Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelin từ dứa

Từ đó, dứa được đem trồng ở các thuộc địa của Tây Ban Nha, nhất là các quốc gia thuộc khu vực Thái Bình Dương như Phi Luật Tân. Tiếng Anh của Dứa là Pinapple. Các nhà thám hiểm Tây Ban Nha thấy trái dứa nom giống như chốp quả thông, bèn đặt tên là “Pina”. Người Anh thêm chữ “Apple” để nói rõ hơn về tính ngọt dịu, ăn được của trái này. Tiếng Việt còn gọi Dứa là trái Thơm hay Khóm, có lẽ vì hương thơm dìu dịu thoát ra từ trái dứa vừa chín tới. Dứa là trái cây nhiệt đới, thích hợp với môi trường ẩm thấp, nhưng có thể chịu đựng tới nhiệt độ 280F (-20C), nhưng ở nhiệt độ lạnh, cây chậm lớn và trái chua. Nông trại trồng dứa quy mô lớn đầu tiên trên thế giới được thiết lập ở Hawaii vào năm 1885. Sau đó, Phi Luật Tân là nước trồng nhiều và sản xuất cảng nhiều nhất. Các quốc gia khác ở Đông Nam Á cũng sản xuất một khối lượng dứa khá lớn. Dứa có quanh năm, nhưng nhiều nhất vào tháng 3 và tháng 7. Trung bình thời gian từ lúc trồng tới lúc thu hoạch là 18 tháng. Dứa thường được hái khi đã chín, sẵn sàng để ăn. Hái khi dứa còn xanh, dứa sẽ không chín tiếp vì không có đủ tinh bột để chuyển thành đường. Ở Việt Nam, dứa được trồng rất nhiều ở Phú Thọ, Ninh Bình, Lâm Đồng, Long An, Kiên Giang, Cần Thơ. Dứa Bến Lức vẫn nổi tiếng khắp miền Nam. Mỗi trái dứa có thể nặng khoảng từ 1/2 kg đến 3 kg. 2.1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dứa Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g dứa Dứa có nhiều sinh tố C, chất xơ pectin và chất gum. Thành phần dinh dưỡng trong 100g dứa: Độ ẩm 81.3-91.2 g Tinh chất Ether 0.03-0.29 g Chất xơ 0.3-0.6 g Nitrogen 0.038-0.098 g Tro 0.21-0.49 g Calcium 6.2-37.2 mg Phosphorus 6.6-11.9 mg Iron 0.27-1.05 mg Carotene 0.003-0.055 mg Thiamine 0.048-0.138 mg Riboflavin 0.011-0.04 mg Niacin 0.13-0.267 mg Ascorbic Acid 27.0-165.2 mg 2.1.3. Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain 2.1.3.1. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ, do 100-200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của quả dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hòa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Đây là bộ phận cho nhiều enzyme bromelain nhất, chiếm 50% protein của quả dứa. (Nguồn: ml) 2.1.3.2. Thân Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Năm 1957, Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelain và người ta bắt đầu tìm cách tách chiết nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh. (Nguồn: ml) 2.1.3.3. Lá Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuốn, hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm tốc độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai. Tuỳ theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60-70 lá (Nguyễn Văn Kế, 2001). Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain. 2.1.3.4. Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10-26 cm và phát triển rộng đến 1 m (Nguyễn Văn Kế, 2001). Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain. 2.2. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…). Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau. Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: Động vật (hạn chế) Thực vật (hạn chế) Vi sinh vật (phổ biến) Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế. Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau: Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn. Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú. Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất cao. Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp. 2.3. ENZYME PROTEASE Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự do, một peptide ngắn,pepton. 2.3.1. Giới thiệu sơ lược các Enzyme protease 2.3.1.1. Protease vi sinh vật Protease từ vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm khoảng 59% lượng enzyme được sử dụng. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Protease từ nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Protease từ xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus... 2.3.1.2. Protease động vật - Tụy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzymenhất. - Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus. Protease pH Chất hoạt hóa Pepsin Chymosin Trypsin Chymotrypsin Carboxypeptidase Aminopeptidase 1,5 – 4,0 5 – 6 6,5 – 9,0 7,0 – 8,5 6,0 – 8,5 6,5 – 8,0 H+, protease Ca2+ Enserkinase, Ca2+ Ca2+ Trypsin - Bảng 2.2: Protease động vật 2.3.1.3. Protease thực vật Protease thực vật tập trung chủ yếu ở một số cây vùng nhiệt đới như đu đủ, dứa, cây sung, articho và đậu tương. Tất cả protease thực vật đều cùng thuộc một nhóm enzyme chứa gốc – SH trong tâm hoạt động. Thí dụ: papain từ mủ đu đủ, bromelain từ dứa, ficin từ quả sung. 2.3.2. Ứng dụng của enzyme protease Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong Công nghiệp Trong các loại enzyme thì enzyme protease có vai trò quan trọng hơn cả vì nó thủy phân protein. Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người, nó là thành phần cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung câp vật liệu như da, lông, tơ phục vụ cho sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời gian bảo quản. Sản phẩm Ứng dụng Bia Phomat Làm mềm thịt Bánh mì Bánh kẹo Da Chất tẩy rửa Làm tan protein hạt, làm ổn định bia. Tủa protein sữa và làm chín phomat. Cắt một phần mô liên kết. Tăng độ dẻo của gluten. Tăng độ giòn. Loại bỏ lông, sắc tố, làm mềm da. Tẩy rửa vết protein. Hiện nay chế phẩm protease thương mại một phần có nguồn gốc động vật và thực vật, nhưng chủ yếu là từ vi sinh vật ( Nguyễn Tiến Thắng, 2004). 2.4. ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA Giới thiệu enzyme bromelain Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20. Ở nước ta nghiên cứu về Bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970. Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là từ thân (EC-3.4.22.32) và trái dứa (EC-3.4.22.33). Ở mỗi bộ phận khác nhau thì Bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau. Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide (Dương Thị Hương Giang, 2005). Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của Bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tính chất vật lí của enzyme bromelain Bảng 2.4: Tính chất vật lí của bromelain thân Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu cơ. Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme Bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau: Tính chất vật lí Kí hiệu Giá trị Hằng số sa lắng S 2.73 S Hằng số khuếch tán D 7.77 x 10-7 cm2/s Thể tích riêng phần V 0.743 mL/g Độ nhớt bên trong [l] 0.039 dl/g Tỉ số ma sát f/f0 1.26 Điểm đẳng điện Pi 9.55 Sự hấp thu A1%cm ở 280 nm 20.1 Trọng lượng phân tử Da 33 200* 32 100** 35 500*** (Nguyễn Đức Lượng, 2004) * : Tính từ phương pháp sa lắng – khuếch tán. ** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong. *** : Tính bằng phương pháp Archibald. Tính chất hoá học của enzyme bromelain Cấu tạo hoá học Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần acid amin ở bromelain thân và quả thay đổi khác nhau. Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và 283-161 acid amin đối với bromelain quả. Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của Bromelain thân có acid amin đầu –NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelin quả, acid amin đầu –NH2 là alanine (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.4.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – - Gly – Cys – Lys - Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- (disulfur). Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Å. Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu. Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử bromelain thân còn có sự hiện diện của các ion Zn2+ với hàm lượng 2 mg/g enzyme có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme. 2.4.4. Hoạt tính của enzyme bromelain Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính Bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín. Trong đó hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn. Một số nghiên cứu cho thấy Bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này tương đương nhau. Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelain yếu hơn papain. Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain và ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004). . Cơ chế tác động Hầu  hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain. Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt). Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác. Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất. Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amin. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide. Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…) Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+ Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định. 2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Bromelain ở dạng tinh khiết thì nhạy với nhiệt: ở 5o C, pH = 4-10, Bromelain có hoạt tính tối đa trên Casein trong 24h; ở 55oC, pH=6 trong 20 phút, hoạt tính giảm 50%. Quá trình sấy thăng hoa (đông khô) mất hoạt tính 27% (Nguyễn Đức Lượng, 2004).       