So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng thức hệ Enzyme của Bacillus subtilis sp. Và Bacillus natto sp. để chế biến thức uống chức năng

ức chuyên môn cũng như những kinh nghiệm sống quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.  Ban giám hiệu trường ĐHSP TP HCM, quý thầy cô bộ môn Vi sinh vật đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay.  Các anh chị em phòng thí nghiệm Biến đổi sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.  Các bạn học viên cao học niên khóa 2007- 2010 ngành Vi sinh vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn.  Cuối cùng tôi xin cảm ơn ba mẹ và những người thân yêu đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, tháng 08 năm 2010 Trương Thị Như Hiếu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận văn này là trung thực, kết quả thí nghiệm được lặp lại tối thiểu 3 lần và chưa ai công bố. Tác giả luận văn Trương Thị Như Hiếu DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT BsTC Bacillus subtilis sp. phân lập từ chao Bn Bacillus natto phân lập từ sản phẩm nattospes CP Môi trường cá peptone ĐC Đối chứng ĐVHT Đơn vị hoạt tính MT Môi trường NB Nutrient Broth NA Nutrent agar PGA Potato glucose agar OD Trị số mật độ quang TCA Trichloroacetic TKm Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men PTHQ Phương trình hồi quy MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu nành là một trong những loại cây trồng phổ biến trên thế giới, nó được xem là nguồn dinh dưỡng tuyệt hảo của nhân loại bởi nó chứa đầy đủ các dưỡng chất cần thiết như protein, lipid, cacbohydrat và các hoạt chất hữu cơ khác. Đặc biệt, nó được xem là dạng thực phẩm đứng đầu về hàm lượng protein có nguồn gốc thực vật. Không chỉ vậy, trong nhiều nghiên cứu đã chứng minh đậu nành còn có tác dụng giảm chlolesterol trong máu, giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, ngăn ngừa bệnh ung thư, bệnh tiểu đường và các rối loạn tiền mãn kinh phụ nữ …[23] Tháng 10 năm 1999, cơ quan kiểm tra dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã đưa ra kết luận: “Sử dụng 25 gam protein đậu nành (có trong 65-70 gam đậu nành) trong khẩu phần ăn hàng ngày có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch”. [25] Tuy có giá trị dinh dưỡng và chức năng cao nhưng trên thực tế ở nước ta hiện nay đậu nành lại xếp vào nhóm có sức cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân. [24] Một trong những lý do chính là hiện nay các sản phẩm từ đậu nành phần lớn là các sản phẩm truyền thống, thường mặn (tương chứa 18-20% NaCl, chao có 7-9% NaCl) không dùng được một lượng lớn trong một khẩu phần; ít có sản phẩm mới có giá trị công nghệ sinh học và thực phẩm chức năng (dùng vi sinh vật có vai trò probiotic) để chế biến thực phẩm. [23] Trong thời gian gần đây, trên thị trường trong nước có xuất hiện một số sản phẩm như Biosubtil, Bioascimil, Anti-bio, …dạng bột, đóng gói nhỏ, mỗi gói từ 1-3 gam, có chứa khoảng 108- 109 vi khuẩn Bacillus subtilis và vi khuẩn lactic, có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa. Từ năm 2007 có sản phẩm Nattospes chứa enzyme nattokinase từ vi khuẩn Bacillus natto, theo quảng cáo là enzyme duy nhất có khả năng làm tan sợi huyết (fibrin) ngăn cản sự tạo huyết khối gây chứng tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim. Ở nước ta có sản phẩm chao, theo TS. Lê Chiến Phương [20] có chứa vi khuẩn Bacillus subtilis có tác dụng tượng tự và có thể so sánh được với Bacillus natto. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp. để chế biến thức uống chức năng”. 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Xác định được chủng vi khuẩn nào có phức hệ enzyme thủy phân đậu hũ tốt hơn để chế biến thức uống chức năng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa và có vai trò probiotic. - Xây dựng được quy trình sản xuất thức uống chức năng từ đậu hũ. - Đáp ứng xu hướng giảm tiêu thụ chất đạm và chất béo động vật thay bằng đậu nành có nguồn gốc thực vật. - Góp phần đưa đậu nành ra khỏi nhóm có cạnh tranh yếu trong nền kinh tế quốc dân. 3. NÉT MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis sp. (sau khi so sánh với Bacillus natto sp.) thủy phân đậu hũ để chế biến thực phẩm chức năng, là tác nhân probiotic thứ nhất. - Dùng vi khuẩn lactic (là tác nhân probiotic thứ 2) ức chế hoạt động vi khuẩn Bacillus vừa đủ để bảo quản thực phẩm mà không dùng hóa chất. - Bước đầu tạo sản phẩm mới: thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐẬU NÀNH 1.1.1. Lịch sử phát triển Đậu nành được xem là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc. Nó được trồng trên nhiều loại đất khác nhau và có phạm vi khí hậu rộng khắp, trải dài từ vùng nhiệt đới Brazil đến hòn đảo Hokkaido đầy tuyết nằm ở phía Bắc Nhật Bản. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã tìm thấy vai trò của đậu nành trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm. Vì vậy, đậu nành ngày càng lan rộng khắp thế giới. [36] 1.1.2. Cây đậu nành Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc: Hình 1.1. Cây đậu nành Đậu nành là cây bụi nhỏ, cao trung bình dưới 1m, có lông toàn thân, có 3 chét hình bầu dục, bông trắng hoặc tím, trái có nhiều lông vàng có từ 3-5 hạt. Cây đậu nành là cây ngắn ngày, phát triển tốt ở vùng nhiệt đới, ưa sáng, ưa nhiệt, chịu hạn, trồng vào cuối mùa xuân, đầu mùa hè. [6] Là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế, dễ trồng, sản phẩm từ nó rất đa dạng. Ngoài ra, cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác nhờ hoạt động cố định N2 của Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu. 1.1.3. Hạt đậu nành 1.1.3.1. Hình thái, cấu trúc [10] * Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, chùy dài. Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Fabales Họ Fabaceae Phân họ: Faboideae Chi Glycine Loài G. max * Màu sắc: vàng, xanh, nâu hoặc đen và các màu trung gian nhưng màu vàng là tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều. * Cấu trúc hạt: gồm 3 phần chính là vỏ hạt, phôi và tử diệp. - Vỏ: là lớp ngoài cùng của hạt đậu nành, có nhiều loại màu sắc và là yếu tố cho việc xác định giống đậu nành, có tác dụng bảo vệ phôi mầm. - Phôi: là rễ mầm, là phần sinh trưởng của hạt khi nảy mầm. - Tử diệp: gồm hai lá mầm tích trữ dinh dưỡng cho hạt. Bảng 1.1. Thành phần các chất có trong hạt đậu nành (% khối lượng) [15] 1.1.3.2. Thành phần hóa học So với các nguyên liệu thực phẩm chính hiện nay, đậu nành thực sự giàu dinh dưỡng, vừa có nguồn protein cao nhất trong các loại đậu vừa là dược liệu quý. Đậu nành có hàm lượng dinh dưỡng thay đổi rộng phụ thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt nhưng nhìn chung chúng chứa 35-40% protein, 15-25% chất béo, 15-30% carbohydrate; các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose và khoảng 5% tro. [29] Theo số liệu phân tích của công ty Ajinomoto, Thái Lan 1994, hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam như bảng 1.2. Bảng 1.2. Hàm lượng dinh dưỡng của hạt đậu nành Việt Nam [20] Chỉ tiêu Đơn vị Hạt đậu nành ở Đồng Nai Hạt đậu nành ở An Giang Khô đậu nành ép công nghiệp Khô đậu nành ép thủ công Protein thô Lipid thô Acid linoleic Lysin Methionin % % % % % 35,56 17,10 8,00 2,05 0,54 38,06 18,00 8,45 0,39 0,59 47,81 1,50 0,60 2,66 0,61 42,94 3,00 1,40 2,72 0,57 Thành phần % khối lượng toàn hạt Protein (%) Lipid (%) Carbohydrate (%) Tro (%) Hạt đậu nành Tử diệp Vỏ hạt Phôi 100 90 8,0 2,0 40,0 43,0 8,8 41,1 20,0 23,0 1,0 11,0 35,0 29,0 86,0 43,0 4,9 5,0 4,3 4,4 Systine Treonin Arginin Phenilalanin Valin Leucin Isoleucin Serin % % % % % % % % 0,61 1,35 2,11 1,49 1,62 2,68 1,51 1,73 0,72 1,53 2,62 1,76 1,74 3,03 1,67 2,05 0,72 1,69 3,03 1,83 1,85 3,39 1,65 2,34 0,75 1,67 2,85 1,95 1,84 3,32 1,77 2,27 Isoflavones trong đậu nành dao động từ 4.39 mg/g đến 15.58 mg/g, có khả năng phòng chống nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch. Ngoài ra, đậu nành cũng rất giàu chất khoáng và nhiều chất xơ. Bảng 1.3. Thành phần khoáng trong đậu nành Thành phần Tỷ lệ (%) Calci 0.16 – 0.47 Phospho 0.41 – 0.82 Mangan 0.22 – 0.24 Kẽm 0.37 g/kg Sắt 90 – 150 mg/kg Bảng 1.4. Thành phần vitamin của đậu nành Thành phần Tỷ lệ (%) Thành phần Tỷ lệ (%) Thiamin 11 – 17.5 % Inositoe 2300 mg% Riboflavin 3.4 – 3.6 % Vitamin A 0.18 – 2.43 % Niacin 21.4 – 23 mg/g Vitamin E 1.4 mg% Pyridoxin 7.1 – 12 mg/g Vitamin K 1.9 mg% Biotin 0.8 mg/g Vitamin B1 0.54 mg% Pantothenic acid 13 – 21.5 mg/g Vitamin B2 0.29 mg% Folic acid 1.9 mg/g Vitamin PP 2.3 mg% Enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase, được biết đến là lipoxydase xúc tác phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa bởi O2, gây mùi đậu nành. Enzyme urease có nhiều ở đậu nành sống, phân hủy ure thành amoniac, là một hợp chất độc với cơ thể người do đó không nên ăn đậu nành sống. [15] 1.1.4. Công dụng của đậu nành [37] Đậu nành có chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và là nguồn cung cấp calci, chất xơ, sắt và vitamin nhóm B. Các hợp chất isoflavon và hóa thảo (phytochemicals) khác trong đậu nành có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau tim, tai biến mạch máu não, ung thư vú, ung thư kết tràng… (Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama. Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần Lan). Những hóa thảo đậu nành gồm: - Protease inhibitors: ngăn ngừa sự tác động của một số gene di truyền gây nên chứng ung thư, bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi trường sống. - Phytates: ngăn cản tiến trình gây bệnh ung thư kết tràng và ung thư vú, có khả năng tiêu diệt chất làm tế bào bị ung thư và phục hồi những tế bào bị hư hại. - Phytosterols: ngừa các bệnh tim mạch bằng cách kiểm soát lượng cholesterol máu, giảm sự phát triển các bướu ung thư kết tràng và chống ung thư da. - Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa bảo vệ tế bào cơ thể, trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng và làm giảm lượng cholesterol trong máu. - Phenolic acid: là một hóa thảo chống oxy hóa và phòng ngừa các DNA bị tế bào ung thư tấn công. - Lecithin: là một hóa thảo làm tăng trí nhớ bằng cách nuôi dưỡng tốt các tế bào thần kinh, làm chắc các tuyến, tái tạo các mô tế bào cơ thể, cải thiện hệ thống tuần hoàn, bổ xương và tăng cường sức đề kháng. - Omega-3 fatty acid: là chất béo không bão hòa có khả năng làm giảm lượng cholesterol xấu đồng thời làm tăng lượng cholesterol tốt trong máu. - Isoflavones (phytoestrogens): là một hóa thảo hoạt động giống estrogen, có khả năng chống lại các tác nhân gây nên chứng ung thư liên hệ đến hormon. 1.1.5. Một số sản phẩm từ đậu nành trên thế giới 1.1.5.1. Những sản phẩm đậu nành ở phương Tây Hình 1.2. Một số sản phẩm đậu nành ở phương tây Những sản phẩm này, được phát triển tại Tây phương trong nhiều thập niên qua bởi những kỹ thuật cao cấp bao gồm: Defatted soy flour and grits chứa từ 50 đến 52 % protein, được tách dầu trong quá trình xay nghiền hạt đậu thành bột, nhiều xơ. Soy protein concentratres chứa khoảng 70 % protein, thường được dùng để làm giả thịt bằm, thức ăn sáng và thức ăn cho trẻ sơ sinh. Soy protein isolates có chứa từ 90 đến 95% protein, khoảng 19% methionine bị mất trong tiến trình biến chế. Textured soy proteins chứa khoảng 52% protein, được tạo sợi dưới áp suất và nhiệt độ cao từ sản phẩm defatted soy flour, sau đó thêm màu và gia vị để giống như mùi vị thực phẩm có nguồn gốc thịt. Soy flour là loại protein đậu nành đơn giản nhất, nó được xay, sàng lọc và không có chất tinh bột nên được dùng như là một loại thực phẩm ăn kiêng. Dầu đậu nành không có protein nhưng rất giàu chất béo không bão hòa và linoleic acid, lecithin có trong loại dầu đậu nành chưa lọc rất tốt cho não. Thực phẩm đậu nành ăn nhanh (Fast food) Số người ăn chay bằng thực phẩm đậu nành càng ngày càng gia tăng tại Hoa Kỳ nên các nhà chế tạo thực phẩm đã biến chế thực phẩm đậu nành thành những loại thức ăn nhanh, tiện nghi và bổ dưỡng như Vons, Lucky, Hughs v.v… 1.1.5.2. Những sản phẩm đậu nành ở phương Ðông Những sự hiểu biết về đậu nành thực sự bắt đầu ở Ðông phương và đã trở thành một phần của nền văn hóa Châu Á. Họ đã chế biến thành những thức ăn như là một nghệ thuật của gia đình và từng địa phương. Những thực phẩm này bao gồm đậu hũ, sữa, nước tương, mì căn, tàu hũ ky, tempeh, miso, natto..v..v.. * Tempeh là bánh làm từ đậu nành và bột gạo lên men, nổi tiếng tại Indonesia, chứa 9% protein đậu nành, nhiều chất xơ và ít chất béo hơn đậu hũ và sữa đậu nành. Hình 1.3. Sản phẩm tempeh * Miso là hỗn hợp lên men gồm đậu nành, bột gạo, muối và nước, rất phổ thông tại Nhật Bản và Trung Hoa. Có sáu loại miso khác nhau nhưng mỗi thứ đều có chứa khoảng 13% protein, 13% muối, bảo quản trong tủ lạnh. Hình 1.4. Các loại miso * Nước tương (soy sauce) rất phổ thông ở Châu Á. Làm từ hỗn hợp đậu nành, gạo nếp, muối, nấm mốc và nước; ủ từ 3 đến 12 tháng tùy theo loại. Ở Việt nam, có nhiều loại tương như tương Tàu, tàu vị yểu, tương Bần Hưng Yên, tương Cự Ðà hay tương Nam Ðàn. Tương Việt Nam không khử trùng theo phương pháp Pasteur. Hình 1.5. Sản phẩm tương * Chao (soya cheese) là sản phẩm được lên men từ đậu phụ nhờ các loài nấm mốc: Actinormucor elegans, M.hiemalis, M.sivticus, M.subtilis thủy phân đậu hũ thành các chất dinh dưỡng đơn giản, dễ hấp thu. [15] Hình 1.6. Sản phẩm chao * Natto là một loại thực phẩm lên men truyền thống của người Nhật Bản, có hai loại: natto sợi (sử dụng vi khuẩn để lên men) và natto muối (sử dụng nấm mốc để lên men). Đậu nành luộc chín ủ với Bacillus natto ở 40oC từ 14 – 18 giờ thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhớt cao và có mùi nồng. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất, độ nhớt càng cao thì chất lượng natto càng tốt và vị càng ngọt. [15] Hình 1.7. Hình sản phẩm natto * Đậu hũ và thành phần dinh dưỡng [3] Ðậu hũ rất phổ thông ở các nước Châu Á. Được làm từ đậu nành, dễ ăn, dễ chế biến và còn được xem như dược phẩm, có tác dụng ngăn ngừa nhiều bệnh tật. Có ba loại là loại loại cứng (firm tofu), loại mềm (soft tofu) và loại đậu hũ lụa (silken tofu). Hình 1.8. Sản phẩm đậu hũ Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng đậu hũ Thành phần dinh dưỡng Đậu hũ cứng Đậu hũ mềm Đậu hũ lụa Calories 120 86 72 Protein (g) 13 9 9,6 Chất béo (g) 6 5 2,4 Chất béo bão hòa (g) 1 1 0 Carbohydrates (g) 3 2 3,2 Calci (mg) 120 130 40 Natri (mg) 9 8 76 Cholesterol (mg) 0 0 0 Sắt (mg) 8 7 1 Xơ (mg) 1 0 0 % calories từ protein 43 39 53 % calories từ carbohydrate 10 9 17 % calories từ chất béo 45 52 30 Nguồn: Composition of Foods: Legumes and Legume Products. United States Department of Agriculture, Human Nutrition Information Service, Agriculture Handbook 8-16. Revised 12-1986. 1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỨC UỐNG CHỨC NĂNG 1.2.1. Định nghĩa [41] * Thực phẩm: tất cả các chất đã hoặc chưa chế biến nhằm sử dụng cho con người gồm đồ ăn, uống, nhai, ngậm, hút và tất cả các chất được sử dụng để sản xuất, chế biến hoặc xử lý thực phẩm, nhưng không bao gồm mỹ phẩm hoặc những chất chỉ được dùng như dược phẩm. * Thực phẩm chức năng Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về thực phẩm chức năng, mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng. Gần đây các định nghĩa về thực phẩm chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau. + Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC), định nghĩa: “ Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến những lợi ích cho sức khoẻ vượt xa hơn dinh dưỡng cơ bản”. + Hiệp Hội nghiên cứu thực phẩm Leatherhead (châu Âu): “Thực phẩm chức năng là thực phẩm được chế biến từ thức ăn thiên nhiên, được sử dụng như một phần của chế độ ăn hàng ngày và có khả năng cho một tác dụng sinh lý nào đó khi được sử dụng”. + Bộ Y tế Việt Nam: Thông thư số 08/TT-BYT ngày 23/8/2004 về việc “Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”. Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật”. Như vậy, khái niệm thức uống chức năng nằm trong khái niệm thực phẩm chức năng. 1.2.2. Khái quát về probiotic 1.2.2.1. Khái niệm Probiotic là các vi khuẩn sống khi được cung cấp với liều lượng thích hợp sẽ đem lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. (Theo định nghĩa của FAO và WHO 2001) 1.2.2.2. Vai trò [26] - Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu. - Ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong đường ruột như: Staphylococcus, Salmonella, Yersinia, Clostridia. - Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột. - Có khả năng chịu được acid dạ dày, chịu được muối mật. - Phòng và chữa một số bệnh tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày, … - Hạn chế sự hình thành các khối u nhờ làm giảm hoạt động enzyme tiết ra từ vi khuẩn có hại góp phần tạo ra các chất gây ung thư và giảm nguy cơ ung thư ruột. - Probiotic có khả năng sản xuất ra lactase giúp tiêu hóa lactose. - Tái thiết lập hệ vi sinh có ích nhanh chóng sau khi dùng kháng sinh. 1.2.2.3. Các yêu cầu đối với vi sinh vật probiotic [33] Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn đạt hiệu quả mong muốn cần phải đáp ứng đúng một số yêu cầu: - Phải được định danh chính xác, đúng tên chủng loài vi sinh vật. - Cư trú ở người, không độc, không gây bệnh. - Đủ số lượng để trị liệu: khoảng 108-109 tế bào trong một ngày. - Có khả năng tồn tại khi đi qua dạ dày, nơi có môi trường acid, pH từ 1-4 . - Chịu đựng được khi qua ruột non, nơi dịch mật toàn phần tiết ra cao nhất. - Sinh ra một số chất kháng sinh, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. - Di truyền ổn định. - Không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi sinh vật khác. - Không được mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh. - Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và bám vào niêm mạc đường tiêu hóa. 1.2.2.4. Các chủng vi sinh vật thường dùng làm probiotic Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, còn Enterococus và Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic. Bảng 1.6. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người (Taylor & Francis, 2004) 1.2.2.5. Một số loại sản phẩm mới từ đậu nành hiện nay trên thị trường * Sữa chua đậu nành (soy yogurt) Sữa chua đậu nành được làm giống như sữa chua từ sữa bò. Sữa đã tiệt trùng được lên men với Acidophilus, Bifida hoặc với các canh trường phù hợp và được lên men cho tới khi canh trường chuyển từ sữa đậu nành sang dạng sữa chua, có vị tương tự như sữa chua từ sữa bò. [30] Năm 1981, tại Nhật lần đầu tiên sản xuất soy yogurt số lượng lớn. [28] * Nước mắm chay đậu nành Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu để sản xuất nước mắm chay, như theo Lê Minh Hoàng - Trường ĐH An Giang, sử dụng Bacillus subtilis sp. để lên men đậu hũ tạo sản phẩm nước mắm chay, … Ngoài việc sử dụng đậu nành trong thực phẩm, còn có một số chế phẩm đặc biệt đáng chú ý được bán tại các Health Food Store gồm: Chủng Lactobacillus Chủng Bifidobacterium Các vi sinh vật khác L. acidophilus L. amylovocus L. casei L. crispatus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracaseii L. plantarum L. reuteri B. adolescentis B. laimalis B. bifidum B. brevis B. infantis B. lactis B. longum Propionibacterium freudenreichii Enterococcus faecalis Lactococus lactis Leuconostoc mesenteroides Streptococus thermophilus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii - Soy Biotic trị các triệu chứng khó chịu của phụ nữ vào thời kỳ tắt kinh. - Magic 851 giúp tăng sự hoạt động của hệ miễn nhiễm và ngăn ngừa ung thư với các chất cô đặc từ đậu nành . [37] 1.3. CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SỬ DỤNG 1.3.1. Bacillus subtilis và Bacillus natto 1.3.1.1. Hệ thống phân loại [40] Giới: Prokaryota Ngành: Protophyta Lớp: Schyzomycetales Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Bacillus natto 1.3.1.2. Phân bố [20] B.subtilis và B.natto có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo bào tử. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… cũng có mặt của chúng và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học. 1.3.1.3. Hình thái [8],[31] Bacillus là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0.5-2.5 x 1.2-10m, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0.9 – 0.6m, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao, về già, tiên mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch. Hình 1.9. Vi khuẩn B.subtilis Hình 1.10. Vi khuẩn B.natto 1.3.1.4. Cấu trúc [37] Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao. Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giác mạc, lớp bề mặt có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng tế bào. Hình 1.11. Bề mặt vi khuẩn Bacillus (C=Capsule, S=S-layer, P=Peptidoglycan) S-layer Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa được xác định rõ ràng nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn. Giáp mạc (capsules) Thành phần hóa học của lớp vỏ nhầy ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide nhưng thành phần chủ yếu là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại quá trình khô. Vách tế bào Vách tế bào rất mỏng (100-200A0), trong suốt không màu. Vách tế bào có tính chất đàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành phần hóa học chủ yếu là glucid, một số chất béo, protide, các acid amin và chúng thay đổi tùy loại vi khuẩn, tùy môi trường sống. Tiên mao (flagella) Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên mao là các sợi lông rất mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi khuẩn, có cấu trúc là protid. Chiều dài tiên mao thường bằng chiều dài tế bào nhưng cũng có thể dài hơn tùy loại vi khuẩn. Số lượng và vị trí tiên mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài. Chúng có thể mọc ở một đầu, hai đầu hoặc mọc xung quanh, … 1.3.1.5. Sự hình thành bào tử [5] Một trong những đặc điểm quan trọng của B.subtilis và B.natto là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất thẩm thấu. Trong thời kỳ nghỉ, bào tử vi khuẩn ở trạng thái sống ẩn (cryptobiosis). Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của bào tử vi khuẩn Bacillus. Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các giai đoạn: - Hình thành những búi chất nhiễm sắc. - Tế bào phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử. - Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ. - Kết thúc việc hình thành áo bào tử. - Kết thúc tạo vỏ bào tử, bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt. - Bào nang vỡ ra; bào tử thoát ra ngoài. 1.3.1.6. Hệ enzyme [13], [27] * Hệ enzyme protease - Các enzyme protease (peptid – hydrolase) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid trong các peptid hoặc protein. - B. subtilis và B.natto có khả năng tổng hợp protease trung tính và kiềm. - Chúng tổng hợp protease ngoại phân (exoprotease) phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ hấp thụ. Đây là chức năng rõ nhất của protease ngoại bào. - Theo Otrosko và tập thể (1977) thì glucose, saccharose, mantose, fructose, socbit là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình tổng hợp protease ở B.natto var.amylolyquefaciens 795. * Hệ enzyme amylase - B. subtilis, B.natto có khả năng tạo một lượng lớn  - amylase. - Amylase của B. subtilis và B.natto không có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân giải tinh bột nhanh gấp 2÷2,5 lần so với  - amylase nấm mốc. -  - amylase của vi khuẩn B. subtilis cũng như của B.natto thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ: G6 → G1 + G5 G7 → G1 + G6 hay G2 + G5 (ít) G8 → G2 + G6 hay G3 + G5 (ít) - Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và maltose. Ở vi khuẩn tỉ lệ này là 1: 5. - pH tối thích cho dextrin hóa và đường hóa của  - amylase là từ 5,6÷6,2. 1.3.1.7. Công dụng [19],[27] - Tạo kháng sinh: subtilin, eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây bệnh. - Người ta cũng thường thu  - amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt để tách hồ tinh bột trên vải từ B. subtilis. - Chế phẩm amylase từ B. subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm (malt) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. - B.subtilis và B.natto có khả năng tạo một lượng lớn -amylase ngoại bào. -amylase của chúng bền nhiệt hơn và phân giải tinh bột nhanh hơn 2 – 2.5 lần so với enzyme của nấm mốc. 1.3.2. Vi khuẩn lactic 1.3.2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic [5],[3] Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tuỳ ý, hầu hết không di động. Tế bào ở dạng cầu khuẩn (đường kính 1µm) hay trực khuẩn (kích thước 1 x 2-3µm). Tồn tại ở dạng tế bào đơn, kết đôi, kết tư (tetracoccus) hay kết thành chuỗi. * Theo khóa phân loại Bergey, vi khuẩn lactic thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Pesiococcus Họ: Enterococcaceae Giống: Enterococcus Họ: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Lactococcus * Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm [8]: - Vi khuẩn lactic đồng hình Tham gia vào quá trình lên men lactic đồng hình mà sản phẩm chính tạo thành là acid lactic (90-98% tổng sản phẩm lên men), có thể có một ít các sản phẩm phụ như: ethanol, acid acetic, acetoin, CO2. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Chúng đóng vai trò quan trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việc tạo hương cho các loại phomai rắn. - Vi khuẩn lactic dị hình Tham gia vào quá trình lên men lactic dị hình mà sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như sau: acid lactic 40%, acid acetic 10%, các chất khí 20%. Nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém nhưng cũng có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm. Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn. 1.3.2.2. Lactobacillus [31] Tế bào hình que ngắn, kích thước 0.5 – 1.2 x 1 – 10µm, đôi khi có dạng hình cầu kết chuỗi ngắn. Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động bằng lông roi, kị khí không bắt buộc. Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, lồi, mờ đục, không nhuộm màu. Hình thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, không khử được nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome. Hình 1.12. Lactobacillus Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30 – 40oC. 1.3.2.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic [5], [32] * Bacteriocin Lên men thực phẩm bằng vi khuẩn lactic là phương pháp bảo quản thực phẩm cổ xưa nhất dựa vào sự đối kháng của các vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, phương pháp này mới nhận được sự chú ý của các nhà khoa học, đặc biệt là việc sử dụng các vi khuẩn lactic khác nhau. Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn lactic là khả năng tạo các hoạt chất kháng khuẩn - bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp., Enterococcus spp.. Bảng 1.7. Đặc tính của một vài loại bacteriocin Bacteriocin Vi sinh vật sản xuất Đặc điểm Nisin Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454 Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào cuối chu kỳ tăng trưởng. Pediocin A Pediococcus pentosaceus FBB61, L-7230 Phổ kháng k._.huẩn rộng. Pediocin AcH Pediococcus acidilactici H Phổ kháng khuẩn rộng. Leucocin Leuconostoc gelidum Phổ kháng khuẩn rộng, được sinh ra vào đầu chu kỳ tăng trưởng. Helveticin L.helveticus 481 Phổ kháng khuẩn hẹp. Carnobacteriocin Carnobacterium piscicola LV17 Phổ kháng khuẩn hẹp, được sinh ra vào đầu chu kỳ tăng trưởng. * Probiotic Vi khuẩn lactic được chú ý sử dụng nhiều trong vai trò probiotic, có nhiều loài được sử dụng như đã trình bày ở phần 1.2.2 của luận văn này. * Một số ứng dụng khác - Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai, koumis… - Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối, … - Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi. - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate. - Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công nghiệp thực phẩm. - Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt dùng để chữa bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi, … CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu * Đậu hũ: đậu hũ Vina Tofu Hình 2.1. Đậu hũ Vina Tofu * Sữa đậu nành không đường Vfresh Nguồn: công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk. Dùng làm môi trường tăng sinh các chủng giống vi sinh vật trong đề tài. * Đường aspartam Nguồn: công ty cổ phần dược phẩm dược liệu Pharmedic - TP.HCM. Dùng bổ sung vào sản phẩm tạo vị ngọt. * Hươmg liệu (hương phomai) Nguồn: do công ty FRAGRANCE OILS (International) LMD. của Anh sản xuất, được mua tại cửa hàng Toàn Hưng, số 451 An Dương Vương, Phường 14 - Quận 5, chuyên cung cấp tinh dầu, hương liệu và bột màu thực phẩm. 2.1.2. Giống vi sinh vật Do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp. - Bacillus subtilis sp. được phân lập từ chao, kí hiệu BsTC. - Bacillus natto sp. phân lập từ sản phẩm Nattospes của Nhật Bản, được kí hiệu là Bn. - Lactobacillus sp. phân lập từ mẻ cơm lên men, kí hiệu là TKm. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Do Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM cung cấp. - Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa Petri, buret, phễu lọc, giấy lọc, …. - Thiết bị thí nghiệm như tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân điện tử, bể ổn nhiệt, máy Kjeldahl bán tự động, máy Soxhlet, máy đo quang phổ, … 2.1.4. Môi trường dùng trong thực nghiệm - Môi trường giữ giống BsTC và Bn.: Môi trường thạch nước mắm (CP: cá peptone). - Môi trường nhân giống BsTC và Bn. Môi trường dịch nước mắm (CP: cá peptone). Môi trường sữa đậu nành. - Môi trường giữ giống Lactobacillus sp.: môi trường cà chua (N2) - Môi trường định tính enzyme. Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% tinh bột định tính enzyme amylase. Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% casein để định tính enzyme protease. Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% fibrin để định tính enzyme protease. (Thành phần các môi trường được trình bày rõ ở phần phụ lục của luận văn này). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính hệ enzyme (amylase, protease) của BsTC và Bn trong điều kiện khác nhau của các yếu tố ảnh hưởng như thời gian, nhiệt độ, pH. Sau đó, tối ưu hóa điều kiện các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme của hai chủng giống vi khuẩn trên. Từ kết quả thu được, sẽ chọn ra một chủng giống tối ưu hơn để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. Nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài được trình bày ở sơ đồ sau: Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hình thái các chủng vi sinh vật có trong đề tài (vi khuẩn Bacillus subtilis sp., Bacillus natto sp., Lactobacillus sp.) 2.2.2.1. Phương pháp nhuộm Gram [14] * Nguyên tắc Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là: Xác định thành phần hóa học trong nguyên liệu đậu hũ Xây dựng đường cong sinh trưởng. Xác định sinh khối tối đa của BsTC, Bn trong môi trường CP và trong môi trường sữa đậu nành. Khảo sát hoạt tính enzyme amylase, protease trên cơ chất đậu của BsTC và Bn từng yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH rồi tối ưu hóa thực nghiệm. Từ đó chọn chủng tối ưu. Khảo sát quá trình lên men Xác định tỷ lệ giống (BsTC hoặc Bn) Thời gian thủy phân đậu hũ. Xác định các chỉ số dinh dưỡng (đạm, đường, lipid, …) Khảo sát quá trình bảo quản Xác định tỷ lệ giống TKm Hàm lượng đường saccharose Thời gian bảo quản Hoàn thiện sản phẩm Khảo sát phụ gia: đường aspartam, hương Đánh giá cảm quan sản phẩm Xác định các chỉ số dinh dưỡng (đạm, đường tổng, lipid, …) Xây dựng quy trình chế biến thức uống chức năng từ đậu hũ Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương. Loại thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do ít peptidoglycan hơn) và được bao bọc bởi một màng mỏng nên có màu hồng. Vi sinh vật nhóm này là Gram âm. * Cách tiến hành - Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. - Nhỏ dung dịch NaCl 9 ‰ lên giữa vòng tròn. - Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 9 ‰ trên lame. - Dàn mỏng thành vết bôi, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dung dịch crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước. - Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước. - Tẩy màu bằng cồn 96o từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm. - Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin, để yên trong 30 giây, rửa với nước. - Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100. 2.2.2.2. Phương pháp nhuộm bào tử [14] Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen - Làm vết bôi trên một phiến kính sạch và để khô tự nhiên. - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong hai phút rồi rửa với nước. - Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi trong vòng 5 phút. - Rửa vết bôi bằng nước - Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. - Rửa vết bôi bằng nước. - Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút - Rửa lại với nước và để khô tự nhiên. - Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh. 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý vi khuẩn 2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý Lactobacillus sp. * Phương pháp định tính acid lactic Nguyên tắc Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi từ xanh tím sang vàng. Quan sát sự đổi màu thuốc thử xác định được khả năng tạo acid lactic của vi khuẩn. Cách tiến hành Chuẩn bị khoảng 5ml môi trường dinh dưỡng, cấy vi khuẩn đã phân lập vào. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng một ngày. Sau đó cho dịch lên men phản ứng với thuốc thử Ufermen. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các thành phần như sau: - Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 3 ml thuốc thử Ufermen. - Ống 2: 3 ml dịch lên men, 3 ml thuốc thử Ufermen. - Ống 3: 3 ml acid lactic 98 %, 3 ml thuốc thử Ufermen. Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử. * Phương pháp định lượng acid lactic [31] Nguyên tắc Acid tổng được đo bằng cách chuẩn độ với NaOH 0,1M; thêm 1-2 giọt phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị. Kết quả % acid lactic được tính theo công thức: % acid lactic = 90: trọng lượng phân tử acid lactic (g) D: độ pha loãng Cách tiến hành Cân 10 g mẫu hòa tan vào 90 ml nước cất. Thêm 1 – 2 giọt phenolphtalein 1%. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bền màu trong 1 phút. Độ therner: một độ Therner tương đương một ml NaOH 0.1M dùng để chuẩn độ 100 ml nguyên liệu. 2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý vi khuẩn BsTC và Bn * Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường CP [23] Khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn là một công việc quan trọng trong công nghiệp lên men. Nó cho biết được tại thời điểm nào thì chất lượng giống vi khuẩn cho vào cơ chất lên men là tốt nhất. VNaOH x NaOH 0,1M x 90 x1 00 mmẫu x 100 x D Nguyên tắc Sự tăng trưởng vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể. Tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời gian. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật theo thời gian ta có thể xác định được đường cong tăng trưởng của chúng. Dụng cụ và môi trường Dụng cụ: đĩa Petri, ống nghiệm nước cất, đầu típ 1ml đã được hấp khử trùng, micropopet 1 ml. Môi trường: môi trường thạch cá pepton (CP), môi trường CP lỏng. Cách tiến hành - Vi khuẩn được nuôi (tăng sinh) trong môi trường CP lỏng từ ống giống gốc. - Khoảng 4 giờ lấy mẫu cấy trang trên môi trường thạch cá pepton (CP agar). - Đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (CFU/ml) có trong mẫu. + Pha mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. + Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 30 – 300 khuẩn lạc trên đĩa. + Tính kết quả Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức là: Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V Ai: là số khuẩn lạc trung bình trên đĩa Di: là độ pha loãng thứ i. V: là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml). - Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log CFU/ml - trục tung và thời gian - trục hoành. * Xây dựng đường cong tăng trưởng trong môi trường sữa đậu nành [23] Thực hiện xây dựng đường cong tăng trưởng của BsTC và Bn trong môi trường sữa đậu nành tương tự như ở môi trường CP nhưng khác là môi trường nuôi (tăng sinh) vi khuẩn là môi trường sữa đậu nành. 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus sp. * Thử nghiệm oxydase [23] Nguyên tắc Thử nghiệm này xác định sự hiện diện hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử với O2 là chất nhận điện tử sau cùng ở các loài hiếu khí hay kị khí tùy ý. Số loại cytochrome trong tế bào thay đổi tùy từng loại vi sinh vật. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylendiamin. Khi có cytochrome c khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy hóa thành indolphenol có màu xanh dương. Cách tiến hành Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng nutrient agar, ủ ở 370C trong 24-48 giờ. Chuyển một ít sinh khối từ khuẩn lạc vào nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Dùng pipette nhỏ một giọt dung dịch trên vào đĩa giấy thử hoạt tính oxydase. Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương trong vài phút. Đọc kết quả Thử nghiệm oxidase dương tính (+) khi xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có sự xuất hiện của màu xanh này thì phản ứng là âm tính (-). * Thử nghiệm catalase [23] Nguyên tắc Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi chuyền điện tử có cytochrome đều có catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kị khí tùy ý. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ các phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng oxy được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. Cách tiến hành Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc (tốt nhất là khuẩn lạc không quá 24 giờ) đặt lên 1 lam kính sạch. Nhỏ 1 giọt dung dịch oxy già (H2O2) 3% phủ lên khuẩn lạc. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Đọc kết quả Nếu thấy xuất hiện bọt khí là catalase (+). * Thử nghiệm nitratase [23] Nguyên tắc Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo cách hô hấp kị khí. Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite, amoniac, nitơ phân tử, … tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật và điều kiện môi trường. Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N- napthylethyleneiamine hydrocloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng. Cách tiến hành Cấy sinh khối chủng thuần vào ống nghiệm đã có 200 µl nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Chuyển đĩa giấy nitrate vào ống nghiệm trên, ủ ở 370C qua đêm. Chuyển đĩa giấy đã tẩm thuốc thử tìm nitrate vào ống nghiệm trên. Đọc kết quả Phản ứng (+) có màu hồng xuất hiện. Ngược lại, không chuyển màu là (-). 2.2.4.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus [31] * Phản ứng nitratase Tương tự như 2.2.4.1. * Phản ứng protease Nguyên tắc Vi sinh vật tiết protease phân giải casein thành polypeptide và acid aimin. Cách tiến hành Tăng sinh vi khuẩn Bacillus trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh Bacillus vào, ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên trên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải casein. * Phản ứng Fibrin Nguyên tắc Vi sinh vật tiết protease phân giải fibrin thành polypeptide và acid amin. Cách tiến hành Tăng sinh vi khuẩn BsTC và Bn trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% fibrin. Nhỏ dịch tăng sinh BsTC và Bn vào, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Phương pháp thu sợi fibrin Dùng 5ml huyết heo: bổ sung 0,5% kalioxalat (K2C2O4.H2O), thêm 150ml NaCl 0,8% tiếp theo thêm 5 ml dung dịch CaCl2 (2,5g/100ml nước cất). Để 10-15 phút. Lọc qua giấy lọc. Rửa mẫu trên giấy bằng NaCl 0,8% đến khi sợi fibrin không còn máu (trước khi rửa bằng NaCl 0,8%, khóa van phễu lại để yên khoảng 10 phút cho mỗi lần rửa). Đem sấy khô hoàn toàn ở nhiệt độ 400C. Sau đó đem đi nghiền mịn. Đọc kết quả Nhỏ Folin pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải fibrin. Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn xuất hiện màu xanh. Phản ứng (-): không bắt màu với thuốc thử Folin. * Phản ứng amylase Nguyên tắc Một số vi sinh vật có enzyme α-amylase thuộc nhóm hydrolase phân giải liên kết glycozide tạo thành dextrin và maltose. Vì vậy, dưới tác dụng của α-amylase thì tinh bột bị phân giải thành dextrin không cho phản ứng màu xanh tím với iod. Cách tiến hành Tăng sinh vi khuẩn trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường starch agar, ủ ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ iod lên trên bề mặt môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải. Đọc kết quả Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn không màu, trong suốt, đó là vòng phân giải tinh bột. Phản ứng (-): môi trường xung quanh vi khuẩn có màu xanh tím. 2.2.5. Phương pháp khảo sát hệ enzyme của vi khuẩn BsTC và Bn 2.2.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn * Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase [18] Nguyên tắc Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học. Dụng cụ và hóa chất - Máy đo quang phổ. - Bể ổn nhiệt. - Dung dịch đệm phosphate (pH 6,2) + Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g Na2HPO4 hòa tan, dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch a). + Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1 g Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch b). + Để chỉnh pH = 6,2: 81,5 ml dung dịch a + 18,5 ml dung dịch b. - Dung dịch tinh bột 1%: 1 g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10 – 15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho đủ 100 ml. - Dung dịch Lugol: 0,5 g Iod + 5 g KI, thêm nước cất cho đủ 200 ml. - Dung dịch HCl 1N: hòa tan 85 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất cho vừa đủ 1 lít. - Dung dịch NaCl 3%: cân 3 g NaCl hòa tan với nước cất cho đủ 100 ml. Tiến hành Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hóa chất Ống chuẩn Ống thử 1 ml nước cất 1 ml dịch enzyme các mẫu 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% Đem ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kìm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10 ml mỗi ống. Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm. Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức: UI= mta LCba ** **)(  a: mật độ quang học của ống chuẩn. b: mật độ quang học của ống thử. C: lượng tinh bột ban đẩu tham gia phản ứng (10mg). L: hệ số pha loãng m: trọng lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu. * Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease [11] Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme. Dụng cụ hóa chất - Ống nghiệm. - HCl 0,1M. - Bể ổn nhiệt. - NaCl 2M. - Máy đo quang phổ. - NaOH 0,1N. - Giấy lọc. - H3PO41/30M. - Dung dịch trichloroacetic 5%. - Na2CO3 0,4M. - Dung dịch đệm phosphat pH = 6,2. - Ca(CH3COOH)2 0,2M. - Tyrosin tinh khiết. - Dung dịch casein 1%. - Thuốc thử Folin. Tiến hành  Dựng đường chuẩn Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g tyrosin /1 ml HCl 0,1M. Thêm 5 ml Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều để ổn định dung dịch ở 37±0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40, AS50.) Ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0). Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g tyrosin và độ hấp thụ: 5 5040302010 050040030020010 SSSSSSSSSS AAAAAAAAAAF            Định lượng enzyme trong mẫu Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37±0,50C trong 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37±0,50C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch trichloroacetic (TCA) 5%. Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3vào 1 ml dịch lọc. Cho thêm thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, để yên ở 37±0,50C trong 20 phút. Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm. Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Tính kết quả Một đơn vị hoạt tính enzyme protease chính là lượng enzyme tạo amino acid tương đương 100 µg tyrosin trong 1 ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease: ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme= (A60 – A0)*F*n*1/100 A60: độ hấp thụ của mẫu. A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng. F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660nm trên đường chuẩn. n: hệ số pha loãng mẫu. 1/100: hệ số chuyển đổi. 2.2.5.2. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn Có ba yếu tố cần khảo sát: thời gian, nhiệt độ và pH vì đây là một trong những yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính hệ enzyme của vi khuẩn. * Yếu tố thời gian - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ ở nhiệt độ phòng lần lượt theo các mốc thời gian: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 giờ. - Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc thời gian trên. * Yếu tố nhiệt độ - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ mẫu ở các nhiệt độ: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 450C trong 24 giờ, pH cơ chất. - Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc nhiệt độ trên. * Yếu tố pH - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với pH lần lượt là 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. - Xác định hoạt tính enzyme các mẫu trên. 2.2.5.3. Tối ưu hóa điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC và Bn [1] Chúng tôi bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với ba yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH vì đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC , Bn. Yếu tố không đổi trong quá trình khảo sát là cơ chất đậu hũ và tỉ lệ giống cấy 1% (v/w). Số thí nghiệm tối ưu 23 = 8, ngoài ra còn có thêm 3 thí nghiệm ở tâm để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy. Ba yếu tố cần khảo sát: - X1 là yếu tố thời gian với các giới hạn được xác định sau khảo sát ở trên. - X2 là yếu tố nhiệt độ với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên. - X3 là yếu tố pH với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên. Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme được tính sau đo OD595 (amylase) hoặc OD660 (protease). Bảng 2.1. Bố trí quy hoạch thực nghiệm Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y 1 + + + 2 + + - 3 + - + 4 + - - 5 - + + 6 - + - 7 - - + 8 - - - 9 0 0 0 10 0 0 0 11 0 0 0 Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. 