Tách dòng và xác định trình tự Nucleotit một số đoạn trong Genome của Virus vàng lùn Lúa (RGSV) tại Việt Nam

NG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Trung Nam Viện Cơng nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai cơng bố. Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Cơng nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này. Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS. Chu Hồng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hồng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật – Viện Cơng nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tơi trong suốt thời gian thực nghiệm và hồn thành khĩa luận này. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của virut gây bệnh và mơi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng tác trong quá trình tơi thực hiện cơng trình nghiên cứu này. Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, các thày cơ giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều kiện cho tơi được thực hiện khĩa luận này. Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn. Tác giả luận văn Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2 MỤC LỤC .............................................................................................................. 3 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 5 DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 7 MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 11 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 11 1.1.1. Thế giới ............................................................................................... 11 1.1.2. Việt Nam ............................................................................................. 12 1.2. TRIỆU CHỨNG LƯA NHIỄM BỆNH VL&LXL ...................................... 13 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LƯA ..... 14 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) ............................................................... 14 1.3.2. Các loại virut khác ............................................................................. 16 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)....................................................... 16 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) ..................................................... 17 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) ................................................ 18 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MƠI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL .............................................................................. 19 1.4.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 19 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại ............................................ 19 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL ................................................................. 20 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT .......................................................................... 21 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử ................................. 21 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22 1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24 1.6.5. Kỹ thuật tách dịng gen ...................................................................... 24 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26 2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26 2.2. HĨA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27 2.2.1. Hĩa chất .............................................................................................. 27 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28 2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30 2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31 2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34 3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34 3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34 3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37 3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37 3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự cĩ mặt của gen ............................... 39 3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 46 CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CƠNG BỐ ................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 53 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ RNA thơng tin) CS Cộng sự CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sơng Cửu Long), CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng bằng sơng Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật), EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym) g gram ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về phân loại virus). ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV), IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thơng tin Cơng nghệ Sinh học), ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra phân tử RNA) RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa) RSV Rice stripe virus RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vịng/phút vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus) VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn lá vRNA viral RNA (đoạn RNA của virus) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................ 13 Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................ 15 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV......................................................... 16 Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................. 17 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................ 18 Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu..................................................... 19 Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ.... 26 Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT ................................................................................. 30 Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV....................... 