Ảnh hưởng của pH pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt. Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8 tùy cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ảnh hưởng bởi các ion kim loại Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain. Ví dụ: KCN, Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit… Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate, clo acetophenol, H2O2, methyl bromur. Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản Bảng 2.5: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản lên hoạt tính enzyme bromelain Điều kiện bảo quản Hoạt tính (UI/mg protein) Dịch chiết Đông khô Nguyên liệu tươi 1600 1150 Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày 830 630 Sấy khô ở 4oC 1880 1360 2.4.5. Ứng dụng của enzyme bromelain 2.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme bromelain để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm (Salem và ctv,1995). Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt. Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt. Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng renin. Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần đây sử dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain chồi dứa đang được quan tâm vào mục đích này. 2.4.5.2. Trong y dược học Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 – 300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc. Ở Mỹ và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế. Điều trị các bệnh nhiễm trùng (Jayaran và ctv, 1991). Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con (Chandler và Mynott, 1998). Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên (Nielsel và ctv, 2001). Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật...Đó là thành quả nghiên cứu của các nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ (Viện Hóa học, Viện Khoa học - công nghệ VN) năm 2006. Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ. 2.4.5.3. Một số chế phẩm enzyme bromelain thương mại Hình 2.4: Chất chiết từ lá và thân dứa được sản xuất dưới dạng viên nén, mỗi viên chứa 200mg bromelain. Hình 2.3: Bột bromelain bổ sung vào thức ăn cho gia súc do Thái Lan sản xuất. 2.4.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước Ở nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch và khả năng ứng dụng của enzyme này. Một số công trình nghiên cứu về enzyme bromelain như: Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao. Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002) nghiên cứu điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm thô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Strea mline với hiệu suất cao. Dương Thị Hương Giang và ctv (2005) nghiên cứu tinh sạch bromelain từ phụ phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel mở rộng với hệ thống cột Stream line 50 và gel trao đổi ion âm SP-Strea mline XL với hiệu suất cao. 2.4.6.2 Nghiên cứu ngoài nước Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên. KỸ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch. Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng phương pháp siêu âm. Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lí các mô mềm, mô động vật, thực vật. Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lí với lysozine (enzyme phá vách tế bào). Đối với những tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy ép tạo áp suất cao để phá vở tế bào. Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu. Sau khi nhận được sinh khối tế bào bị nghiền, công việc tiếp theo là phải tách vách và các mảnh vỡ tế bào ra khỏi dịch chứa protein được giải phóng trong quá trình nghiền. Thường người ta sử dụng phương pháp: ly tâm, lọc, tách dịch 2 lớp, tách nucleic acid và lipid. Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN Có năm phương pháp lắng tủa protein : tủa bằng muối, bằng dung môi hữu cơ, tủa tại điểm đẳng điện, tủa bằng polymer trung tính không mang điện và bằng các chất đa điện phân. 2.6.1. Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau Để tinh sạch protein ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng ammonium sulfate thường được sử dụng bước đầu trong quy trình tách chiết và tinh sạch protein. Ở các nồng độ muối cao protein sẽ tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính. Khi cho thêm muối vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi đủ một lượng muối vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu tủa protein bằng cách ly tâm và hòa tan trở lại trong dung dịch đệm. Dung dịch lúc này vẫn chứa nhiều muối còn lại trong tủa. Có nhiều phương pháp để rửa muối khỏi protein nhưng người ta thường loại muối bằng phương pháp thẩm tích hay phương pháp lọc gel. Dung dịch sau khi rửa sạch muối được giữ để sử dụng cho các quá trình tinh sạch và phân tích tiếp theo. (Dương Thị Hương Giang, 2004). 