Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố

iễm trên các nông sản đó đồng thời chế biến chúng thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật có hại đã gây ra tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổn thất gây nên do nấm mốc chiếm một phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về lượng cho nông sản nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và động vật kinh tế. Nấm mốc phát triển trên lương thực không những sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt: Protein, glucid, lipit và các vitamin, chúng còn tiết ra các độc tố. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus moninus tạo ra là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến, …thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và các động vật kinh tế. Do vậy, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và các độc tố mốc, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc trên lương thực, thực phẩm. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. ở nước ta hiện nay, công tác vệ sinh an toàn lương thực, thực phẩm đã có những tiến bộ rõ rệt và ngày càng được chú ý. Từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [17] đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam và một số lương thực như: Đậu, đỗ, lạc…Đặng Hồng Miên [16] cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc. Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự – 1996 [1] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm ngô: aflatoxịn, fumonixin, Ochotoxin A, deoxynivalenol và nivalenol…và các biện pháp phòng trừ. Những kết quả nghiên cứu của PGS.TS: Nguyễn Thuỳ Châu đã cho thấy ngô Việt Nam đã nhiễm nhiều loại mycotoxin, trong đó aflatoxin đã nhiễm ở mức độ cao. Nguyễn Thị Thanh Trà cũng đã khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus và aflatoxin trên một số giống ngô lai và ngô địa phương ở vùng Gia Lâm, Hà Nội và phụ cận. Để tìm hiểu thêm về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên một số giống ngô và biện pháp phòng trừ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố” Mục tiêu và nội dung nghiên cứu: Mục tiêu nghiên cứu: + Xác định được sự nhiễm nấm mốc tự nhiên và hàm lượng aflatoxin trên một số giống ngô, lạc ở một số tỉnh. + Thăm dò khả năng phòng chống aflatoxin bằng các chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố. Nội dung nghiên cứu: + Khảo sát sự nhiễm nấm mốc trong một số mẫu ngô và lạc ở một số tỉnh. + Xác định hàm lượng aflatoxin trong một số mẫu ngô. + Phân lập và phân loại các chủng Aspergillus flavus + Nuôi cấy các chủng Aspergillus flavus đã phân lập để kiểm tra khả năng sinh aflatoxin. + Thử nghiệm phương pháp phòng chống aflatoxin bằng các chủng Aspergillus flavus và các loại nấm khác không sinh độc tố. Phần II: Tổng quan tài liệu 2.1. Hệ nấm mốc trên lương thực: Theo Christensen [22] có hai hệ nấm mốc trên lương thực: Hệ nấm mốc ngoài đồng và hệ nấm mốc bảo quản. 2.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng: Trong khi cây lương thực đang phát triển ở ngoài đồng hay sau khi thu hoạch nhưng trước khi hạt được đập tuốt bị các nấm mốc này xâm nhập. Có một số ngoại lệ như phần lớn ngô được bảo quản ở dạng bắp trong các lều và để ngoài trời, trong các điều kiện như vậy nó có thể nhiễm các nấm mốc ngoài đồng hay nấm mốc ngoài đồng thường có mặt ở đó và tiếp tục phát triển. Tuỳ từng loại ngũ cốc, vùng địa lý cư trú, thời tiết mà các nấm mốc này phát triển nhiều hay ít. Các loại lúa mì, lúa gạo, đại mạch, kiều mạch, và ngô thường nhiễm các loại nấm ngoài đồng như Alternaria, Cladosporium, Helminthosporium, và Furarium. Tất cả các nấm mốc ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển. Độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa (ở các hạt ngũ cốc giàu tinh bột, 20%-21% độ ẩm, trọng lượng ẩm cơ bản) là điều kiện cho nấm phát triển. Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô, nhưng chết tương đối nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối trên 70%, ở các hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩm trên 14%. Những bằng chúng gần đây nhất đã cho thấy rằng sự phối hợp đúng đắn của độ ẩm, nhiệt độ và thời gian bảo quản, có thể hạn chế hoàn toàn các nấm ngoài đồng ở các hạt đại mạch giống mà không bị nhiễm các nấm mốc bảo quản. Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chất lượng của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước thu hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường, và nó không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản. 2.1.2. Hệ nấm mốc bảo quản: Theo Christensen [22] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, trong đó có năm loài phổ biến. Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn này. Những loài này có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%. Đa số các nấm này thường ở trên các nguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới và nhiễm trên tất cả các hạt lương thực và hạt giống. Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300 – 320C và tốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Một vài chủng của nhóm A.glaucus phát triển chậm ở nhiệt độ 100-150C. Một vài loài Penicillium yêu cầu độ ẩm cao hơn. Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng. 2.2. Đại cương về độc tố nấm: Độc tố nấm còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [37]. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái (Morrau 1974) [15]. Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của chúng (Scheoedes và Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hoá. Quá trình trao đổ chất gồm 2 giai đoạn: trao đổi chất sơ cấp và trao đổi chất thứ cấp. Quá trình trao đổi chất sơ cấp được hiểu là các phản ứng tạo thành chất cần thiết đảm bảo sự sống và sự phát triển của tế bào còn trao đổi chất thứ cấp là quá trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa được rõ, chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế bào đó. Quá trình trao đổi chất sơ cấp của tế bào là căn bản giống nhau ở các thế hệ thống sống, nhưng quá trình trao đổi chất thứ cấp thì phụ thuộc khá chặt chẽ vào đặc tính của mỗi loài, mỗi chủng nấm mốc. Thông thường quá trình này thường xảy ra vào cuối giai đoạn phát triển của tế bào nấm mốc. Các độc tố nấm mốc được tổng hợp từ nhiều đường chuyển hoá khác nhau, cụ thể như sau: + Dẫn xuất của đường glucoza + Dẫn xuất của các axitamin + Dẫn xuất của polyxetoacid + Dẫn xuất của terpenteichthecen + Các dẫn xuất của mevelonat kết hợp với axitamin. Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loài nấm có thể đồng thời sản sinh nhiều loại đốc tố. Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria và Claviceps. Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, axit cyclopianzoic. Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin. Các độc tố của Penicillium: Patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, và axit cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin và moniliformin. Các độc tố của Alternaria: axit tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. Các độc tố của Claviceps: Các alkaloit Ergot [21]. Mặc dù độc tính của những loài nấm lớn nhất định đã được biết tới từ lâu, nhưng khả năng gây độc cho con người từ các sản phẩm độc của các nấm mốc chưa được thừa nhận, cho mãi đến năm 1850, khi sự liên quan giữa việc ăn phải lúa mạch đen nhiễm Claviceps purpurea và các đặc tính lâm sàng của bệnh Ergot đã được phát hiện. Vấn đề này được tiếp tục bằng các báo cáo về các độc tố nấm mốc khác đã ảnh hưởng đến con người như xác định các hội chứng liên quan đến việc ăn phải bánh mì nhiễm Furarium graminearum, sự nhận biết bệnh do nấm mốc Stachybotris và những nghiên cứu liên quan đến bệnh giảm bạch cầu độc tố thực phẩm (ATA), và sự ăn phải các hạt lương thực để qua mùa đông nhiễm Fusarium poae và Fuarium sporotrichioides ở nước Nga trong chiến tranh thế giới lần thứ hai. Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo. Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa thịt. 2.3. Độc tố aflatoxin: Trong số các mycotoxin thì Aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện [28]. Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen biết là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. 2.3.1. Tính chất hoá lý: Các Aflatoxin gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2. Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Bốn chất được phân biệt trên cơ sỏ màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá được gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk). Trong bốn loại aflatoxin thì aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn. OCH3 O O O O O Aflatoxin B1 Aflatoxin M2 OH OCH3 O O O O O Aflatoxin B2 O O O O O OCH3 Aflatoxin M1 OH OCH3 O O O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin G1 O O O O OCH3 O O Aflatoxin G2 Công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các trao đổi chất liên quan đến aflatoxin B1 và G1 và aflatoxin B2 và G2 là dẫn xuất của dihydro của các hợp chất mẹ. Các aflatoxin M1và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hoá của B1, B2 phải theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo như sau: Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hoá lý cho việc phát hiện và định lượng. Nồng độ aflatoxin M1 0,02mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng. Các aflatoxin được hoà tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom và metanol và đặc biệt ở dimethylsulfoit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thực nghiệm). Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10-20mg/l. Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong không khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hoà tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh. Các aflatoxin ít hoặc không bị phá huỷ dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên lạc rang đã giảm đặc biệt lượng các aflatoxin và nó có thể bị phá huỷ hoàn toàn bằng việc xử lý mạnh bằng amoniac hay hypochlorit. Claude Moneau và cộng sự [15] khi nghiên cứu tính chất của aflatoxin đã đưa ra những kết quả sau: Bảng 1: Tính chất hoá lý của các aflatoxin. AFLATOXIN Các điểm nóng chảy Huỳnh quang * ** B1 268- 269 265- 270 252- 266 Xanh lam B2 268- 289 305- 309 280- 283 Xanh lam G1 244- 246 247- 250 246- 247 Xanh lục G2 229- 231 237- 240 Xanh lục M1 299 Xanh tím M2 293 Tím Ghi chú: * Kết quả của Joun send ** Kết quả của Stub bjield Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thuỷ phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng aflatoxin của các sản phẩm, mặc dầu sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả. Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hoá sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu [51]. 2.3.2. Các phương pháp phân tích: 2.3.2.1. Các phương pháp sinh học: Phương pháp thử sinh học dùng vịt con một ngày tuổi để xác định sự có mặt của aflatoxin nghi ngờ trong thực phẩm. Phương pháp thử trên bào thai gà với liều 0,1 - 0,2 μg aflatoxin B1 được áp dụng vào màng trứng. Vận tốc gây chết được ghi lại trong thời gian 23 ngày cấy vào trứng. Một vài phương pháp thử sinh học khác đã được triển khai như dùng vi khuẩn, tôm biển để thử. Những mô tả chi tiết có thể tìm thấy trong báo cáo Goldlatt và Ciegler và cộng sự [34]. 2.3.2.2. Phương pháp hoá học: Mặc dù các quy trình luôn luôn thay đổi, nhưng các bước cơ bản vẫn giữ nguyên, bao gồm: chiết xuất, loại trừ mỡ, làm sạch, phân tích và định lượng. Sự phối hợp các kỹ thuật chiết xuất lỏng và sắc ký dẫn đến phương pháp ngày nay được sử dụng rộng rãi nhất được biết như phương pháp CB (Contamination Branch) của Eppley [30]. Phương pháp BF (Best Foods) nhanh và kinh tế hơn, nhưng làm sạch kém hơn cũng đã được triển khai. Việc định tính và định lượng các aflatoxin có thể thực hiện bằng kỹ thuật sắc kí bản mỏng, sắc kí lỏng hiệu cao năng (HPLC) và ELISA. 2.3.3. Sự tạo aflatoxin do các nấm mốc: Khả năng tạo aflatoxin thường được thấy ở hai chủng của hai loài Aspergillus flavus Link và A.parasiticus speare. Trong những năm gần đây người ta đã phát hiện khả năng tạo aflatoxin ở A.nomimus. Các chủng tạo ra aflatoxin của Aspergillus flavus là rất phổ biến và thường được phân lập từ các nguyên liệu khác nhau. Bảng 2 cho thấy tỷ lệ cao (từ 20% đến 98%) các chủng phân lập của Aspergillus flavus có khả năng tạo aflatoxin. Các nghiên cứu sâu hơn trong những điều kiện khống chế chính xác cho thấy độ ẩm ở cân bằng với độ ẳm tương đối 85% (hay hoạt tính nước aw = 0,85) là giới hạn dưới của sự phát triển của Aspergillus flavus ở tinh bột , các loại hạt [49]. Bảng 2: Các chủng tạo aflatoxin của Aspergillus flavus phân lập từ bốn loại hạt cốc: Nguồn Số chủng phân lập Phần trăm chủng phân lập tạo aflatoxin (%) Sản lượng tạo aflatoxin cực đại (μg/Kg) Lạc 100 98 3.300 Hạt bông 59 81 3.200 Gạo 127 20 1.100 Lúa 63 24 3.300 ( Số liệu của Schroder và Boller 1976) Các nhiệt độ cực tiểu tối thích và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 120-270C và 400 - 420C theo thứ tự. Northolt đã nghiên cứu tác dụng của hoạt tính nước và nhiệt độ lên sự phát triển và sự tạo aflatoxin của A.parasiticus và đi đến kết luận rằng các lượng không thể phát hiện được của aflatoxin B1 đã được tạo ở giá trị aw dưới 0,83 và nhiệt độ dưới 100C [43]. 2.3.4. Sự nhiễm aflatoxin ở các ngũ cốc ở ngoài đồng: Lạc có thể bị nhiễm Aspergillus flavus trước thu hoạch nhưng dễ bị nhiễm nhanh hơn sau khi cây lạc được nhổ lên và làm khô sơ bộ trước khi củ lạc được lấy ra khỏi cây. Thời gian sau thu hoạch là thời gian nhiễm độc cao đối với sự tạo aflatoxin. Các côn trùng gây thương tổn cho hạt cũng là yếu tố đối với sự nhiễm Aspergillus flavus. Sự gây thương tổn cho côn trùng cho ngô ở ngoài đồng cũng có thể đi kèm hoạc tiếp theo sự nhiễm Aspergillus flavus và sự tạo aflatoxin trước thu hoạch. Aflatoxin cũng nhiễm nặng trên bông lúa mạch ở ấn độ [51]. 