Theo dõi hàm lượng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Theo thống kê số lượng các dược phẩm mới được phép lưu hành trong 20 năm vừa qua đã cho thấy, các hợp chất thiên nhiên đã và vẫn được coi là nguồn cấu trúc mới để tạo ra các dược phẩm mới. Đặc biệt rõ ràng nhất là trong lĩnh vực thuốc chống ung thư có tới 60%, trong bệnh truyền nhiễm là 70% có nguồn gốc tự nhiên. Ý nghĩa to lớn của những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là ở chỗ chúng không chỉ được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà quan trọng hơn là chúng có thể là những chất mẫu, chất dẫn đường để phát triển các thuốc mới hoặc là các chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ các nguyên lý của dược lý học con người. Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Hoa Kỳ coi kho tàng cây thuốc của Trung Quốc là nguồn khai thác các chất mẫu, chất dẫn đường mới nhằm khám phá và phát triển các thuốc chống ung thư và chống HIV trong tương lai. Những năm gần đây có nhiều cây thuốc cổ truyền của y học Trung Quốc là đối tượng nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng điều trị ung thư, qua đó đã và đang phát hiện ra hàng loạt chất mới, nhiều chất rất có triển vọng trở thành những chất dẫn đường. Nhiều ent -kauran ditecpenoit thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào, chống khối u và anti -HIV. Đã có nhận xét rằng, hoạt chất ở một số cây thuốc có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư, hạ huyết áp, lợi tiểu và thường có mặt các ent -kauran ditecpenoit. Cây Khổ sâm cho lá thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam. Cây mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt Nam, nhưng cũng được trồng nhiều ở các trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân, nhất là ở vùng đồng bằng sông Hồng, vì được coi như nguồn thuốc tại chỗ để chữa các bệnh viêm nhiễm, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi nhai sống, vò hoặc giã nát vắt lấy nước uống chữa bệnh đau bụng đi ngoài, chữa các vết thương nhiễm trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt tính sinh học của lá cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được quyết định bởi các ent -kauran ditecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây độc hại rất mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người và chế phẩm từ cây Khổ sâm còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm virus (gây suy giảm miễn dịch) Gumboro cường độc. Chúng tôi cho rằng các ent -kauran từ cây Khổ sâm rất có triển vọng là chất dẫn đường nhiều hứa hẹn để tạo ra các thuốc chống viêm, chống ung thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực. Để góp phần tìm hiểu và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu phong phú đang được sử dụng rộng rãi trong dân gian, đề tài: “Theo dõi hàm lƣợng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae” là nội dung chính của luận văn này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Những loài cây thuộc chi Croton L., và công dụng trong y học Các thực vật chi Croton L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có khoảng 700 loài [26], gặp phổ biến ở các vùng nhiệt đới, ít gặp ở vùng ôn đới và rất hiếm ở vùng hàn đới. ở châu Á có khoảng 50 loài, riêng ở Đông dương có hơn 40 loài [35]. ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Croton L. có 18 loài [1], còn Nguyễn Nghĩa Thìn [13] đã thống kê được 41 loài, trong đó có tới 21 loài đặc hữu trong hệ thực vật nước ta. Có nhiều loài cây thuộc chi Croton L. được sử dụng trong y học dân gian nhiều dân tộc, nhất là ở khu vực Trung và Nam Mỹ cũng như ở Đông Nam Á. Y học cổ truyền ở Brasil và các dân tộc sinh sống trong vùng Amazon dùng lá, vỏ và rễ cây C. cajucara [36] để chữa trị nhiều loại bệnh như là sốt cao, chống viêm nhiễm, ỉa chảy, viêm loét dạ dày, giảm cholesterol máu, chữa ung thư, hạ huyết áp, diệt trừ ốc sên, xua đuổi côn trùng [37]. Nước sắc rễ cây C. campestris ở Brasil được dùng để chữa bệnh giang mai, viêm ống mật, thuốc sổ, trị ung thư [26]. ở Equađo người ta dùng vỏ cây C. eluteria chữa bệnh cao huyết áp, kiết lỵ, sốt rét, đau dạ dày và còn có tác dụng bồi bổ sức khoẻ [45]. Nhân dân các nước vùng Trung và Nam Mỹ như Peru, Equađo dùng nhựa và vỏ cây C.lechlerii có tính kháng sinh để chữa các vết thương, trị ung thư [27]. Nước sắc lá cây C. schiedeanus được y học dân gian Columbia chữa bệnh cao huyết áp, có tác dụng giãn mạch [29]. Rễ cây C. macrostachys ở Tanzania được dùng để chữa bệnh tiểu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 đường [27]. Một số nước ở vùng Đông Phi (Camơrun, Nigeria, Siraleon v.v..) dùng rễ và vỏ thân cây C. zambicus làm thuốc nhuận tràng, trị kiết lỵ và chống co giật [39]. ở Thái Lan người ta dùng vỏ, rễ cây cũng như quả của cây C. oblongifolius để chữa bệnh rối loạn tiêu hoá, kiết lỵ, loét dạ dày, trị ung thư [44] hoặc dùng cây C. sublyratus [33] để trị loét hành tá tràng. ở nước ta cũng có một vài loài thuộc chi Croton L., được dùng trong y học dân gian. Cây Lơpơté (C. crassifolium) ở Tây Nguyên được dùng để trị bệnh đường ruột [13], cây Khổ sâm cho lá (C. tonkinensis) trị sốt rét, bệnh đường ruột [2], [12]. Bên cạnh những cây được dùng làm thuốc trong y học dân gian, người ta cũng biết một số cây thuộc chi Croton L., có chứa độc tố. ở châu Phi có nhiều Croton spp thuộc loại cây độc, được thổ dân sử dụng trong đánh bắt cá, tẩm tên độc trong săn bắn như vỏ cây C. hovarum ở Madagasca là một thí dụ [34]. ở Việt Nam có nói đến cây Ba đậu (C. tiglium) [3] là cây độc, dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc. 1.2. Những nghiên cứu hoá thực vật về chi Croton L., Cho đến nay có khoảng trên 50 loài thực vật chi Croton L., được nghiên cứu hoá thực vật [28], đã phân lập và nhận dạng được 271 chất, chủ yếu gồm các ditecpenoit và ancaloit. 1.2.1. Các ancaloit Các ancaloit tìm thấy trong thực vật chi Croton L., đều có chứa dị vòng cơ bản là isoquinolin [41], tạo ra các bộ khung proaporphin (1), aporphin (2), morphinandienon (3) và rất gần đây là berbin (tetrahydroprotoberberin) (4). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 1.2.1.1. Ancaloit khung proaporphin (1) 1 2 3 4 5 6 78 9 10 13 11 12 NH O H 6a (1) Các ancaloit kiểu khung proaporphin (1) khác nhau bởi các nhóm thế ở các vị trí 1, 2, 6 và cấu hình của hydro ở vị trí 6a. 1.2.1.2. Ancaloit khung aporphin (2) Các ancaloit khung aporphin (2) thường khác biệt nhau bởi nhóm thế ở các vị trí 1, 2, 6, 9, 10, 11 và cấu hình hydro ở vị trí 6a. N H 1 2 3 4 5 6 7 8 6a 9 10 11 (2) 1.2.1.3. Ancaloit khung morphinandienon O N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A B C D (3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Các ancaloit khung morphinandienon (3) khác biệt nhau bởi các nhóm thế ở vị trí 2, 3, 4, 6, 8, 17 và cấu hình của vòng D. 1.2.1.4. Ancaloit khung berbin (tetrahydroprotoberberin) (4) N R6 R5 R4 R3 R1 R2 H 1 4 5 6 14 13 8 9 1012 (4) Các berbin (4) hay tetrahydroprotoberberin ancaloit là những ancaloit mới phát hiện rất gần đây trong hai loài thực vật chi Croton L., các ancaloit này khác nhau bởi các nhóm thế gắn vào các vị trí 2, 3, 8, 10, 11 và cấu hình của proton ở vị trí C14. 