SỬ DỤNG ENZYME BROMELAIN-KHÓM ĐỂ ỨC CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME PECTINMETYLESTERASE TRONG NƯỚC ÉP TRÁI BƯỞI

trái bưởi” do Phan Thị Xuân Huyên thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện Lý Nguyễn Bình Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2008 Chủ tịch hội đồng LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến: Thầy Lý Nguyễn Bình đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Và thầy Lê Thanh Hùng phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn cùng toàn thể các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 29 đã tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ TÓM TẮT Trong công nghiệp chế biến nước quả đục sự hiện diện của enzyme pectinmetylesterase là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Do vậy việc tìm ra các biện pháp để ức chế hoạt tính của pectinmetylesterase luôn được các nhà khoa học thực phẩm tìm tòi. Một trong các biện pháp hữu hiệu để ức chế hoạt tính của enzyme pectinmetylesterase là sử dụng enzyme protease (bromelain khóm). Đề tài này với mục đích là tìm ra quy luật hoạt động của enzyme bromelain khóm ở các điều kiện xử lý pH (4,6-6,4), nhiệt độ (35-600C), nồng độ enzyme bromelain (0-0,008%) và thời gian thủy phân (0-20 phút). Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính còn lại của PME thấp nhất ở điều kiện: • pH 4,6-5,8 và nhiệt độ từ 50-600C • Tỷ lệ enzyme bromelain khóm 0,002-0,006%, thời gian thủy phân 15-20 phút và 0,008% enzyme bromelain khóm, thời gian thủy phân 10-20 phút Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng i Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ MỤC LỤC TÓM TẮT...................................................................................................................................i MỤC LỤC .................................................................................................................................ii DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG...............................................................................................................iv CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU.........................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................................1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.....................................................................................2 2.1 Giới thiệu về bưởi ............................................................................................................2 2.1.1 Nguồn gốc.................................................................................................................2 2.1.2 Thành phần................................................................................................................2 2.1.3 Dược tính của bưởi ...................................................................................................3 2.1.4 Enzyme pectinmethylesterase...................................................................................4 2.2 Khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase .........................................6 2.3 Giới thiệu enzyme bromelain...........................................................................................7 2.3.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu ..............................................................................7 2.3.2 Enzyme bromelain ....................................................................................................8 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.....................................16 3.1 Phương tiện nghiên cứu .................................................................................................16 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu...........................................................................16 3.1.2 Nguyên liệu.............................................................................................................16 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm................................................................................................16 3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...............................................................................16 3.2 Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................................17 3.2.1 Nội dung nghiên cứu...............................................................................................17 3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu.....................................................................................17 3.2.3 Bố trí thí nghiệm .....................................................................................................17 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN...................................................................................21 4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và pH đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase (PME) của enzyme bromelain khóm ...............................................................................................21 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase (PME).........................................22 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................25 5.1 Kết luận..........................................................................................................................25 5.2 Đề nghị...........................................................................................................................25 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................26 PHỤ LỤC..................................................................................................................................iv Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cơ chế phân cắt của pectinesterase.............................................................................. 4 Hình 2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của bromelain ...................... 11 Hình 3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của bromelain .............................. 12 Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng............................................... 13 Hình 5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu nước bưởi ...................................................................................17 Hình 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase..................... 21 Hình 7: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase............................. 22 Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase .......... 22 Hình 9: Ảnh hưởng của % enzyme bromelain khóm lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase ..................................................................................................................24 Hình 10: Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase................. 24 Hình 11: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain khóm và thời gian thủy phân lên hoạt tính còn lại của pectinmetylesterase ....................................................................................... 25 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của bưởi trong 100 g phần ăn được.......................................2 Bảng 2: Hàm lượng khoáng chất của bưởi so với một số trái cây có múi khác (ppm)..............2 Bảng 3: Hàm lượng vitamin của bưởi so với một số trái cây có muối khác (ppm)...................3 Bảng 4: Thành phần pectin trong một số loại trái cây ...............................................................5 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trồng cây ăn trái với sản lượng lớn nhất nước ta. Sản lượng trái cây ở đây không chỉ đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước mà còn đáp ứng yêu cầu xuất khẩu. Hầu hết các loại trái cây được tiêu thụ ở dạng tươi, cho nên hư hỏng trong bảo quản là rất nhiều. Ngoài ra, vào mùa thu hoạch chính luôn xảy ra tình trạng trái cây rớt giá. Điều này đã đặt ra cho các nhà chế biến là phải tận dụng được nguồn nguyên liệu trong thời điểm này để chế biến ra các loại nước trái cây phục vụ cho người tiêu dùng vào lúc nguồn nguyên liệu trái mùa, cũng như giúp nhà vườn tránh được tình trạng nguyên liệu tồn đọng khó tiêu thụ. Cũng như các sản phẩm nước ép trái cây khác, nước bưởi ép được tiêu thụ trên thị trường gồm có nước quả trong và nước quả đục. Vấn đề đặt ra ở đây là đối với nước quả đục trong thời gian bảo quan chờ tiêu thụ xảy ra tình trạng là sự mất đi đặc tính đục trong dịch ép do sự hiện diện của pectinmetylesterase. Pectinmetylesterase của quả sẽ cắt các pectin tạo thành pectate, nó phản ứng với canxi của môi trường để tạo nên canxi pectate không hòa tan, gây đục cho sản phẩm. Để tránh tạo thành gel pectate, vấn đề đặt ra là phải ức chế hoạt động của enzyme này . Để làm đa dạng sản phẩm nước ép trái cây các nhà khoa học thực phẩm đã đưa ra những biện pháp để có thể ức chế được hoạt động của pectinmetylseterase. Phương pháp xử lý nhiệt được sử dụng từ trước tới nay nhưng nó có khuyết điểm là mùi vị sản phẩm không còn hấp dẫn, sự giảm sút về dinh dưỡng. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghệ enzyme, chúng ta có thể sử dụng enzyme để ức chế hoạt động của pectinmetylseterase. Việc sử dụng enzyme sẽ không ảnh hưởng tới giá trị cảm quan và dinh dưỡng cho sản phẩm nước bưởi. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain. Từ đó tìm ra những điều kiện tốt nhất mà bromelain có thể ức chế được hoạt động của enzyme pectinmetylesterase một cách hiệu quả nhất. