Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang pva – alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao

i xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala trên chất mang PVA-alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao” là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức và dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và dựa trên sự hướng dẫn khoa học của Th.S Trần Thị Tưởng An. Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung đồ án có tham khảo và sử dụng các tài liệu thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khóa luận. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực hiện Ngô Lê Hồng Duyên i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện cho em được thực hiện đồ án này. Em xin cảm ơn toàn thể thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tận tình truyền đat các kiến thức và kỹ năng để em có thể hoàn thành khóa luận này. Trong suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Năng Lượng Sinh Học và Biomass – Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cô Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Cảm ơn cô đã gợi ý đề tài, tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tại đại học Bách Khoa, tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, luôn theo sát chỉ dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt quá trình làm khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị làm việc trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây. Cảm ơn ba mẹ người đã luôn luôn bên cạnh động viên tinh thần em trong những lúc em cảm thấy khó khăn nhất. Cuối cùng, cảm ơn tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm những người bạn đã luôn bên cạnh và giúp đỡ em trong mọi việc. Mặc dù đã cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm và máy móc hiện đại cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong được sự góp của quý thầy cô và các bạn để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực hiện Ngô Lê Hồng Duyên ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT ...................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................. vii LỜI MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................................. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 1.1 Giới thiệu về bioethanol ......................................................................................... 3 1.1.1 Khái niệm ........................................................................................................ 3 1.1.2 Các thế hệ bioethanol ...................................................................................... 6 ❖ Bioethanol thế hệ thứ nhất ..................................................................................... 6 ❖ Bioethanol thế hệ thứ hai ....................................................................................... 6 ❖ Bioethanol thế hệ thứ ba ........................................................................................ 6 1.2 Quy trình sản xuất ethanol ..................................................................................... 7 1.2.1 Tiền xử lý ........................................................................................................ 8 1.2.2 Thủy phân ..................................................................................................... 10 1.2.3 Lên men ........................................................................................................ 11 1.2.4 Chưng cất, thu hồi bioethanol ....................................................................... 11 1.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol ............................................................... 13 1.3.1 Một số nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol ............................................ 13 1.3.2 Sản xuất bioethanol sử dụng nguồn nguyên liệu vỏ cacao ........................... 15 1.3.2.1 Giới thiêu về vỏ cacao ............................................................................... 15 1.3.2.2 Tình hình sản xuất cacao ở Việt Nam ....................................................... 15 1.4 Cố định tế bào ...................................................................................................... 17 1.4.1 Định nghĩa và các phương pháp cố định....................................................... 17 1.4.2 Ưu điểm & nhược điểm ................................................................................ 20 1.4.3 Chất mang .................................................................................................... 22 1.4.4 Saccharomyces & Pichia .............................................................................. 26 1.4.5 Một số nghiên cứu về cố định tế bào ............................................................ 28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 32 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ................................................................. 32 2.1.1 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 32 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 32 iii Đồ án tốt nghiệp 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 32 2.1.4 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 32 2.2 Vật liệu và thiết bị ................................................................................................ 32 2.2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ........................................................ 32 2.2.2 Hóa chất sử dụng .......................................................................................... 33 2.2.3 Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 35 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................. 35 2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................................... 36 2.4 Phương pháp phân tích ......................................................................................... 39 2.4.1 Phương pháp Vi sinh..................................................................................... 39 2.4.2 Phương pháp sinh hóa ................................................................................... 42 2.4.3 Xử lý số liệu .................................................................................................. 43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................................ 44 3.1 Quá trình cố định tế bào ....................................................................................... 44 3.1.1 Cảm quan nồng độ sodium alginate .............................................................. 44 3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ PVA ....................................................................... 