured in Serum-Free Medium. Biology of reproduction 44, 256 - 260. 69. Schalkoff, M.E., S.P. Oskowitz and R.D. Powers. (1989). Ultrastructural observations of human and mouse oocytes treated with cryopreservatives. J. In Vitro Fertil. Embryo Transf. 6:168-175. 70. Shamsuddin M., Larsson B., Gustafsson H., Rodriguez-Martinez H. (1993). In vitro development up to hatching of bovine in vitro-matured and fertilized oocytes with or without support from somatic cells. Theriogenology, 39: 1067. 71. Shaw, J.M. and A.O. Trounson. (1989). Parthenogenetic activation of unfertilized oocytes by exposure to 1,2-propanediol is influenced by temperature, oocyte age and cumulus removal. Gamete Res. 24:269-279. 72. Shaw JM., Diotallevi L., Trounson AO. (1991). A simple rapid 4.5 M dimethyl- sulfoxide freezing technique for the cryopreservation of one-cell to blastocyst stage preimplantation mouse embryos. Reprod Fertil Dev, 3: 621. 73. Sirard M. A., Florman H. M., Leibfried-Rutledge M. L., Barnes F. L., Sims M. L., First N. L. (1989). Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes. Biol Reprod, 40: 1257. 74. Sofai Tamas, Kashiwazaki Naomi, Ozawa Manabu, Nakai Michiko, Maedomari Naoki, Noguchi Junko, Kaneko Hiroyuki, Nagai Takashi and Kikuchi Kazuhiro (2008). Effect of Centrifugation Treatment before Vitrification on the Viability of Porcine Mature Oocytes and ygotes 73 Produced In Vitro. Journal of Reproduction and Development, Vol. 54 No. 3. pages 149- 155. 75. Somfai T, Dinnyes A, Sage D, Marosan M, Carnwath JW, Ozawa M, et al (2006). Development to the blastocyst stage of parthenogenetically activated in vitro matured porcine oocytes after solid surface vitrification (SSV). Theriogenology [Epub ahead of print] 76. Smith, A. U. (1952). Behavior of fertilized rabbit eggs exposed to glycerol and to low temperatures. Nature 170:374-375. CrossRef. Medline 77. Trounson A. O., Willadsen S. M., Moor R. M. (1977). Reproductive function in prepubertal lambs: ovulation, embryo development and ovarian steroidogenesis. Journal J Reprod Fetil, Volume 49, Pages 69 -75 78. Vahida Anchamparuthy (2007). Vitrification of bovine oocytes. Dissertation submitted to the Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy In Animal Science. 79. Vajta G., Kuwayama M., (2006). Improving cryopreservation systems. Theriogenology 65: 236 244 80. Van Blerkom, J., and P.W. Davis. (1994). Cytogenetic, cellular, and developmentalconsequences of cryopreservation of immature and mature mouse and human oocytes. Micryoscopy Res. Tech. 27:165-193. 81. Vincent, C, S.J. Pickering, M.H. Johnson and S.J. Quick. (1990). Dimethylsulphoxide affects the organization of microfilaments in the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 26:227-235. 82. Vincent, C. and M.H. Johnson. (1992). Cooling, cryoprotectants, and the cytoskeleton of the mammalian oocyte. Oxford Rev. Reprod. Biol. 14:73-100. 83. Wassarman, P. (1988). The mammalian ovum. Page 69 in The Physiology of Reproduction. E. Knobil and J. Neill, eds. Raven Press, New York. 84. White, K.L. and C. Yue. (1996). Intracellular receptors and agents that induce activation in bovine oocytes. Theriogenology 45:91-100. 