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV… 34 Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc............... 41 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank).......................................................................... 42 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dịng CP của RGSV tỉnh Bình Thuận trên mơi trƣờng LB đặc................................................. 37 Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR các dịng RGSV bằng cặp mồi pUC 18.. 38 Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dịng của phân đoạn 1 và 4 RGSV bằng cặp mồi pUC 18............................................................................... 38 Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI.................................................................................................................. 39 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại Bình Thuận bằng BamHI..................................................................................... 40 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank........................................................... 43 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới, đứng thứ ba sau ngơ và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein, các chất khống và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL. Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành cơng lớn nhất là nơng nghiệp và cây lúa vẫn luơn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt Nam. Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus- RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43], [48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại virut này. Trong đĩ, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam cĩ nguy cơ tiếp tục bị giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12]. Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phịng chống rầy nâu- mơi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phịng trừ bằng thuốc hĩa học, sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng... Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng pháp này vẫn chƣa cao. Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặng nề về sản lƣợng lúa gạo cho các tỉnh ĐBSCL [7] và cĩ nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp bách là phải kiểm tra sự cĩ mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam Trung Bộ, nơi cĩ diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL. Đồng thời, Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, gĩp phần vào việc đề ra những biện pháp đối phĩ kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung. Với những lí do trên, chúng tơi tiến hành đề tài : “Tách dịng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam”. 2. Mục tiêu Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV). 3. Nội dung nghiên cứu 1> Tách dịng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng RGSV. 2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các chủng virut. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1. Thế giới Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch rầy đã xảy ra trên quy mơ rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất trắng. Ngồi tác hại trực tiếp, rầy nâu cịn là mơi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn 300 triệu USD [22]. Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đơng Nam châu Á [43]. Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện ở vụ mùa thứ hai ở Đài Loan, biểu hiện cây lúa bệnh và hình thái, cấu tạo của RWSV tƣơng tự RGSV [20]. Năm 1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm rầy và virut, gây thiệt hại 03 triệu tấn thĩc [40]. Năm 1992 – 1993 cả vụ mùa giống SP60 ở Thái Lan bị mất do tác hại của rầy nâu [50]. Rầy nâu mang các loại virut gây bệnh trên cây lúa nhƣ RGSV và RRSV, nên cĩ nguy cơ gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Hai phƣơng pháp truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ cây lúa là phun thuốc trừ sâu và dùng giống cây kháng rầy. Dùng thuốc trừ sâu hĩa học đắt, độc hại và ơ nhiễm mơi trƣờng, do đĩ biện pháp trồng cây lúa mang gen kháng rầy thơng qua lai giống đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi. Tinjuangjun và CS (2000) đã chuyển gen gna thành cơng vào hai giống gạo Thái Lan là Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) và Supanburi 60 (SP60), 37% số lƣợng rầy giảm đi khi gna biểu hiện bằng promoter RSs1 và 42% khi gna biểu hiện bằng promoter Ubi-1 [50]. Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen kháng rầy đang gặp trở ngại do sự thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chĩng của rầy nâu. Tại các Hội nghị quốc tế về rầy nâu họp tại IRRI- Philippin (05/1977), Việt Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi là mối đe dọa thƣờng xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61]. 1.1.2. Việt Nam Bệnh VL&LXL trên lúa đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An vào năm 1963. Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và 1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8]. Bệnh cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên và Khánh Hồ. Năm 1999 cĩ 13.120 ha lúa bị nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM cĩ 242 ha bị bệnh và khơng trổ bơng đƣợc [9]. Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng Tháp với thiệt hại dƣới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đĩ tiêu huỷ khoảng 500 ha [54]. Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã đƣợc cơng bố ở ĐBSCL và miền Đơng Nam bộ. Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đơng và vụ Đơng Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSCL, Đơng Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên. Theo báo cáo của các địa phƣơng, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ Thu Đơng 2006 và vụ Đơng Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu của các tỉnh vùng ĐBSCL và Đơng Nam bộ là 33.323 ha, và diện tích nhiễm bệnh VL&LXL là 51.768 ha, trong đĩ cĩ 26.283 ha nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1]. Cũng trong năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) cùng các chuyên gia Việt Nam đã đi thực tế đồng lúa ở Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tiền Giang quan sát thấy cây lúa cĩ dấu hiệu bị bệnh VL&LXL và xuất hiện nhiều rầy nâu gây hiện tƣợng “cháy rầy”. Qua xét nghiệm bằng phƣơng pháp ELISA dƣơng tính với kháng thể đặc hiệu của RGSV và RRSV đã khẳng định tỉ lệ nhiễm RGSV, RRSV khá cao, đồng thời cĩ sự xuất hiện của RTSV [56]. Năm 2008, dịch rầy nâu và các bệnh virut hại lúa tuy cĩ giảm so với năm trƣớc nhƣng vẫn đang ở mức nghiêm trọng. Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, trong đĩ cĩ 4.298 ha bị nhiễm nặng. Diện tích bị nhiễm bệnh VL&LXL trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập trung trên lúa hè thu giai đoạn địng trổ, trong đĩ diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 ha (tỉ lệ bệnh trên 10-20%), nhiễm nặng 138 ha (tỉ lệ bệnh trên 20-50%) [11]. Năm 2009, dịch rầy nâu và bệnh VL&LXL vẫn xảy ra trên nhiều vùng với diện tích lớn. Tính đến tháng 08/2009 tại các tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ Hè Thu là 87.246 ha tập trung tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, Sĩc Trăng, Bạc Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đơng là 18.747 ha tại Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh. Diện tích nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận [12]. 1.2. TRIỆU CHỨNG LƯA NHIỄM BỆNH VL&LXL Triệu chứng ban đầu chƣa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình thƣờng. Bụi lúa bệnh chỉ hơi ngã màu xanh nhạt, đơi khi cĩ những lá màu vàng đến cam. Thời gian sau cây lúa bệnh cĩ vẻ kém phát triển hơn (lúc này rất dễ nhầm lẫn với hiện tƣợng kém dinh dƣỡng nên nơng dân thƣờng bĩn thêm phân đạm) [8]. Lúa nhiễm bệnh trong giai đoạn cịn non thƣờng rất lùn, mọc nhiều chồi và cĩ lá thẳng đứng. Các lá bệnh thƣờng ngắn, hẹp, cĩ màu nhạt, và cĩ nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình dạng khơng cố định [32],[43]. Các lá non mọc sau khi bị nhiễm bệnh thƣờng bị sọc loang lổ, tuy nhiên lá lúa cĩ thể vẫn xanh bình thƣờng nếu đƣợc cung cấp đủ phân đạm [32]. Nhìn tồn cảnh thấy lúa hồi xanh khơng đều sau khi cấy, lá hẹp và dựng đứng, lá cĩ màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá cĩ màu xanh đậm cĩ thể cĩ nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1). Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi “Nguồn: ” Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn cĩ chiều cao tƣơng đƣơng với các bụi khác, chƣa khác biệt lắm [64]. Càng về sau nhìn tồn cảnh thấy lúa phát triển khơng đều do bụi lúa bị bệnh khơng phát triển chiều cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khơ và lụi dần nhƣ cháy rầy từng chịm. Cây lúa bệnh cĩ thể khơng cĩ bơng hoặc cĩ rất ít bơng nhƣng hạt bị đen và lép. Triệu chứng Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26]. Lúa trƣởng thành khi bị nhiễm bệnh cĩ lá bị vàng, bơng bị nâu và hạt lép [43]. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LƯA 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) Virut vàng lùn lúa đƣợc phát hiện chủ yếu trên lúa Oryza sativa [25], [43] và cĩ tên khoa học là Rice grassy stunt virus (RGSV), thuộc chi Tenuivirus [57]. Virut phân bố tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và gây thiệt hại kinh tế rất đáng kể. Các chủng RGSV gây vàng lá, mất mầu và chết cây đƣợc phát hiện năm 1977 tại Đài Loan [19], năm 1982- 1983 tại Philippin và Thái Lan [25], và năm 1984 tại Ấn Độ [33]. Ngồi ra, virut cịn phân bố tại các nƣớc châu Á khác nhƣ Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Sri Lanka, Trung Quốc, và Việt Nam [8], [9], [19], [51]. RGSV ký sinh chủ yếu trên các lồi lúa Oryza spp. và rầy Nilaparvata spp. Vì vậy cĩ thể nĩi Nilaparvata spp là vectơ duy nhất truyền bệnh này cho lúa [31]. Thất thu năng suất do RGSV thƣờng khĩ đƣợc tính tốn chính xác vì thiệt hại do virut thƣờng khơng thể đƣợc tách biệt rõ ràng với thiệt hại của rầy nâu và của virut lùn xoắn lá (RRSV- cũng đƣợc truyền bởi rầy nâu) [40]. Trong năm 1974- 1977, cĩ tổng cộng 1,2 triệu ha lúa ở Indonesia bị nhiễm bởi rầy nâu và virut vàng lùn lúa. Sự thất thu năng suất do cả hai lồi dịch hại này gây nên khoảng 03 triệu tấn lúa [40]. RGSV khơng đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh hoặc qua phấn hoa [31]. Virut cũng khơng đƣợc truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh, hoặc qua lây bệnh bằng tay. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy nâu (Nilaparvata lugens) và một số lồi rầy khác (N. bakeri, N. muiri) [28], [43]. Virut đƣợc truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật số trong rầy ký chủ, nhƣng khơng đƣợc truyền qua trứng rầy [36]. Rầy nâu một khi nhiễm bệnh sẽ truyền virut cho đến lúc chết. Kể từ năm 1984, RGSV thƣờng ít xuất hiện và gây thiệt hại tại châu Á. Mặc dù khơng đƣợc báo cáo nhiều, sự ít xuất hiện của RGSV cĩ lẽ là do sự thay đổi trong khả năng truyền bệnh của quần thể rầy nâu. Tại Philippin, tỉ lệ rầy nâu cĩ thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm 1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26]. Từ đây ta cĩ thể giả thiết là một trong những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy cĩ khả năng lấy và truyền virut cĩ thể đã tăng lên đáng kể trong quần thể rầy nâu tại vùng này trong Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 những năm vừa qua. Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân tử RdRp [35]. Thể virut khĩ đƣợc quan sát thấy trong dịch trích thực vật dƣới kính hiển vi điện tử. Thể virut sau khi đƣợc ly trích cĩ dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 nm khi đƣợc quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2). Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Thanh đen dài 100 nm. “Nguồn: DPV”. Lúa bị nhiễm virut cĩ nhiều bĩ sợi đƣợc quan sát trong nhân và tế bào chất hoặc trong các thể cĩ màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp lục [20]. Các thể hình ống đi kèm với các hạt cĩ đƣờng kính 25 nm cịn đƣợc tìm thấy trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh [47]. Các hạt 25 nm tƣơng tự cũng xuất hiện dƣới dạng các mảng kết tinh trong các thể béo và khí quản của rầy nâu nhiễm virut [43]. RGSV cĩ 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32]. Cả 6 đoạn RNA đều lƣỡng tính (ambisense, mã hố protein theo cả 2 chiều dƣơng và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự nhau. Các đoạn mã kết thúc này cĩ khả năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo. Đoạn mã theo chiều bổ sung của đoạn RNA dài nhất (RNA1) chứa một ORF mã hố cho một RdRp tƣơng tự nhƣ RdRp của RSV, lồi chuẩn của chi Tenuivirus [35], [38] và cĩ cùng 37 ± 9% axit amin giống nhau trong tổng số 2140 axit amin. Tuy nhiên, khác với các Tenuivirus khác, RNA1 của RGSV cịn cĩ thêm một ORF ngắn cĩ chiều dƣơng ở gần đầu 5’. Hai protein dự đốn đƣợc mã hố bởi RNA2 chỉ tƣơng tự chút ít với các protein đƣợc mã hố bởi RNA2 của các Tenuivirus khác. Các protein dự đốn đƣợc mã hố bởi RNA3 và RNA4 rất khác biệt so với các protein đƣợc biết. Sự khác biệt giữa Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 các protein đƣợc mã hố bởi các chuỗi RNA2, 3, 4 5 và 6 cho thấy RGSV rất khác biệt so với các Tenuivirus khác [51]. Các đoạn RNA1, 2, 5, 6 của RGSV theo thứ tự tƣơng đƣơng với RNA1, 2, 3, 4 của RSV. Protein vỏ của RGSV đƣợc mã hố bởi đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21]. Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV Các thanh đen hình sợi chỉ tƣợng trƣng cho các RNA với chiều dài đã đƣợc xác định. Các mũi tên đen tƣợng trƣng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi tên là chiều của quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide. “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006” 1.3.2. Các loại virut khác 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV) Bệnh lùn xoắn lá lúa đƣợc miêu tả đầu tiên năm 1977 [48]. Bệnh xuất hiện chủ yếu trên các lồi lúa Oryza spp. và đƣợc gây ra bởi virut cĩ tên khoa học là Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58]. RRSV xuất hiện tại nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc [60], và Việt Nam. RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Virut khơng đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20]. Virut khơng đƣợc truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh [60]. Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh duy nhất đƣợc biết [18], [48]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Thể virut của RRSV cĩ dạng hình cầu, bao gồm một vỏ, một phần trung tâm, và một phức hợp nucleoprotein. Vỏ virut khơng cĩ màng bao và mang nhiều thành phần nhỏ tạo thành các gai (Hình 1.4). Vỏ virut cĩ 12 gai dạng “B” dài 8 – 10 nm, rộng 23- 26 nm ở phần chân đế và 14- 17 nm ở phần trên [36]. Thể virut cĩ rất nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mơ của mạch rây và thƣờng liên kết với nhau tạo thành các sợi dài. Virut khơng đƣợc phát hiện ở các mơ khác [48]. Khi bị nhiễm virut, các tế bào nhu mơ của mạch rây nhân lên và phình ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá [26]. RRSV cĩ 10 đoạn RNA sợi đơi khác nhau [59]. Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (A): Thể virut với các protein gai dạng B “nguồn ”.; (B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem trong uranyl acetate, thanh đen dài 50 nm. “Nguồn: DPV”. 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) Virut tungro hình cầu cĩ tên khoa học là Rice tungro spherical virus (RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27]. RTSV phân bố trên các lồi lúa Oryza spp. ở hầu hết các nƣớc trồng lúa tại vùng Nam và Đơng Nam Á. RTSV cịn cĩ thể phân bố ở những quốc gia khác nhƣng khơng đƣợc phát hiện bởi vì virut này thƣờng khơng gây ra triệu chứng bệnh. Sự phân bố của RTSV cĩ lẽ liên quan lớn đến sự phân bố của cơn trùng truyền bệnh [59]. RTSV kết._. hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14]. Đây là bệnh hại lúa gây thiệt hại kinh tế rất lớn với thiệt hại ƣớc tính hàng năm tại vùng Đơng Nam Á lên đến hơn 1,5 tỉ USD [24]. RTSV khơng đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh. Virut khơng đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành với cây lúa bị bệnh. RTSV cĩ tác dụng nhƣ là một lồi giúp đỡ cho RTBV trong việc truyền bằng cơn trùng [42]. RTSV đƣợc truyền dƣới dạng bán bền bởi một số lồi rầy xanh. Lồi rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đơng Nam Á là rầy xanh đuơi đen Nephotettix virescens (tên khác là N. impicticeps) [47], [59]. A B Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Xem trong dung dịch uranyl acetate. “Nguồn: Hull R., 1996” RTSV cĩ thể virut hình cầu, đƣờng kính 30 nm (Hình 1.5), chứa một phân tử RNA sợi đơn cĩ chiều dƣơng và dài khoảng 12 kb [37], và ba protein cấu tạo vỏ virut là CP1 (kích thƣớc 22.900 kDa), CP2 (22.300 kDa) và CP3 (33.000 kDa) [23],[46], [49], [52], [53]. 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) Virus tungro hình nhộng cĩ tên khoa học là Rice tungro bacilliform virus (RTBV), thuộc chi Tungrovirus, họ Caulimoviridae [27], [34]. RTBV đƣợc tìm thấy tại hầu hết các nƣớc trồng lúa tại Nam và Đơng Nam Á. Sự phân bố của virut cĩ lẽ cĩ mối quan hệ chặt chẽ với sự phân bố của rầy xanh (cơn trùng truyền bệnh tungro) [59]. Giống nhƣ RTSV, RTBV khơng đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh. Virut khơng đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành với cây lúa bị bệnh. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy xanh (Nephotettix virescens) khi cĩ sự giúp đỡ của RTSV. RTBV chỉ đƣợc truyền khi rầy xanh hút RTSV trƣớc hoặc cùng thời gian [16]. RTBV cĩ thể virut dạng hình nhộng, chứa 01 DNA sợi đơi và cĩ dạng vịng. Sợi DNA đơi này cĩ một điểm đứt ở các vị trí nhất định trên mỗi sợi đơn [15], [13]. Bộ gen của RTBV đƣợc dịch sang một RNA dài hơn chiều dài của bộ gen ban đầu và RNA này đƣợc dịch ngƣợc sang DNA để tái tạo lại bộ gen của virut. RNA này cịn đƣợc dùng để dịch mã protein của các ORF 1, 2, 3. Ngồi ra, RNA này cịn đƣợc cắt nhỏ để dịch mã và tạo ra ORF 4 [27]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MƠI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL 1.4.1. Đặc điểm hình thái - Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal), thuộc họ Delphacidae, bộ Homoptera [65]. - Trứng rầy nâu cĩ dạng “quả chuối tiêu”, mới đẻ trong suốt, gần nở chuyển màu vàng và cĩ hai điểm mắt đỏ. Trứng rầy nâu đẻ thành từng ổ từ 5-12 quả nằm sát nhau theo kiểu “úp thìa”, đầu nhỏ quay vào trong, đầu to quay ra ngồi biểu bì ngồi của bẹ lá (Hình 1.10.A). - Rầy non rất linh hoạt, mới nở cĩ màu xám trắng, tuổi 2-3 trở lên cĩ màu nâu vàng, trong điều kiện mật độ cao cĩ màu nâu sẫm (Hình 1.10.B). - Con trƣởng thành cĩ màu nâu tối, con đực nhỏ hơn con cái. Cĩ 2 dạng rầy trƣởng thành: loại cánh ngắn (Hình 1.10.C) và loại cánh dài (Hình 1.10.D). Hình 1.6 . Các giai đoạn phát triển của rầy nâu A. Trứng rầy; B. Rầy con (ấu trùng); C. Rầy nâu trƣởng thành cánh ngắn; D. Rầy nâu trƣởng thành cánh dài “Nguồn: ” 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại Vịng đời của sâu gai từ 25- 30 ngày và thay đổi theo mùa + Thời gian trứng: 5- 14 ngày + Thời gian rầy non: 12- 32 ngày + Thời gian rầy trƣởng thành: 3- 20 ngày A B C D Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Rầy cái trƣởng thành cĩ thể đẻ 150- 250 trứng và cĩ tính hƣớng sáng mạnh. Con trƣởng thành và rầy non đều hút nhựa cây từ dảnh và lá lúa. Rầy nâu xâm nhập vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ. Rầy nâu phát sinh với mật độ cao và gây hại nặng vào giai đoạn trƣớc lúc lúa trỗ bơng, ngậm sữa và bắt đầu chín [65]. Nếu chỉ đơn thuần rầy gây hại khơng là mơi giới truyền bệnh thì đánh giá mức gây hại của rầy nâu là khơng lớn nhƣng cách phịng trừ loại rầy này lại tƣơng đối khĩ. Rầy nâu cĩ phản ứng kháng, nhiễm với các giống lúa rất rõ, nĩ cĩ khả năng hình thành các nịi sinh học mới khi cĩ sức ép chọn lọc của mơi trƣờng đủ lớn. Rầy cĩ khả năng di cƣ đám đơng rất xa và kháng thuốc cao. Rầy nâu cịn cĩ tác hại chủ yếu là truyền lan các loại virut [10]. Nguy hiểm hơn cả là bệnh VL&LXL lúa khi truyền các loại virut là RGSV và RRSV. Rầy nâu thích hợp với điều kiện khí hậu ấm nĩng, độ ẩm cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở Miền Nam rầy cĩ thể gây hại liên tục các vụ lúa, cịn ở phía Bắc cháy rầy thƣờng xảy ra vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng 9 đầu tháng 10 (vụ mùa) [54]. Tỉ lệ rầy nâu N. lugens cĩ thể truyền bệnh khác nhau theo từng vùng trên ruộng lúa, và biến động từ 5- 60 % [22], [28], [29]. Tỷ lệ rầy truyền bệnh cĩ thể đƣợc tăng lên bằng cách chọn lọc và nhân mật số các cá thể rầy cĩ khả năng truyền virut, nhƣng lại giảm đi khi khơng cịn áp lực chọn lọc [28]. Với rầy nâu N. lugens, tỉ lệ truyền bệnh khơng khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và cái, giữa rầy đen đậm và đen nhạt, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn [28]. Tuy nhiên, rầy non cĩ khả năng truyền bệnh cao hơn và cĩ giai đoạn ủ virut ngắn hơn rầy trƣởng thành [22]. 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL Bệnh VL&LXL cho đến nay chƣa cĩ thuốc đặc trị. Vì vậy, biện pháp an tồn và hữu hiệu nhất vẫn là phịng bệnh thơng qua việc ngăn chặn, tiêu diệt rầy nâu (mơi giới truyền bệnh trực tiếp). Sự phát triển và lây truyền bệnh virut tùy thuộc vào số lƣợng cây mang nguồn bệnh, số lƣợng và sự hoạt động của cơn trùng truyền bệnh, sự mẫn cảm của giống lúa với virut, với cơn trùng truyền bệnh và thời tiết. Nhiều biện pháp phịng trừ bệnh VL&LXL đã đƣợc tiến hành nhƣ canh tác lúa theo tinh thần 3G, 3T, trong đĩ khơng bĩn thừa N, giảm mật độ xạ cấy, giảm sử dụng thuốc hĩa học, bĩn phân cân đối tạo sức đề kháng cho cây lúa, phun thuốc diệt trừ rầy [5]. Thuốc hĩa học cĩ thể làm giảm mật số rầy nhƣng vẫn khơng thể giải quyết đƣợc bệnh vàng lùn lúa, vì sự truyền bệnh cĩ thể xảy ra giữa rầy và cây lúa trong khoảng thời gian rất ngắn [2],[5]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Từ năm 2003 đến nay tại Sĩc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên đồng ruộng, và đã cho kết quả khả quan. Chế phẩm sinh học dựa trên nuơi cấy các loại nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đƣa loại nấm này ra đồng ruộng, rầy nâu gặp nấm sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phƣơng pháp này cĩ thể diệt trừ rầy nâu một cách hiệu quả mà khơng gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [55]. Hiện nay, phƣơng pháp này cũng gặp nhiều hạn chế: về mặt qui mơ (mỗi lần áp dụng chỉ trên diện tích vài chục ha đất), về cơng nghệ chế biến, mƣa sau khi phun sẽ làm trơi thuốc, phun thuốc phải trúng rầy, mƣa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh hƣởng tới chất lƣợng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu khơng bị tiêu diệt ngay sau khi phun thuốc) [6]. Nhiều kết luận cho rằng khơng một biện pháp đơn lẻ nào cĩ thể phịng trừ rầy nâu một cách hồn hảo. Vấn đề chỉ cĩ thể giải quyết bằng cách thực hiện một chƣơng trình phịng trừ tổng hợp, trong đĩ giống kháng, biện pháp sinh học, biện pháp canh tác và dùng thuốc hĩa học phải đƣợc kết hợp với nhau một cách hợp lý [9], [44]. Vì vậy, địi hỏi phải cĩ những nghiên cứu chi tiết về các chủng virut gây bệnh và mơi giới truyền bệnh VL&LXL trên qui mơ rộng lớn. 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử Trong sinh học phân tử, cĩ nhiều loại enzym quan trọng, trong đĩ phải kể đến những loại sau: Enzym phiên mã ngƣợc cĩ vai trị quyết định trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử Eucaryot. Enzym này do các retrovirut sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào vật chủ. Enzym phiên mã ngƣợc tổng hợp nên một mạch DNA bổ sung (cDNA- complementary DNA) từ RNA khuơn theo chiều 5’-3’, khi cĩ mặt của mồi. Các ứng dụng chủ yếu là: Thiết lập ngân hàng cDNA, tiến hành phản ứng PCR trên mRNA, và xác định trình tự của các axit nucleic bằng phƣơng pháp sử dụng các dideoxynucleotit. DNA ligase là enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay RNA (RNA ligase). Enzym này đƣợc tách chiết từ E.coli và xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự DNA cĩ đầu so le. T4 DNA ligase cĩ nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Enzym này cĩ cùng chức năng với ligase tách chiết từ E.coli nhƣng đặc biệt cịn cĩ khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên T4 DNA ligase đƣợc dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật tạo dịng. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuơn cho sự tổng hợp (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuơn là RNA để tổng hợp DNA. Ngồi ra, cịn cĩ Terminal transferrase là một DNA polymerase khơng tổng hợp mạch mới từ mạch khuơn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của một phân tử DNA cĩ sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp bổ sung với phần đầu của mạch khuơn (đầu 3’), để từ đĩ các polymerase mới nối dài tạo mạch bổ sung. Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease cĩ khả năng cắt DNA mạch đơi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả năng này, ngƣời ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nĩ sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đĩ khoảng 1000 – 5000 nucleotit và giải phĩng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đĩ; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đĩ khoảng 20 nucleotit. Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hoặc 6). Đối với một số RE, trình tự nhận biết khơng cĩ tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotit của trình tự cĩ thể đƣợc thay thế bởi nucleotit khác. Đặc trƣng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng cĩ cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hồn tồn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo cùng chiều 5’-3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn: - Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà khơng muốn cĩ intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta cĩ thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi RNA khuơn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 nucleotit tự do cĩ trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuơn ban đầu. Để tăng hiệu quả của qua trình tổng hợp, lƣợng mồi đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng RNA khuơn và chất kìm hãm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase. Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuơn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuơi và mồi ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3. 1.6.3. Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp) đƣợc Karl Mullis và cộng sự mơ tả đầu tiên vào năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro tƣơng đối đơn giản, cho phép nhân một số lƣợng khơng giới hạn nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA mới từ mạch khuơn đều cần sự cĩ mặt của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn DNA ngắn cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuơn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym này bao gồm 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần: 1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95oC trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút. 2> Lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuơn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút. 3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuơn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh hiện tƣợng bắt cặp khơng đặc thù, phản ứng thƣờng đƣợc thực hiện ở 72oC. Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt, ví dụ nhƣ Taq- polymerase đƣợc tách triết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ suối nƣớc nĩng. Hiện nay, enzym này chủ yếu đƣợc tổng hợp theo con đƣờng tái tổ hợp. Sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đơi, với N sợi khuơn ban đầu sau n chu kỳ sẽ cĩ N*2n sợi DNA đƣợc tạo ra. Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ, cĩ khoảng 30 triệu bản đƣợc tạo ra từ một sợi khuơn ban đầu. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mơ tả vào năm 1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ơng về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Tuy nhiên, khơng phải tất cả các vi khuẩn đều cĩ thể biến nạp đƣợc một cách dễ dàng. Để cĩ thể biến nạp ở E.coli cĩ hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, trƣớc khi biến nạp, ngƣời ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCl2 lạnh. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmit tái tổ hợp với các tế bào, rồi ủ trong đá từ 20- 30 phút, sau đĩ tạo một sốc nhiệt ngắn ở 420C trong khoảng 1- 1,5 phút, làm nhƣ vậy DNA sẽ chui vào tế bào. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đƣợc nuơi phục hồi trong mơi trƣờng LB lỏng ở 370C trong khoảng 60- 90 phút. Sau đĩ, các tế bào đƣợc đƣa lên mơi trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào cĩ plasmit tái tổ hợp. Trong quá trình biến nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Mặc dù cĩ nhƣợc điểm rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nĩ cĩ thể tạo ra tới 109 các tế bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đƣa 1µg DNA vào thí nghiệm. Trong thực tế, với 1µg DNA ngƣời ta tạo ra đƣợc 106 đến 107 tế bào biến nạp. 1.6.5. Kỹ thuật tách dịng gen Tách dịng gen là một cơng cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách dịng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên, DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử dụng là plasmit thích ứng của vi khuẩn E.coli. Sau đĩ, vectơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều lần. Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E.coli. Cuối cùng qua các bƣớc tách chiết DNA, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một lƣợng lớn plasmit tái tổ hợp. Các nhân tố nhƣ vectơ, tế bào chủ cĩ thể thay đổi nhƣng tiến trình tách dịng nĩi chung đƣợc thực hiện qua 4 bƣớc: xử lý DNA cần tạo dịng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dịng. - Xử lý DNA cần tạo dịng Trƣớc hết DNA cần tạo dịng đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đĩ đƣợc làm sạch để thu đƣợc phân đoạn DNA cĩ kích thƣớc nhƣ mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR. Bƣớc này nhằm tạo điều kiện cho bƣớc chọn dịng đƣợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp cĩ kích thƣớc khơng mong muốn. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Tạo vectơ tái tổ hợp Vectơ tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dịng) vào vectơ tách dịng. Thơng thƣờng, sau khi chạy PCR với enzym Taq- polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen đƣợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết kế các thế hệ vectơ tách dịng cĩ mang 1 nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã đƣợc mở vịng sẵn tại PCS (polycloning site- vùng nhân dịng đa điểm cắt). Hiện nay, cĩ rất nhiều vectơ tách dịng cĩ điểm cắt này, nhƣ pBT, pCR®2.1- TOPO, pGEM ® -T... Vectơ tách dịng và DNA cần tạo dịng đƣợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dƣới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ đƣợc gắn vào vectơ theo nguyên tắc bổ sung A – T tại vị trí mở vịng. - Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau. Bƣớc này nhằm sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. - Chọn dịng Chọn dịng vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thơng dụng: chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh (kanamycin, ampicillin,...) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn khơng đƣợc biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn cĩ mang vectơ nhƣng khơng cĩ đoạn gen nào đƣợc gắn vào. 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR) Nguyên tắc kỹ thuật colony- PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA đƣợc thay bằng DNA plasmit giải phĩng từ khuẩn lạc ở nhiệt độ cao 94 0C đến 950C, màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phĩng plasmit tái tổ hợp. Plasmit tái tổ hợp sẽ làm khuơn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU - Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc thu từ các tỉnh đại diện cĩ tỷ lệ nhiễm bệnh từ trung bình đến cao ở khu vực Nam Trung Bộ, mỗi tỉnh thu mẫu từ 2- 3 địa điểm khác nhau (Hình 2.1). STT Tên tỉnh thu mẫu Ký hiệu mẫu 1 Bình Định BĐ 2 Phú Yên PY 3 Khánh Hịa KH 4 Ninh Thuận NT 5 Bình Thuận BT Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ 1 2 3 5 4 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.2. HĨA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 2.2.1. Hĩa chất - Các cặp mồi dùng để tách dịng gen mã hĩa protein vỏ và các phân đoạn khác đƣợc tổng hợp bởi hãng Invitrogen (Mỹ). Các hĩa chất sinh học phân tử và các thiết bị đều đƣợc các hãng nổi tiếng nhƣ Fermentas (Đức), QIAGEN (Đức), Invitrogen (Mỹ), BIONEER (Hàn Quốc)... cung cấp. - Thang DNA chuẩn (Fermentas, Invitrogen) - QIAamp ® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN). - Bộ hĩa chất sử dụng cho RT-PCR (Invitrogen- Super ScriptTM III One- Step RT-PCR system with Platinium ® Taq High Fidelity) (Invitrogen). - Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit- QIAGEN). - Kit tách và tinh sạch plasmit (QIAprep Spin Miniprep- QIAGEN) - Các hĩa chất thơng dụng khác nhƣ: Ampicillin, IPTG, X-gal, agarose, ... (Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech). - Các hĩa chất cho phản ứng PCR, H2O khử DEPC. - Vectơ pBT (Viện Cơng nghệ Sinh học). 2.2.2. Thiết bị Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vơ trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và các trang thiết bị khác. 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu - Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. - Phịng thí nghiệm Di truyền học và Cơng nghệ gen, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm Mẫu lúa đƣợc thu tại các địa phƣơng nghi cĩ hiện tƣợng nhiễm bệnh, do các chuyên gia tại địa phƣơng trực tiếp dẫn đi thu mẫu. Mẫu lúa đƣợc thu là những cây lúa cĩ nhiều biểu hiện khác biệt so với những cây bên cạnh: lá vàng, xoắn, lùn hơn Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 bình thƣờng. Mẫu lúa đƣợc chứa trong các ống đã khử trùng và bảo quản trong điều kiện -840C đến khi sử dụng. 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu Quy trình thiết kết mồi đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ Ngân hàng gen (GenBank); ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank: Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63]. Trình tự của các đoạn gen quan tâm cĩ thể tìm kiếm thơng qua tên của gen hoặc số hiệu của gen đƣợc đăng kí trong ngân hàng gen. Sau khi cĩ đƣợc trình tự của gen quan tâm, các đoạn primer sẽ đƣợc thiết kế bằng việc sử dụng các chƣơng trình thiết kế. ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. Chƣơng trình Primer3 đƣợc đăng kí tại địa chỉ bin/primer3plus/primer3plus.cgi [67]. Trong quá trình thiết kế mồi cần căn cứ vào mợt sớ điểm sau: Mồi phải cĩ độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao. Cớ gắng chọn trình tƣ̣ mồi cĩ khoảng 50% GC khi đĩ Tm trong khoảng 56- 62 0C sẽ tạo điều kiện để quá trình ủ đạt kết quả tốt. Tránh G và C ở đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng cơ hợi tạo ra hiện tƣợng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau ). Tránh chọn các vùng cĩ trình tự tƣơng đờng để hạn chế các mồi tƣ̣ gắn với nhau . Tính tốn nhiệt độ nĩng chảy (Tm) của primer với tởng sớ 40C cho GC và 20C cho AT theo cơng thức Tm = 4(G+C) + 2(A+T), sau đó trƣ̀ đi 50C tƣ̀ giá trị này và đây chính là nhiệt đợ ủ (Ta) của primer [30], [39]. 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa RNA tổng số từ các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc tách chiết theo hƣớng dẫn sử dụng hĩa chất trizol reagents. Lá lúa (khoảng 200g) đƣợc nghiền trong nitrogen thành bột mịn; Bổ sung 1 ml trizol reagents, đảo nhẹ ở nhiệt độ phịng trong 10 phút; Bổ sung 200 µl chloroform : isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 10.000v/p trong 10 phút; Hút dịch nổi, kết tủa RNA bằng Isopropanol. Ly tâm Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 ở 10.000v/p trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa; Rửa tủa bằng cách bổ sung 700µl ethanol 70%, ly tâm ở 7000v/p trong 5 phút (lặp lại 2 lần), làm khơ và pha lỗng RNA trong nƣớc khử DEPC 0,01%; Cất mẫu ở -840C. 2.3.4. Phản ứng RT-PCR - Thành phần: Thành phần phản ứng RT-PCR (one-step) trong thể tích 25l: 5l đệm RT-PCR 5X; 10pg- 5g RNA tổng số (1l); 75pmol mỗi loại mồi đặc hiệu (0,75l); 1l 10mM dNTP mix (10mM mỗi loại dATP, dGTP, dTTP và dCTP, ở pH trung tính); 1l hỗn hợp enzym (Reverse transcriptase và Taq polymerase); 0,2 l chất ức chế Ribonuclease tái tổ hợp RNase OUTTM (40u/l); Bổ sung nƣớc khử ion đã đƣợc khử trùng tới thể tích 25l. - Chu kỳ nhiệt: Thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt sau: bƣớc 1: 50 0C, 30 phút; bƣớc 2: 950C, 15 phút; bƣớc 3: 940C, 30 giây; bƣớc 4: 530C, 30 giây; bƣớc 5: 720C, 3 phút; từ bƣớc 3 đến bƣớc 5 lặp lại 10 chu kỳ; bƣớc 6: 940C, 30 giây; bƣớc 7: 550C, 30 giây; bƣớc 8: 720C, 5 phút; từ bƣớc 6 đến bƣớc 8 lặp lại 30 chu kỳ; bƣớc 9: 720C, 10 phút; bƣớc 10: 40C, bảo quản mẫu. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE [45], nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và thơi gel bằng bộ Kit của QIAGEN. 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) Sản phẩm PCR của gen quan tâm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đƣợc làm sạch theo bộ kit QIAquick Gel Extraction rồi gắn vào vectơ tách dịng pBT (Hình 2.2). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: - Thơi gel sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, cĩ kích thƣớc khoảng 1kb; bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ: Vmẫu : VQG = 1 : 3 (1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ ở 50 0 C trong 10- 15 phút, cứ 3 phút đảo mẫu nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút để đảm bảo gel tan hồn tồn; chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thơi gel Qiaquick spin, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột; bổ sung 500µl dung dịch QG, ly tâm 13.000v/p trong 1 phút; thêm 750µl dung dich PE vào cột, để ở nhiệt độ phịng trong 5 phút; ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch PE; hịa tan DNA trong 30- 50µl nƣớc cất hoặc dung dịch EB, đã đƣợc làm ấm đến 500C, để ở nhiệt độ phịng 1 phút, ly tâm 13.000v/p để thu DNA. - Gắn gen vào vectơ: Sản phẩm thơi gel đƣợc gắn vào vectơ pBT với sự xúc tác của T4 ligase. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 giữa nucleotit Adenin của sản phẩm PCR và nucleotid Thymin của vectơ. Các thành phần của vectơ pBT đƣợc thể hiện trong hình 2.2. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phịng trong 02 giờ để phản ứng xảy ra hồn tồn. Vectơ tái tổ hợp sau đĩ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên mơi trƣờng LB đặc cĩ bổ sung ampicillin 0,01mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Thành phần phản ứng gắn gen vào vectơ pBT: Buffer T4 ligase 10X (2µl); DNA (8µl); plasmit pBT (1µl); T4 ligase 2u/µl (1µl); H2O (8µl). Tổng thể tích 20µl. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đĩ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT. 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt - Chuẩn bị tế bào khả biến: Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên mơi trƣờng LB đặc và nuơi qua đêm ở 370C. Chọn một khuẩn lạc nuơi cấy trong 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2- 3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuơi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40C). Ly tâm 4000v/p, ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hịa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840C. - Biến nạp: Bổ sung 20µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ, đặt ngay vào đá trong 30 phút rồi ủ ở 420C chính xác trong 1,5 phút, sau Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 đĩ đặt vào đá 5 phút. Bổ sung 700µl mơi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuơi ở 37 0C, lắc 200v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa mơi trƣờng LB đặc cĩ chứa 0,1mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. 2.3.7. Colony-PCR Sau khi nuơi khuẩn đã biến nạp trên mơi trƣờng chọn lọc, thu đƣợc những khuẩn lạc xanh và trắng. Nguyên lý của khuẩn lạc xanh và trắng: Tồn bộ khuẩn lạc phát triển trên mơi trƣờng cĩ ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit (vectơ). Vì sự cĩ mặt của gen kháng ampicillin trong plasmit giúp vi khuẩn cĩ khả năng kháng kháng sinh ampicillin. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện do trong vectơ mang gen lac-operon hoạt động bình thƣờng, khơng cĩ đoạn gen đƣợc xen vào, khi cĩ chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hĩa cơ chất X-gal thành hợp chất cĩ mầu xanh. Cịn những khuẩn lạc trắng cĩ thể là do nhận đƣợc plasmit mang lac-operon khơng hoạt động, chính vì vậy khi cĩ chất cảm ứng IPTG thì gen khơng tổng hợp enzym β-galactosidase và khơng xảy ra hiện tƣợng chuyển hĩa X-gal. Lac-operon bị bất hoạt là do đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lacZ. Do đĩ, lac-promoter khơng thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên khơng cĩc sự dịch mã thành enzym. Tuy nhiên, khơng phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn DNA quan tâm. Mặc dù vậy, việc chọn khuẩn lạc trắng để nghiên cứu tiếp đã loại bỏ đƣợc phần lớn các trƣờng hợp khơng mong muốn. Để phản ứng hiệu quả hơn cần kiểm tra bằng cách chạy phản ứng colony-PCR. Khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đƣợc chọn lọc và đánh số thứ tự, thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc cĩ plasmit mang gen quan tâm. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% để chọn ra các khuẩn lạc mang gel cĩ kích thƣớc nhƣ mong muốn, đồng thời nuơi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng cĩ bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmit. Thành phần phản ứng colony-PCR: Dung dịch đệm PCR 10X (2µl); MgCl2 25mM (2µl); dNTPs 2,5mM (2µl); Mồi pUC18-xuơi 10 pmol/µl (1µl); Mồi pUC18- ngƣợc 10 pmol/µl (1µl); DNA polymerase 1u/1µl (1 µl); H2O khử ion (11µl). Tổng thể tích là 20µl. Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony-PCR: bƣớc 1: 950C, 5 phút; bƣớc 2: 940C, 30 giây; bƣớc 3: 520C, 30 giây; bƣớc 4: 720C, 3 phút; từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 10 chu kỳ; bƣớc 5: 940C, 30 giây; bƣớc 6: 550C, 30 giây; bƣớc 7: 720C, 5 phút; từ bƣớc 5 đến bƣớc 7 lặp lại 25 chu kỳ; bƣớc 8: 720C, 10 phút; bƣớc 9: 40C, bảo quản mẫu. 2.3.8. Tách chiết plasmit Sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmit. Đây là phƣơng pháp tách plasmit lƣợng._.