2.3.5. Sự nhiễm aflatoxin trong thực phẩm: Mặc dầu các aflatoxin đã được tìm thấy ở các thực phẩm khác nhau, nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung ở lạc và các hạt có dầu khác, bao gồm hạt bông, ngô, hạt giẻ Braxin. Các điều tra của Mỹ với trên 1500 mẫu ngô thu hoạch ở vụ mùa của các năm 1969-1970, chủ yếu từ các nguồn thương mại, đã cho thấy rằng từ 2-3% mẫu nhiễm aflatoxin B1 và G1 ở khoảng từ 3-37 μg/Kg. Trong nghiên cứu tiếp theo 60 mẫu từ đông - nam của Mỹ aflatoxin B1 đã tìm thấy trong 21 mẫu ở mức từ 6-308 μg/Kg ở thời kỳ 1969-1970. ở một số bang đông nam của mỹ, aflatoxin đã nhiễm với tần số cao ở ngô ngoài đồng. ở một số mẫu ngoài đồng, mức nhiễm aflatoxin B1 dao động từ vài nghìn μg/Kg hay cao hơn. hầu hết sự nhiễm ở ngoài đồng đã liên quan đến tổn thất gây lên do côn trùng. ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1(mức trung bình 400 μg/Kg), trong khi 40% nhiễm aflatoxin B1(mức trung bình 133 μg/Kg) đã tìm thấy ở Uganda và 97% ở đảo Sebu ở Philippin , trung bình là 213 μg/Kg. Hàm lượng aflatoxin ở các mẫu ngô ở gia đình đã liên quan đến sự bùng nổ của bệnh gan độc tố gây cấp tính ở tây - bắc của ấn độ [48]. Theo Goto và công sự [33] -85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa năm 1984-1985 ở Thái Lan đã nhiễm aflatoxin B1 với lượng 6,30-1310 ppb và 0,6-767 ppb, theo thứ tự. ở Việt Nam Nguyễn Phùng Tiến [18] cũng đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên ngô và đã cho thấy trên 38 mẫu bảo quản trong kho lương thực của thị xã Thanh Hoá của tỉnh Thanh Hoá đã nhiễm các nấm mốc thuộc các chi sau: Aspergillus, Penicillium, Rhiopus, Cladosporium, Sporotrichum, Mucor, Saccharomyces, Trichoderma, Geotrichum. Tuy nhiên chưa có số liệu về việc nghiên cứu mức nhiễm các mycotoxin trên ngô trong công trình nghiên cứu này. Đậu Ngọc Hào và các cộng sự [7;9] đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hoá. Kết quả phân tích của 24 mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột cho thấy các mẫu này đã nhiễm A.flavus với tần số cao, từ 50-80%. Các loài khác như A.glacus, A.fumigatus và A.candidus cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Loài A.ochraceus đã phát hiện thấy ở tỷ lệ thấp. Các loài của chi Fusarium đã nhiễm với tần xuất là 15%. Kết quả nghiên cứu mức nhiễm aflatoxin những mẫu ngô trên đã cho thấy là 33% số mẫu ngô hạt đã nhiễm aflatoxin B1 từ 10 - 40ppb, 8,3% số mẫu nhiễm aflatoxin B2 từ 10-20ppb, 72% số mẫu ngô bột đã nhiêm aflatoxin B1 từ 25-250ppb, 9,5% số mẫu ngô nhiêm aflatoxin B2 từ 10 - 20ppb (kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thuỳ Châu). 2.3.6. Độc tính của aflatoxin. 