Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam

ghĩa khơng chỉ về kinh tế mà cịn cĩ ý nghĩa về khoa học. Đặc biệt, kỹ thuật đơng lạnh trứng ngồi việc ứng dụng trong điều trị vơ sinh cịn là nền tảng cho những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận tế bào gốc phơi, nhân giống vật nuơi, bảo quản nguồn gen in vitro, chuyển gen, sinh sản vơ tính… Ở nước ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được triển khai nhằm nhân nhanh đàn bị để thực hiện “Chiến lược phát triển chăn nuơi đến năm 2020” do Thủ tướng chính phủ đề ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này cịn gặp khĩ khăn do nguồn trứng khơng đủ để tiến hành các thí nghiệm nuơi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization_IVF)…Nguyên nhân của vấn đề này là do hạn chế trong việc vận chuyển và chi phí. Do đĩ, cung cấp nguồn trứng cĩ chất lượng cao với giá thành thấp đang được quan tâm. Heo là đối tượng động vật quan trọng cho việc nghiên cứu sinh lý và bệnh học ở người. Kỹ thuât chuyển gen đang đĩng vai trị thiết yếu trong việc tạo ra heo cĩ kiểu gen cho các hướng nghiên cứu khác: khai thác tế bào gốc phơi, cắt phơi… Xa hơn nữa, cơng nghệ này cịn cĩ khả năng ứng dụng trong Y sinh: cấy ghép cơ quan, nội tạng… Bảo quản lạnh giao tử và phơi từ heo cĩ thể là một phuơng pháp thay thế hữu hiệu trong việc duy trì những cá thể sinh sản nhằm bảo tồn các kiểu gen quý hiếm. Đây là một cuộc cách mạng khơng chỉ với việc kiểm sốt khả năng sinh sản ở heo mà cịn với sự gia tăng sử dụng heo trong các ứng dụng về cơng nghệ Y sinh học. Hiện nay nguồn trứng chủ yếu được bảo quản bằng phương pháp đơng lạnh, song tỷ lệ trứng sống sau khi rã đơng theo tổng kết của các chuyên gia thế giới chưa cao (bị 30%, người 10%,). Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong cơng việc của nhiều nước. Một trong những tác nhân giới hạn thành cơng của kỹ thuật đơng lạnh trứng là xảy ra tổn thương lạnh trong suốt quá trình đơng lạnh. Trứng rất dễ tổn thương khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp của quá trình đơng lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phương pháp thủy tinh hĩa (Ruffing và cs., 1993; Martino và cs., 1996). Trên cơ sở đĩ, chúng tơi mạnh dạn thực hiện đề tài “Thu nhận trứng bị, heo để cải thiện cải thiện quy trình đơng lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam”. 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Thu nhận và nuơi trứng bị, heo đến giai đoạn trưởng thành (In vitro Maturaration_IVM) - Thử nghiệm khả năng sống của trứng bị, heo trưởng thành sau khi đơng lạnh bằng phương pháp thủy tinh hĩa. 3. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI  Tiếp cận với nhu cầu địi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề này trong cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phịng thí nghiệm cho phép ứnng dụng Cơng nghệ Sinh học.  Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm: Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuơi, đơng lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bị heo tại Viện Chăn nuơi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS. Otoi (Người Nhật) và các cán bộ của viện đảm trách…  Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngồi nước  Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đơng lạnh và giải đơng trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR… 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Phương pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đơng lạnh trứng, giải đơng trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đơng.  Phương pháp tổng hợp  Phương pháp so sánh 5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU  Trứng bị từ các nguồn khác nhau: từ viện chăn nuơi quốc gia, lị mổ Vissan  Trứng heo từ lị mổ Vissan Tp. HCM 6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  NỘI DUNG 1: Đơng lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)  NỘI DUNG 2: Đơng lạnh trứng bị trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong cọng rạ (PP2)  NỘI DUNG 3: Đơng lạnh trứng bị chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2) 7. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI Kết quả khoa học Đã tiến hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bị, heo thu nhận từ lị mổ bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong vi giọt và trong cọng rạ. Kết quả sản phẩm Đã bảo quản được số lượng trứng vượt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh:  71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM  36 cọng rạ chứa 197 trứng bị đã IVM  70 cọng rạ chứa 365 trứng bị chưa trưởng thành  305 trứng heo đã IVM trong vi giọt  477 trứng bị chưa trưởng thành trong vi giọt Kết quả đào tạo 02 cử nhân  Phan Bá Quy: Thử nghiệm bảo quản trứng bị trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong cọng rạ (vitrification)- 2008  Nguyễn Quốc: Bảo quản trứng bị bằng phương pháp thủy tinh hĩa (vitrification) – 2009. (Chuẩn bị báo cáo tốt nghiệp vào ngày 25/05/2009) 01 SV nghiên cứu khoa học đạt giải nhì cấp trường Đỗ Hồng Hùng: Thử nghiệm bảo quản trứng bị, heo bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong vi giọt (microdrop vitrification) – 2009. Kết quả bài báo, báo cáo đã cơng bố  01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, 2008 (Bảo quản trứng bị bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong cọng rạ)  01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, 2008 (Bảo quản trứng bị bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong cọng rạ; đang chờ phản biện) CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐƠNG LẠNH TRỨNG 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước Khái niệm thủy tinh hĩa hay tồn bộ vật chất cĩ trạng thái trong suốt giống thủy tinh được mơ tả đầu tiên vào năm 1890, sau đĩ được Luyet mơ tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937) [46]. Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản phơi thỏ ở nhiệt độ thấp [3]. Đến năm 1949, Polge và cs. phát hiện ra glycerol cĩ thể giữ được sức sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ được hạ xuống -70oC [65]. Phát hiện này mở ra khả năng cĩ thể bảo quản các loại tế bào và mơ ở nhiệt độ thấp hơn. Smith (1952) đã đơng lạnh phơi thỏ ở nhiệt độ -79oC và -196oC nhưng đạt kết quả khơng cao. Sau khi rã đơng, chỉ cĩ 1% số phơi được bảo quản cịn giữ được một phơi bào cĩ khả năng tiếp tục phân chia [76]. Năm 1976, Parkening và cs. tiến hành đơng lạnh trứng chuột ở -30oC và -50oC cĩ tỉ lệ sống đạt 51 – 56%; ở -75oC chỉ đạt 18% trứng sống [60]. Một loạt nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977) [85], Trouson (1977) [77], Massip (1979) [52], đã cải tiến phương pháp đơng lạnh và rã đơng theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm pha lỗng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đơng lạnh và rã đơng mà vẫn bảo tồn sức sống của phơi, thu được kết quả tốt ở bị và chuột. Những cải tiến này cũng hạn chế được sự biến đổi về hình thái học của phơi. Ngày nay, việc đơn giản hĩa kĩ thuật đơng lạnh và rã đơng theo phương pháp một bước (one – step method) do Leibo (1980) đề xuất đã thực sự thúc đẩy việc sử dụng phơi cũng như tinh trùng đơng lạnh rộng rãi trong sản xuất. Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đơng lạnh thì sức sống của phơi đạt trên 80% và tỉ lệ thụ thai đạt 50 – 60% [40]. Đến năm 1985, Rall và Fahy đã cơng bố phương pháp đơng lạnh cực nhanh cịn gọi là phương pháp thủy tinh hĩa, bằng cách nhúng trực tiếp phơi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 0oC, do đĩ chỉ mất vài giây để đơng lạnh. Và ơng đã thực hiện thành cơng trong trữ lạnh phơi gia súc (bị) [66]. Phương pháp này khơng yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt tiền hay kĩ năng đặc biệt mà cĩ thể tiến hành rất nhanh. Mặt khác, phương pháp thủy tinh hĩa đơn giản hơn phương pháp đơng lạnh thơng thường. Từ đĩ, phương pháp thủy tinh hĩa được sử dụng rộng rãi và bây giờ được xem như là phương pháp thay thế phương pháp đơng lạnh chậm. Mặc dù, phương pháp đơng lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hĩa được Rall và Fahy thực hiện thành cơng đầu tiên trên phơi bị vào năm 1985 [66]. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 [37] và sau đĩ vài tháng, quy trình này cũng được thực hiện đầu tiên trên phơi người đang phát triển ở giai đoạn phơi nang bởi Lane [38]. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phơi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hĩa ra đời [90]. Kỹ thuật đơng lạnh bằng phương pháp thủy tinh hĩa áp dụng thành cơng trên trứng bị (Martino và cs.,1996) [51]. Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đơng lạnh và rã đơng bằng phương pháp thủy tinh hĩa là 88% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991) [72]; 99% (Lane, 2001) [39]; 90% (Kim, 2007) [36]. Trên bị, tỷ lệ trứng sống sau đơng lạnh và rã đơng là 85% (Otoi,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt Chian (2004) thu được tỷ lệ trứng bị sống sau rã đơng đạt 92% khi dùng chất bảo quản đơng lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)...[17]. Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đơng lạnh và rã đơng trứng heo bằng phương pháp thủy tinh hĩa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong dung dịch thủy tinh hĩa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau rã đơng là 54 – 56% [24]. Trong năm này Martins R.D. và cs. đã đơng lạnh trứng bị chưa chín bằng phương pháp thủy tinh hĩa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhĩm đối chứng là 74,6% [50]. Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan Ayhan đã bảo quản trứng bị chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhĩm đối chứng là 79,6% [18]. Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hưởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy tinh hĩa trứng heo sử dụng phương pháp thủy tinh hĩa trên bề mặt kim loại. Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bước (trong EG 4% khoảng 10 – 15 phút ở 37oC, sau đĩ trong dung dịch thủy tinh hĩa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0.3M) [75]. Gupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tinh hĩa tương tự với quy trình trên. Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện khi kết hợp sử dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp 2 chất này trên đối tượng trứng MII. Tuy nhiên phương pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng (chỉ 3.4% phát triển đến blastocyst so với lơ đối chứng là 20.1%) [28]. Moratĩ và cs. (2008) đã bào quản trứng bị trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đơng tương ứng là 88,4% và 94,5% [54]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu đơng lạnh phơi bị đã được tiến hành vào năm 1984. Phương pháp đơng lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12oC/phút) sau khi khử nước cục bộ ở nhiệt độ phịng trên phơi bị đã thành cơng với 63,4% (33/52) phơi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,2% (23/52) phơi nang thốt màng và tỷ lệ cĩ thai sau khi cấy phơi đơng lạnh – rã đơng là 33,3% (7/21) [3]. Năm 1990, con bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phơi đơng lạnh nhập khẩu [2]. Năm 2003, Lưu Cơng Khánh và cs. đã báo cáo thành cơng việc nghiên cứu ứng dụng phơi bị đơng lạnh bằng glycerol [5]. - Ngày 24/05/2004, trường hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ [90]. - 2008, Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. đã bảo quản thành cơng trứng bị bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong cọng rạ với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đơng lạnh sau giải đơng 58,83% [4]. - Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu nhũ, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (trứng) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phơi… 1.2. SINH LÝ BUỒNG TRỨNG 1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng Hình thành nang trứng là quá trình tiếp nối của các giai đoạn từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp và sau đĩ thành nang thứ cấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy dịch, phồng lên và di chuyển ra ngồi buồng trứng để chuẩn bị rụng trứng – đĩ là nang trứng chín (Hình 1.1). Và quá trình phát triển này ở gia súc từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn trước rụng trứng mất khoảng 180 ngày (Lussier và cs., 1987) [45]. Từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng đường kính nang trứng bị tăng 30 đến 400 lần (từ 50m lên 15 đến 20mm). Trong quá trình này trứng hình thành màng trong suốt, tích lũy một số sản phẩm cần thiết cho sự thụ tinh và các giai đoạn đầu của sự phát triển phơi. Sau khi rụng nang trứng sẽ hình thành thể vàng. Số lượng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các lồi cĩ sự khác nhau và thối hĩa dần trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng cĩ hiệu quả càng ít. Ở bị, bê con lúc mới sinh ra cĩ hơn 100.000 nang trứng và số lượng này giảm dần theo độ tuổi. Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng 1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng Một trứng trưởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nĩ được phĩng thích từ nang trứng trưởng thành của buồng trứng. Sự trưởng thành của trứng liên quan mật thiết với sự trưởng thành của các nang trứng (Hình 1.2). Quá trình phát triển của trứng gồm 4 giai đoạn: Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục; Sự gia tăng số lượng tế bào mầm bằng nguyên phân; Sự giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân; Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của trứng. Trong quá trình giảm phân của trứng cĩ 2 giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng (block):  Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ nhất: khi trứng bước vào giai đoạn prophase của giảm phân I, cho ra trứng sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (Germinal Vesicle_GV). Các trứng sẽ vượt qua giai đoạn này khi cĩ sự xuất hiện của đỉnh LH (Luteinizing hormone) tức khi cá thể đến tuổi trưởng thành sinh dục.  Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ hai: khi ở giai đoạn metaphase-M của giảm phân II (MII), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MII. Trứng chỉ vượt qua được giai đoạn MII khi cĩ sự thụ tinh của tinh trùng. Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng Sự trưởng thành của trứng bao gồm những biến đổi ở mức tế bào để hỗ trợ cho sự thụ tinh và thời kỳ đầu của sự phát triển phơi thai (Sirard và cs., 1989) [73]. Sự trưởng thành trứng bao gồm:  Sự trưởng thành về nhân Quá trình trưởng thành trong nhân trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mầm (Germinal Vesicle Breakdown_GVBD), cơ đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi vơ sắc, phân chia nhiễm sắc thể tương ứng với việc tách ra của thể cực thứ I và dừng ở metaphase II. Ở bị, các nang trưởng thành đạt kích thước từ 2 - 3mm, một số trứng cĩ khả năng xảy ra hiện tượng GVBD và hồn tất quá trình giảm phân sau đĩ (Lonergan và cs., 1994 [42]; Fulka và Motlik., 1986 [25]). Và khi trứng đạt đến giai đoạn metaphase II sẽ đạt đường kính là 110m. Điều này giống với trứng thu từ nang nguyên thủy hoặc sơ cấp (chưa đạt đến kích thước khảo sát là tối ưu) khơng thể tiếp tục hay hồn tất quá trình giảm phân và sẽ khơng cĩ khả năng trưởng thành nhân. Do đĩ, đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho việc nuơi trưởng thành in vitro nhẳm đạt kết quả cao nhất.  Sự trưởng thành về tế bào chất Sự trưởng thành của tế bào chất bao gồm sự thay đổi tồn diện cấu trúc để trứng tiến từ giai đoạn túi mầm đến giai đoạn metaphase II (Shamsuddin và cs., 1993) [70]. Trong quá trình này, các bào quan được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển của phơi. Các ti thể thay đổi theo sự lớn lên của trứng. Khi trứng cĩ kích thước nhỏ hơn 100mm, ti thể cĩ dạng cầu và định vị tại trung tâm trứng. Nhưng khi trứng cĩ đường kính 100mm, ti thể cĩ hình trứng và di chuyển ra xa vị trí trung tâm, chúng cĩ dạng hình túi và nằm tại vùng ngoại vi của trứng khi tế bào đạt đến kích thước 110mm. Các ti thể di chuyển dọc theo các vi ống được hình thành trong tế bào chất. Tương tự, các túi mầm sẽ di chuyển ra phía màng trong suốt khi trứng phát triển với kích thước hơn 110mm. Bộ Golgi chịu trách nhiệm hình thành các thể hạt vỏ của màng trong suốt. Và số lượng Golgi trong trứng tăng theo đường kính của nang. Cĩ thể dễ dàng quan sát sự thay đổi vị trí của hạt vỏ trong suốt quá trình trưởng thành của tế bào chất. Cùng với sự thay đổi vị trí, sự thay đổi cấu trúc hạt vỏ là hai yếu tố cĩ ý nghĩa đặc biệt đối với sự thụ tinh của trứng. Các thể hạt vỏ di chuyển ra phía màng trong suốt, giải phĩng các chất bên trong làm cho màng trong suốt thay đổi cấu trúc, tăng kích thước nội bộ và hạn chế sự thụ tinh đa tinh trùng (polyspermy). Do vậy, sự trưởng thành về tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng của trứng khi thụ tinh, phân chia tế bào và phát triển đến giai đoạn phơi nang. 1.2.3. Cấu tạo của trứng Xung quanh trứng là lớp tế bào cumulus (granulose cell) kết hợp một cách chuyên biệt với trứng, giữa chúng cĩ khe nối giúp duy trì quá trình trao đổi chất của trứng. Các lớp tế bào cumulus này vừa bảo vệ trứng, vừa cung cấp chất dinh dưỡng nuơi trứng. Đặc biệt là khi trứng rụng, trứng khơng cịn nguồn cung cấp chất dinh dưỡng nào khác ngồi tế bào hạt. Tiếp đến là màng phĩng xạ tỏa trịn. Bên trong màng phĩng xạ là màng trong suốt của trứng, đĩng vai trị rất quan trọng trong thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng tế bào chính là khoảng khơng quanh nỗn. Trong màng tế bào chất là bào tương và nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội của lồi. Trứng chín là trứng đang ở giai đoạn metaphase II với thể cực thứ nhất. (Hình 1.3) Hình 1.3. Tế bào trứng 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐƠNG LẠNH TRỨNG 1.3.1. Các phương pháp đơng lạnh Đơng lạnh trứng là sự bảo quản thành cơng chức năng bình thường của trứng khi giảm nhiệt độ dưới mức phản ứng hĩa học bình thường xảy ra (từ 37oC, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 196oC (nhiệt độ khơng sinh lý)). Đơng lạnh trứng cĩ thể phân loại theo hai cách chung là đơng lạnh cân bằng “equilibrium” với phương pháp đơng lạnh chậm (slow freezing) hay đơng lạnh khơng cân bằng “nonequilibrium” với phương pháp đơng lạnh nhanh (rapid freezing) và phương pháp thủy tinh hĩa (vitrification), tùy theo tốc độ làm lạnh và chất bảo quản đơng lạnh sử dụng. Tuy nhiên, bản chất của các phương pháp này là giống nhau, cụ thể là đều cĩ mục đích chung nhằm bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của tinh thể đá nội bào, sự khử nước và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp.  Phương pháp thủy tinh hĩa (Vitrification) Thủy tinh hĩa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phơi với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, tồn bộ khối vật chất bên trong và bên ngồi tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt khơng cĩ sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như mơi trường bên ngồi trong quá trình làm lạnh. [50, 54] Phương pháp này loại trừ hạn chế của quá trình đơng lạnh chậm là cần thiết bị phức tạp. Một thuận lợi nữa của phương pháp này là khả năng sống của tế bào cao nếu điều kiện tối ưu do khơng cĩ tinh thể đá ngoại bào. Gần đây hơn, những phương pháp thủy tinh hĩa cải tiến đã được phát triển, cĩ khả năng làm lạnh và làm ấm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể tích của dung dịch bảo quản. Phương pháp này hy vọng cĩ khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thương do đơng lạnh. Trong phương pháp thủy tinh hĩa, tế bào cần được xử lí theo các bước đơng lạnh thơng thường như cân bằng trong dung dịch bảo vệ lạnh pha lỗng, ngâm trong dung dịch đơng lạnh nhanh một khoảng thời gian ngắn trước khi được làm lạnh trong nitơ lỏng. Thời gian tiếp xúc trong dung dịch của phương pháp thủy tinh hĩa khơng chỉ phụ thuộc vào dung dịch bảo vệ đơng lạnh mà cịn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thấm của tế bào và độc tính của chất bảo quản lạnh chịu ảnh hưởng rộng bởi nhiệt độ. Tế bào được huyền phù trong một dung dịch chất bảo quản thấm cĩ nồng độ rất cao ở nhiệt độ phịng. Bởi vì sự hiện diện với nồng độ cao các chất bảo quản cĩ khả năng gây độc cho tế bào nên trứng khơng được phép giữ lâu tại nhiệt độ này mà thay vào đĩ chỉ được cân bằng đơng lạnh trong khoảng thời gian rất ngắn trước khi chúng được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. [48] Khác với các phương pháp đơng lạnh chậm và đơng lạnh nhanh, trong phương pháp đơng lạnh cực nhanh, thể tích của dung dịch đơng lạnh nhanh được giảm đến mức tối thiểu sử dụng nhiều cơng cụ khác nhau. Ví dụ, tế bào được đặt ở đầu loop hay được đặt dính ở ống bảo quản lạnh (cryotube hay cryoloop), ống mao dẫn mở (cọng rạ hở “open pulled straw”), hay đơng lạnh khơng cĩ dụng cụ chứa (vi giọt). Mục đích của phương pháp này là làm lạnh và rã đơng trứng với thể tích tối thiểu cần cho đơng lạnh nhanh. Phương pháp đơng lạnh cực nhanh cũng được đưa ra để cải tiến sự sống sĩt của tế bào sau khi rã đơng bởi vì nhiệt độ tới hạn cĩ thể vượt qua nhanh chĩng trước khi tế bào bị tổn thương. Tuy nhiên chất bảo quản được dùng trong kỹ thuật này cĩ nồng độ rất cao, cĩ khả năng gây nên những tổn thương về cấu trúc di truyền cho tế bào. Cĩ lẽ đây là lý do tại sao phơi sau trữ lạnh cĩ cấu trúc và phát triển rất tốt khi nuơi trong ống nghiệm nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phơi vẫn cịn rất thấp. Người ta cho rằng thành cơng của phương pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trước khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đơng cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá. Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực tế nhưng tiềm năng của nĩ rất lớn vì tính đơn giản và những ưu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm đang được sử dụng. [11, 13, 48] 1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA) Các chất bảo quản lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hĩa gần giống như trong kỹ thuật đơng lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hĩa luơn bao gồm một hoặc hai chất bảo quản lạnh cĩ khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nước bên trong tế bào và một chất bảo vệ đơng lạnh khơng cĩ khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. [11, 13] 1.3.2.1. Các chất bảo quản thường sử dụng cho phương pháp thủy tinh hĩa  Chất bảo quản lạnh cĩ khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (được sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH).  