1.2.2. Các hợp chất ditecpenoit Các ditecpenoit chiếm tới 114/271 kiểu hợp chất đã phân lập và nhận dạng được từ các loài thuộc chi Croton [28]. Cách gọi tên và cấu trúc hoá học của chúng rất đa dạng, từ loại khung không vòng cho đến khung đa vòng giáp nhau. Kiểu không vòng như phytan (5) (2,6,10,14-tetrametylhexadecan), loại một vòng lớn như cembran (6) (18,19,20-trimetyl-1-isopropylcyclotridecan). Kiểu hai vòng giáp nhau như labdan (7), clerodan (8). Ba vòng giáp nhau như pimaran (9), kauran (10), beyeran (11). Kiểu 4 vòng giáp nhau như atisan (12), sarcopetelan (13), phorbol (14). Năm vòng như trachyloban (15). 1.2.2.1. Ditecpen không vòng Phytan thuộc loại ditecpen không vòng, có cấu trúc hoá học 2,6,10,14- tetrametylhexadecan (5). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 (5) Các ditecpen loại này khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu hình các nhóm hydroxy, xeton và olefin. 1.2.2.2. Ditecpen vòng lớn Cembran (6) Cembran thuộc loại ditecpenoit một vòng lớn chung có cấu trúc hoá học 4,8,12-trimetyl-1-isopropyl-cyclotridecan khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu hình của liên kết olefin. (6) 1.2.2.3. Ditecpen 2 vòng 1.2.2.3.1. Khung labdan (7) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 (7) 1 23 45 67 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 1.2.2.3.2. Clerodan ditecpen (furanoditecpen) Các hợp chất ditecpen khung clerodan gặp rất phổ biến trong thiên nhiên, chỉ riêng chi Croton L. đến nay đã phân lập được 42 trong số 114 ditecpenoit từ những thực vật này. ở vị trí 15, 16 của hầu hết các clerodan ditecpen đóng vòng epoxy để hình thành vòng furan, nên các ditecpenoit loại này còn được gọi là furanoditecpen. 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (8) 1.2.2.4. Ditecpen có 3 vòng dính kết (pimaran) Các loài thuộc chi Croton L. được nghiên cứu, mới chỉ thấy kiểu khung pimaran (9). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (9) 1.2.2.5. Ditecpen 4 vòng dính kết Thường gặp các kiểu khung kauran (10), beyeran (11), atisan (12), sarcopetelan (13) và phorbol (14) ditecpen. 1.2.2.5.1. Kauran ditecpen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 1 2 3 4 5 6 7 810 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 O O HOOC (10) (10.13) 8,15-seco-kauran 1.2.2.5.2. Các ditecpen kiểu khung beyeran (11), atisan (12) và sarcopetelan (13) Các kiểu cấu trúc (11) và (12) thường gặp trong nhiều họ thực vật, nhưng chỉ rất gần đây mới phát hiện thấy trong cây Croton sarcopetalus và cũng đồng thời khám phá ra kiểu khung sarcopetelan ditecpen (13). Điều đáng chú ý là trong rễ cây này còn tìm thấy các dẫn xuất của clerodan (8) và pimaran (9) ditecpen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (11) (12) O O 20 1918 17 16 15 14 13 1211 10 9 8 7 6 5 43 2 1 (13) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 1.2.2.5.3. Phorbol ditecpen R1O OR2 OH CH2OR3HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 O (14) Các phorbol ditecpen có cấu trúc hoá học 4,9 ,12 ,13 ,20- pentahydroxy-1,6-tigliadien-3-one, chúng chỉ khác nhau về cấu hình của nhóm hydroxyl ở vị trí 4 và các nhóm chức khác, cho đến nay mới chỉ gặp duy nhất một cấu hình 4 của phorbol, còn hầu hết là cấu hình 4 . 