2.3.6.1. Tác động lên tế bào: Khả năng gây ung thư của các aflatoxin đã được Wogan nghiên cứu [51] và được IARC đánh giá lại [50]. ở mức độ tế bào việc cho uống aflatoxin với liều khác nhau đã nhanh chóng ức chế rõ ràng enzym AND và ARN polymeraza ở gan, các đáp ứng tương tự đã được quan sát ở việc nuôi cấy các tế bào người và động vật. Quá trình sinh tổng hợp protein cũng bị hỏng, đặc biệt trong điều kiện khi mà quá trình sinh tổng hợp chịu ảnh hưởng mạnh bằng sự biến đổi quá trình sinh tổng hợp ARN thông tin. Dường như là sự ức chế polymeraza là hậu quả gián tiếp của hoạt tính mẫu bị hỏng của nhiêm sắc thể, do tương tác giữa nhiêm sắc thể - toxin. Sự tương tác giữa aflatoxin hay một số các dẫn xuất của nó với ARN hay thành phần khác của nhiễm sắc thể là sự nhận xét như sự việc ban đầu ở hàng loạt quan sát của các phản ứng. Bằng chứng khác sự tác động của aflatoxin lên lưới nội bào (Endoplasmicreticulum) và do đó thay đổi sự gắn polysome vào màng tế bào chất. Krustev và các cộng sự [9] đã nghiên cứu những biến đổi về mặt siêu cấu trúc và hình thái bệnh học của mô gan của chuột đực liên quan đến tác dụng của liều đơn độc aflatoxin B1 [40]. Với liều nhiễm 6 μg aflatoxin B1/100g trọng lượng cơ thể trên con chuột đực, những biến đổi về mặt hình thái của tế bào gan được đặc trưng bởi sự phân ly của các thành phần hạt và sợi của nhân, sự vón nhiễm sắc thể ở ngoại biên của nhân, một vài sự biến dạng của màng nhân, làm giảm khoảng không xung quang nhân và các giọt mỡ nhỏ ở một vài nhân. Lưới nội bào xung quang nhân ít được nhìn thấy và mất sự tạo hạt của các ribosome của chúng. Từ các bộ phận khác, đặc biệt lý thú là các lysome, rất nhiều, không chỉ ở các tế bào gan mà còn ở các tế bào Kupfer. Hoạt tính photphataza axit cũng giảm rõ rệt.[40]. 2.3.6.2 Tác động lên động vật: - Tác dụng cấp tính: Ciogles-1974 đã tiến hành thí nghiệm so sánh LD%) của aflatoxin đối với từng loại gia súc. Thỏ 0,3-0,5mg/1kg thể trọng Vịt 0,4-0,6 Lợn 0,6 Cừu 1,0-2,0 Gà 6-16 Chuột bạch đực 7,0 Chuột bạch cái 18,0 Ngộ độc cấp tính aflatoxin phụ thuộc vào lứa tuổi (gia súc non thường nhạy cảm hơn so với gia súc trưỏng thành), giới tính (chuột bạch đực nhạy cảm hơn so với chuột bạch cái), loài gia súc, đường aflatoxin xâm nhập vào cơ thể, tình trạng sức khoẻ, thành phần dinh dưỡng thức ăn, môi trường sống… Các aflatoxin khác nhau độc tính gây ngộ độc cũng khác nhau. -Tác dụng mãn tính Ngộ độc mãn tính aflatoxin B1 thường gây ra những tổn thưuơng ở gan và một số cơ quan khác. Chỉ cần một lượng nhỏ aflatoxin 250-500ppb trong thức ăn là gia cầm đã nhạy cảm với bệnh truyền nhiễm. Khi nhiễm aflatoxin thường làm giảm sức đề kháng của động vật và người, làm giảm lượng sữa (ở bò lượng sữa giảm 93%). Một số loài mẫn cảm với aflatoxin như chuột, vịt, cá khi bị nhiêm độc mãn tính thưòng dẫn đến ung thư, gây quái thai. - Gây tổn thương gan. Aflatoxin tồn tại trong cơ thể tuỳ thuộc mức độ đồng hoá, dị hoá nhanh hay chậm của cơ thể mà quyết định vị trí tổn thương tại các tiểu thuỳ gan. - Mức độ ảnh hưởng có liên quan đến quá trình chuyển hoá từ aflatoxin thành aflatoxicol tại gan. Bảng 3: Lượng aflatoxin và tổn thương gan Loài động vật Lượng aflatoxin trong thức ăn (ppb) Vùng tổn thương gan Vịt 30 Gà 500 Vùng rìa tiểu thuỳ Gà tây 300 Lợn 800 Vùng trung tâm Bò sữa 2300 Vùng trung tâm tiểu thuỳ Chuột 4500 - Gây ung thư Lancaster và cộng sự (1961) đã tiến hành gây ung thư gan cho chuột, nhờ bổ xung thức ăn nhiễm nấm mốc hoặc thức ăn nhiễm aflatoxin B1. Ngoài Gây ung thư Lancaster và cộng sự (1961) đã tiến hành sau ung thư gan cho chuột, nhờ bổ sung thức ăn nhiễm aflatoxin B1. Ngoài ra bổ sung bằng khô lạc nhiễm Aspergillus flavus cũng gây được ung thư cho chuột. Theo Wogan (1977) [50] thì độc tính gây ung thư của aflatoxin ở các loài khác nhau thì khác nhau. Bảng 4: Độc tính gây ung thư của aflatoxin ở các loài động vật khác nhau Loài Liều aflatoxin (mg/kgtA) Thời gian theo dõi (tháng) Tỷ lệ ung thư Tỷ lệ % Vịt 300/kg TA 14 tháng 8/11 72 Thỏ 100-800 toàn bộ 24 3/42 Chuột bạch 100/kg TA 14-22 28/28 100 Chuột 150/kg TA 20 0/60 0 Cá hương 8/kg TA 12 27/66 Theo Wogan và Newberme (1988) với liều 0.015ppm trong thức ăn đã gây tỷ lệ ung thư cao cho chuột bạch. Nếu bổ sung 0,4mg aflatoxin B1 vào thức ăn mỗi ngày và kéo dài trong 24 tuần sau đó nghỉ 82 tuần thì vẫn phát hiện thấy nhiều u gan ở chuột lang. Bảng 5: Mối quan hệ giữa tỷ lệ ung thư của chuột lang với lượng và thời gian lây nhiễm aflatoxin: Hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn(mg/kgta) Thời gian nhiễm (ngày) Tần số có u gan 5,0 370 14/15 3,5 340 11/15 3,5 325 7/10 1,0 294 5/9 1,0 323 8/15 0,2 360 2/10 0,2 361 2/10 0,005 380 0/10 - Tính gây quái thai: Những thí nghiệm của Elis và Dipaolo (1976) đã chứng minh rằng việc tiêm aflatoxin B1 vào chuột theo đường ổ bụng với liều 4mg/kg thể trọng gây cho thai chuột bị tật hoặc bị chết. - Tính gây đột biến: Aflatoxin B1 gây ra sự khác thường ở nhiễm sắc thể: Các đoạn nhiễm sắc thể có các cầu nối ở đôi chỗ, các cầu cromatit, sự đứt đoạn cromatit, sự đứt đoạn AND ở các tế bào động vật và thực vật (Ong,1975). Aflatoxin gây đột biến gen ở các vi khuẩn nghiên cứu, khi hoạt hoá bằng các chế phẩm Microsom từ gan chuột và từ gan người(Wong và Hsiter, 1976). Tuy nhiên không quan sát thấy tác dụng gây đột biến ở chuột cái bị nhiễm aflatoxin theo đường ổ bụng với liều 5mg/Kg thể trọng (Leonard và CS, 1975). 2.3.6.3. Tác động ở người Nhiều nghiên cứu về các vùng dân cư ở các nước khác nhau trên thế giới cho thấy: Các nồng độ aflatoxin thực tế ở thức ăn có liên quan đến tai biến ung thư gan ở những vùng đó. Bảng 6: Mối quan hệ tỷ lệ ung thư gan với sự hấp thụ aflatoxin vào trong cơ thể. Vùng Tỷ lệ ung thư gan (tỷ lệ người chết/105 người) Aflatoxin nhận vào (mg/kg người/ngày) Kenya – Vùng cao 0,7 3,5 Kenya – Vùng thấp 4,2 10,0 Songkhla – Thái Lan 2,0 5,0 Thụy sỹ 2,2 5,1 Ratbur – Thái Lan 6,0 45,0 Mozambique 13,0 222,4 Ba trẻ em ở Đài Loan và một trẻ em ở Uganda đã bị hoại tử gan cấp tính liên quan đến việc ăn phải gạo và sắn nhiễm aflatoxin ở liều 200 μg/kg và 1700 μg/kg là bằng chứng thuyết phục nhất và liên quan giữa aflatoxin với bệnh gan cấp tính. ở vùng tây bắc ấn Độ năm 1974, trong một vụ dịch vài trăm dân làng đã ăn ngô bị nhiễm aflatoxin ở mức 15 μg/kg có dấu hiệu ngộ độc và trên 100 người đã bị chết. Nói chung các chất này tác động lên gan theo trình tự như sau: đầu tiên là hoại tử nhu mô gan, tăng sinh biểu mô, sau đó là xâm nhiễm tế bào lympho để nhằm chống đỡ tạm thời, rồi tiến đến sơ gan, nếu thời gian kéo dài sẽ ddẫntới ung thư gan. Nhưng bản chất aflatoxin không gây ung thư mà do nó gắn vào một enzym dẫn đến ung thư, khả năng này phụ thuộc vào sự tồn tại của nhân dihydrouran và phần 5 lacton chứa nó, do đó nó đổi phần tận cùng difuran quan trọng trong tính độc và tính gây độc. Chính vì vậy mà aflatoxin B1 bao giờ cũng gây ung thư mạnh hơn B2 và G2 (do B2 không có nối đôi nên kém độc hơn). 