45 3.2 Kết quả sử dụng chế phẩm S.cerevisia và P.anomala cố định trên PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao ...................................................................................... 48 3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian (giờ) lên men ........................................................ 48 3.2.2 Ảnh hưởng của pH ........................................................................................ 52 3.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men ...................................................................... 54 3.3 Khả năng tái sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA để lên men ........................................................................................................ 57 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 61 4.1 Kết luận ................................................................................................................ 61 4.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 62 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ................................................................................................. 62 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI ............................................................................................. 62 TÀI LIỆU TỪ INTERNET ............................................................................................. 63 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT DNS 3,5-dibnitrosalycylic acid P.anomala Pichia anomala PL Phụ lục PVA Polyvinyl alcohol S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDA Sabouraud Dextrose Agar SDB Sabouraud Dextrose Broth SHF Separate hydrolysis and fermentation SSCF Simultaneous saccharification and co-fermentation SSF Simultaneous saccharification and fermentation TSD Tái sử dụng v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc tính hóa lý của ethanol Bảng 1.2 Thông số của bioethanol so với xăng Bảng 1.3 Các phương pháp tiền xử lý Bảng 1.4 Các kỹ thuật lên men thu nhận bioethanol Bảng 2.1 Thông tin thiết bị sử dụng trong quá trình nguyên cứu Bảng 2.2 Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào của Saccharomyces cerevisiae Bảng 2.3 Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào của Pichia anomala Bảng 2.4 Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo ethanol Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol Hình 1.3 Trái cacao Hinh 1.4 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl alcohol Hinh 1.5 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl acetate Hình 1.6 Saccharomyces cereviciae Hình 1.7 Pichia anomala Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 3.1. Mật độ tế bào cố định trên PVA Hình 3.2. Hiệu suất cố định tế bào Hình 3.3. Mật độ tế bào cố định trên PVA Hình 3.4. Hiệu suất cố định tế bào Hình 3.5 Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men Hình 3.6 Sự thay đổi các thành phần theo pH trong môi trường lên men. Hình 3.7 Sự thay đổi các thành phần theo tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men. Hình 3.8 Sự thay đổi các thành phần qua số lần tái sử dụng. vii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Như chúng ta đã biết, nền kinh tế thế giới hiện nay và trong tương lai phụ thuộc rất nhiều vào nhiên liệu hóa thạch, mặc dù nguồn tài nguyên này trong đó có dầu thô là tác nhân gây ô nhiễm môi trường rất lớn và được báo động là đang đi vào giai đoạn cạn kiệt như một sự tất yếu khi tài nguyên tự nhiên hữu hạn bị khai thác tối đa. Bên cạnh đó, nhu cầu bảo vệ môi trường sống trên trái đất được trong sạch dài lâu cũng như cần phát triển kinh tế với một tốc độ cao và trên quy mô rộng làm cho an ninh năng lượng toàn cầu ngày càng bị đe dọa nghiêm trọng. Do đó, nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đã được đặt ra trong gần nửa thế kỷ qua và ngày càng trở nên cấp thiết. Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo. Bioethanol tồn tại ở dạng lỏng có thể được sử dụng làm nguồn nhiên liệu mới cho tương lai. Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động do tinh bột là nguồn lương thực của con người. Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên liệu giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với sản xuất bằng con đường hóa học. Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40– 75% tổng chi phí của sản xuất ethanol. Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol là vô cùng cần thiết. Các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm của ngành nông nghiệp như rơm rạ, bã mía, vỏ cacaođang là sự lựa chọn hàng đầu hiện nay, việc sản xuất bioethanol từ các phụ phẩm nông nghiệp giúp giảm giá thành bioethanol, hạn chế rác thải nông nghiệp, tăng năng suất lao động của người nông dân, . Bioethanol thường được sản xuất bằng nấm men tự do, tuy nhiên lên men bằng nấm men tự do gặp một số vấn đề như thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp, tiêu tốn khá nhiều năng lượng để tách nấm men sau quá trình lên men. Để khắc phục, ta dùng phương pháp cố định nấm men với nhiều ưu điểm như: tốc 1 Đồ án tốt nghiệp độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn dù diện tích bề mặt dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn, và khả năng tái sử dụng nấm men cố định giúp giảm thời gian nuôi cấy và thời gian lên men, ổn định hoạt tính của nấm men. Bên cạnh đó, vỏ cacao là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ phế phẩm. Với sản lượng hằng năm khoảng 1-2 tấn/ha, lượng vỏ thải ra là gánh nặng rất lớn đối với môi trường. Bên cạnh đó, cây cacao cho thu hoạch gần như quanh năm nên nguồn cung nguyên liệu khá thuận lợi. Nguồn vỏ ca cao khổng lồ bị bỏ phí bấy lâu nay có thể được tận dụng rất hiệu quả để thử nghiệm lên men ethanol sinh học. Do vậy, đề tài “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae & Pichia anomala trên chất mang PVA-alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ ca cao” thực hiện để khảo sát lên men ethanol bằng phương pháp cố định tế bào và ứng dụng nguồn nguyên liệu phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái cacao. 2. Mục tiêu đề tài Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala sử dụng chất mang PVA-alginate, ứng dụng trong lên men ethanol từ vỏ cacao. 