2.2.6. Quy trình công nghệ lên men đậu hũ chế biến thức uống chức năng Hình 2.3. Quy trình công nghệ thủy phân đậu hũ làm thức uống chức năng Giải thích quy trình  Nhân giống Sau khi so sánh hoạt tính enzyme của BsTC và Bn, chọn vi khuẩn có hoạt tính enzyme tối ưu hơn để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. Dùng que cấy lấy vi khuẩn được chọn từ ống giống để cấy vào 10 ml môi trường sữa đậu nành đã thanh trùng, nuôi cấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.  Lựa chọn nguyên liệu Chất lượng đậu hũ có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, đặc biệt là giá trị cảm quan của sản phẩm. Yêu cầu của đậu hũ: Nhân giống trong môi trường sữa đậu nành Giống vi khuẩn được chọn Đậu hũ Hấp thanh trùng (1000C, 15 phút) Lên men Xay nhuyễn Cấy giống Cấy Lactobacillus sp. Phụ gia Sản phẩm - Trắng, mềm, mịn. - Mùi thơm. - Vị béo. - Đảm bảo vệ sinh và ổn định chất lượng.  Thanh trùng Hấp thanh trùng ở 1000C trong 15 phút nhằm tiêu diệt và ức chế một phần các vi sinh vật có trong đậu hũ để chuẩn bị cấy giống vào cho quá trình lên men.  Xay nhuyễn Dùng máy xay sinh tố gia đình (đã vô trùng) để xay đậu hũ tơi nhuyễn trong thời gian 3 phút.  Cấy giống Cấy giống phải thực hiện trong tủ cấy đã được vô trùng bằng cách lau cồn, chiếu đèn cực tím. Hút giống đã được tăng sinh từ môi trường sữa đậu nành cho vào đậu hũ đã xay nhuyễn với tỉ lệ đã được khảo sát - Tỉ lệ giống khảo sát: 0.5%, 1%, 2% (v/w).  Lên men Quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện đã khảo sát. - Khảo sát thời gian lên men: 15, 18, 21, 24, 27 giờ.  Cấy Lactobacillus sp. Cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. đã được tăng sinh từ môi trường sữa đậu nành cùng với lượng đường saccharose đã được khảo sát vào đậu hũ đã được lên men nhằm mục đích bảo quản và tạo vị chua đặc trưng vì theo nguyên tắc Lactobacillus sp. sẽ sử dụng đường saccharose làm nguồn dinh dưỡng và lên men tạo acid lactic. - Khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus bổ sung vào: 0%,1%, 2% (v/w). - Khảo sát lượng đường saccharose bổ sung: 0%, 1%, 2% (v/w) - Khảo sát điều kiện bảo quản: nhiệt độ phòng và tủ lạnh (10-200C). - Theo dõi thời gian bảo quản. Bổ sung phụ gia Nhằm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm ta cần bổ sung một số phụ gia với nồng độ phù hợp sau khi khảo sát. - Về màu sắc, sản phẩm có màu trắng của đậu hũ rất có giá trị cảm quan nên không bổ sung phụ gia tạo màu. - Về mùi, sản phẩm có mùi đậu hũ lên men nên chúng tôi chọn hương phomai có mùi thơm béo như đậu hũ. Khảo sát tỉ lệ hương bổ sung: 10/00, 2 0/00, 3 0/00, 4 0/00(v/w). - Về vị, chúng tôi sử dụng đường aspartam, là loại đường tạo vị ngọt nhưng không chứa calo. Khảo sát tỉ lệ đường aspartam bổ sung: 0,350/00, 0,7 0/00, 1,05 0/00, 1,4 0/00 (v/w) tương đương 1, 2, 3, 4 gói thành phẩm đường aspartam (35 mg/gói). 2.2.7. Phương pháp phân tích 2.2.7.1. Xác định độ ẩm [3] Nguyên tắc Làm bay hơi hết nước trong thực phẩm. Cân trọng lượng thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. Dụng cụ - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ. - Cân phân tích. - Bình hút ẩm. - Đĩa Petri. Cách tiến hành - Cân đĩa sấy khô. - Cân 10 g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào đĩa Petri. - Cho tất cả vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường tối thiểu là 6 giờ. - Sấy xong, đem làm nguội ở bình hút ẩm (25 – 30 phút) và đem cân ở cân phân tích với độ chính xác đến 0.0001 g. - Cho vào lại tủ sấy 100 – 1050C trong 30 phút, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân như trên cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0.5 mg cho mỗi gam chất thử. Tính kết quả Độ ẩm theo phần trăm (X) được xác định bằng công thức: X = (G1 – G2) * 100 / (G1 – G) G: trọng lượng đĩa Petri. G1: trọng lượng đĩa Petri và mẫu trước khi sấy. G2: trọng lượng đĩa Petri và mẫu sau sấy tới trọng lượng không đổi. 2.2.7.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl [12] Nguyên tắc - Vô cơ hóa đạm bằng H2SO4 đậm đặc thành amon sulphate ((NH4)2SO4)). Muối này đem tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3. H2SO4 đậm đặc Chất đạm (NH4)2SO4 Xúc tác, nhiệt độ (NH4)2SO4 + NaOH  2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4 - Sau đó, lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3. Mà ở đó H3BO3 tự phân ly. H3BO3  HBO2 + H2O - Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2 NH4OH + HBO2  NH 4+ + BO2- + H2O BO2- là một base mạnh, vì vậy dung dịch của bình hứng sẽ chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2- được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. BO2- + H+  HBO2 Hóa chất và thiết bị - Máy Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo - Burret 25 ml - Bếp nung - Bình chưng cất - H2SO4 đậm đặc - NaOH 32% - HCl 0,25N - Chất xúc tác: là hỗn hợp của 60 g selenium + 75 g CuSO4+ 865 g K2SO4 - Hỗn hợp chỉ thị màu: + Hòa tan 0,264 g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối. + Hòa tan 1,28 g bromo cresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối. Trộn đều hai dung dịch trên , bổ sung đến 1 lít bằng cồn tuyệt đối. - Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: hòa tan 80 g acid boric trong 1800 ml nước cất, đun nóng một chút, để nguội bổ sung 25 ml hỗn hợp chỉ thị màu. Bổ sung đến 2 lít bằng nước cất. Cách tiến hành - Vô cơ hóa mẫu + Nguyên tắc: sự vô cơ hóa chất đạm là sự vô cơ hóa tất cả các chất đạm dù ở bất cứ dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amoniac sulphate (NH4)2SO4) đậm đặc và chất xúc tác. + Thực hành: cân 100 mg mẫu đã nghiền nhỏ, 1 g chất xúc tác cho vào ống phá mẫu + 5 ml H2SO4 đậm đặc, nối bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu. Khi thời gian phá mẫu kết thúc để ống phá mẫu nguội. Bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất. + Chưng cất Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 80 ml NaOH 32%. Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu. Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện màu phớt đỏ. Tính kết quả Thông qua lượng HCl 0,25N ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được NH3 giải phóng từ mẫu. 1 ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035 g nitơ hữu cơ. % Nitơ tổng số = C VHCl*100*0035.0 VHCl 0.25N : thể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ. C (g): trọng lượng mẫu đem xác định. 2.2.7.3. Phương pháp xác định đạm amoniac [12] Nguyên tắc Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm dưới dạng vô cơ (muối amon hay các amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình phân hủy cacboxyl của acid amin) có bản chất là base, vì thế về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này ._.