2.6.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ Các dung môi hữu cơ như: aceton, ethanol (được dùng nhiều nhất). Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả tủa tốt hơn so với tủa bằng muối, không cần loại muối trước khi chạy sắc kí, cách tiến hành đơn giản. Nhưng khi tủa bằng dung môi hữu cơ phải thực hiện trong điều kiện lạnh vì nếu tủa ở nhiệt độ thường sẽ làm biến tính protein, lượng dung môi cần dùng tương đối nhiều. 2.6.3. Tủa bằng điểm đẳng nhiệt Dựa trên tính chất protein có độ hoà tan thấp ở điểm đẳng điện. Ở điểm đẳng điện độ hydrate-hoá của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn. Phương pháp này cho hiệu quả không cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ. 2.6.4. Tủa bằng các loại polymer Polyethyleneglycol (PEG) là polymer được sử dụng rộng rãi để tủa protein. Cơ chế tủa bằng polymer là tạo tủa protein nhờ giảm mức độ hydrate-hoá của nó. Thường người ta dùng nồng độ polymer ở tỉ lệ 5-15% (trọng lượng/thể tích). Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, hiệu suất tạo kết tủa cao, tuy nhiên chi phí tốn kém. Người ta thường sử dụng 2 loại polymer có MW 6000 và 12000. 2.6.5. Tủa bằng chất đa điện phân Các chất đa điện phân như polyacrylic acid, polysaccharide và polyphosphate có tính acid cũng được sử dụng để tủa protein, tuy có hạn chế nhất định về mặt công nghệ ở quy mô sản xuất lớn. Lợi thế cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất đa điện phân ở nồng độ thấp (0.05-0.1%), hiệu suất kết tủa cao. Nhược điểm của phương pháp này là rất đắt tiền và dễ biến tính protein. (Nguyễn Tiến Thắng, 2009). SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME Định nghĩa enzyme cố định Enzyme cố định (hay còn gọi là enzyme không hoà tan) là những enzyme chuyển động trong không gian bị giới hạn. Sự giới hạn của enzyme đạt được bằng cách đưa nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha dung dịch tự do mà ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ chất. Pha chứa enzyme cố định thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước cao phân tử. Theo Michael Trevan, thuật ngữ cố định (immobilization enzyme, insoluble enzyme) được hiểu là đưa những phân tử enzyme vào những pha riêng rẽ. Pha nay được tách riêng với dung dịch tự do. Pha enxyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. Theo Kalus Mosbach, các chất xúc tác sinh học cố định là enzyme, tế bào, cơ thể sống hoặc tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái cho phép sử dụng lại và liên tục. Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định 2.7.2.1. Ưu điểm Enzyme cố định ngày càng sử dụng rộng rãi là nhờ vào những đặc điểm nổi bật: Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định trong một thời gian dài. Do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền. Thuận lợi trong các quá trình tự động hoá và liên tục. Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ, dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm. Do đó tránh được những ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất dược phẩm, trong công nghiệp sản xuất hoá chất tinh khiết và trong phân tích. Có thể dừng phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất. Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như các tác nhân gây biến tính so với enzyme hoà tan. Hoạt tính ổn định hơn so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như: pH, nhiệt độ,…nhờ các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hoá trị, liên kết hydro, liên kết ion, và các liên kết khác. 2.7.2.2. Nhược điểm Bên cạnh đó enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định: Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme thường thấp hơn so với enzyme tự do. Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hoá trị là do chất hoạt hoá và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme. 2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hoà tan là: Bản chất và tính chất hoá học của chất mang. Các tính chất lý học của chất mang như tính hoà tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hoá học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. Dẫn xuất enzyme không hoà tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của e._.