3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề tài, tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Khảo sát chất mang PVA-alginate để cố định S. cerevisiae và P.anomala - Khảo sát các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men khi sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên chất mang PVA-alginate. - Thử nghiệm khả năng sử dụng chế phẩm S.cerevisiae và P.anomala cố định trên chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao 2 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về bioethanol 1.1.1 Khái niệm Bioethanol hay còn gọi là ethanol sinh học, là một dạng ethanol (hình 2.1) không tổng hợp bằng con đường hóa học mà được sản xuất bởi các vi sinh vật thông qua quá trình lên men đường từ các vật liệu sinh học có chứa đường hay các vật liệu có thể chuyển đổi thành đường như tinh bột, cellulose, lignocellulose, thường là từ các loại ngũ cốc như ngô, lúa mì, đậu tương hoặc từ vỏ cây, bã mía,... nhờ tác dụng của enzyme. Hình 1.1. Công thức cấu tạo ethanol (wikipedia) Quá trình lên men đường tạo thành ethanol và carbon dioxide: C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 Ethanol dùng làm nhiên liệu cho động cơ đốt trong sẽ bị đốt cháy hòa trộn với oxygen trong động cơ tạo ra carbon dioxide, nước và nhiệt lượng: C2H6O + 3O2 → 2CO2 + 3H2O+ nhiệt lượng Tổng hợp 2 công thức trên như sau: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O+ nhiệt. Nhiệt lượng sinh ra trong quá trình dùng để chạy máy. CO2 được sinh ra trong quá trình này là carbon trung tính (Carbon neutral) khác với loại khí carbon được tạo thành sau khi đốt các nhiên liệu hóa thạch. Carbon được tạo ra sau khi đốt các nhiên liệu hóa thạch không nằm trong chu trình carbon nên việc đốt chúng sẽ làm tăng hàm lượng carbon trong không khí gây hiệu ứng nhà kính. 3 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Đặc tính hóa lý của ethanol Công thức cấu tạo C2H5OH Khối lượng phân tử 46,07 g/mol Hình dạng Chất lỏng không màu (giữa -117oC &78oC) Độ hòa tan Hòa tan không giới hạn Khối lượng riêng 0,789 kg/l Nhiệt độ sôi 78,5oC (173oF) Nhiệt độ đông -117oC Điểm bắt lửa 12,8oC (thấp nhất) Điểm nóng chảy 425oC Giới hạn nổ Thấp hơn 3,5% v/v; lớn hơn 19% v/v Áp suất hơi 50mmHg (38oC) Giá trị nhiệt cao hơn 29.800 kJ/L (ở 20oC) Giá trị nhiệt thấp hơn 21.090 kJ/L (ở 20oC) Nhiệt dung riêng 60 Kcal/Kg Độ acid (pKa) 15,9 Độ nhớt 1.200 mPa.s (ở 20oC) o Chỉ số khúc xạ (nD) 1,36 (ở 25 C) Chỉ số octane 99 (nguồn: Graeme M.Walker) 4 Đồ án tốt nghiệp Quá trình sản xuất rượu ethanol làm nhiên liệu sinh học sạch gồm có 3 giai đoạn: - Lên men đường với chất men (microbial yeast). - Cất rượu: Rượu ethanol dùng để làm nhiên liệu cho xe ô tô phải chứa rất ít nước bằng phương pháp chưng cất rượu, nhưng rượu thuần chỉ đạt đến giới hạn 95-96%. Loại rượu này có thể dùng chạy máy, nhưng không thể hòa trộn với xăng dầu. - Làm khô: Đây là phương pháp làm khô rượu ethanol bằng cách dùng sàng phân tử ZEOCHEM Z3-03, hoặc thêm chất hydrocarbon benzene hoặc dùng chất calcium oxide như là chất làm khô để khử nước trong rượu. Ethanol thu được sau quá trình chưng cất ngũ cốc lên men có dạng hỗn hợp gồm nước và ethanol, cần phải tách nước để lấy ethanol khan trước khi trộn với xăng. Cũng có thể dùng ethanol chưa khan nước (hydrous ethanol) nhưng chỉ cho các loại động cơ xe có chế tạo tương thích. Bioethanol có thể được sử dụng như một nguyên liệu lỏng trong động cơ đốt trong do nó có chỉ số octane cao và tính chất hóa lý tương đương với xăng (bảng 2.2). Chỉ số octane càng cao thì chỉ số chống gõ (anti-knocking index) tránh được tiếng gõ làm tổn thương lòng máy. Có thể sử dụng bioethanol nguyên chất hoặc pha trộn với xăng dầu. Nếu sử dụng E10 (10% ethanol) thì không cần phải thay đổi kết cấu xe. Bảng 1.2 Thông số của bioethanol so với xăng Tỷ Độ nhớt Điểm Năng lượng Năng Chỉ số Nhiên o trọng (mm2/s) chớp (tại 20 C lượng octane liệu tượng o (kg/L) nháy ( C) MJ/kg) (MJ/L) (RON) đương (L) Xăng 0,76 0,6 <21 42,7 32,45 92 1 Bioethanol 0,79 1,5 <21 26,8 21,17 129 0,65 (nguồn: paul 2006) 5 Đồ án tốt nghiệp 1.1.2 Các thế hệ bioethanol Hiện nay dựa trên nguồn nguyên liệu sản xuất mà nguời ta chia bioethanol thành các thế hệ khác nhau. Bioethanol duợc chia thành 3 thế hệ chính: ❖ Bioethanol thế hệ thứ nhất Bioethanol thế hệ thứ nhất được sản xuất từ đuờng bằng quá trình lên men các loại đường có nguồn gốc từ lúa mì, ngô, củ cải đường, mía, mật rỉ đuờng. Hạn chế của việc sản xuất bioethanol thế hệ thứ nhất là tạo gánh nặng cho sản xuất nông nghiệp. Ðất nông nghiệp ngày một giảm, không thể cung cấp đủ cho việc sản xuất bioethanol mà không ảnh hưởng đến nguồn cung cấp thực phẩm trong nước và bioethanol được tao ra cạnh tranh chi phí với các nguồn năng lượng hóa thạch. ❖ Bioethanol thế hệ thứ hai Ðể khắc phục nhược điểm của bioethanol thế hệ thứ nhất, người ta đã sử dụng nguồn nguyên liệu phế thải hay nguồn nguyên liệu không phải là thực phẩm để có thể cung cấp nguyên liệu lâu dài, chi phí thấp và có lợi ích cho môi truờng. Nguồn cung cấp chủ yếu là thân cây, rơm rạ cũng như các loại cây trồng không phải cây lương thực như cỏ, jatropha hay các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như vỏ chuối, vỏ cacao với hàm lượng lignocellulose cao. Biothanol thế hệ thứ hai được sản xuất từ sinh khối lignocellulose (bộ khung tạo nên tính chất “gỗ” của thực vật) đang trở thành xu hướng hiện nay.Tuy nhiên, quá trình tiền xử lý lại tiêu tốn khá nhiều chi phí. ❖ Bioethanol thế hệ thứ ba Là những nhiên liệu (dầu thực vật, biodiesel, bioethanol, biogas, biomethanol, biobutanol và nhiên liệu sinh học khác) trong đó có bioethanol được sản xuất từ tảo. Ðặc điểm nổi bật của nhiên liệu từ tảo là không ảnh hưởng đến nguồn nước ngọt, có thể sản xuất bằng cách sử dụng nước biển và nước thải, tương đối vô hại 6 Đồ án tốt nghiệp cho môi trường. Nhưng chi phí cho các dự án sản xuất rất cao nên chỉ dừng ở việc thử nghiệm mà chưa ứng dụng trong quy mô sản xuất lớn. Cho đến nay, sản xuất cồn sinh học ở Việt Nam vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu từ đường (mía, rỉ đường) và tinh bột (sắn). 1.2 Quy trình sản xuất ethanol Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol trong đó nguồn nguyên liệu lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú nhất. Sau đây là quy trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose được thể hiện qua sơ đồ hình 2.2. Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa sinh khối (Nguồn: Bioresource Technology, 2009) 7 Đồ án tốt nghiệp Quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản: - Tiền xử lý nguyên liệu. - Thủy phân nguyên liệu. - Lên men. - Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. Quá trình này phụ thuộc nhiều vào công nghệ hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin được không trình bày. 1.2.1 Tiền xử lý Trong sinh khối lignocellulose thì cellulose là thành phần chính để lên men bioethanol. Cellulose và hemicellulose được bảo vệ bởi lớp lignin dày đặc chống lại sự thủy phân của enzyme.Vì vậy, cần thiết phải có một bước tiền xử lý để phá vỡ lignin để lộ cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân của enzyme được dễ dàng. Tiền xử lý nhằm mục đích giảm kết tinh của cellulose, tăng diện tích bề mặt sinh khối, loại bỏ hemicellulose, và phá vỡ lignin. Tiền xử lý làm cho cellulose dễ tiếp cận hơn với các enzyme để chuyển đổi polyme carbohydrate thành đường lên men có thể đạt được nhanh hơn, dẫn đến yêu cầu enzyme sử dụng sẽ giảm, chi phí cũng sẽ giảm. Quá trình tiền xử lý phải đáp ứng những yêu cầu: • Nâng cao được hiệu quả của quá trình thủy phân tiếp theo. • Hạn chế sự mất mát của hydrocarbon. • Tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ làm ức chế quá trình thủy phân và quá trình lên men. • Phá vỡ được lớp bao bọc của lignin và hemicellulose với cellulose. • Tiết kiệm được chi phí. Vì các nguyên liệu lignocellulose khác nhau có các đặc tính lý hóa khác nhau, nên cần áp dụng các công nghệ tiền xử lý phù hợp với các đặc điểm của từng 8 Đồ án tốt nghiệp nguyên liệu sinh khối lignocellulose. Tiền xử lý bao gồm các phương pháp cơ học, hóa lý, hóa học, sinh học,...được tóm tắt trong bảng 2.3. Bảng 1.3. Các phương pháp tiền xử lý Phương Tác nhân/ Kĩ Nguyên liệu TLTK pháp thuật Tác động cơ học Rơm rạ Hideno et al, 2009 Nổ hơi nước Mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, bã Guoce Yu & mía Shinichi Yano et al, Vật lý Nén nước nóng Rơm rạ 2008 Vi sóng Rơm rạ Azuma et al, 1984 Siêu âm Bã mía Lê Thị Như Ý, 2014 Acid Thân cây ngô, rơm lúa mì, vỏ Xuebing Zhao et al, cacao, vỏ chuối 2014 Dung môi hữu Rơm rạ Jamshid et al, 2005 cơ Chất thải nông nghiệp và thân Hóa học Kiềm cây cỏ như rơm rạ. Zhang và Cai, 2008 Tác nhân oxy Rơm rạ hóa Phế phẩm nông nghiệp và lõi Wei và Cheng ,1985 Amoniac nổ sợi bắp Zhong et al, 2009 (AFEX) Các chất thải nông nghiệp như Sinh học Vi sinh vật Patel et al, 2007 rơm rạ. 9 Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Thủy phân Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đường đơn (hexose và pentose). Ở đây, ta quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Phương trình phản ứng tổng quát (PT2): (C5H10O5)n + nH2O →nC6H12O6 (PT2) Dùng acid hoặc enzyme để thủy phân cellulose. 2.3.3.2.1 Thủy phân bằng acid Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vô cơ . 2.3.3.2.2 Thủy phân bằng enzyme Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng cellulase. Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật (nấm,vi khuẩn). Nhiều loài nấm như Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, và T. emersonii có thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase và hemicellulase ngoại bào. Vật liệu lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều kiện ôn hòa (50oC và pH~5), cho phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách hiệu quả mà không hình thành nên các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của enzyme. Quá trình thủy phân bằng enzyme bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như : cấu trúc nguyên liệu, nhiệt độ , pH, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, ảnh hưởng của các 10 Đồ án tốt nghiệp chất kìm hãm. Mỗi yếu tố đều có sự ảnh hưởng nhất định, tuy nhiên yếu tố nhiệt độ và pH là ảnh hưởng mạnh nhất . 1.2.3 Lên men Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên men thành ethanol nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, tổ hợp nhiều loại nấm men hoặc vi khuẩn (Zymomonas spp). Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme gọi là quá trình oxy hóa sinh học. Có rất nhiều phương pháp lên men để tạo bioethanol, bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol là thủy phân và lên men có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF), đồng thời (SSF), hay đồng thời kết hợp nhiều chủng vi sinh vật (SSCF). Các phương pháp lên men bioethanol được tóm tắt trong bảng 1.4. 1.2.4 Chưng cất, thu hồi bioethanol Bioethanol cần phải được tách chiết ra khỏi dịch lên men và được tinh chế thì mới có thể sử dụng. Thu hồi ethanol từ dịch lên men bằng quá trình chưng cất hoặc kết hợp quá trình chưng cất với quá trình hấp phụ. Để thu cồn tuyệt đối người ta có thể dùng các phương pháp sau: • Chưng phân tử, chưng trích ly. • Hấp phụ rây phân tử. • Dùng Na2SO4, CaSO4, CaCO3, CuSO4 khan để hấp phụ nước. • Thẩm thấu qua màng lọc. • Chưng cất và thẩm thấu qua màng. Giai đoạn này phụ thuộc vào các kỹ thuật, máy móc và quá trình thiết bị nên trong giới hạn đề tài này không nghiên cứu. 11 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. Các kỹ thuật lên men thu nhận bioethanol Phương pháp Nguyên tắc Ưu điểm Nhược điểm • Ức chế hoạt tính Thủy phân và lên Là một quá • Thủy phân và lên enzyme bởi sản phẩm men riêng rẽ trình gồm hai men được thực hiện cuối. pha tách biệt, trong điều kiện tối ưu (separate hydrolysis • Thời gian thủy phân thủy phân của mỗi quá trình, and fermentation – dài  nhiễm khuẩn rất nguyên liệu và không phụ thuộc vào SHF) cao. lên men glucose nhau. tạo ethanol. • Ứng dụng quy mô công nghiệp. Thủy phân và lên Là quá trình lên • Không cần phải • Không thể tái sử dụng men đồng thời men đồng thời tách glucose khỏi cơ nấm men vì nó ở trạng (Simultaneous với thủy phân chất lignocellulose  thái hỗn hợp của dịch sau Saccharification cơ chất. tránh được thất thoát lên men. and Fermentation- glucose. • Ethanol tạo thành sẽ SSF) • Thời gian lên men quay lại ức chế cellulase ngắn  tránh được Ethanol thu được không hiện tượng tạp nhiễm. cao. Thủy phân và lên Là quá trình lên • Sản phẩm • Nhiệt độ của quá trình men đồng thời kết men kết hợp với hemicellulose sau tiền thủy phân bằng enzyme hợp các giống vi các giống vi xử lý không cần tách và lên men ethanol khác sinh vật sinh vật diễn ra khỏi thành phần sợi nhau đáng kể , làm cho (Simultaneous đồng thời với cellulose. việc tối ưu hóa đồng thời saccharification and quá trình đường hai hoạt động rất khó. cofermentation- hóa cơ chất. SSCF) 12 Đồ án tốt nghiệp 1.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol 1.3.1 Một số nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol Công nghệ sản xuất bioethanol gồm 3 bước chính: Tinh bột, cellulose → glucose → ethanol Dựa vào 3 bước đơn giản ta có các nguồn nguyên liệu sản xuất: - Ethanol được sản xuất từ đường Đây là cách nhanh chóng và... & Tiền xử lý Giữ giống Khảo sát pH, thời gian và tỷ lệ tế bào cố định để Khảo sát nồng lên men Cố định tế độ PVA và Lên men acid boric bào Khảo sát khả năng tái sử dụng Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.2.1 Khảo sát nồng độ PVA và H3BO3 để cố định tế bào S.cerevisiae và P.anomala - Để tăng khả năng tạo hạt, tiến hành bổ sung aliginate cùng tạo hạt với chất mang PVA và CaCl2 được bổ sung vào H3BO3. - Tiến hành khảo sát nồng độ alginate (1%, 2%, 3%, 4%): giữ chất mang PVA nồng độ 12%, tạo hạt trên dung dịch H3BO3 7% và CaCl2 2%. - Tiến hành khảo sát khả năng cố định tế bào nấm men ở nồng độ PVA (10%, 11%, 12%, 13%, 14%) và H3BO3 (5%, 6%, 7%, 8%, 9%) khác nhau. - Trước khi cố định: kiểm tra mật độ tế bào trong dịch nấm men ban đầu (môi trường SDB) - Sau khi cố định: kiểm tra mật độ tế bào không được cố định và kiểm tra mật độ tế bào sống trong hạt cố định bởi chất mang PVA và H3BO3. - Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào nấm men ở các nồng độ PVA và alginate. 