85. Willadsen S. M. (1977). Factors affecting the survival of sheep embryos during-freezing and thawing. Journal Ciba Found Symp. Page 175 - 201 , 86. Wilmut, I. and L.E.A. Rowson. (1973). Experiments in the low temperature preservation of cow embryos. Vet. Rec. 92:686-690 87. Wolf, D.P. and M. Hamada. (1977). Induction of zonal and egg plasma membrane blocks to sperm penetration in mouse eggs with cortical granule exudates. Biol. Reprod. 17:350-354. 88. Wu Caihong, Rui Rong, Dai Jianjun, Zhang Chunyan, Shiqiang Ju, Xie Bing, Lu Xiao, and Zheng Xiaofeng (2006). Effects of Cryopreservation on the Developmental Competence, Ultrastructure and 74 Cytoskeletal Structure of Porcine Oocytes. Molecular Reproduction and Development 73:1454 1462 89. Yamauchi N. and Nagai T. (1999). Male Pronuclear Formation in Denuded Porcine Oocytes After In Vitro Maturatio in the Presence of Cysteamine. Biology Of Reproduction 61, 828 833 (1999). 90. 75 Phụ lục PHỤ LỤC 1. Các môi trƣờng thu nhận và nuôi chín trứng Nƣớc muối sinh lý Thành phần Nồng độ NaCl 9,00 g/1 Penicilin 200 UI/ml Streptomycin 200 mg/ml Dung dịch D_PBS Thành phần Nồng độ NaCl 8g/l KC1 0.2 g/1 MgCl2.6H20 0.1 g/1 CaCl2 0.1 g/1 KH2P04 0.2 g/1 Na2HPO4.12H2O 1.15 g/1 Penicilin 100 UI/ml Streptomycin 100 mg/ml Môi trƣờng TCM để nuôi trứng IVM1 Thành phần Nồng độ TCM-199 Dịch nang trứng 10% Natri pyruvate 0.91 mM L - cystein 0.57 mM hCG 10 IU/ml PMSG 10 IU/ml Penicilin 100 UI/ml Streptomycin 100 mg/ml 76 Phụ lục Mỗi trƣờng TCM để chuyển trứng sau 22-24 giờ nuôi IVM2 Thành phần Nồng độ TCM-199 Dịch nang trứng 10% Natri pyruvate 0.9 1 mM L - cystein 0.57 mM Penicilin 100 UI/ml Streptomycin 100 mg/ml 2. Kết quả thu nhận trứng heo Số đợt TN số buồng trứng tổng sổ trứng thu đƣợc Loại A Loại B 1 8 163 62 47 2 8 170 66 43 3 8 166 71 44 4 8 173 69 51 5 8 167 72 45 6 8 176 73 49 7 8 182 82 54 8 8 174 74 52 9 8 179 75 46 10 8 183 79 43 2.1. Xứ lý số liệu về số trứng thu đƣợc trên một buồng trứng Trung binh Ty le trung A Mean 21,6625 Mean 41,67594 Standard Error 0,270063007 Standard Error 0,685733 Median 21,6875 Median 42,21409 Mode #N/A Mode #N/A Standard Deviation 0,854014214 Standard Deviation 2,168477 Sample Variance 0,729340278 Sample Variance 4,702293 Kurtosis - 1,185934473 Kurtosis -0,45553 Skewness 0,003762842 Skewness -0,41313 Range 2,5 Range 7,018135 Minimum 20,375 Minimum 38,03681 Maximum 22,875 Maximum 45,05495 Sum 216,625 Sum 416,7594 Count 10 Count 10 Confidence Level(95,0%) 0,610924965 Confidence Level(95,0%) 1,551235 77 Phụ lục Ty le trung B Mean 27,36523 Standard Error 0,678741 Median 27,39351 Mode #N/A Standard Deviation 2,146367 Sample Variance 4,606889 Kurtosis -0,80395 Skewness -0,43699 Range 6,38779 Minimum 23,49727 Maximum 29,88506 Sum 273,6523 Count 10 Confidence Level (95,0%) 1,535418 2.2. Nuôi trứng chín Số đợt TN A + B Số trứng chín Tỷ lệ trứng heo chín 1 109 68 62,39 2 109 67 61,47 3 115 72 62,61 4 120 77 64,17 5 117 79 67,52 6 122 81 66,39 7 128 86 67,19 8 126 84 66,67 9 121 82 67,77 10 122 83 68,03 Tổng 1189 779 65,42 ± 0,79 Ty le trung heo chín Mean 65,41989 Standard Error 0,793633 Median 66,53005 Mode #N/A Standard Deviation 2,509689 Sample Variance 6,298539 Kurtosis -1,57052 