1.2.2.6. Ditecpen 5 vòng dính kết (trachyloban) Các dẫn xuất của trachyloban thuộc loại 5 vòng dính kết. 20 1918 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 43 2 1 (15) 1.2.3. Các hợp chất khác Thường gặp một số hợp chất tritecpenoit như là 3 -acetoxy-14- taraxeren-28-oic acid (16.a) [32, 34, 36, 41], 3 -O-axetoaxetyl-20(29)-lupeol (16.b) [28]. Các hợp chất steroit (17) glucosid như là 3 , 14 ,15 ,16 - tetrahydroxypregnan-20-one glucosid (17.1) và (17.2) trong cây C. ruizianus [43]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 AcO COOH (16.a) (16.b) OH RO OH O OH H (17) O O N (Me)2 OMe O O MeO (18) O N O NH O (19) Ngoài những nhóm chất điển hình nêu trên, trong các thực vật chi Croton rất thường gặp taspin (18), nhưng chỉ xuất hiện ở nhựa cây tiết ra tại nơi bị thương tổn do yếu tố ngoại lai [38], Julocrotine (19) là những ancaloit khá đặc biệt và gây độc tế bào [40]. CH3CO-CH2CO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 1.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng của cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) 1.3.1. Giới thiệu cây khổ sâm Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1, 2], thuộc loại cây nhỏ, cao khoảng 0,7-2,0m, mọc thành bụi, lá mọc so le, nhìn gần như đối nhau, có khi mọc thành vòng giả có từ 3 đến 6 lá. Lá có hình mũi mác, cả 2 mặt đều có lông óng ánh như lá cây nhót. ở mặt dưới lá có 3 gân toả ra từ cuống, lá có tuyền hoa nhỏ, trắng, mọc thành chùm ở kẽ lá hay đầu cành. Hoa đơn tính cùng gốc, quả có 3 mảnh vỏ hạt hình trứng, màu đỏ. Mùa ra hoa kết quả khoảng từ tháng 5 đến tháng 8. 1.3.2. Tác dụng của cây khổ sâm Cây Khổ sâm cho lá mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt Nam, nên có nhiều tên gọi khác nhau như là Cổ sâm, Sâm nam, ở vùng Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc nhân dân gọi là cây kẻ chỉ. Thường gặp nhiều ở các vùng Ninh Bình, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Thanh Hoá [6]. Hiện nay, cây khổ sâm được trồng nhiều ở các trạm xá đông y, y tế xã và nhà dân. Cây này thuộc loại cây thuốc dân gian, chữa được một số bệnh, nhất là bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi nhai sống, vò hoặc giã nát để lấy nước uống chữa bệnh đau bụng, đi ngoài, phụ nữ bị bệnh hậu sản, lở loét người ngoài da, chữa các vết thương nhiễm trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét. ở Hưng Yên, nhân dân dùng cành, lá khô đem sao vàng, sắc lấy nước uống để chữa bệnh tê thấp. Gần đây những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt tính sinh học của cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được quyết định bởi các ent -kauran d itecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây độc hại rất mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người [4] và chế phẩm từ cây Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Khổ sâm còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm virus (gây suy giảm miễn dịch) Gumboro cường độc [10]. 1.3.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học cây Khổ sâm Những nghiên cứu hoá học về cây khổ sâm đã cho biết thành phần trong đó rất phong phú và đa dạng bao gồm nhiều nhóm chất khác nhau như: steroit, tritecpenoit, flavonoit, ancaloit, và ditecpenoit [4]. 1.3.3.1. Các ditecpenoit Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen phân lập được từ cây Khổ sâm (Croton tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung ent -kauran-16-ent-15-on. Theo qui tắc IUPAC, chúng tôi đề nghị gọi tên các ent -kauran này là crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 1.1), cấu trúc hoá học và một vài đặc tính vật lý của chúng (bảng 1.2). Bảng 1.1: Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis Gagnep., Thứ tự Tên chất CTPT Tên khoa học Thời gian công bố Tài liệu 1 Crotonkin-1 C22H32O4 ent-18-axetoxy-7 - hydroxykaur-16-en- 