36 Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2 Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào của S.cerevisiae PVA 10% 11% 12% 13% 14% H3BO3 5% NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 6% NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 7% NT11 NT12 NT13 NT14 NT15 8% NT16 NT17 NT18 NT19 NT20 9% NT21 NT22 NT23 NT24 NT25 Bảng 2.3 Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào của Pichia anomala PVA 10% 11% 12% 13% 14% H3BO3 5% NT26 NT27 NT28 NT29 NT30 6% NT31 NT32 NT33 NT34 NT35 7% NT36 NT37 NT38 NT39 NT40 8% NT41 NT42 NT43 NT44 NT45 9% NT46 NT47 NT48 NT49 NT50 2.3.2.2 Khảo sát các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men khi sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA để lên men từ vỏ cacao. Nguyên liệu được tiền xử lý bằng phương pháp thủy nhiệt theo tỷ lệ (bột vỏ cacao và nước cất) là (1:20), đun trong 2 giờ. Nguyên liệu sau khi tiền xử lý sẽ được điều chỉnh pH, hấp khử trùng (121oC, 10atm, 10 phút) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng bổ sung enzyme cellulase, 37 Đồ án tốt nghiệp pepton và nấm men S.cerevisiae và P.anomala tiến hành thủy phân và lên men đồng thời. Sau lên men thu dịch lên men có chứa cồn. Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ở nhiệt độ phòng (25oC – 35oC), trong điều kiện tĩnh, tế bào nấm men cố định bởi hạt có nồng độ PVA 12%, alginate 1%, dung dịch acid boric (H3BO3) 7% và CaCl2 2%; tỷ lệ nấm men cố định 5%. Đề tài khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và lên men đồng thời được trình bày tóm tắt trong bảng 3.3 Bảng 2.4 Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm Nghiệm thức Thời gian (giờ) pH Tỷ lệ nấm men 1 42 2 45 3 48 5 5% 4 51 5 54 6 56 7 4,5 8 Thời gian tối ưu 5 5% 9 5,5 10 3% 11 5% Thời gian tối ưu pH tối ưu 12 7% 13 9% 38 Đồ án tốt nghiệp Sau khi thủy phân và lên men các chỉ tiêu cần theo dõi: nồng độ cồn (%), hàm lượng đường khử (mg/ml), hàm lượng cellulose (mg/ml). Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, kết quả được tính bằng trung bình của 3 lần đo. 2.3.2.3 Khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA để lên men từ vỏ cacao. Tiến hành khảo sát khả năng tái sử dụng trong thời gian lên men tối ưu. Nguyên liệu sau khi tiền xử lý sẽ được điều chỉnh pH, hấp khử trùng (121oC, 10atm, 10 phút) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng bổ sung enzyme cellulose, peptone và nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala tiến hành thủy phân và lên men đồng thời. Sau mỗi lần lên men ở thời gian tối ưu, thu dịch lên men và sử dụng hạt cố định ở lần lên men trước, thay thành phần nguyên liệu mới bột vỏ cacao đã qua tiền xử lý bổ sung enzyme cellulose và peptone tiếp tục tiến hành lên men ở thời gian tối ưu. Xác định khả năng tái sử dụng. Sau mỗi lần lên men thu dịch men đo các chỉ tiêu cần theo dõi: nồng độ cồn (%), hàm lượng đường khử (mg/ml), hàm lượng cellulose (mg/ml). 2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Phương pháp Vi sinh 2.4.1.1 Phương pháp giữ giống nấm men Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để yên đến khi agar đông lại. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống nghiệm gốc sang ống môi trường thạch nghiêng đã chuẩn bị sẵn từ trước. Công việc này tiến hành trong tủ cấy vi sinh để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này. 2.4.1.2 Phương pháp nhân giống và hoạt hóa giống nấm men Giống nấm men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống trước khi đưa vào lên men. Ở đề tài này tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn: 39 Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn 1: Nấm men sau khi được tăng sinh trên môi trường thạch nghiêng SDA. Khuẩn lạc được cấy ria sang môi trường thạch đĩa. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ thuần cấy vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường SDB. Nuôi ở 37oC trong 48 giờ. Giai đoạn 2: Cho toàn bộ nấm men đã nuôi giống ở giai đoạn 1 vào erlen có chứa 200mL môi trường SDB vô trùng, nuôi ở 37oC trong 48 giờ. Cần hoạt hóa giống nấm men trước 8-24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực trở lại trước khi lên men cho đợt tiếp theo. 2.4.1.3 Định lượng số tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ❖ Nguyên tắc: Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, qua đó xác định được số tế bào sống. ❖ Mục đích: Để xác định số lượng vi sinh vật không được cố định. Lấy mẫu sau khi cố định hạt ở trong dung dịch tạo hạt còn dư. ❖ Tiến hành: - Pha loãng mẫu: pha loãng mẫu theo các dãy số thập phân thích hợp như : 10-1, 10-2. - Cấy mẫu: Dùng micropipette hút 0,1mL dịch mẫu đã pha loãng cho vào mỗi đĩa thạch. Khi tất cả các thể tích 0,1mL dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển lên bề m t thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng thủy tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng. - Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc đếm được từ 25-250 để tính toán. Mật độ tổng của nấm men được tính theo công thức : A = 푁 (cfu/mL) 푁1 ×푉 ×푓1 +⋯푁2 ×푉 ×푓2 Trong đó: A: số tế bào (cfu) nấm men trong 1ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. 40 Đồ án tốt nghiệp V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng. Làm tròn kết quả có được, ghi lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số m ). ❖ Lưu ý: - Nếu ở độ pha loãng cao nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250 thì kết quả ghi là > 2,5.107 cfu/mL. - Nếu độ pha loãng thấp nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, kết quả ghi là < 2,5.103 cfu/mL. 2.4.1.4 Phương pháp đếm khuẩn lạc ❖ Nguyên tắc: Xác định số tế bào sống gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa. ❖ Mục đích: Để xác định số lượng vi sinh vật được cố định. Lấy mẫu ở trong dung dịch sau khi phá hạt. ❖ Cách tiến hành: • Chuẩn bị chất mang PVA-alginate, dung dịch tạo hạt CaCl2-H3BO3 và dung dịch đệm (K2HPO4 và KH2PO4) hấp khử trùng • Chuẩn bị 200mL SDB đã hấp vô trùng, 1 đĩa thạch SDA và 1 erlen chứa 10mL SDB vô trùng • Cấy ria giống từ ống thạch nghiêng sang đĩa SDA, ủ ở 37oC trong 24 giờ • Lấy 1 khuẩn lạc riêng lẻ cho vào erlen chứa 10mL SDB, ủ ở 37oC trong 48 giờ • Chuyển 10mL môi trường này vào chai chứa 200mL SDB để nấm men tiếp tục phát triển tăng sinh khối, ủ 37oC trong 48 giờ (cho đến khi môi trường đục). Thu sinh khối. • Tạo hạt alginate có chứa nấm men, để tủ lạnh trong 2 tiếng để nấm men cố định bền chắc cấu trúc • Gạn phần dung dịch tạo hạt ban đầu, cho dung dich đệm phá vỡ cấu trúc alginate vào hạt vừa tạo. Hỗn hợp để máy lắc trong 24 giờ 41 Đồ án tốt nghiệp • Pha loãng mẫu ở các nồng độ thập phân khác nhau:10-1, 10-2...