Skewness -0,57457 Range 6,564897 Minimum 61,46789 Maximum 68,03279 Sum 654,1989 Count 10 Confidence Level(95,0%) 1,795323 78 Phụ lục Đông lạnh trứng bàng PP2 Số straw Số trứng đem đông lạnh Số trứng thu hồi sau đông lạnh Ty le thu hoi Số trứng sống 6 33 25 75,76 12 5 31 22 70,97 10 7 38 29 76,32 14 7 39 31 79.49 14 8 41 35 8537 16 8 42 35 83 33 17 7 39 32 82,05 15 8 43 36 83,72 17 8 41 35 85,37 17 7 39 33 84,62 17 71 386 313 80,70 ±1,55 149 2.4. Xử lý số liệu đông lạnh trứng heo theo PP2 Ty le thu hoi Mean 80,69809242 Standard Error 1,551320757 Median 82,69230769 Mode 85,36585366 Standard Deviation 4,905706972 Sample Variance 24,0659609 Kurtosis - 0.099477945 Skewness - 0,959819227 Range 14,39811172 Minimum 70,96774194 Maximum 85,36585366 Sum 806,9809242 Count 10 Confidence Level(95,0%) 3.509331354 Ty le song/thu hoi Ty le song/ so trung dong lanh Mean 47,53612144 Mean 38,39114 Standard Error 0,601537684 Standard Error 1,015816 Median 47,61111111 Median 38,74296 Mode 48,57142857 Mode #N/A Standard Deviation 1,90222918 Standard Deviation 3,212292 Sample Variance 3,618475853 Sample Variance 10,31882 Kurtosis 0,913406203 Kurtosis 0,408826 Skewness 0,745437488 Skewness -0,32659 Range 6,353861193 Range 11,33168 Minimum 45,16129032 Minimum 32,25806 Maximum 51,51515152 Maximum 43,58974 Sum 475,3612144 Sum 383,9114 Count 10 Count 10 Confidence Level(95,0%) 1,360772778 Confidence Level(95,0%) 2,297935 79 Phụ lục 2.5. Kết quả đông lạnh trứng heo theo PP1 Số đợt TN Số vo giọt So trung ĐL So trung thu hoi Ty le thu hoi So trung song 1 8 58 32 55,17 15 2 8 53 46 86,79 18 3 10 73 57 78,08 21 4 4 32 32 100,00 11 5 3 21 14 66,67 9 6 3 20 12 60,00 6 7 4 28 11 39,29 8 8 3 20 12 60,00 3 43 305 21668,25 ± 6,81 91 2.6. Xử lý kết quả đông lạnh trứng heo theo PP1 Ty le thu hoi Ty le song/thu hoi Mean 68,24992992 Mean 46,15444088 Standard Error 6,810105548 standard Error 5,625972695 Median 63,33333333 Median 43,00271739 Mode 60 Mode #N/A Standard Deviation 19,26188726 standard Deviation 15,91265377 Sample Variance 371,0203006 Sample Variance 253,2125501 - Kurtosis 0,202388479 Kurtosis - 0,427632468 Skevvness 0,311032897 Skevvness 0,592134845 Range 60,71428571 Range 47,72727273 Minimum 39,28571429 Minimum 25 Maximum 100 Maximum 72,72727273 Sum 545,9994394 Sum 369,2355271 Count 8 Count 8 Contidence Level(95,0%) 16,10334073 Confidence Level(95,0%] 13,30331147 Ty le song/so trung ?L Mean 29,92438 standard Error 2,821423 Median 29,38356 Mode #N/A standard Deviation 7,980188 Sample Variance 63,6834 Kurtosis 1,738241 Skevvness - 0,40411 Range 27,85714 Minimum 15 Maximum 42,85714 Sum 239,395 Count 8 Contidence Level(95,0%) 6,671604 80 Phụ lục 2.7. Xử lý số liệu so sánh đông lạnh trứng heo theo 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Cọng rạ Vi giọt Ty le thu hoi Ty le thu hoi Mean 80,69809 68,24992992 Variance 24,06596 371,0203006 Observations 10 8 Pooled Variance 175,8585 Hypothesized Mean Difference 0 df 16 tStat 1,978939 P(T<=t) one-tail 0,03265 t Critical one-tail 1,745884 P(T<=t) two-tail 0,065299 t Critical tvvo-tail 2,119905 t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Cọng rạ Vi giọt Ty le song/thu hoi Ty le song/thu hoi Mean 