So sánh các chủng nấm men đang được sử dụng trong các nhà máy sản xuất cồn eetylic ở Việt Nam từ nguyên liệu rỉ đường

g nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y tế... Sản lượng cồn rượu mà thế giới sản xuất ra hàng năm ngày càng tăng. Chưa có tài liệu nào cho phép chúng ta biết rõ số lượng cồn rượu làm ra và việc sử dụng chúng ở tất cả các nước trên thế giới. Hầu hết các nước trên thế giới đều dùng cồn để pha chế rượu và cho các nhu cầu khác nhau như: y tế, nhiên liệu và nguyên liệu cho các ngành công nghiệp khác. Đặc biệt từ sau cuộc khủng hoảng về dầu hoả làm giá xăng dầu, nhiên liệu tăng quá cao thì việc nghiên cứu sản xuất cồn làm nhiên liệu trở nên phổ biến trên thế giới. ở các nước có công nghiệp rượu vang phát triển như Italia, Pháp, Tây Ban Nha, Modova... cồn được dùng để tăng thêm nồng độ rượu. Một lượng khá lớn cồn được dùng để pha chế các loại rượu mạnh, cao độ như Whisky, Brandy, Rhum.. Nước ta nằm ở vùng á nhiệt đới, thích hợp cho việc trồng mía tạo thuận lợi cho công nghiệp mía đường phát triển. Nhờ quá trình đổi mới, công nghiệp đường mía phát triển rất mạnh, nguyên liệu mía đã được trồng ở khắp mọi nơi, sản lượng đường tăng rất nhanh và đạt tới một triệu tấn vào năm 2000. Cùng với sản phẩm chính là đường kính, sản lượng rỉ đường, một loại phụ phẩm của công nghiệp mía đường, thải ra hàng năm cũng tăng một cách đáng kể làm cho rỉ đường mía tồn đọng với khối lượng lớn tại các nhà máy đường. Đó là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất các sản phẩm có ích từ vi sinh vật như cồn etylic, axit citric, axit lactic, sinh khối nấm men... Theo thống kê chưa đầy đủ, mỗi năm nước ta có gần 1/2 triệu tấn rỉ đường cần chế biến, trong đó có khoảng 1/4 được dùng để sản xuất axit glutamic, số còn lại được dùng để sản xuất cồn etylic bằng các công nghệ phần lớn là còn lạc hậu mà đặc điểm chính là hiệu suất chuyển hoá đường thành rượu thấp nên nồng độ cồn trong dấm chín không cao, dẫn tới hậu quả là hiệu quả kinh tế thấp. Một yếu tố quan trọng trong công nghệ sản xuất rượu cồn là chủng nấm men dùng để lên men. Nấm men dùng trong sản xuất cồn êtylic phải có khả năng lên men các đường nhanh và càng triệt để càng tốt, đồng thời tạo ít sản phẩm trung gian và sản phẩm phụ, ổn định và chịu được những biến đổi của môi trường. Hiện nay, các nhà máy sản xuất cồn từ rỉ đường thường sử dụng các chủng IA,B, ,L, G-67, G-73, 28. Một số nhà máy đẵ đưa nấm men khô bánh mì vào sử dụng. Theo như khuyến cáo của nhà sản xuất nấm men thì nấm men khô có nhiều ưu điểm như: thời gian lên men nhanh, không qua giai đoạn tăng sinh khối, ít nhiễm khuẩn, luôn đảm bảo mật độ tế bào trong dịch lên men, thu hồi CO2 cao, tạo ít sản phẩm phụ. Các ưu điểm trên của nấm men khô có đúng không cần được kiểm nghiệm qua thực tế sản xuất. Nhưng mục đích cuối cùng trong sản xuất cồn êtylic là hiệu suất thu hồi cồn cao. Vì thế, bên cạnh việc cải tiến các điều kiện kĩ thuật công nghệ, việc chọn được chủng nấm men tốt cho hiệu suất thu hồi cồn cao là hết sức quan trọng trong sản xuất cồn êtylic. Để so sánh và tìm ra chủng nấm men tốt nhất cùng các điều kiện tương ứng nhằm ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất rượu cồn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đê tài: So sánh các chủng nấm men đang được sử dụng trong các nhà máy sản xuất cồn êtylic ở Việt Nam từ nguyên liệu rỉ đường. Nội dung nghiên cứu bao gồm: Khảo sát hình thái và khả năng sinh trưởng của các chủng Đánh giá sơ bộ khả năng lên men của các chủng Đánh giá khả năng chuyển hoá đường thành rượu của các chủng ảnh hưởng của các điều kiện lên men tới khả năng lên men của các chủng +ảnh hưởng của nhiệt độ +ảnh hưởng của pH +ảnh hưởng của nồng độ chất khô +ảnh hưởng của nồng độ chất sát trùng Phần ii Tổng quan về tài liệu II.1 Giới thiệu về công nghệ sản xuất rượu etylic ở Việt Nam. Rượu etylic đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp ở Việt Nam từ đầu thế kỉ 19 với hai nhà máy rượu là nhà máy rượu Hà nội ở miền bắc và nhà máy rượu Bình Tây ở miền nam. Từ năm 1956, nhà máy rượu Hà Nội đã được nhà nước khôi phục trở lại hoạt động nhằm cung cấp chủ cho nhu cầu uống của nhân dân ta và một phần lớn dành cho xuất khẩu sang các nước Đông Âu. Kể từ đó đến nay, các công đoạn trong công nghệ sản xuất rượu cồn liên tục được đổi mới và hiện đại hoá nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm. Hiện nay,để sản xuất được 1 lit cồn 96% chỉ cần tối đa 2,6-2,8 Kg bột sắn hoặc 4-5 Kg rỉ đường.Tuy nhiên, ở Việt Nam, Rượu etylic sản xuất ra chủ yếu phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu còn cho các ngành khác thì còn hạn chế. Khoảng 10 năm trở lại đây, sau khi các nước Đông âu tan rã, công nghiệp sản xuất rượu cồn ở Việt Nam gặp không ít khó khăn do thị trường tiêu thụ bị thu hẹp. Do vậy, công nghiệp sản xuất rượu cồn cũng ít được chú trọng phát triển. Hiện nay, cả nước đang trong giai đoạn công nghiệp hoá và hiện đại hoá, nhu cầu rượu cồn ngày càng cao để phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng của nhân dân cũng như để phục vụ cho các ngành công nghiệp khác nhau, công nghiệp sản xuất rượu cồn đang được khôi phục và phát triển. Song song với các nhà máy sản xuất từ tinh bột, các nhà máy sản xuất rượu từ rỉ đường cũng được chú trọng phát triển để tận dụng nguồn phế thải của các nhà máy đường. Rỉ đường trong sản xuất chiếm 3-4% trọng lượng mía. Ngày nay, với chương trình mía đường quốc gia, nhiều nhà máy đường đã mọc lên ở khắp mọi nơi. Có tổng cộng khoảng 50 nhà máy đường có công suất 400 đến 800 tấn mía/ngày. Sản lượng đường hiện nay đạt 1000.000 tấn/năm. Như vậy, hàng năm, các nhà máy đường thải ra khoảng 400.000-600.000 tấn rỉ đường. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để cung cấp cho ngành công nghiệp lên men đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất rượu cồn. Sơ đồ2.1 Quy trình sản xuất cồn etylic từ rỉ đường Rỉ đường Pha loãng và axit hóa Cặn Pha chế rỉ đường, nuôi men và lên men Lên men rỉ đường Men giống Chưng cất Tinh chế II.2 Rỉ đường mía II.2.1.thành phần cấu tạo [1,4,5,8] Rỉ đường mía là thành phần còn lại của dung dịch đường sau khi đã tách phần đường kính kết tinh. Số lượng và chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, hoàn cảnh địa lí và trình độ kĩ thuật chế biến của nhà máy đường. Thông thường rỉ đường mía thu được bằng 3-4% trọng lượng mía đưa vào chế biến. Thành phần chính của rỉ đường là đường, các chất phi đường và nước. Rỉ đường mía có khoảng 20% nước, 62% đường và 10% chất phi đường hoặc cao hơn một chút. Nước trong rỉ đường gồm phần lớn ở trạng thái tự do và số ít ở trạng thái liên kết dưới dạng hydrat. Đường trong rỉ đường bao gồm 25-40% saccharoza, 15-25% đường khử (glucoza và fructoza) và 