2.3.7. Giới hạn aflatoxin cho phép sử dụng: Giới hạn aflatoxin hiện thời thiết lập bởi cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc (μg/kg,ppb) (Park 1992a) (FDA) [3]. Các thực phẩm cho người, trừ sữa 20 Sữa 0,5 Các thức ăn gia súc (Trừ các loại liệt kê dưới đây) 20 Thức ăn từ bột bông (dùng cho bò trưỏng thành, lợn và các khẩu phần thức ăn của gia súc) 100 Ngô cho lợn sắp thịt (finislin swine) 100 Ngô cho thức ăn gia súc của trâu bò thịt 100 2.4. Vấn đề khử nhiễm các mycotoxin: Sự ô nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc có thể gây nguy hiểm đến sức khoẻ của con người và động vật, các nhà khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá huỷ các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Phương pháp giải quyết tốt nhất để kiềm chế aflatoxin là phòng ngừa. Tuy nhiên sự nhiễm aflatoxin đôi khi là không thể tránh được, và nếu sự phòng ngừa thất bại, những phương pháp khác phải được xem xét tới. Các kỹ thuật dùng để khử aflatoxin trong các mặt hàng khác nhau bao gồm loại trừ bằng phương pháp vật lý hay sinh học và hoá học. 2.4.1. Vấn đề phòng ngừa: ở thuật ngữ rộng, vấn đề phòng ngừa sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin có thể là đưa ra những biện pháp kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây hại. Đáng tiếc là những biện pháp như vậy là rất khó thực hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào điều kiện khí hậu và các thay đổi cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Các thực nghiệm với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông nghiệp về sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một thực tiễn là sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là không thể tránh được. 2.4.2. Giảm hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sinh học: Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong các nguyên liệu tự nhiễm tự nhiên như: chlorin, ozon, axit hydrochloric … Đáng tiếc, các hoá chất này mặc dầu chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Do vậy, việc sử dụng các chủng không có hại cho con người và thực phẩm mà lại có khả năng giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Những nghiên cứu để xác định các chủng đối kháng với các chi nấm mốc Aspergillus, Fusarium, Rhizoctonia, Alternaria, Claviceps…đã và đang tiếp tục trong nhiều năm. Biện pháp phòng trừ nấm mốc độc bằng các chủng đối kháng căn cứ vào những đặc điểm di truyền học (trao đổi chất, tự phân đôi nhân, đột biến, tiết enzym có tác dụng thuỷ phân …) tính cạnh tranh sinh thái (nguồn dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm …) Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thì ngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực phẩm được xử lý, đôi khi cần phải thoả mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn với Stretoroccus lactis đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt, nên không thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm. Gần đây các nhà khoa học đã tìm thấy một số chủng B.subtilis sản sinh iturin A. Iturin A có khả năng ức chế rất mạnh mẽ sự phát triển của các nấm sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin của chúng. Do vậy, người ta sử dụng iturin A trong việc ngăn chặn aflatoxin trên ngũ cốc và các loại hạt. Các nhà khoa học ở Nhật Bản đã tìm ra một số chủng B.subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin của chúng. Các nhà khoa học ở Thái Lan cũng tìm ra 32 chủng vi khuẩn và 7 chủng nấm men được phân lập từ ngô và đất trồng ngô có hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin. Sự cộng sinh của các loài nấm khác (Aspegillus flavus, Aspergillus niger, Tricoderma, Rhizotonia … không sinh độc tố) cũng kìm hãm sự phát triển và khả năng tạo độc tố của nấm mốc Aspergillus flavus [38]. Các giải pháp về di truyền học ._.