Ethylene glycol (EG): Phổ biến nhất và đã được sử dụng trong quy trình thủy tinh hĩa. Chất này ít ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nĩ sẽ xuất hiện vào khoảng 38oC. EG cĩ độc tính thấp với phơi chuột, đặc biệt là phơi nang và khuếch tán nhanh, cân bằng nhanh chĩng với tế bào qua màng trong suốt và màng tế bào. Sau khi đơng lạnh trứng và phơi bằng phương pháp thủy tinh hĩa bằng EG đã cĩ sự mang thai bình thường trên động vật và người. [11]  Dimethyl sulfoxide (DMSO): DMSO được phát hiện vào năm 1959 như là một chất bảo quản hiệu quả. Chất này xuyên qua màng dễ dàng hơn glycerol nhưng tính độc của nĩ lại cao hơn ở nhiệt độ cao.  Propylene glycol (PG): cũng là một chất tương tự như glycerol, nhưng nồng độ của nĩ được yêu cầu thấp hơn trong chất đơng lạnh, và độc hơn glycerol.  Chất bảo quản lạnh khơng cĩ khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose. Các saccharide khác nhau thường được sử dụng, bao gồm mono-, di- và trisaccharides. Các monosaccharide gồm fructose, glucose, và galactose. Các disaccharide như sucrose, trehalose và lactose. Những sucrose khơng thấm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẩy nước ra khỏi tế bào. Người ta đã chứng minh được nồng độ sucrose cao (1mol/lít) thực sự khơng gây độc cho phơi và trứng (Kuleshova và cs., 1999) [37]. Trahelose đã được xem là chất bổ sung của chất bảo quản đơng lạnh rất cĩ hiệu quả (Begin và cs., 2003) [14]. Cả sucrose và trehalose ức chế màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ bền của enzyme và màng tế bào. Trong một số trường hợp, trehalose cịn là một chất bảo vệ tốt hơn cả sucrose. [11] Để đạt tỷ lệ đơng lạnh cao, địi hỏi sử dụng chất bảo quản đơng lạnh nồng độ cao để làm giảm tinh thể đá. Kết quả là với nồng độ cao cĩ thể dẫn đến sốc thẩm thấu và gây độc hĩa học. Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nồng độ cao: (i) Giảm bớt chất bảo quản đơng lạnh, (ii) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đơng. [54] Trong thành phần mơi trường thủy tinh hĩa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol và một chất bảo vệ đơng lạnh khác cũng cĩ khả năng thấm qua màng tế bào (thường là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. [60] 1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử Dung dịch chất bảo quản chứa nhiều hợp chất khác nhau cĩ tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đơng lạnh và rã đơng. Chẳng hạn như những hợp chất gồm citrate, nỗn hồng trứng. Dung dịch bảo quản đơng lạnh thường được tạo bằng cách thêm vào một lượng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với mơi trường cấy giao tử và phơi.  Dung dịch đệm Dung dịch thủy tinh hĩa là dung dịch chất bảo quản đơng lạnh mà khơng bị đơng đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp với tốc độ làm lạnh cao. Vì vậy mơi trường đệm cơ bản sử dụng cho thủy tinh hĩa là đệm muối photphat hay đệm HEPES.  Các đại phân tử Các hợp chất đại phân tử được thêm vào dung dịch chất bảo quản đơng lạnh: polyvinylpirrolidone (PVP) nhưng khơng thành cơng trong trong đơng lạnh phơi và gây độc cao đối với phơi (Wilmut và Rowson, 1973). Polyethylene glycol (PEG) cũng được sử dụng như chất bổ sung (Rall và Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), Ficoll. Ngồi ra, cịn cĩ các protein lớn gồm albumin huyết thanh bị – Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bị mang thai – Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biến khác là các protein giảm nhiệt – Thermal Hysteresis Proteins (THPs). [55, 66, 86] Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lượng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tinh hĩa. Thủy tinh hĩa ngoại bào cần nồng độ chất bảo quản cao hơn nội bào. Việc thêm polymer cĩ phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Ficoll cĩ khả năng đẩy mạnh thủy tinh hĩa ngoại bào với nồng độ chất bảo quản đơng lạnh giống như thủy tinh hĩa nội bào. Hơn nữa, các polymer cĩ thể tạo ra chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tinh thể đá trong suốt quá trình đơng lạnh và rã đơng.Vì thế, các đại phân tử hoạt động như chất thay thế ngoại bào để làm tăng chất bảo quản đơng lạnh bên ngồi, từ đĩ làm giảm độc cho tế bào. [55, 66] 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng trứng sau khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hĩa Quá trình đơng lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong đĩ, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành cơng. Do đĩ, để sống sau đơng lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thương bởi quy trình đơng lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đơng lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đơng lạnh chúng là rất khĩ (Vincent và Johnson, 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp thủy tinh hĩa tránh được sự hình thành đá nội bào (Intracellular Ice Formation_IIF) – ảnh hưởng đến khả năng sống của trứng sau rã đơng - nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn (Rall và Fahy, 1985; Vajta và Kuwayama, 2006). [66, 79, 81] Bên cạnh đĩ, phương pháp thủy tinh hĩa dường như đe dọa đến sự sống sau đơng lạnh do nồng độ chất bảo quản đơng lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện cĩ thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996). Ngồi ra, chất lượng trứng sau thủy tinh hĩa cịn phụ thuộc các yếu tố như những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đơng lạnh và rã đơng gây ra; đặc điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đơng lạnh (Bernard A. và Fuller B.J., 1996). Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đơng lạnh cĩ thể bị tác động bởi trạng thái trưởng thành của chúng, chất lượng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đơng lạnh đã sử dụng. Ví dụ, khi trưởng thành, chất lượng và kích thước trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến kết quả đơng lạnh. [15, 29] Phương pháp thủy tinh hĩa đã được áp dụng trên phương diện lâm sàng (Kuleshova và Lopata, 2002). Một vài điều cần lưu ý cĩ thể dẫn tới tỷ lệ thành cơng thấp là chất lượng nitơ lỏng, thời gian thao tác, tốc độ đơng lạnh, ảnh hưởng chất bảo quản đơng lạnh…[37] 1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đơng lạnh  Sự hình thành tinh thể đá Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngồi tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào trong đơng lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành cĩ dạng sáu cạnh, hình dạng của nĩ sẽ là hình cây thơng khơng đồng dạng và hình cầu khi tốc độ làm lạnh được đẩy lên (Hình 2.4). [55, 60] Hình 1.4. Ảnh hưởng của tốc độ đơng lạnh lên sự hình thành tinh thể đá Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.000oC/giây, nước nguyên chất tạo băng vơ định hình mà khơng cĩ dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đơng sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nước đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đơng sẽ gây bất lợi cho tế bào. [55, 60] Ở mơi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thường được hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15oC. Tuy nhiên, tinh thể nước đá chỉ được hình thà._.nh ở nhiệt độ -10oC khi trong dung dịch cĩ các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tượng thủy tinh hĩa (vitrification). Hiện tượng này xảy ra khi trong mơi trường đơng lạnh cĩ các chất hịa tan cũng như các chất bảo quản cĩ nhiệt độ đơng đá thấp hơn bình thường. [55, 60]  Sự khử nước Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Thơng thường các tế bào sẽ cĩ thể bị tổn thương ở nhiệt độ 15 đến -90oC. Một khi tế bào khơng được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0oC. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hĩa của tính thấm và tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đĩng vai trị quyết định trong xác định quá trình đơng lạnh thích hợp nhất.  Độ pH của dung dịch Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid – base của mơi trường biến đổi theo hướng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hịa tan trong mơi trường dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo quản đơng lạnh với bản chất hĩa học của nĩ giữ vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt biến đổi acid – base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động như những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào được bảo quản. Người ta nhận thấy rằng, sự sống cĩ thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH lớn hơn 9.  Sự hình thành bọt khí Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thương và cĩ thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thể đá. Thể tích nước bị đơng lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nước đá thấp hơn tỷ trọng của nước) dẫn đến việc bọt khí cĩ thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 – 100µm và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh. Bên cạnh các khí hịa tan theo nồng độ, mơi trường nuơi cấy cịn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid – base. Khi làm lạnh thì các khí này khơng cịn ở dạng hịa tan mà tách ra thành những bọt khí cĩ khả năng gây tổn thương cho tế bào. Khi tiến hành giải đơng, bọt khí cĩ thể được hình thành và cĩ thể phát triển thành khơng bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và cĩ thể bị phá hủy hồn tồn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong mơi trường sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng mơi trường PBS cĩ thể hạn chế số lượng bọt khí. [7, 9] 1.3.3.2. Tính an tồn khi đơng lạnh trứng trưởng thành Nghiên cứu sử dụng trứng trưởng thành cho thấy khả năng sống của trứng sau đơng lạnh và rã đơng bị ảnh hưởng bởi một số các nhân tố. Giữa các nhân tố hình thái, sự cĩ mặt hay vắng mặt các tế bào hạt cumulus trong suốt quá trình đơng lạnh cĩ thể tác động trực tiếp lên khả năng sống của trứng sau rã đơng. Hơn nữa, tổn hại tế bào sau rã đơng gần ngưỡng gây chết sẽ ảnh hưởng tới khả năng phát triển của chúng. Trứng trưởng thành khơng đồng nhất trong sự phân bố và tổ chức các bào quan trong bào tương cĩ thể ảnh hưởng đến kết quả của quy trình đơng lạnh. Trứng ở giai đoạn metaphase II dễ bị tổn thương lạnh do thoi vơ sắc nơi nhiễm sắc thể bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Làm lạnh trứng trong thời gian ngắn ở 20oC cĩ thể gây ra sự phá vỡ khơng phục hồi bộ máy thoi vơ sắc trong khi sự khử nước xảy ra nhanh chĩng ở nhiệt độ thấp hơn 0oC. Sự sắp xếp các vi sợi thoi vơ sắc thích hợp là điều cần thiết để tách và sắp xếp đúng NST, vì vậy trứng đơng lạnh càng tăng khả năng bị đa bội thể sau khi thể cực thứ 2 bị đẩy ra ngồi. Sự đứt gãy bộ xương tế bào dẫn tới bộ xương tế bào bất bình thường, giữ lại thể cực thứ hai, thay đổi cấu tạo và các bào quan. [64, 80] Các vi ống của trứng cĩ thể bị tổn thương do chất bảo quản đơng lạnh và sự thay đổi của nhiệt độ (Pickering và cs., 1990; Van Blerkom và Davis, 1994) [64, 80]. Trứng tiếp xúc với chất bảo quản đơng lạnh và thay đổi nhiệt độ cĩ thể gây ra sự khử polymer của tubulin cùng với trứng (Aman và Parks, 1994) [11]. Tổn thương thoi vơ sắc giảm phân (meiotic spindle) cĩ thể thay đổi vị trí nhiễm sắc thể và hậu quả là giới hạn khả năng thụ tinh của trứng (Eroglu và cs., 1998) [23]. Liên quan đến khả năng thụ tinh khơng chỉ do tổn thương thoi vơ sắc mà cịn do khả năng bất thường của nhiễm sắc thể (Aman và Parks, 1994) [11]. Hơn nữa, theo mơ tả đầu tiên trên trứng chuột do tác giả Magistrini và Szưllưsi (1980) [48], các vi ống và thoi vơ sắc giảm phân của trứng của tất cả các lồi động vật cĩ vú khơng tập trung và khơng kết hợp khi trứng tiếp xúc với nhiệt độ gần 0oC trong khoảng vài phút (Parks và Ruffing, 1992; Vincent và Johnson, 1992) [61, 82]. Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đơng lạnh khác nhau. Johnson và Pickering (1987) cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu với DMSO kết quả là khơng tập trung thoi sắc và nhiễm sắc thể bị phân tán [81]. Vincent và cs. (1990) cũng phát hiện ra DMSO cĩ ảnh hưởng lên trứng. Tuy nhiên, họ đã kết luận tổn thương là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đĩ chất bảo quản đơng lạnh khơng thể thấm vào tế bào một cách nhanh chĩng và vì vậy rất ít chất bảo quản đơng lạnh trong tế bào [81]. Cơng bố của Shaw và Trounson (1989) cho rằng propylene glycol gây ra hoạt hĩa trinh sản (parthenogenetic) trên trứng chuột – là sự hoạt hĩa nhân tạo phong tỏa trạng thái dừng ở giai đoạn metaphase II. Sự hoạt hĩa này xảy ra do sự tăng nồng độ Ca2+ (mà hiện tượng này chỉ cĩ khi tinh trùng xâm nhập vào trứng). Dịng Ca2+ tăng làm giải phĩng các thể vỏ hạt của trứng, và trứng tiếp tục quá trình giảm phân để hình thành thể cực thứ 2. White và Yue (1996), Gook và cs (1995) cũng đã chứng minh trứng người cũng gặp phải hiện tượng trên sau rã đơng. Xơ cứng màng trong hay hoạt hĩa trứng gây ra bởi sự giải phĩng các tế bào hạt vỏ này (Wolf và Hamada, 1977; Gulyas và Yuan, 1985). Các hạt vỏ được giải phĩng ra ngồi thành bào tương trong suốt phản ứng màng trong suốt. Đây là phản ứng thơng thường, xảy ra khi tinh trùng xâm nhập vào trứng để thụ tinh và ngăn hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (Wassarman, 1988). Propylene glycol cũng được cho là nguyên nhân giải phĩng hạt vỏ trước trưởng thành (Schalkoff và cs., 1989) và phá vỡ các vi sợi (Vincent và cs., 1992). [26, 69, 83, 84, 87] DMSO cũng tỏ ra là nguyên nhân gây xơ cứng màng trong suốt và giảm các hạt vỏ trong trứng chuột (Vincent và cs.,1990). Những nghiên cứu sau này cho thấy rằng trứng tiếp xúc với DMSO ở nhiệt độ 20 – 37oC phủ nhận tác động trên màng trong suốt, tỷ lệ thụ tinh và tổ thức thoi vơ sắc. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng tự bản thân trứng gây ra xơ cứng màng trong suốt [82]. 