15-on 25/10/1999 13/2/2003 14,16 2 Crotonkin-2 C22H32O5 ent-1a-axetoxy- 7 ,14a- dihydroxykaur-16- en-15-on 10/11/2002 28/3/2003 15,18 3 Crotonkin-3 C22H34O4 ent-16(S)-18- axetoxy-7 - hydroxykaur-15-on 13/02/2003 01/3/2004 16,20 4 Crotonkin-4 C20H30O3 ent-7 ,14a- dihydroxykaur-16- en-15-on 9/7/1998 28/3/2003 17,18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 5 Crotonkin-5 C22H32O5 ent-18a-axetoxy- 7a,14 - dihydroxykaur-16- en-15-on 28/03/2003 18 6 Crotonkin-6 C20H30O3 ent-7 ,18- dihydroxykaur-16- en-15-on 09/9/2003 19 7 Crotonkin-7 C24H34O6 ent-1a,14a- diacetoxy-7 - hydroxykaur-16-en- 15-on 01/03/2004 20 8 Crotonkin-8 C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy- 14a -hydroxykaur- 16-en-15-on 01/03/2004 20 9 Crotonkin-9 C22H32O4 ent-18-axetoxy-14a- hydroxykaur-16-en- 15-on 01/03/2004 20 10 Crotonkin-10 C22H32O5 ent-11a -axetoxy- 7 ,14a- dihydroxykaur-16- en-15-on Chem. Pharm.Bull. 2002,50, 808- 813. 29/12/2004. 21,24 11 Crotonkin-11 C20H28O3 ent-kaur-16-en-15- on-18-oic acid Phytochem. 1973, 12, 2712-2723. 29/12/2004. 22,24 12 Crotonkin-12 C20H32O ent-18- hydroxykaur- 16-en Phytochem. 1988, 27, 3209-3212. 29/12/2004 23,24 13 Crotonkin-13 C26H36O7 ent-1a,7 ,14a- triacetoxykaur-16- en-15-on 2007 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 R5 O R4 R1 R2-H2C R3 Bảng 1.2: Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các Crotonkin từ cây Croton tonkinensis Gagnep., Th ứ tự R1 R2 R3 R4 R5 M mp( o C) Rt (phút) 1 H OAc OH H =CH2 360 142-143 23.9 2 OAc H OH OH =CH2 376 97-98 21.6 3 H OAc H OH CH3 362 177-179 22.43 4 H H OH OH =CH2 318 210-212 22.63 5 H OAc OH OH =CH2 376 21.39 6 H OH OH H =CH2 318 155-156 7 OAc H OH OAc =CH2 418 22.64 8 OAc H OAc OH =CH2 418 23.01 9 H OAc H OH =CH2 360 10 11-OAc H OH OH =CH2 376 11 H COOH H H =CH2 316 12 H OH H H =CH2 288 13 OAc H OAc OAc =CH2 460 1.3.3.2. Các ancaloit Những nghiên cứu về thành phần ancaloit từ cây Khổ sâm cho biết đã phân lập và nhận dạng được 6 ancaloit với bộ khung rất phong phú đó là các berbin ancaloit (corytenchin, corytenchirin [4], [6], protoberberin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 N+ H3CO H3CO OCH3 R N H3CO H3CO R OCH3 OH H N H3CO H3CO OCH3 CH3 OH (dehydrocorytenchin) [7], benzyltetrahydroisoquinolin (laudanidin) [7] và aporphin ancaloit (corunnin, oxoglaucin) [9]. Bảng 1.3: Ancaloit khung berbin Berbin TT R Tên chất [M+H] + 1 H Corytenchin 342 2 CH3 Corytenchirin 356 Bảng 1.4: Ancaloit khung protoberberin Protoberberin TT R Tên chất [M+H] + 3 OH Dehydrocorytenchin 338 Bảng 1.5: Ancaloit khung Benzyltetrahydroisoquinolin Benzyltetrahydroisoquinolin TT Tên chất [M+H] + 4 (+)-laudanidin 344 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 N H3CO R1 R3 CH3O R2 O OOH HO OH OH 1' 2' 4' 2 4 5 6 9 10 8 6' Bảng 1.6: Ancaloit khung Aporphin Aporphin TT R1 R2 R3 Tên chất [M+H] + 5 O - OCH3 CH3 Corunnin 352 6 OCH3 OCH3 Oxoglaucin 352 1.3.3.3. Các flavonoit Một vài flavonoit đã phân lập được từ cây Khổ sâm (C. tonkinensis) đó là kaempferol hay 3,4 , ,5,7-tetrahydroxyflavon, vitexin hay apigenin-8C- -D- glucopyranosid, và isovitexin hay apigenin -6C- -D-glucopyranosid [4], [8]. Kaemperol là một trong những flavonol gặp rất phổ biến trong giới thực vật, có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá [28]. Trong y học cổ truyền Việt nam, người ta đã phát hiện chất giải độc chính là vitexin [4], và vitexin thể hiện hoạt tính yếu với nấm mốc Aspergillius niger ngoài ra không có hoạt tính nào khác, còn isovitexin thì không có hoạt tính. Kaempferol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 