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bưởi 2.1.1 Nguồn gốc Theo nhiều tài liệu, bưởi có nguồn gốc từ Đông Nam Á, quần đảo Mã Lai , sau này lan dần sang Châu Á và đến Châu Úc. Bưởi được xem như là giống cây quan trọng ở Đông Nam Á. Cây cao từ 5-15m, thường có gai lớn (nhất là trồng hột), nhánh non có lông tơ, bưởi chịu được cả nhiệt độ cao và cả nhiệt độ thấp, giống này có khả năng phát triển ở những vùng đất thấp hay khô hạn. Ở Việt Nam, bưởi được trồng nhiều ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long với nhiều giống với các tên gọi khác nhau. Bưởi da xanh được trồng nhiều ở tỉnh Bến Tre. Giống ưởi này được biết đến trong vài năm gần đây nhờ phẩm chất thơm ngon, trái hình cầu, nặng khoảng 1,1 kg, có màu từ hồng đến đỏ không đều, bó khá chặt, nước quả khá ngọt (Brix=9,5-12%), tỷ lệ thịt quả trên 55%, có vị thơm và rất ngon. Giống như cam, quýt, bưởi được sử dụng rộng rãi vì có chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể nhất là vitamin C. Vị chua nhẹ và hơi đắng của bưởi giúp dễ tiêu hóa và tuần hoàn máu. Trái bưởi được chế biến thành nhiều loại sản phẩm: nước giải khát, xyrô, mứt, rượu… 2.1.2 Thành phần Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của bưởi trong 100 g phần ăn được Nước (g) 91.38 P (mg/100g) 9 Tro (g) 0,29 Fe (mg/100g) 0,12 Protein (g) 0,55 Mg (mg/100g) 8 Carbonhydrate (g) 7.68 K (mg/100g) 129 Chất xơ (g) 0,7 B2(mg/100g) 0,02 Năng lượng (kj) 126 P.P (mg/100g) 0,1 Ca (mg/100g) 11 C (mg/100g) 38.1 (6) Bảng 2: Hàm lượng khoáng chất của bưởi so với một số trái cây khác (ppm) Trái cây Canxi Phospho Magie Kali Bưởi 170 160 100 2000 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Táo 100 130 100 1500 Chuối 100 300 300 4000 Sơ ri 200 300 150 2500 Chanh 80 100 70 1400 Cam 350 300 130 1400 Khóm 110 100 150 2500 (5 ) Bảng 3: Hàm lượng vitamin của bưởi so với một số trái cây khác (ppm) Trái cây Vitamin A Vitamin B1 Vitamin B2 Vitamin C Bưởi 2 0,5 0,2 400 Táo 0,5 0,3 0,2 100 Chuối 2 0,5 0,6 100 Sơ ri 2 0,4 0,7 2000 Chanh 2 0,4 0,2 500 Cam 1 0,9 0,4 500 Khóm 0,3 0,8 0,4 200 (5 ) 2.1.3 Dược tính của bưởi Nước khoáng trong bưởi chứa hàm lượng vitamin C cao Vitamin C có khả năng phòng chống ung thư Vitamin C có khả năng phòng chống các bệnh tim mạch (4). Nước bưởi giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường Theo y học hiện đại, nước bưởi có chứa thành phần tựa như insulin, giúp hạ đường huyết, có tác dụng hỗ trợ đối với bệnh nhân tiểu đường, cao huyết áp (7). Ăn bưởi đều đặn sẽ giúp giảm cân và phòng chống thư Một hoặc hai quả bưởi mỗi ngày, cùng với một khẩu phần ăn khoa học, có thể giúp bạn giảm cân. Nó cũng giúp làm giảm nguy cơ ung thư ở những người hút thuốc nhờ tác dụng khống chế hoạt động của chất sinh ung thư trong khói thuốc (8). Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4 Ăn bưởi làm giảm cholesterol Trong bưởi có pectin, chất sợi hòa tan có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu, giảm chất béo thâm nhập vào cơ thể. Theo nghiên cứu trên những người có lượng cholesterol trong máu cao, việc ăn thường xuyên 15 g pectin trong bưởi trong thời gian 4 tháng giúp giảm cholesterol trung bình 8%, trong một vài trường hợp cá biệt giảm đến 20% (9). Giảm tai biến tim mạch Hesperidin và naringin là hai chất flavonoid có trong bưởi giúp bảo vệ tính đàn hồi của mạch máu, ngừa xơ cứng động mạch, gián tiếp chống cao huyết áp và tai biến mạch máu não. Acid galacturonique trong bưởi tác động đặc biệt lên cholesterol xấu, một trong những yếu tố tạo nên mảng xơ vữa thành mạch làm giảm độ đàn hồi của động mạch. Chính tác động này có tác dụng săn đuổi và loại bỏ sự tích tụ cholesterol, đồng thời làm sạch các mạch máu (9). 2.1.4 Enzyme pectinmetylesterase Pectinmetylesterase (PME) còn có tên là Pectinesterase hay pectin-pectinhydrolase (EC 3.1.1.11), là enzyme xúc tác thủy phân của các nhóm methyl ester của các gốc galacturonase nằm kề đơn vị không bị ester hóa. Tức là phân cắt các nhóm methoxyl (- COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do. PME 2H2O Hình 1: Cơ chế phân cắt của pectinmethylesterase Cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan: các gốc bị acetyl hóa, các nhóm ester bị chuyển đổi thành amid hay bị khử đến rượu bậc một hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh sẽ ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase (PME). Polygalacturonic acid cũng là chất ức chế cạnh tranh của PME (3). Tốc độ để ester hóa trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch. Đối với pectinmetylesterase có nguồn gốc từ thực vật tấn công hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn. Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Bảng 4: Thành phần pectin trong một số loại trái cây Trái cây Pectin (% w/w) Loại pectinase pH Táo 0,7-0,8 PE-PG 3,5 Chuối 0,5-0,6 PE-PG - Sơ ri 0,2-0,3 PE 3 Bưởi 1,3-1,6 PE 3,2 Cam 0,6-0,9 PE 2,2 (5 ) Cà chua chứa ít nhất 2 loại PME: PME1 và PME2. PME1 giảm vào giai đoạn chín nhưng PME2 tích lũy dần cho đến khi trái có màu đặc trưng của trái chín. PME có khối lượng 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở nồng độ 0,005M và 0,05M theo thứ tự. Pectinesterase (PE) của đậu nành là protein có khối lượng 33kD, hoạt động ở pH tối ưu gần bằng 8. Chuối có hai loại pectinesterase (PE). Cả hai cùng có khối lượng phân tử là 30kD, nhưng điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3; pH tối thích là 7,5. Hoạt độ của hai enzyme này tăng khi thêm vào dung dịch NaCl 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose, và galactose. PE trong quả cam (cũng như các quả họ citrus khác) có hai loại: PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,5 và ≥11, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 = 7,6, còn PE2 = 8,0 (3). Sự có mặt của PE trong trái cây họ citrus là nguyên nhân gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công nghệ thực phẩm, tức là sự mất đi của các vết vẩn đục trong dịch ép. Nếu PE không bị ức chế trực tiếp sau khi chiết tách dịch quả bằng cách bất hoạt bởi nhiệt hay lạnh đông, các phân tử pectin sẽ bị đề ester hóa và sẽ bị đông tụ bởi sự có mặt của ion Ca2+ trong dịch ép. Để ngăn chặn điều này, nước ép phải được tách phần cặn và phần trong. Nếu nước ép quá đặc, gel pectate hình thành và do đó nước ép sẽ không được hoàn nguyên trở lại. Những vấn đề này làm giảm chất lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng. Các chất tạo hương của nước ép trái cây họ citrus cực kỳ mẫn cảm với nhiệt. Các phương pháp sản xuất trái cây đông lạnh được thực hiện. Polyphenol có thể ức chế được hoạt động của PE nhưng lại gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan (vị và tính đồng nhất của sản phẩm. PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối, nhưng nếu thêm pectic acid vào lại làm cho nước ép bị phân lớp. Việc thêm các exo-enzyme : PG (polygalactorunase) làm phân hủy pectin có mức ester hóa thấp hình thành trước khi đông tụ với Ca2+ xảy ra, hay PL ( pectin liase) phân Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ hủy pectin trong nước ép trái cây đến sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn, là các hợp chất không mẫn cảm với Ca2+, dù là đề ester hóa nhưng thực chất cũng đã thực hiện chức năng ức chế hoạt động của enzyme PE. Vấn đề đặt ra là nước ép được cho bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hóa quá trình xử lý nhiệt và khôi phục hương vị cho sản phẩm, kết hợp với điều kiện bảo quản đông lạnh và vận chuyển nhanh nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bị bất hoạt do tác động của nhiệt độ.Tuy nhiên, đối với các nước đang phát triển, vân đang tồn tại vấn đề này trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus có hoạt lực PE cao (3). 2.2 Khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase Để ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase bằng các phương pháp nói trên là điều khó thực hiện với điều kiện ở nước ta. PME có bản chất là một protein nên nó dễ bị biến tính bởi nhiệt độ cao và cũng bị enzyme protease cắt đứt liên kết peptide. Việc sử dụng nhiệt độ cao để ức chế hoạt động của enzyme này thường được áp dụng ở các nước đang phát triển. Còn việc sử dụng enzyme protease được xem như là một phát hiện mới dựa trên việc protease sẽ cắt đứt mạch pepetide của PME, cũng đồng nghĩa với việc sẽ ức chế được hoạt động của enzyme PME Sử dụng enzyme protease Sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác: Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa. Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein. Cơ chế thủy phân như sau: Endopeptidase HO H HO H NH2-CH-CO-NHCH….NHCHCO-NHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOH R1 R2 R3 R4 R5 R6 Aminopeptidase HO H Carboxy peptidase Exopeptidase (3) Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Thường protease trong cơ thể tồn tại dạng không hoạt động (zymogen) và có thể chuyển thành dạng hoạt động do chính enzyme protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó.Khi đó sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho các hoạt động khác, enzyme chuyển sang trạng thái họat động. Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein mà người ta chia protease ra làm 2 nhóm: Endopeptidase phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành các polypeptide mạch ngắn, peptone… Exopeptidase (polypeptidase) phân cắt liên kết peptide ở 2 đầu mạch Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease mà người ta chia nhóm: Protease acid: hoạt động ở pH acid Protease kiềm: hoạt động ở vùng pH kiềm Protease trung tính hoạt động ở vùng pH trung tính. Có nhiều loại enzyme protease có thể ức chế hoạt động của PE. Nhưng do đặc thù của sản phẩm nước bưởi là pH thấp, không chịu được nhiệt độ cao, cũng như vấn đề về nguồn ezyme và các vấn đề về kinh tế, kỹ thuật khác nên nghiên cứu này quyết định sử dụng enzyme bromelain để tiến hành thí nghiệm. 2.3 Giới thiệu enzyme bromelain 2.3.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu Khóm là một loại nông sản vô cùng quan trọng, chỉ đứng thứ hai - sau chuối và đóng góp hơn 20% tổng sản lượng trái cây ở các nước nhiệt đới. Các nhà khoa học cho rằng nguồn gốc ban đầu của khóm là ở lưu vực sông Amazon với Brazil và Paraguay là hai nước thuần hoá được giống khóm đầu tiên. Khóm được sản xuất một cách rộng rãi trên toàn thế giới vào những năm 1500 khi nó bắt đầu du nhập sang châu Âu và các nước nhiệt đới. Ban đầu, khóm được người dân vùng Caribbe gọi là Anana có nghĩa là “trái cây ngon tuyệt” (“excellent fruit”). Tên gọi “khóm” (“pineapple”) bắt nguồn từ châu Âu vì người ta nghĩ rằng nó giống như trái thông (“pinecone”) với phần thịt giống như một quả táo (apple). Ngày nay, Thái Lan, Philippine, Brazil và Trung Quốc là những nước sản xuất khóm hàng đầu trên toàn thế giới. Bên cạnh đó, các nước khác như Ấn Độ, Nigieria, Kenya, Indonesia, Mexico và Costa Rica cũng đóng góp trên 50% tổng sản lượng khóm trên toàn thế giới (10).  Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha. Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ. Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12. Ở miền Nam, dứa có thể ra hoa quanh năm, song thường tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10. Từ khi ra hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng (10). Quả dứa được coi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, loại quả “vua”, rất được ưa chuộng ở các nước phương Tây. Quả dứa có mùi thơm mạnh, chứa nhiều đường, lượng calo khá cao, giàu chất khoáng, nhất là Kali, có đủ các loại vitamin cần thiết như A, B1, B2, PP, C đặc biệt trong cây và quả dứa có chất Bromelin là một loại men thủy phân protein (giống như chất Papain ở đủ đủ), có thể chữa được các bệnh rối loạn tiêu hóa, ức chế phù nề và tụ huyết, làm vết thương mau thành sẹo. Trong công nghiệp, chất Bromelin dùng làm mềm thịt để chế biến thực phẩm, nước chấm (10). 2.3.2 Enzyme bromelain Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ học Bromeliaceae, đặc biệt là cây dứa (thân và trái). Bromelain được trích ly từ khóm lần đầu tiên vào năm 1891 và được giới thiệu như một sản phẩm thương mại vào năm 1957. Hoạt tính của bromelain được phát hiện ở trong thân và quả cây khóm, nhưng trong thân khóm chứa nhiều bromelain hơn quả khóm Bromelain là một loại enzyme thuộc nhóm protease, nó dễ dàng thủy phân hầu hết các loại protin như casein, gelatin, đậu nành, cá…để tạo thành các peptide, poly peptide và các acid amin. Bromelain không giống như các các loại enzyme khác, nó hoạt động rất rộng cả trong môi trường acid lẫn kiềm. Bromelain vẫn có hoạt tính cả trong môi trường cơ thể sinh vật (2). Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Enzyme bromelain có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da ( 3) Trong công nghiệp, phần thân nguyên liệu được dùng làm nguyên liệu chính để sản xuất enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau mùa thu hoạch trái. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33) Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2. Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân tại vị trí bất kỳ trên mạch polypeptide. Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như broimelain thân. Nhưng bromelain quả hoạt động thủy phân tốt trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg- NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân (11). Mã số enzyme Bromelain thân: E.C.3.4.22.32 (12). Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain Tên khoa học và y học: sulfuhydryl proteolytic enzyme, cytein protase Tên thương mại: Bromanase (Kramer – Novis), bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp). Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine. i. Cấu tạo hóa học Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain thân có khoảng 321-144 acid amin, còn bromelain quả có khoảng 283-161 acid amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở đầu carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alnine. Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH (sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp amino trong phân tử bromelain như sau: Ser-Val-Lys-Asn=Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-AlaCys-Tryp -Gly-Cys-Lys- (3) ii. Hoạt tính của bromelain Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amylase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị BTU, (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU (đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)… Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCUs hoặc GMU. 1 GMU tương đương với 1,5 MCU (8). iii. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain Giống như các cấu trúc sinh học khác, hoạt tính enzyme của bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác: Nhân tố môi trường: nhiệt độ, pH, ion kim loại…; Nhân tố bên trong: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme…; Các yếu tố pH, nhiệt độ cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa… Bromelain là một enzyme có nguồn gốc từ thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý được quan tâm nhiều nhất bởi các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng đến nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (3). Nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10 Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme… Các nghiên cứu cho thấy: Bromelain hoạt động ở nhiệt độ từ 40-600C ( tối thích 50-600C) và bị ức chế ở nhệt độ trên 65oC (17). Bromelain tinh khiết rất nhạy cảm với nhiệt độ Ở 50C, pH 4-10, bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24 giờ Ở 550C, pH 6,1 bromelain bị bất hoạt 50% hoạt tính trong vòng 29 phút. Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính (3). Theo cuộc nghiên cứu của Bollag và Edelstein vào năm 1991 thì Bromelain có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 45-700C. H oạ t t ín._.