1.4. Ứng dụng của đơng lạnh trứng Đơng lạnh trứng là một phương pháp dùng để lưu trữ các tế bào trứng trong thời gian dài và đang được quan tâm nhiều vì phương pháp này cĩ nhiều ứng dụng ở cả người và động vật. 1.4.1. Ở người Đứa bé đầu tiên trên thế giới ra đời từ trứng đơng lạnh được ghi nhận vào năm 1986. Cho đến năm 2004, thống kê cho thấy trên thế giới cĩ khoảng 40 bé đơng lạnh trứng ra đời và trên dưới 60 trường hợp thai đang tiến triển. Tỷ lệ thai lâm sàng từ các chu kỳ trứng đơng lạnh hiện cịn khá thấp và khơng ổn định. Người ta ước tính cần phải rã đơng khoảng 100 trứng thì mới cĩ một trường hợp mang thai thành cơng. Nguyên nhân của thành cơng thấp cĩ thể là: (1) Cấu trúc di truyền đặc biệt của trứng, khi các nhiễm sắc thể đang trong giai đoạn phân chia và xếp trên mặt phẳng xích đạo; (2) Tổn thương của các cấu trúc nội bào do quá trình trữ lạnh-rã đơng; (3) Trứng là một tế bào cĩ kích lớn, với lượng nước bên trong chiếm khá nhiều [26]. Phương pháp đơng lạnh trứng thường được sử dụng cho những trường hợp sau: Phụ nữ cịn trẻ hoặc khơng cĩ bạn tình mà trứng của họ cĩ nguy cơ bị phá hủy nặng nề do chiếu xạ, hĩa trị liệu; Lập ngân hàng trứng hỗ trợ cho các chương trình bệnh nhân khơng cĩ nỗn; Trong những trường hợp khơng cĩ tinh trùng để thụ tinh cần lưu trữ trứng; Phụ nữ muốn trì hỗn tuổi sinh đẻ; Tránh những rắc rối vể mặt luật pháp, tơn giáo của đơng lạnh phơi đặc biệt ở những nước mà đơng lạnh phơi khơng được phép thực hiện [90]. 1.4.2. Ở động vật Bảo quản giao tử cái (trứng) làm cơ sở cho các nghiên cứu, ứng dụng sâu hơn: Dùng cho các nghiên cứu về IVF để cải thiện hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm; Việc đơng lạnh trứng giúp vận chuyển dễ dàng, hạn chế lây lan dịch bệnh; Thiết lập ngân hàng để lưu trữ nguồn di truyền của những động vật cĩ nguy cơ tuyệt chủng hay quý hiếm; Trao đổi mua bán dễ dàng, đặc biệt là những lồi cĩ giá trị kinh tế cao [3, 6]. CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG 1: ĐƠNG LẠNH TRỨNG HEO TRƯỞNG THÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HĨA Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng Chuẩn bị  Hấp vơ trùng nước muối sinh lý (0,9%), nước cất, kéo, kẹp  Bổ sung penicillin (100IU/ml) và streptomycin (0,1mg/ml) vào nước muối sinh lý trước khi sử dụng, để trong bình giữ ấm khoảng 33 – 35oC. Tiến hành Dùng kéo thu nhận buồng trứng ở phía hai bên tử cung ngay khi heo vừa được mổ, rửa sạch cho vào nước muối sinh lý chuyển nhanh vể phịng thí nghiệm (PTN) trong khoảng 2-3 giờ. Tại PTN, chọn những buồng trứng cĩ các nang nổi đều, kích thước trung bình khoảng 3- 6mm. Loại bỏ mỡ, rửa sạch máu bằng nước muối sinh lý đã bổ sung kháng sinh. Thực hiện thao tác thu trứng từ buồng trứng trong tủ thao tác 30 – 60 phút. Hình 2.2: Mẫu buồng trứng heo 2.1.2. Thu nhận và nuơi trứng Chuẩn bị Dụng cụ bằng kim loại được rửa sạch và hấp khử trùng ở 1210C, 1atm hơi nước trong 30 phút. Các đĩa petri và đĩa 4 giếng nhựa sử dụng một lần nên chỉ chiếu UV vỏ bọc trong 2 giờ trước khi sử dụng. Tủ thao tác và kính hiển vi soi nổi được chiếu UV 15 phút trước khi sử dụng, chiếu xong bật quạt hút 15 phút để hạn chế tác động cĩ hại của tia UV cịn sĩt lại. Chiếu UV vơ trùng các dụng cụ: đèn cồn, găng tay, đầu kim 18G, syringe 5ml, kẹp, kéo, đĩa Pétri, đĩa Φ35, Φ60, đĩa 4 giếng, dung dịch D-PBS, nước muối sinh lý, đầu tip, pipette Pasteur. Kéo pipette Pasteur với đường kính khoảng 110 – 130µm. Mơi trường thu trứng chuẩn bị trước và ủ ấm ở 38,5oC tối thiểu 2 giờ trước khi sử dụng (nhưng khơng quá 20 giờ). Mơi trường chuẩn bị để thu trứng theo Bảng 2.1. Bảng 2.1. Mơi trường chuẩn bị thu trứng Tên dụng cụ Mơi trường Thể tích Mục đích sử dụng Becher 100 ml NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh 200 ml Rửa buồng trứng Becher 50 ml D-PBS bổ sung kháng sinh 50 ml Thu dịch nang trứng Đĩa Petri nhựa Φ35 D-PBS 3 ml Thu trứng từ dịch nang trứng Đĩa 4 giếng 1 giọt IVM1 rửa trứng và 3 giọt IVM1 nuơi trứng 120 µl/giọt Rửa trứng + Nuơi trứng Tiến hành Vơ trùng tay và lau lọ chứa mẫu bằng cồn 70o trước khi thao tác trong tủ vơ trùng  Đốt đèn cồn tạo khơng gian vơ trùng, dùng kẹp gắp mẫu buồng trứng cho vào nước muối sinh lý đã ủ ấm cĩ bổ sung kháng sinh để rửa sạch. Sau đĩ gắp buồng trứng để lên miếng gạc nặn thật sạch máu.  Dùng kim tiêm 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml D-PBS cĩ bổ sung kháng sinh, tiến hành chọc – hút dịch trong các nang cĩ đường kính từ 3 - 6mm, lượng D-PBS này cĩ tác dụng pha lỗng dịch nang trứng và trứng hút được, đồng thời giữ ổn định nhiệt cho trứng thu. Sau đĩ chuyển dịch nang trứng vào các đĩa Pétri nhựa (Φ35) và để lắng từ 5-10 phút trong tủ ấm 38,5oC.  Dùng pipette Pasteur đã kéo gắn vào mouth pipette, soi tìm và phân loại trứng dưới kính hiển vi đảo ngược hoặc kính hiển vi soi nổi. Trứng được phân loại theo nhĩm tác giả Loos và cs (1989) [43]. Chuyển trứng sang giọt mơi trường IVM1 để rửa trứng và chuyển vào các giọt mơi trường nuơi. Sau 22-24 giờ, tiến hành chuyển trứng sang giọt mơi trường IVM2 tiếp tục nuơi đến 42 - 44 giờ. Trong thao tác chọc hút trứng, mặt vát của kim tiêm cần được úp xuống để tránh bỏ sĩt trứng vì trứng cùng lớp tế bào hạt bao quanh bám ở đáy nang (phía cuống buồng trứng). Ngồi ra cần chú ý đặt mũi kim vào vị trí cách nang muốn chọc hút khoảng 3-5 mm rồi từ đĩ đưa vào nang trứng và hút trứng ra tránh tình trạng áp suất lớn làm mất trứng. Hình 2.3. Thao tác chọc hút trứng từ buồng trứng Hình 2.4. Soi tìm và thu trứng bằng hệ thống kính đảo ngược 2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đơng lạnh Chuẩn bị enzyme  Eppendorf chứa Hyaluronidase 1mg/ml được ủ ấm ở 38,5oC trước khi sử dụng 2 giờ.  Đĩa Petri nhựa Φ35 chứa giọt mơi trường IVM1 ủ ấm trước khi sử dụng 2 giờ. Loại cumulus và quan sát  Tạo giọt hyaluronidase trên đĩa Petri nhựa  Sau 42 - 44 giờ nuơi cấy, sử dụng mouth pipette cĩ gắn pipette Pasteur chuyển trứng vào giọt Hyaluronidase và vortex trong vịng 30 giây để loại bỏ cumulus.  Các tế bào trứng sau khi loại cumulus gọi là các tế bào trứng trần sẽ được chuyển vào giọt mơi trường IVM1.  Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược, đánh giá sự trưởng thành của trứng thơng qua: sự đồng nhất về tế bào chất của trứng và sự xuất hiện thể cực thứ nhất.  Chỉ những trứng cĩ tế bào chất đồng đều và cĩ thể cực thứ nhất mới được sử dụng cho quá trình đơng lạnh. 2.1.4. Đơng lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong vi giọt (PP1) Chuẩn bị  Bình nitơ lỏng, cryotube, mouth pipette cĩ gắn pipette Pasteur, hộp xốp chứa nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi  Chuẩn bị 2 đĩa Petri nhựa Φ35: Đĩa số 1 chứa 100µl mơi trường VS1 (TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG), đĩa số 2 chứa 300µl mơi trường VS2 (TCM–199 10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose). Đặt 2 đĩa ở nhiệt độ phịng (25oC) khoảng 15 phút trước khi sử dụng.  Rĩt nitơ lỏng ra hộp xốp, cho cryotube và bơng gịn nhúng chìm vào nitơ. Tiến hành Hình 2.5. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt đơng lạnh -Sau khi IVM 42 – 44 giờ và đã loại bỏ cumulus, ta chọn những trứng cĩ tế bào chất đồng đều và cĩ thể cực thứ nhất chuyển vào đĩa số 1 (mơi trường VS1) để trong vịng 45 giây. Chuyển trứng sang đĩa số 2 (mơi trường VS2), dùng mouth pipette cĩ gắn pipette Pasteur hút khoảng 5µl tạo vi giọt cĩ chứa 5 – 7 trứng và nhỏ trực tiếp vào hộp xốp chứa nitơ lỏng trong vịng 25 giây. Lần lượt tạo vi giọt đơng lạnh tất cả các trứng cĩ được, sau đĩ dùng kẹp tìm và gắp các vi giọt cho vào cryotube (lưu ý khơng bỏ sĩt vi giọt). Dùng bơng nhét kín miệng cryotube và nhanh chĩng chuyển cryotube vào bình chứa nitơ lỏng để bảo quản. Hình 2.6. Cách tạo vi giọt đơng lạnh Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN2 Hình 2.8. Chuyển vi giọt vào cryotube 2.1.5. Phương pháp giải đơng các vi giọt được đơng lạnh Chuẩn bị Chuẩn bị 1 đĩa nhựa Φ35 trống; 1 đĩa 4 giếng: giếng 1 chứa mơi trường RĐ1 (TCM–199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose), giếng 2 chứa mơi trường RĐ2 (TCM–199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose), giếng 3 chứa mơi trường RĐ3 (TCM–199 + 10% FBS), giếng 4 chứa mơi trường IVM2 (dùng để đánh giá sống chết). Tiến hành Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong khơng khí 5 giây, sau đĩ cho vào bể ổn nhiệt 5 giây và chuyển mơi trường bên trong cọng rạ vào đĩa nhựa Φ35 trống. Chuyển trứng sang giếng số 1 của đĩa 4 giếng chứa mơi trường RĐ1, giữ khoảng 1,5 phút ở nhiệt độ phịng (25oC). Chuyển trứng qua giếng số 2 chứa mơi trường RĐ2, giữ 1,5 phút ở nhiệt độ phịng. Tiếp tục chuyển trứng vào giếng số 3 chứa mơi trường RĐ3, giữ khoảng 5 phút ở nhiệt độ phịng. Sau cùng chuyển trứng sang giếng số 4 chứa mơi trường IVM2, để đánh giá sự sống chết của trứng. Hình 2.9. Thao tác đổ vi giọt ra khỏi cryotube Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đơng  Lưu ý:  Mỗi lần chuyển trứng sang các giọt mơi trường tương ứng, trứng sẽ bị co lại vì vậy cần quan sát hình thái của trứng dưới kính hiển vi đảo ngược để khơng bị mất mẫu.  