47,53612144 46,15444088 Variance 3,618475853 253,2125501 Observations 10 8 Pooled Variance 112,8158833 Hypothesized Mean Difference 0 df 16 tStat 0,274240293 P(T<=t) one-tail 0,39370455 t Critical one-tail 1,745883669 P(T<=t) two-tail 0.7874091 t Critical two-tail 2,119905285 t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Cọng rạ Vì giọt Ty le song/so trung dong lanh Ty le song/so trung ĐL Mean 38,39114 29,92438 Variance 10,31882 63,6834 Observations 10 8 Pooled Variance 33,66582 Hypothesized Mean Difference 0 df 16 tStat 3,07632 P(T<=t) one-tail 0,003615 t Critical one-tail 1,745884 P(T<=t) two-tail 0,00723 t Critical two-tail 2,119905 81 Phụ lục 3. Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ 3.1. Kết quả thu nhận trứng lo TN số buồng trứng tổng trứng loai A loại B 1 7 105 65 21 2 6 84 47 15 3 4 82 46 16 4 6 112 67 21 5 6 87 46 16 6 5 106 55 22 7 4 91 56 17 8 6 132 64 23 9 6 110 66 21 50 909 512 172 Số trứng / buồng Mean 18,55 Standard Error 1,118875648 Median 18,66666667 Mode #N/A Standard Deviation 3,356626944 Sample Variance 11,26694444 Kurtosis - 1,67418481 Skewness - 0,272813353 Range 8,75 Minimum 14 Maximum 22,75 Sum 166,95 Count 9 Confidence Level(95,0%) 2,580131869 Tỷ lệ trứng loại A Tỷ lệ trứng loại B Mean 56,5066442 Mean 18,94014775 Standard Error 1,56797933 Standard Error 0,346444451 Median 56,097561 Median 18,75 Mode #N/A Mode #N/A Standard Deviation 4,703938 Standard Deviation 1,039333354 Sample Variance 22,1270327 Sample Variance 1,080213821 Kurtosis - 0,99865743 Kurtosis - 0,218128265 Skewness - 0,46204462 Skewness 0,34529797 Range 13,4199134 Range 3,330474557 Minimum 48,4848485 Minimum 17,42424242 Maximum 61,9047619 Maximum 20,75471698 Sum 508,559798 Sum 170,4613298 Count 9 Count 9 Confidence Level(95,0%) 3,61576682 Confidence Level(95,0%) 0,798902337 82 Phụ lục 3.2. Kết quả nuôi trứng bò Số đợt TN Tổng trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng đem nuôi Trứng chín Tỷ lệ % 1 86 81,90 72 83,72 2 62 73,81 53 85,48 3 62 75,61 52 83,87 4 88 78,57 73 82,95 5 62 71,26 55 88,71 6 77 72,64 64 83,12 7 73 80,22 63 86,30 8 87 65,91 73 83,91 9 87 79,09 75 86,21 68475,45 ±1,69 58084,92 ± 0,63 Tỷ lệ trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng chín Mean 75,44679 Mean 84,91924 standard Error 1,693808 standard Error 0,633776 Median 75,60976 Median 83,90805 Mode #N/A Mode #N/A standard Deviation 5,081424 standard Deviation 1,901329 Sample Variance 25,82087 Sample Variance 3,615052 Kurtosis - 0,07971 Kurtosis 0,402795 Skevvness - 0,62504 Skevvness 0,983648 Range 15,99567 Range 5,755132 Minimum 65,90909 Minimum 82,95455 Maximum 81,90476 Maximum 88,70968 Sum 679,0211 Sum 764,2732 Count 9 Count 9 Confidence Level(95,0%) 3,905928 Confidence Level(95,0%) 1,461491 3.3. Kết quả đông lạnh trứng bò Số cọng rạ Số trứng đông lạnh Số trứng thu hồi Tỷ lệ thu hồi Số trứng sống Tỷ lệ trứng sống Tỷ lệ trứng sống/ số trứng đông lạnh 4 22 17 77,27 11 64,71 50,00 4 23 18 78,26 13 72,22 56,52 4 24 19 79,17 15 78,95 62,50 4 20 18 90,00 15 83,33 75,00 4 21 17 80,95 14 82,35 66,67 4 20 18 90,00 15 83,33 75,00 4 22 19 86,36 16 84,21 72,73 4 22 20 90,91 17 85,00 77,27 4 23 20 86,98 17 85,00 73,91 36 197 166 133 67,73 ± 3,18 83 Phụ lục Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ trứng sống/số trứng thu hồi Mean 84,4313215 Mean 79,90062302 Standard Error 1,837993699 Standard Error 2,330087323 Median 86,36363636 Median 83,33333333 Mode 90 Mode 83,33333333 Standard Deviation 5,513981096 Standard Deviation 6,990261969 Sample Variance 30,40398753 Sample Variance 48,8637624 Kurtosis -2,042065976 Kurtosis 2,024270268 Skewness -0,143126624 Skewness -1,656602558 Range 13,63636364 Range 20,29411765 Minimum 77,27272727 Minimum 64,70588235 Maximum 90,90909091 Maximum 85 Sum 759,8818935 Sum 719,1056072 Count 9 Count 9 Confidence Level(95,0%) 4,238421066 Confidence Level(95,0%) 5,373190998 Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL Mean 67,73349436 Standard Error 3,180744333 Median 72,72727273 Mode 75 Standard Deviation 9,542232998 Sample Variance 91,0542106 Kurtosis - 0,326702762 Skewness -0,949783408 Range 27,27272727 Minimum 50 Maximum 77,27272727 Sum 609,6014493 Count 9 Confidence Level(95,0%) 7,334809578 4. Kết quả đông lạnh trứng bò theo vi giọt Đợt TN Số vi giọt Số trứng đông lạnh Số trứng thu hồi Tỷ lệ thu hồi Số trứng sống 1 7 50 37 74,00 28 2 10 71 55 77,46 41 3 9 65 43 66,15 27 4 9 60 41 68,33 28 5 6 55 40 72,73 27 6 10 66 50 75,76 34 7 8 48 39 81,25 30 8 9 62 49 79,03 40 68 477 354 74,34 ±1,83 255 84 Phụ lục Tỷ lệ thu hồi Mean 74,33988435 Standard Error 1,829074999 Median 74,87878788 Mode #N/A Standard Deviation 5,173405341 Sample Variance 26,76412283 Kurtosis - 0,753469629 Skewness - 0,416631211 Range 15,09615385 Minimum 66,15384615 Maximum 81,25 Sum 594,7190748 Count 8 Confidence Level(95,0%) 4,3250751 Tỷ lệ trứng sống/ thu hồi Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL Mean 71,9200301 Mean 53,69672 Standard Error 2,202956251 Standard Error 2,801405 Median 71,41906874 Median 53,75758 Mode #N/A Mode #N/A Standard Deviation 6,230901215 Standard Deviation 7,923569 Sample Variance 38,82412995 Sample Variance 62,78295 Kurtosis - 0,917277014 Kurtosis -1,00556 Skewness 0,123887189 Skewness -0,08631 Range 18,84195539 Range 22,97767 Minimum 62,79069767 Minimum 41,53846 Maximum 81,63265306 Maximum 64,51613 Sum 575,3602408 Sum 429,5738 8 Count 8 Count 8 Confidence Level(95,0%) 5,209163775 Confidence Level(95,0%) 6,62427 5. Kết quả đông lạnh trứng bò theo cọng rạ Đợt TN Số Sstraw Số trứng đông lạnh Số trứng thu hồi Tỷ lệ thu hồi Số trứng 1 12 61 48 78,69 36 2 10 50 42 84,00 28 3 8 44 30 68,18 17 4 8 40 25 62,50 16 5 13 70 47 67,14 27 6 8 44 34 77,27 25 7 11 56 36 64,29 23 70 365 262 71,72 ±3,10 172 85 Phụ lục Tỷ lệ thu hồi Mean 71,72452 Standard Error 3,101218 Median 68,18182 Mode #N/A Standard Deviation 8,205053 Sample Variance 67,32289 Kurtosis - 1,59993 Skewness 0,431313 Range 21,5 Minimum 62,5 Maximum 84 Sum 502,0716 Count 7 Confidence Level(95,0%) 7,588408 Tỷ lệ trứng sống/thu hồi Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL Mean 65,31406321 Mean 47,15911372 Standard Error 2,688458166 Standard Error 3,608034599 Median 64 Median 41,07142857 Mode #N/A Mode #N/A Standard Deviation 7,112991716 Standard Deviation 9,545962271 Sample Variance 50,59465116 Sample Variance 91,12539568 Kurtosis -1,2453122 Kurtosis -2,62962447 Skewness 0,211967536 Skewness 0,379373845 Range 18,33333333 Range 20,44496487 Minimum 56,66666667 Minimum 38,57142857 Maximum 75 Maximum 59,01639344 Sum 457,1984425 Sum 330,113796 Count 7 Count 7 Confidence Level(95,0%) 6,578420134 Confidence Level(95,0%) 8,828542603 86 Phụ lục 6. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành theo 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Vi giọt Cọng ra Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ thu hồi Mean 74,339887 1,72452021 Variance 26,764126 7,32289058 Observations 8 7 Pooled Variance 45,48355 Hypothesized Mean Difference 0 df 13 tStat 0,749296 P(T<=t) one-tail 0,233511 t Critical one-tail 1,770933 P(T<=t) two-tail 0,467022 Mean 2,160369 t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Vi giọt Cọng ra Tỷ lệ trứng sống/thu hồi Tỷ lệ trứng sống/ thu hồi Mean 71,9200301 65,31406321 Variance 38,82412995 50,59465116 Observations 8 7 Pooled Variance 44,2566782 Hypothesized Mean Difference 0 df 13 tStat 1,918648284 P(T<=t) one-tail 0,038627266 t Critical one-tail 1,770933383 P(T<=t) two-tail 0,077254532 t Critical two-tail 2,160368652 7. So sánh đông lanh trứng bò bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa cọng rạ ở 2 giai đoạn khác nhau t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Chƣa chín Chín Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ thu hồi Mean 71,72452 84,4313215 Variance 67,32289 30,40398753 Observations 7 9 Pooled Variance 46,22637 Hypothesized Mean Difference 0 df 14 tStat -3,70853 P(T<=t) one-tail 0,001169 t Critical one-tail 1,76131 P(T<=t) two-tail 0,002338 t Critical two-tail 2,144787 87 Phụ lục t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Chƣa chín Chín Tỷ lệ trứng sống/thu hồi Tỷ lệ trứnq sống/thu hồi Mean 65,31406321 79,90062302 Variance 50,59465116 48,8637624 Observations 7 9 Pooled Variance 49,60557187 Hypothesized Mean Difference 0 df 14 tStat -4,109584645 P(T<=t) one-tail 0,000531035 t Critical one-tail 1,761310115 P(T<=t) two-tail 0,00106207 t Critical two-tail 2,144786681 t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Chƣa chín Chín Tỷ lệ trứng sống/số trứng ĐL Tỷ lệ trứng sống/số trứng đông lạnh Mean 47,15911 67,73349 Variance 91,1254 91,05421 Observations 7 9 Pooled Variance 91,08472 Hypothesized Mean Difference 0 df 14 tStat -4,27774 P(T<=t) one-tail 0,000383 t Critical one-tail 1,76131 P(T<=t) two-tail 0,000766 t Critical two-tail 2,144787 8. So sánh bảo quản trứng bò, heo đã chín bằng cọng rạ t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances Trứng bò Trứng heo Tỷ lệ thu hồi Ty le thu Mean 84,43132 80,69809242 Variance 30,40399 24,0659609 Observations 9 10 Pooled Variance 0 Hypothesized Mean Difference 16 df 16 tStat 1,552172 P(T<=t) one-tail 0,070088 t Critical one-tail 1,745884 P(T<=t) two-tail 0,140175 t Critical two-tail 2,119905 88 Phụ lục t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances Trứng bò Trứng heo Tỷ lê trứng sống Tỷ lệ sống/thu hồi Mean 79,90062302 47,53612144 Variance 48,8637624 3,618475853 Observations 9 10 Hypothesized Mean Difference 0 df 9 tstat 13,44888706 P(T<=t) one-tail 1,44997E-07 t Critical one-tail 1,833112923 P(T<=t) two-tail 2.89994E-07 