để cấy mẫu. • Hút 0,1mL mẫu đã pha loãng cho vào đĩa thạch có chứa môi trường SDA, dùng que trải tam giác thủy tinh trải đều dịch vi sinh trên bề mặt môi trường. Ủ 37oC trong 48 giờ. Sau khi ủ, lấy đĩa thạch ra và tiến hành đếm. 2.4.2 Phương pháp sinh hóa 2.4.2.1 Định lượng đường khử bằng phương pháp Miller ❖ Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5-dinitrosalycylic acid (DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-nitrosalycylic có màu đỏ cam. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540-600nm. ❖ Cách tiến hành: • Hút 1ml dung dịch mẫu (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) + 1ml dung dịch DNS. • Nung cách thủy hỗn hợp trong 15-20 phút. Làm lạnh nhanh về nhiệt độ phòng rồi đo OD ở bước sóng 540nm. • Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose suy ra hàm lượng đường khử trong mẫu. Tính toán kết quả theo công thức: D = 푋 × 푛 ×푉 (mg/g) 푚 Trong đó: X (mg/mL) đường khử trong dung dịch đường pha loãng n: hệ số pha loãng 42 Đồ án tốt nghiệp V: Thể tích dịch đường gốc (mL) m: Khối lượng mẫu cân (g) 2.4.2.2 Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher – Hofft ❖ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu giữa cellulose với thuốc thử Anthrone (9,10- dihydro-9-oxoantracen) trong acid H2SO4 đậm đặc để xác định hàm lượng cellulose trong mẫu. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị chuẩn cellulose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng cellulose của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 630nm. ❖ Cách tiến hành: • Hút 0,5ml dung dịch (đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) + 5ml dung dịch Anthrone. • Nung cách thủy hỗn hợp trong 5 phút. Làm lạnh nhanh rồi đo OD ở bước song 540nm. • Từ giá trị OD thu được, dựa vào đồ thị đường chuẩn cellulose suy ra hàm lượng celulose trong mẫu. 2.4.2.3 Phương pháp xác định pH Dùng pH kế. 2.4.2.4 Phương pháp xác định độ cồn Dùng cồn kế: Đơn vị % v/v. 2.4.3 Xử lý số liệu Số liệu thu được ở các thí nghiệm là số liệu thô. Sau đó sẽ được xử lý thống kê bằng ANOVA một yếu tố. 43 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Quá trình cố định tế bào 3.1.1 Cảm quan nồng độ sodium alginate Nồng độ sodium Trạng thái chế phẩm cố Hình ảnh alginate (%) định 0,5 Hạt mềm, một số hạt bị vỡ ngay khi vừa nhỏ vào dung dich tạo hạt 1 Hạt chắc, tròn đều đẹp 2 Hạt chắc, hạt dai nhưng không tròn mà có đuôi 3 Hạt dẻo, hạt dai, một số hạt bị dính vào nhau thành chùm . 44 Đồ án tốt nghiệp Tiến hành tạo giá thể hạt: tạo dung dịch keo có thành phần PVA 12%, alginate ở các nồng độ khác nhau 0.5%, 1%, 2%, 3%; cố định thành hạt bằng cách nhỏ giọt vào dung dịch cố định có thành phần acid boric (H3BO3) 7% và CaCl2 2%. Kết quả: Trong quá trình tạo hạt cố định tế bào, sodium alginate được bổ sung vào dung dịch để cải thiện tính chất hạt PVA-acid boric bằng cách giảm sự kết tụ và để tăng cường tính chất bề mặt của các hạt. Do đó nồng độ alginate có ảnh hưởng đến hạt PVA-acid boric cố định. Nồng độ alginate thấp hạt không chắc khi cố định tế bào sẽ, nồng độ quá cao thì hạt cứng, cấu trúc quá chặt chẽ tế bào làm giảm khả năng bắt chất dinh dưỡng môi trường. Nồng độ alginate cao thì hạt được tạo cũng sẽ có cấu trúc quá chặt chẽ sẽ ảnh hưởng đến việc trao đổi chất của nấm men cố định với môi trường. Nên nồng độ tốt để hạt gel có cấu trúc ổn định, tế bào được cố định vẫn có thể trao đổi chất tốt là alginate 1% để kết hợp với các chất mang và dung dich tạo hạt gel khác. 3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ PVA PVA có tính đàn hồi và bền cơ học cao, khả năng cố định tế bào tốt. Chất mang PVA có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng. Nhờ có cấu trúc đặc biệt mà PVA trở thành chất mang hữu hiệu để cố định tế bào vi sinh vật mà không làm cản trở đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các tế bào vi sinh vật được cố định bên trong. Cố định lạnh đông hình thành gel với hệ thống các lỗ xốp làm cho cơ chất và sản phẩm phản ứng có thể thấm qua chất mang rất dễ dàng. Tuy nhiên cố định tế bào vi sinh vật trong điều kiện nhiệt độ thấp cũng ảnh hưởng ít nhiều đến hoạt tính vi sinh vật. Kết quả khảo sát mật độ tế bào được cố định trên chất mang PVA – alginate. 45 Đồ án tốt nghiệp Mật độ của S.cerevisia trong bình nhân giống: 107,5 cfu/ml ❖ Saccharomyces cerevisia 8 7 6 5 PVA 10% 4 PVA 11% 3 PVA 12% PVA 13% 2 Mật độ tế cfu/mllogđộtế bàoMật PVA 14% 1 0 5 6 7 8 9 Nồng độ acid boric (%) Hình 3.1. Mật độ tế bào cố định trên PVA 120 100 PVA 10% 80 PVA 11% 60 PVA 12% PVA 13% Hiệu suất (%) Hiệu suất 40 20 PVA 14% 0 5 6 7 8 9 Nồng độ acid boric (%) Hình 3.2. Hiệu suất cố định tế bào (%) 46 Đồ án tốt nghiệp Mật độ của P.anomala trong bình nhân giống: 108,5 cfu/ml ❖ Pichia anomala 9 8 7 6 PVA 10% 5 PVA 11% 4 PVA 12% 3 PVA 13% 2 Mật độ tế cfu/mllogđộtế bàoMật PVA 14% 1 0 5 6 7 8 9 Nồng độ acid boric (%) Hình 3.3. Mật độ tế bào cố định trên PVA 35.0 30.0 25.0 PVA 10% 20.0 PVA 11% 15.0 PVA 12% Hiệu suất (%) Hiệu suất 10.0 PVA 13% 5.0 PVA 14% 0.0 5 6 7 8 9 Nồng độ acid boric (%) Hình 3.4. Hiệu suất cố định tế bào (%) ❖ Nhận xét: Polyvinyl alcohol (PVA) sẽ cố định tế bào bằng cách tạo cryogel. Acid boric (H3BO3) là dung dịch hỗ trợ tạo hạt PVA, nồng độ acid boric phụ thuộc vào tỷ lệ phần trăm của PVA được sử dụng. Việc cố định tế bào phụ thuộc vào việc tạo hạt 47 Đồ án tốt nghiệp gel, phụ thuộc vào nồng độ PVA và acid boric, nếu nồng độ PVA và acid boric càng tăng thì khả năng tạo hạt gel tăng, mật độ tế bào được cố định càng cao nhờ hạt gel PVA khó bị vỡ, có tính đàn hồi càng cao. Nồng độ PVA 12% và acid boric 7% có hiệu suất cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisia đạt 98%; nồng độ PVA 12% và acid boric 5%, nồng độ PVA 13% và acid boric 7% có hiệu suất cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisia đạt 94%; nồng độ PVA 13% và acid boric 5% có hiệu suất cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisia đạt 94%. Nồng độ PVA 10% và acid boric 5% có hiệu suất cố định tế bào nấm men Pichia anomala 10,1%; nồng độ PVA 12% và acid boric 7% có hiệu suất cố định tế bào nấm men Pichia anomala 28,8%; nồng độ PVA 13% và acid boric 9% có hiệu suất cố định tế bào nấm men Pichia anomala 25,3%; Có thể thấy rằng nồng độ PVA càng cao thì hiệu suất cố định tế bào càng tăng. Do nồng độ PVA càng cao thì hạt càng chặt các lỗ xốp càng nhỏ tế bào trôi ra càng ít. Chất mang PVA có các đặc tính cơ lý và khả năng chịu đựng tốt hơn, tuy nhiên nồng độ cồn sản phẩm thấp và hiệu suất lên men không cao. Từ những kết quả trên ta có