Thao tác nhanh, tránh làm tổn thương trứng 2.1.6. Đơng lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hĩa trong cọng rạ (PP2) Chuẩn bị Mơi trường VS1: TCM–199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dùng để cần bằng trứng Mơi trường VS2: TCM–199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dùng để bảo quản trứng ở -196oC Cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), bình nitơ lỏng Tiến hành Sau 22 – 24h nuơi, chọn những trứng chín đem đơng lạnh theo phương pháp thủy tinh hĩa (vitrification) 2 bước: Trứng đang giữ trong mơi trường C3 sẽ được cân bằng trong mơi trường VS1 (TCM–199 + 10% FBS +10% DMSO + 10% EG) 45 giây, sau đĩ chuyển qua mơi trường VS2 (TCM–199 +10% FBS + 20% DMSO + 20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây. Sau đĩ chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vịng 30 giây. Cách chuyển trứng vào cọng rạ như sau: hút 1 khoảng mơi trường VS2, sau đĩ hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn mơi trường VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn mơi trường VS2 (Hình 2.11) và hàn đầu cọng rạ bằng máy ép nhựa. Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh). Hình 2.11. Cọng rạ chứa trứng Giải đơng trứng Trứng được rã đơng theo 03 bước. (Xem 2.1.4) Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong khơng khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 33 – 35oC, dùng bơng gịn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đĩ cắt đầu cịn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống. Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua mơi trường giải đơng số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang mơi trường RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua mơi trường RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phịng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa mơi trường nuơi trứng, để trong tủ nuơi (38,5oC, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục hồn tồn trước khi đánh giá sự sống chết của trứng. Hình 2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng Hình 2.13. Giải đơng cọng rạ trong nước ấm Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng Hình 2.15. Chuyển trứng vào mơi trường RĐ 2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng  Trứng sống: màng tế bào cịn nguyên vẹn, tế bào chất sáng đều và khơng bị co, khơng bị phân mảnh.  Trứng chết: màng tế bào bị tổn thương trong quá trình đơng lạnh, nên tế bào chất bị co hoặc phân mảnh, màng tế bào cĩ tể bị gãy. 2.2. NỘI DUNG 2: ĐƠNG LẠNH TRỨNG BỊ TRƯỞNG THÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HĨA TRONG CỌNG RẠ (PP2) Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng Xem 2.1.1 2.6.2.2. Thu nhận và nuơi trứng Chuẩn bị NaCl 0,9%: bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma). Dung dịch D – PBS: mơi trường sử dụng để thu dịch nang trứng. Trước khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml và ủ ấm ở 37oC. Mơi trường Flushing (FLUSH 050, FertiPro) (mơi trường W2): sử dụng để rửa trứng trước khi IVM. TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF (mơi trường C3): cần ủ ấm 38,5 oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng. Parafin lỏng (dầu khống) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa cĩ tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt. Hyaluronidase (H4272, Sigma): dạng dung dịch được sử dụng để phá các tế bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM. - Dụng cụ Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vơ trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, bercher, erlen… - Thiết bị Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phĩng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật)  Thu nhận trứng Thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút (Xem phần 2.1.2) Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đĩ, trứng A và B cịn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.  Nuơi trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM) - Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (cĩ từ 3 lớp cumulus trở lên) từ đĩa D – PBS cho vào các giếng cĩ mơi trường W2 và C3 để rửa. - Sau đĩ cho khoảng 20 - 30 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuơi chứa mơi trường C3 (loại đĩa 4 giếng chứa 500 l/giếng và phủ dầu khống). Nuơi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hịa. Lưu ý: Mơi trường C3 cần ủ ấm 38,5 oC, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trước khi sử dụng. - Sau 22 - 24h nuơi cấy, đánh giá sự trưởng thành của trứng bằng cách tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trưởng thành sẽ cĩ 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng 2. 2.3. Đơng lạnh trứng theo phương pháp 2 Xem 2.1.6 2.3. NỘI DUNG 3: ĐƠNG LẠNH TRỨNG BỊ CHƯA TRƯỞNG THÀNH BằNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HĨA Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 2.3.1. Thu nhận buồng trứng Xem phần 2.1.1. 2.3.2. Thu nhận trứng Xem phần 2.2.2 (Khơng tiến hành nuơi) 2.3.3. Đơng lạnh trứng Đơng lạnh trứng theo phương pháp 1 (Xem 2.1.4) Đơng lạnh trứng trong cọng rạ (Xem 2.1.6) 2.3.4. Phương pháp giải đơng Giải đơng trứng đơng lạnh trong vi giọt (Xem 2.1.5) Giải đơng trứng đơng lạnh trong cọng rạ (Xem 2.1.6 2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU Tất cả số liệu thu được trong nghiên cứu đều được xử lý bằng phần mềm Excel – 2007 với độ tin cậy 95%. Dùng hàm Descriptive Statistics, t-Test Two- Sample Assuming Equal Variances, t-Test Two- Sample Assuming Unequal Variances. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NỘI DUNG 1 3.1.1. Kết quả thu nhận trứng Trứng heo được thu nhận bằng phương pháp chọc hút (Hình 3.1), kết quả thể hiện ở Bảng 3.1. và Biểu đồ 3.1. Hình 3.1. Trứng heo được thu nhận từ buồng trứng (X100) Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo Số đợt TN Số buồng trứng Tổng trứng Số trứng/buồng Loại A Loại B 10 80 1733 21,66 ± 0,27 41,68 ± 0,69% (723 trứng) 27,37 ± 0,69% (474 trứng) α < 0,05 Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng Tiến hành chọc hút 80 buồng trứng, thu được 1733 trứng các loại, như vậy trung bình thu được 21,66 trứng/buồng. Trong đĩ những trứng được chọn nuơi là các trứng loại A chiếm tới 41,68% (723 trứng) và loại B đạt 23,37% (474 trứng), cịn lại 34,95% (536 trứng) là trứng loại C. Ở đây tỷ lệ trứng loại C khá cao vì thơng thường lớp cumulus bao quanh trứng heo rất lỏng lẻo, dễ bị bong ra nếu dùng lực hút và đẩy mạnh. Chính vì vậy, thao tác thu nhận trứng địi hỏi phải điều chỉnh lực đẩy của xi lanh để hạn chế trứng xấu. Bên cạnh đĩ, vì nguồn mẫu buồng trứng thu nhận từ lị mổ nên cĩ thể chất lượng mẫu khơng đảm bảo sự tương đồng về các chỉ tiêu cần thiết: tuổi buồng trứng, chất lượng buồng trứng, kích thước nang trứng… 3.1.2. Kết quả nuơi trứng trong ống nghiệm (IVM) Những trứng loại A và B đem nuơi cấy qua 2 mơi trường VM1 và VM2 như đã trình bày ở trên. Sau 44 giờ, thu và vortex trứng bằng hyaluronidase 0,1% để loại cumulus nhằm quan sát thể cực (Hình 3.2). Thí nghiệm được tiến hành 10 đợt, kết quả ghi nhận ở Bảng 3.2. và Biểu đồ 3.2. Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất Bảng 3.2. Kết quả nuơi trứng heo 41.68% 23.37% 34.95% Loại A Loại B Loại C Số đợt TN Số trứng đem nuơi Tỷ lệ trứng chín 10 1189 65,42 ± 0,79% (779 Trứng) α < 0,05 Biểu đồ 3.2. Kết quả nuơi trứng heo Sau 10 lần thí nghiệm, tổng số đã chọn được 1189 trứng tốt dùng để nuơi. Sau 44 – 48 giờ nuơi cấy, cĩ 779/1189 trứng chín, đạt tỷ lệ trung bình 65,42 ± 0,79%. Tỷ lệ này khá cao so với tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2004) chỉ đạt 18,3%. Đồng thời khi so sánh với một số kết quả được cơng bố trên thế giới thì thấy kết quả IVM trứng heo của chúng tơi cũng khơng cĩ sự cách biệt mấy: Abeydeera Lalantha R. và cs. (1998, 80 – 85%); Kazuhiro và cs. (1999) là 68%; Yamauchi và cs. (1999, 60 - 70%); Marques và cs. (2006) là 65%; Maedomari (2007, 64,5%). Tuy nhiên, kết quả này thấp so với các tác giả khác trên thế giới như: Iwamoto (2005, 73,00%). Tỷ lệ trứng chín thấp hơn như thế là do các nguyên nhân sau: - Địa điểm lấy mẫu nằm cách xa phịng thí nghiệm và thu mẫu vào đêm khuya (24giờ) nên thời gian vận chuyển mẫu về nơi xử lý khá lâu. Bên cạnh đĩ, dụng cụ ổn nhiệt trong quá trình thu mẫu do được tự chế nên khơng đảm bảo hệ thống ổn nhiệt trong quá trình vận chuyển mẫu. Hai yếu tố này ảnh hưởng gián tiếp đến tỷ lệ sống, chết và sự trưởng thành của trứng trong quá trình nuơi cấy. - Mẫu buồng trứng thu nhận từ lị mổ nên khơng biết rõ độ tuổi, yếu tố di truyền của con giống. Các trứng thu nhận từ buồng trứng cĩ thể ở nhiều giai đoạn khác nhau của sự phát triển nên khả năng trưởng thành của trứng diễn ra khơng đồng thời tại một thời điểm. 65.42% 34.58% Trứng chín Trứng chưa chín và chết - Thao tác thu nhận trứng bằng phương pháp chọc hút cũng tác động khơng tốt đến trứng vì chọc hút bằng kim 18G gây áp lực hút quá mạnh làm mất tính liên kết của phức hợp trứng – cumulus (Cumulus – Oocyte Complex_COC) ảnh hưởng khả năng trưởng thành của trứng. Thao tác chuyển trứng bằng hệ thống mouth pipette và pipette Pasteur cịn chậm làm cho trứng phải tiếp xúc trực tiếp với các điều kiện bất lợi của mơi trường như nhiệt độ, ánh sáng trong khoảng thời gian dài. Chính các lý do này cũng gĩp phần vào việc ảnh hưởng đến tỷ lệ trưởng thành của trứng. - Bên cạnh đĩ, do điều kiện phịng thí nghiệm khơng cho phép, kết quả là thời gian thực hiện IVM quá lâu nên trứng một phần nào bị thối hĩa. Ngồi ra, chính tác nhân enzyme hyaluronidase, tác động cơ học bằng máy vortex và việc hút rửa loại cumulus và enzyme bằng pipette Pasteur đã tác động xấu đến trứng vì màng tế bào động vật rất mỏng manh, đặc biệt là màng tế bào trứng. 3.1.3. Kết quả đơng lạnh trứng bằng PP1 Sử dụng số trứng metaphase II cĩ xuất hiện thể cực đã thu nhận được từ các thí nghiệm trên, tiến hành quy trình đơng lạnh và giải đơng theo trình tự các bước; ghi nhận kết quả trong Bảng 3.3. Bảng 3.3. Kết quả đơng lạnh trứng heo bằng PP1 Số đợt TN Số vi giọt Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống/thu hồi Tỷ lệ sống/số trứng ĐL 8 43 305 68,25 ± 6,81% (216 trứng) 46,15 ± 5,63% (91 trứng) 29,92 ± 2,82% α < 0,05  Tỷ lệ thu hồi Tiến hành 8 đợt thí nghiệm với tổng số trứng đem đơng lạnh là 305 trứng. Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đơng đạt 68,25 ± 6,81%. Cĩ tới 31,75% trứng bị thất thốt trong quá trình giải đơng (Biểu đồ 3.3). Điều này cĩ thể được lý giải như sau: Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đơng lạnh theo PP1 - Vi giọt đơng lạnh cĩ thể tích rất nhỏ và hơi lạnh của nitơ làm hạn chế tầm nhìn nên dẫn đến việc rất dễ sĩt một số vi giọt cĩ chứa trứng trong hộp đựng nitơ lỏng. Chính điều này làm cho khả năng bỏ sĩt trứng trong quá trình thu nhận vi giọt vào cryotube rất cao. - Mơi trường thủy tinh hĩa VS1 và VS2 cĩ nồng độ các chất bảo quản cao dần làm cho hai dung dịch này cĩ độ nhớt đặc trưng, đặc biệt là mơi trường VS2. Việc này gây khĩ khăn cho quá trình thu nhận trứng vì chiết suất của mơi trường thay đổi liên tục làm cho việc quan sát trứng dưới kính hiển vi rất khĩ kiểm sốt. Bên cạnh đĩ, giới hạn về thời gian xử lý trứng trong các mơi trường thủy tinh hĩa rất ngắn (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2) nên việc bỏ sĩt trứng là khơng thể tránh khỏi. - Chất bảo quản đơng lạnh cĩ tính thấm cao cĩ thể gây ra sự thay đổi lớn về thể tích tế bào trong suốt quá trình đơng lạnh và giải đơng. Bên cạnh đĩ, mơi trường ngoại bào sẽ trở nên ưu trương hơn bởi vì nồng độ chất tan tăng lên so với nồng độ mơi trường nội bào. Vì thế nước sẽ rời khỏi tế bào và kết quả là tế bào co lại. Đây chính là lý do trứng thường bị mất ở mơi trường thủy tinh hĩa trong khi thao tác. - Tương tự khi thu hồi trứng từ vi giọt đơng lạnh trong mơi trường VS2 khả năng bỏ sĩt trứng là rất cao. Ngồi ra, vi giọt chứa trứng cũng thường bị sĩt lại trong cryotube. Hơn nữa, thao tác giải đơng chậm cịn làm cho vi giọt tan ra trong cryotube gây khĩ khăn cho việc thu nhận trứng và làm thất thốt một số lượng trứng khơng nhỏ.  Tỷ lệ sống chết Từ số trứng thu hồi được sau giải đơng, chúng tơi tiến hành đánh giá tỷ lệ sống chết bằng cách quan sát hình thái. 68.25% 31.75% Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đơng Tỷ lệ trứng thất thốt Hình 3.3. Trứng sống Hình 3.4. Trứng cĩ tế bào chất phân mảnh Hình 3.5. Trứng chết do tế bào chất co lại Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP1 Tỷ lệ trứng sống khi quan sát hình thái của tất cả các thí nghiệm cịn thấp (46,15%) so với các cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã được cơng bố trong thời gian gần đây. Năm 2004, Fujihira thực hiện quy trình đơng lạnh và giải đơng trứng heo bằng phương pháp thủy tinh hĩa sử dụng Cryotop, với nồng độ ethylene glycol (EG) trong dung dịch thủy tinh hĩa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau giải đơng là 54 – 56%. Năm 2006, nhĩm tác giả Gupta, Uhm và Lee - thực hiện đơng lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hĩa sử dụng bề mặt rắn (Solid Surface Vitrification_SSV) cĩ xử lý với cytochalasin B, thu đuợc tỷ lệ sống về mặt hình thái sau giải đơng hơn 60%. Kết quả nghiên cứu của chúng tơi chưa cao, điều này cĩ thể giải thích như sau:  Chất lượng trứng nuơi chín khơng ổn định ở các lần thí nghiệm như đã trình bày ở trên.  Ảnh hưởng của enzyme hyaluronidase trong quá trình vortex loại bỏ cumulus và thời gian vortex quá mức cũng phần nào tác động đến tính tồn vẹn của màng tế bào chất.  Phương pháp thủy tinh hĩa địi hỏi sự chính xác về thời gian, trứng chỉ tiếp xúc với các dung dịch thủy tinh hĩa trong vịng vài giây (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2). Bên cạnh đĩ, thao tác đơng lạnh và giải đơng bằng vi giọt cịn khá mới, điều làm cho thời gian chuyển 46.15% 53.85% T._.