O O OH OH HO O HO OH HO OH 1'' 3'' 5'' 6'' O O OH OH HO O HO HO OH OH AcO AcO COOH Vitexin hay apigenin-8C- -D-glucopyranosid Isovitexin hay apigenin-6C- -D-glucopyranosid 1.3.3.4. Các tritecpenoit Hai hợp chất tritecpenoit được phát hiện từ cây Khổ sâm đó là - Amyrin axetat (urs-12-en-3 -yl axetat) và Axetyl aleuritolic axit (3 - hydroxytaraxer-14-en-28-oic axit) [5]. -Amyrin axetat Axetyl aleuritolic axit 1.3.3.5. Các steroit Nhóm chất steroit tìm thấy trong các dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của cây Khổ sâm cho lá, chủ yếu thuộc loại sterol C29 với bộ khung 3 - ol, 5 -pregnan, có mạch nhánh với cấu hình và cấu dạng khác nhau. Đó là các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 R2 R1O 3 5 810 12 14 15 17 18 19 20 21 -sitosterol, poriferasterol, -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl, -sitosterol với stigmasterol [4]. Bảng 1.7: Các steroit khung sterol R1 R2 -sitosterol H 24 22 29 poriferasterol H -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl C6H12O5 1.4. Áp dụng phƣơng pháp LC /MS trong phân tích các chất Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đóng vai trò quan trọng và có hiệu quả trong sức khỏe cộng đồng. Đó là những nguồn gốc thiên nhiên với thành phần hoạt chất rất nhỏ trong cây cỏ thực vật được sử dụng có hiệu quả trong các bệnh viện y học cổ truyền. Theo đó để đảm bảo tính ổn định cũng như hiệu quả sử dụng cây cỏ trong việc khám chữa bệnh, cần có hệ thống đánh giá chất lượng các dược phẩm. Có nhiều phương pháp áp dụng để kiểm tra chất lượng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 đó là xác định hoạt chất toàn phần hoặc từng thành phần. Đơn giản hơn cả là phương pháp định lượng để xác định . Việc phân tích các ditecpenoit thành phần trong hỗn hợp là nhiệm vụ khó khăn và phức tạp, vì chúng thường là những chất đồng phân có nhiều tính chất hoá lý rất gần nhau. Nghiên cứu xác định định tính và định lượng các hỗn hợp phức tạp như vậy thường phải dùng các phương pháp sắc ký như là sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng phân giải cao và đặc biệt gần đây phổ biến là các kỹ thuật của sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS). Phương pháp HPLC - DAD-ESI/MS là một công cụ phân tích nhanh để xác định thành phần hóa học trong cây cỏ thực vật . Nó được kết hợp giữa kỹ thuật HPLC, đặc trưng phổ UV, và bộ phận cung cấp thông tin về khối lượng phân tử (ESI/-MS) được sử dụng để phân tích hỗn hợp các chất phức tạp trong cây cỏ so sánh với với chất chuẩn hoặc là thời gian lưu. Và cuối cùng những công bố về việc sử dụng kỹ thuật HPLC -DAD-ESI/MS đã đánh dấu một bước phát triển trong việc phân tích thành phần phức tạp ở các phân đoạn dịch chiết thô từ cây cỏ thiên nhiên [30], [31]. Người ta thường sử dụng kỹ thuật này để phân tích những thành phần phức tạp trong các dịch chiết thu được từ thực vật. 1.4.1. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Sắc ký lỏng cao áp (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ. Như vậy, độ tinh khiết của nhiều hợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng phương pháp HPLC. Kỹ thuật bao gồm một pha rắn cố định (pha tĩnh) được nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng di động (pha động) chạy qua. Việc phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện là nhờ sự khác nhau về tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha. Phương pháp HPLC, dựa trên các cơ chế của hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc kích cỡ (exclusion gel Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 permeation) tuỳ thuộc vào kiểu pha tĩnh đem sử dụng. Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu, cột sắc ký, đầu dò (detector) và hệ thống sử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính). Sơ đồ 1.1: Hệ thống sắc ký lỏng phân giải cao. Cấu tạo của hệ thống bơm đảm bảo việc duy trì tốc độ dòng của pha động không thay đổi. Thiết kế của hệ thống van bơm mẫu đảm bảo việc đưa mẫu phân tích vào cột có thể thao tác ở áp suất cao không phải ngắt dòng. Cột sắc ký dùng trong HPLC có thể thuộc một trong các kiểu phân tách dưới đây: - Cột pha thƣờng: sự phân tách dựa trên sự khác nhau về tính hấp phụ của pha tĩnh, vật liệu được sử dụng thường là hạt silica có bề mặt phân cực gây ra bởi các nhóm silanol (-Si-OH). - Cột pha đảo: sự phân tách dựa trên nguyên lý phân bố các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha tĩnh có bề mặt không phân HPLC Stationary and Mobile phase Liquid <400 bar <400 l 1 ml/min light detector <1000 C Mobile phase Pump Injector Data evaluation Detector Column Oven Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 cực. Vật liệu thường dùng là các hạt silica được biến tính hóa học thông qua phản ứng của nhóm silanol với các nhóm chức khách nhau và thường là: Octa -Si-(CH2)7CH3 C8 Octadecyl -Si-(CH2)17CH3 C18 Phenyl -Si-(C6H5)2 C6H5 Cyanopropyl -Si-(CH2)3CN CN Aminopropyl -Si-(CH2)3NH2 NH2 - Cột trao đổi ion: sự phân tách dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các phân tử chất tan mang điện tích với pha tĩnh. Vật liệu để nhồi cột là nhựa trao đổi ion (cationit hoặc anionit) dùng làm pha tĩnh. - Cột sắc ký gel (size exclusion) : pha tĩnh là các hạt polime có các lỗ hổng khác nhau. Sự phân tách được thực hiện là nhờ sự khuyếch tán của phân tử chất tan vào pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ dễ dàng vượt qua pha tĩnh và bị rửa giải chậm hơn các phân tử có kích thước lớn. Vì yêu cầu phân tách, vật liệu nhồi cột dùng làm pha tĩnh trong HPLC thường dùng là các hạt có kích thước nằm trong khoảng 5 đến 10 m có dạng hình cầu hoặc bất kỳ và cột thường dùng là thép không gỉ, có đường kính trung bình vào khoảng 2 đến 5mm, chiều cao dài 50 - 300mm. Một cách lý tưởng, nhiệt độ của pha động và cột phải giữ ổn định trong suốt quá trình phân tách. Cũng như vậy, nhiệt độ của pha động thoát ra khỏi cột cũng phải tương đương với nhiệt độ của đầu dò. Khi cột đã được lựa chọn thì thành công của việc phân tách tuỳ thuộc vào thành phần pha động, đặc biệt là trong trường hợp sắc ký đẳng dòng. Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan trong pha động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh. Nếu như Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 mẫu tan tốt trong pha động thì nó sẽ rửa giải sớm và trong trường hợp không có tương tác với pha tĩnh thì nó sẽ ra khỏi cột với tốc độ bằng tốc độ của pha động. “Độ mạnh” của pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thay thế tỷ lệ dung môi đã sử dụng. Pha động càng “mạnh” thì mẫu sẽ được rửa giải càng sớm. Với cột pha thường, do bề mặt phân cực nên độ mạnh của pha động đồng nghĩa với độ phân cực của dung môi. Độ mạnh của dung môi theo thứ tự tăng dần của độ phân cực trình bày như sau: Hexane = heptane = pentane < cyclo hexane < chloroform < toluen < dichloro methane < ethylacetate = THF < diethylete < acetone = acetonitrile < ethanol < H2O <acetic acid. Trong sắc ký lỏng pha ngược bề mặt của vật liệu nhồi cột không phân cực và nước hoặc dung dịch nước có thể dùng làm pha động. Độ mạnh của pha động tăng dần khi