nồng độ PVA 12% và acid boric 7% cho hiệu suất cố định lớn nhất ở cả hai loại tế bào nấm men Saccharomyces cerevisia đạt 98%, Pichia anomala 28,8%. Đây là nồng độ PVA và acid boric thích hợp để cố định tế bào. 3.2 Kết quả sử dụng chế phẩm S.cerevisia và P.anomala cố định trên PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao 3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian (giờ) lên men Thời gian là yếu tố quan trọng ảnh huởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, nồng độ cellulose, chủng nấm menThời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men để dừng quá trình lên men. Nếu thời gian lên men quá ngưỡng, quá trình lên men 48 Đồ án tốt nghiệp chưa xảy ra hoàn toàn, đường sót sẽ còn nhiều trong dịch lên men và độ cồn tạo ra thấp. Nếu thời gian lên men quá dài, môi trường lên men sẽ dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật không mong muốn, đồng thời nếu có sự hiện diện của oxy thì cồn sẽ bị oxy hóa thành acid acetic, làm giảm độ cồn. Trong giai đoạn bắt đầu từ khi cho tế bào nấm men đã được cố định vào lên men để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. Vì trong môi truờng này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng luợng cần thiết bằng con đường lên men Ðể đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2. Ðó là nguyên nhân muốn có ethanol nhiều thì không được có oxy trong môi trường lên men. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này ethanol sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm giảm hoạt tính của tế bào được cố định và giảm nồng độ cồn sinh ra dẫn đến hiệu suất không tốt. Giống nấm men sau khi nhân giống đạt đủ sinh khối sẽ được cố định cho vào môi trường lên men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt sau lên men thì cần hoạt hóa 8 – 24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực trở lại. Quá trình lên men xảy ra nhanh trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ, nấm men đi vào pha thích nghi với môi trường, số lượng tế bào nấm men cũng tăng nhanh đáng kể. Nấm men hấp thụ đường dinh dưỡng được chuyển hóa phần lớn ở giai đoạn này. Do đó, việc chọn thời gian lên men phù hợp có ý nghĩa rất quan trọng, chọn thời gian lên men sao cho có lợi nhất. Đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men ở các mốc thời gian 42, 45, 48, 51, 54, 56 giờ. Kết quả khảo sát một số thành phần trong thời gian lên men được trình bày trong hình. 49 Đồ án tốt nghiệp 2.50 2.00 1.50 1.00 Nồng (%) Nồng độcồn 0.50 0.00 42 45 48 51 54 56 Thời gian (giờ) Độ cồn a. Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian lên men. 5.65 5.6 5.55 5.5 5.45 5.4 pH 5.35 5.3 5.25 5.2 5.15 42 45 48 51 54 56 pH Thời gian (giờ) b. Biến đổi pH theo thời gian lên men. 9.00 a a a 8.00 b c 7.00 d 6.00 e b c 5.00 d 4.00 e 3.00 f Hàm lượng (mg/ml) lượng Hàm 2.00 1.00 0.00 42 45 48 51 54 56 Glucose Thời gian (giờ) c. Biến đổi hàm lượng đường khử và hàm lượng cellulose theo thời gian lên men. 50 Đồ án tốt nghiệp 120.0 b ab ab a a 100.0 b c a b d e e 80.0 60.0 Hiệu (%)Hiệu suất 40.0 20.0 0.0 42 45 48 51 54 56 Glucose Cellulose Thời gian (giờ) d. Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hiệu suất lên men ethanol. Hình 3.5 Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men ❖ Nhận xét: Qua biểu đồ hình 3.5 cho thấy: Quá trình lên men xảy ra nhanh trong khoảng từ 42 đến 56 giờ, nấm men đi vào pha ổn định thích nghi với môi trường. Nấm men hấp thụ đường và chất dinh dưỡng hòa tan khác để lên men tạo thành cồn. Đường và chất dinh dưỡng được chuyển hóa phân lớn ở giai đoạn này, độ cồn tăng đều từ 42 giờ đến 54 giờ nhưng không có sự chênh lệch nhiều (từ 1,77% ± 0,15 đến 1,9% ± 0,1) từ 42 giờ đến 56 giờ nồng độ cồn cao nhất ở 54 giờ là 1,9% ± 0,1. Hàm lượng đường khử tăng do nấm men cố định đã tăng sinh khối và sử dụng đường dẫn đến độ cồn tăng và hàm lượng đường khử cũng tăng, phản ứng tạo thành ethanol cũng diễn ra nhanh. Hàm lượng đường khử tăng từ (6,37 ± 0,1 mg/ml) tăng lên (8,31 ± 0,1 mg/ml) Đồng thời hàm lượng cellulose cũng giảm mạnh từ (7,74 ± 0,2 mg/ml) xuống còn (2,84 ± 0,1mg/ml) do hoạt lực enzyme cho vào còn mạnh nên dễ dàng phân cắt cellulose thành đường tăng còn hàm lượng đường tăng còn hàm lượng cellulose thì giảm. (Bảng 1 – PLB). 51 Đồ án tốt nghiệp Từ khoảng 54 đến 56 nồng độ cồn bắt đầu giảm. Vì trong thời gian dài thì ethanol dễ bị oxy hóa thành acid acetic làm giảm độ cồn và làm giảm pH của dịch lên men. Từ những kết quả trên có thể kết luận 54 giờ là thời gian tối ưu để tế bào nấm men cố định trong hạt gel PVA thủy phân và lên men đồng thời vỏ ca cao thu bioethanol và tiến hành lấy 54 giờ là thời gian tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2 Ảnh hưởng của pH 1.20 a 1.00 a b 0.80 0.60 0.40 Nồng độ cồn (%) cồnđộ Nồng 0.20 0.00 4.5 5 5.5 Độ cồn pH a. Biến đổi nồng độ cồn theo pH trong môi trường lên men. 7.0 a a 6.0 5.0 a 4.0 ab b 3.0 b 2.0 Hàm lượng (mg/ml) lượng Hàm 1.0 0.0 4.5 5 5.5 Glucose pH b. Biến đổi hàm lượng đường khử và hàm lượng cellulose theo pH trong môi trường lên men. 52 Đồ án tốt nghiệp 100.0 a 98.0 b b 96.0 a 94.0 92.0 b 90.0 c Hiệu suất (%) suất Hiệu 88.0 86.0 84.0 82.0 4.5 5.0 5.5 Glucose pH c. Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất lên men ethanol. Hình 3 .6 Sự thay đổi các thành phần theo pH trong môi trường lên men Độ pH hay nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến sản phẩm lên men. Do đó, pH của môi trường lên men sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả lên men. Đề tài tiến hành lên men với pH môi trường ban đầu ngay khi trung hòa. Kết quả khảo sát pH được thể hiện qua hình 3.6 ❖ Nhân xét: Khi lên men môi trường có pH 5,5 thì thu được dịch có độ cồn cao nhất là 9,7% ± 0,12. (hình 4.6a). Nồng độ cồn tăng khi pH 4,5 (0,77 % ± 0,06), pH 5 (0,93% ± 0,06), pH 5,5 (0,97% ± 0,12) (Hình 4.6a). Do việc làm giảm ion H+ trong môi trường tạo thuận lợi cho sự chuyển hóa đường thành rượu của nấm men Môi trường ban đầu là pH 4,5 cho độ cồn sau lên men là thấp nhất (0,77% ± 0,06) vì nếu pH quá thấp sẽ ức chế tế bào nấm men, sinh khối không cao dẫn đến nồng độ cồn cũng không cao (Bảng 2 - PLC). Môi trường lên men pH 5,5 (nồng độ cồn 0,97%) thu được nồng độ cồn cao nhất. Hàm lượng đường khử thấp nhất là 2,5 ± 0,3 mg/ml, hàm lượng cellulose cao (6,2 ± 0,2 mg/ml. Hàm lượng cellulose vẫn còn cao, nhưng nồng độ đường giảm, 53 Đồ án tốt nghiệp điều đó chứng tỏ ở pH nấm men đang sử dụng nhiều đường lên men ethanol. Ở pH 5,5 nấm men đang hoạt động tối ưu (Bảng 2-PLC). Môi trường có pH 4,5 khi lên men thì có hàm lượng cellulose (5,9 ± 0,1 mg/ml) và hàm lượng đường khử vẫn còn cao 4,1 ± 0,4 mg/ml.Qua đó có thể thấy ở pH này nấm men không có được hoạt động tối ưu, sử dụng rất ít đường để lên men tạo ethanol. Tại pH 5 thì cho thấy nấm men cố định đang hoạt động ở mức trung bình. Hàm lượng cellulose còn lại sau lên men (3,6 ± 0,3 mg/ml) thấp hơn so với 2 mức pH còn lại, nhưng hàm lượng đường ở pH này vẫn còn cao vì nấm men cố định chưa sử dụng phần đường được phân giải từ cellulose. Như vậy pH bằng 5,5 tối ưu cho quá trình lên men cố định tế bào thu ethanol từ vỏ cacao. 