t Critical two-tail 2,262157158 t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances Tỷ lệ trứng sống/số trứng đông lạnh Ty le song/so trung dong lanh Mean 67,73349 38,39114 Variance 91,05421 10,31882 Observations 9 10 Hypothesized Mean Difference 0 df 10 tStat 8,787729 P(T<=t) one-tail 2.56E-06 t Critical one-tail 1,812461 P(T<=t) two-tail 5.13E-06 t Critical two-tail 2,228139 Đề tài: THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐẺ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Tp. HCM ngày 08 tháng 05 năm 2009 Chủ nhiêm đề tài ThS. Nguyễn Thị Thƣơng Huyền Xác nhận của đơn vị chủ trì TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp. Hồ Chí Minh Fax: 84 8 38350096 Tel: 84 8 38300529 HỘI NGHỊ KHOA HỌC LẦN THỨ 6 THE 6th SCIENTIFIC CONFERENCE 14/11/2008 TẬP TÓM TẮT BÁO CÁO ABSTRACT Tp. Hồ Chí Minh-2008 IV - O - 3.5 BẢO QUẢN TRÚNG BÒ TRƢỞNG THÀNH BẰNG PHƢƠNG PHÁP THỦY TINH TRONG CỌNG RẠ Nguyễn Thị Thƣơng Huyền1,2, Võ Thị Tuyết Nga1, Nguyễn Thị Thanh Xuân1, Hoàng Thị Bích Tuyền1, Nguyễn Thị Phƣơng Dung1, Đặng Thị Thu Thủy1, Phạm Kim Ngọc1 1 Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQG Tp. HCM 2Trƣờng Đại học Sƣ phạm Tp. HCM Tóm tắt Trứng đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chọc hút, chuyển trứng vào môi trƣờng Cl (TCM199, 10% FBS, hCG, EGF) và nuôi ở 38,50C và 5% CO2. Trứng chín đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa: trứng đƣợc cho vào dung dịch chứa 10% DMSO + 10% EG trong 45 giây, tiếp theo cho vào dung chứa 20% DMSO + 20% EG + IM sucrose trong 25 giây, sau đó cho vào cọng rạ (0,25 ml) và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 25-40 giây kê từ khi trứng tiếp xúc với dung dịch bảo quản). Giải đông trứng theo quy trình 3 bƣớc. Kết quả thu đƣợc 224/536 trứng chín sau khi nuôi 24 tiếng (41,84 ± 13,50%). Tổng cộng có 114/194 trứng sống sau giải đông, đạt tỷ lệ 58,83 ± 11,10% (độ tin cậy 95%) theo quan sát hình thái. Từ khóa: Đông lạnh thủy tinh hóa, trứng bò. CRYOPRESERVATION OF MATURE BOVINE OOCYTES BY VITRIFICATION IN STRAWS Nguyen Thi Thuong Huyen 1,2 , Vo Thi Tuyet Nga 1 , Nguyen Thi Thanh Xuan 1 , Hoang Thi Bich Tuyen 1 , Nguyen Thi Phuong Dung 1 , Dang Thi Thu Thuy 1 , Phan Kim Ngoc 1 1 Falcuty of Biology, University of Science-VNU HCMC, 2 University of Pedagogy HCMC Abstract Bovine oocytes collected using follicle - puncturing method were cultured in Cl medium (TCM-199, 10% FBS, hCG, EGF) at 38,5 0 C, 5% CO2. Matured oocytes were cryopreserved by vitrification in two steps, (i) oocytes were incubated in the solutions containing 10% DMSO + 10% EG in 45 seconds; (ii) oocytes were then subjected in the solution containing 20% DMSO + 20% EG + 1M sucrose in 25 seconds and then loaded into straws (0,25 ml); the straws were plunged directly into liquid nitrogen within 25 - 40 seconds of beginning with the exposure to step two. Oocytes were thawed in three step procedure. After 20 - 24h incubation, the number of oocytes which were observed Metaphase II stage were 224/536 oocytes (41,84 ± 13,50%) and 114/194 (58,83 ± 11,10%) oocytes could be recovered after cryopreservation by morphological examination. Key words: Vitrification, bovine oocytes. ._.