độ phân cực của dung môi giảm dần (nghĩa là trật tự ngược với trường hợp pha thường). Pha động yếu nhất là nước sạch, acetonitryle hoặc THF là các pha động rất mạnh. Detector UV-VIS là loại detector hay được dùng vì nó có khả năng ứng dụng rộng rãi và giá thành rẻ hơn các loại detector khác, nó có độ nhạy trung bình, tín hiệu không ảnh hưởng bởi nhiệt độ và áp suất. Tuy nhiên, detector UV-VIS chỉ sử dụng được khi mẫu có hấp thụ ánh sáng trong vùng 200 - 700nm. Detector chỉ số khúc xạ (RID) là một loại detector phổ thông, dựa trên khả năng phân biệt sự thay đổi chỉ số khúc xạ, có độ nhạy cảm với nhiệt độ và áp suất cũng như khí bị hoà tan trong pha động, nên độ nhạy phân tích không cao. Ngoài hai loại detector trên người ta còn sử dụng detector huỳnh quang, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 detector điện hoá, detector độ dẫn ... trong sắc ký lỏng cao áp. 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS). Mẫu được bơm tự động qua cột LC (pha lệch) dưới áp cao và dung môi rửa giải thích hợp. Sau đó các thành phần tách qua cột được phát hiện bằng đầu dò detector UV. Từng thành phần được đưa thứ tự vào buồng ion hóa (ESI – Electron Spray Ionization). Các ion tạo thành qua bộ phận phân tích đến Detector, các tín hiệu được chuyển qua dạng tín hiệu điện từ, qua bộ phận lọc và khuyếch đại cho các phổ khối lượng của từng phần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thuộc loại thực vật đặc hữu của Việt Nam là cây thuốc dân gian, chữa được một số bệnh phổ biến, những hiểu biết về thành phần hóa học và dược lý của cây cho biết có tác dụng chống viêm, chống ung thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực [10]. Nhiệm vụ của bản luận văn này là chiết xuất phân lập một số ent - kauran ditecpen của cây Khổ sâm cho lá và theo dõi sự biến đổi hàm lượng ent -kauran ditecpenoit chính ở một số thời gian sinh trưởng của cây trong năm. 2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là mẫu cành và lá khô. Mẫu cành, lá tươi được thu theo các tháng 1,3,4,5/2008 tại Tân Yên, Bắc Giang và các mẫu thu ở các vùng Sóc Sơn, Ninh Bình, Phú Thọ, Hưng Yên. Các mẫu nói trên đã được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định là đồng nhất về mặt thực vật và định danh là Croton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae. Ảnh 2.1: Hoa và quả cây Khổ sâm Ảnh 2.2: Lá và quả cây Khổ sâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Mẫu cây tươi lấy về được sấy ngay ở 110 C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát, hoặc sấy ở nhiệt độ 50-60 C cho tới khi khô giòn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với cloroform ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Các dịch chiết được cất kiệt dung môi ở áp suất giảm để nguội, rồi đem cân. Việc phân lập các chất ra khỏi hỗn hợp của chúng được kết hợp những phương pháp khác nhauV: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế v.v...để được chất tinh khiết. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm. 2.1.2. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết. Để theo dõi sự biến động thành phần hoá học của cây C.tonkinensis thu ở các thời điểm khác nhau đã dùng phương pháp bán định lượng bằng cách cân trực tiếp các chất phân lập được từ khối lượng ngâm chiết. Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như: - Sắc ký lớp mỏng (TLC) - Sắc ký cột thường - Sắc ký lỏng áp suất cao 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, R f, điểm nóng chảy, v.v.. khi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Đối với những chất rắ._.