3.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol. Quá trình sinh trưởng của nấm men phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường quanh nó. Khi cố định tế bào, do sự tương tác giữa tế bào với chất mang và giữa tế bào với nhau mà khả năng sinh trưởng và hình thái của tế bào cũng có một vài biến đổi. Trong đề tài này cố định 2 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala để lên men thu bioethanol và việc bổ sung tỷ lệ giống lên men là 3%, 5% 7%,9%. Do dó ta tiến hành khảo sát tìm ra tỷ lệ bổ sung tế bào 2 chủng nấm men cố định bởi chất mang PVA để nâng cao hiệu quả lên men. Kết quả khảo sát tỷ lệ nấm men cố định được trình bày. 54 Đồ án tốt nghiệp 1.2 a a 1 b a 0.8 0.6 0.4 Nồng độ cồn (%) độcồnNồng 0.2 0 3 5 7 9 Độ cồn Tỷ lệ tế bào cố định (%) a. Biến đổi nồng độ cồn theo tỷ lệ tế bào cố định bổ sung vào môi trường lên men. 5.5 a a 5.4 a 5.3 5.2 b 5.1 pH 5 4.9 4.8 4.7 4.6 3 5 7 9 pH Tỷ lệ tế bào cố định (%) b. Biến đổi nồng pH theo tỷ lệ tế bào cố định bổ sung vào môi trường lên men. 55 Đồ án tốt nghiệp 25.0 a 20.0 15.0 10.0 b Hàm lượng (mg/ml) lượng Hàm a 5.0 b c c d d 0.0 3 5 7 9 glucose cellulose Tỷ lệ tế bào cố định (%) c. Biến đổi nồng hàm lượng đường khử và hàm lượng . cellulose theo tỷ lệ tế bào cố định bổ sung vào môi trường lên men 100.0 a b 98.0 c 96.0 a 94.0 c 92.0 b d 90.0 88.0 d 86.0 Hiệu suất (%) Hiệu suất 84.0 82.0 80.0 78.0 3 5 7 9 glucose cellulose Tỷ lệ tế bào cố định (%) d. Ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào cố định bổ sung vào môi trường lên men tới hiệu suất lên men ethanol. Hình 3.7 Sự thay đổi các thành phần theo tỷ lệ nấm men cố định trong môi trường lên men 56 Đồ án tốt nghiệp ❖ Nhận xét: Tỷ lệ nấm men cố định đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men bioethanol. Qua đồ thị ta thấy được tỷ lệ nấm men cố định ảnh hưởng đến hiệu suất lên men và nồng độ ethanol sản phẩm. Tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men là 3% có độ cồn lớn nhất 1% so với độ cồn của tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men 7% là 0,97% thì không chênh lệch không nhiều. Hàm lượng đường khử ở tỷ lệ nấm men cố định 3% (2,6 ± 0,06 mg/ml) cao hơn so với hàm lượng đường khử ở tỷ lệ nấm men cố định 7 % (4,6 ± 0,26 mg/ml). Độ cồn của tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men là 9% (0,9% ± 0,06) tuy có độ cồn chênh lệch không cao so với độ cồn của tỷ lệ nấm men cố định 3% (1%) nhưng do tỷ lệ tế bào quá lớn sẽ không đủ cơ chất cho các tế bào hoạt động một cách tối ưu nhất. Từ những kết quả cho thấy tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men là 3% là tỷ lệ tối ưu để lên men vỏ ca cao thu bioethanol. 3.3 Khả năng tái sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA để lên men Một trong những ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật cố định tế bào là khả năng tái sử dụng cho nhiều quá trình lên men mà không cần phải tách tế bào ra khỏi giá thể chất mang giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm. Hạt gel có thành phần là PVA chứa tế bào vi sinh vật cố định có cấu trúc bền chắc, không thay đổi nhiều sau các chu kỳ lên men. Chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA có khả năng tái sử dụng. Sau khi cho tế bào cố định vào môi trường lên men lần đầu tiên tới thời gian tối ưu của quá trình lên men thì tiếp tục cho vảo môi trường lên men từ vỏ ca cao lần thứ 2, sau đó là lần thứ 3. Ta có được kết quả khảo sát. 57 Đồ án tốt nghiệp 1.2 a a 1 0.8 b 0.6 0.4 Nồng độ cồn (%) độcồnNồng 0.2 0 1 2 3 Độ cồn Số lần tái sử dụng a. Biến đổi nồng độ cồn theo số lần tái sử dụng. 6.40 6.20 a 6.00 b 5.80 5.60 c pH 5.40 5.20 5.00 4.80 1 2 3 pH Số lần tái sử dụng b. Biến đổi nồng pH theo số lần tái sử dụng. 58 Đồ án tốt nghiệp 30.0 a 25.0 a 20.0 15.0 b 10.0 Hàm lượng (mg/ml) lượng Hàm b a b 5.0 0.0 1 2 3 Số lần tái sử dụng Glucose Cellucose c. Biến đổi nồng hàm lượng đường khử và hàm lượng cellulose theo số lần tái sử dụng. 96.0 a 94.0 92.0 90.0 a a b b 88.0 b 86.0 Hiệu suất (%) Hiệu suất 84.0 82.0 80.0 1 2 3 Glucose Cellucose Số lần tái sử dụng c. Hiệu suất lên men ethanol sau mỗi lần tái sử dụng. Hình 3.8 Sự thay đổi các thành phần qua số lần tái sử dụng 59 Đồ án tốt nghiệp ❖ Nhận xét: Dựa vào đồ thị ta thấy, qua 3 lần tái sử dụng (TSD) ta thấy độ cồn giảm dần từ lần 1 (1%) xuống lần TSD 2 (0,9 % ± 0,1) và tiếp tục giảm ở lần TSD 3 (0,7% ± 0,06). pH tăng dần từ lần tái sử dụng thứ nhất (5,42 ± 0,08) đến lần tái sử dụng thứ ba (6,1 ± 0,1) việc pH tăng sẽ ảnh hưởng rất lớn tới nấm men trong hạt gel cố định, ở pH tối ưu thì nấm men cố định nằm trong hạt mới có thể tiếp tục hoạt động trao đổi chất sinh ethanol. Hàm lượng đường khử tăng từ lần thứ nhất (4,1 ± 0,05 mg/ml) tới lần thứ 2 (4,6 ± 0,22 mg/ml) và giảm tiếp lần tái sử dụng thứ 3 (3,4 ± 0,19 mg/ml). Tế bào cố định từ lần TSD 1 sang lần TSD 2 nấm men cố định vẫn tiếp tục sử dụng đường lên men tạo ethanol nên hàm lượng đường, tuy nhiên hoạt động đã giảm nên đường tăng là do một lượng cellulose bị thủy phân thành đường, còn từ lần TSD 2 sang lần TSD 3 hàm lượng đường tăng chứng tỏ hoạt động của nấm men cố định đã giảm đi. Hàm lượng cellulose giảm dần từ lần tái sử dụng thứ nhất tới lần tái sử dụng thứ 3. Từ đó có thể thấy được chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA có khả năng tái sử dụng. 60 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Khi khảo sát nồng độ PVA và nồng độ acid boric để đạt được mật độ tế bào cao nhất: - Với cả hai chủng nấm men Saccharomyces ceresiviae và Pichia anomala: nồng độ chất tạo hạt PVA 12% - alginate 1,0% và dung dịch tạo hạt acid boric 7,0% - CaCl2 2,0% là tối ưu cho quá trình cố định tế bào nấm men. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sử dụng tế bào cố định: Từ các thí nghiệm khảo sát các yếu tố, rút ra được các thông số tối ưu để sử dụng tế bào P. anomala và S. ceresiviae cố định trên chất mang PVA-alginate trong quá trình lên men từ vỏ ca cao đạt độ cồn cao nhất: - Thời gian lên men: 54 giờ - pH lên men: 5,5 - Tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men: 3% Chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên gel PVA có khả năng tái sử dụng. 4.2 Kiến nghị Do điều kiện thời gian hạn hẹp nên quá trình chỉ nghiên cứu khả năng cố định tế bào trên PVA chưa khảo sát được bao nhiêu lần tái sử dụng của nấm men cố định. Hiệu suất lên men trong đề tài chưa cao nên cần nghiên cứu khảo sát việc tăng