3-5% đường không lên men được tạo nên trong quá trình chế biến đường. Theo nghiên cứu của một số tác giả, ngoài saccharoza, glucoza và fructoza, rỉ đường mía còn có một lượng nhỏ các loại đường khác như rafinoza, lactoza, mantoza và xyloza. Đường nghịch đảo của rỉ đường bắt nguồn từ mía và sự thuỷ phân saccharoza trong quá trình chế biến đường. Sự phân giải saccharoza thành glucoza và fructoza vừa là sự mất mát saccharoza vừa là sự yếu kém về chất lượng bởi vì glucoza và fructoza sẽ biến thành axit hữu cơ và hợp chất màu dưới điều kiện thích hợp. Trong môi trường kiềm fructoza có thể biến thành axit lactic, fucfurol, oxymetyl, trioxyglutaric, axetic, formic và CO2. Đường nghịch đảo còn tác dụng với axit amin, peptit bậc thấp của dung dịch đường để tạo nên hợp chất màu melanoidin. Tốc độ tạo melanoidin phụ thuộc vào pH : rất thấp ở pH 4,9 và rất cao ở pH 9. Trong rỉ đường còn có trisacharit hay polysaccharit. Trisaccharit gồm 1 mol glucoza và 2 mol fructoza. Polysaccharit gồm dextran và levan. Những loại đường này không có trong nước mía và vi sinh vật tạo nên trong quá trình chế biến đường. Các chất phi đường gồm phi đường hữu cơ và phi đường vô cơ. Phi đường hữu cơ chứa nitơ của rỉ đường mía chủ yếu là các axit amin cùng với một lượng rất nhỏ protein và sản phẩm phân giải của nó. Nitơ tổng số trong rỉ đường mía xê dịch trong khoảng 0,4-1,5%, trung bình là 0,7% trọng lượng của rỉ đường. Theo một số nhà nghiên cứu, rỉ đường mía có tất cả các axit amin như trong rỉ đường củ cải đường. Hợp chất phi đường không chứa nitơ bao gồm pectin, araban, galactan hoặc các sản phẩm thủy phân từ chúng là arabinoza và galatoza, chất nhày, chất màu và chất thơm. Pectin bị kết tủa trong quá trình chế biến đường nhưng các chất vừa nói không kết tủa và gần như toàn vẹn đi vào rỉ đường. Người ta đã phân tích định tính các loại axit hữu cơ và cho biết các axit sau đây có trong rỉ đường mía của các nước Đông Nam á : Axit aconitic, lactic, malic, xucxinic, glycolic, xitric và lượng nhỏ fumaric, oxalic, và gluconic. Riêng gaxit aconitic có nồng độ khá cao, xấp xỉ 0,1-0,2%. Các chất màu của rỉ đường bao gồm chất caramen, melanoid, melanin và phức phenol Fe2+. Cường độ màu tăng ba lần khi nhiệt độ tăng thêm 100C. Độ màu tăng có nguồn gốc sâu xa từ sự biến đổi của saccharoza. Có thể chia các hợp chất màu thành nhiều nhóm -Chất caramen : Xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharoza kèm theo loại trừ nước và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. -Phức chất polyphenol –Fe+2 : là Fe+2 –brenzcatechin có màu vàng xanh không thể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường. -Melanoidin : Đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và axit amin mà chủ yếu là axit aspactic. sản phẩm ngưng tụ quen biết nhất là axit fuscazinic đóng vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đường. -Melanin: Được hình thành nhờ phản ứng oxy hoá khử các axit amin thơm nhờ xúc tác của enzym polyphenol-oxydaza khi có mặt của O2 và Cu2+. -Humin : Được trùng hợp từ 66-68 các đơn vị cấu tạo của axit amin. Từ đó phân tích ra được khoảng 52-53 gốc axit aspactic, 5 gốc axit amino-b-butyric, 2 gốc axit glutamic, 2 gốc b-amino propionic và 1 gốc axit p-butyric, 2 gốc axit p-amino-izovaleric. Ngoài ra rỉ đường còn có chứa hợp chất màu nâu có công thức cấu tạo C17-18H26-27O10N. -Chất keo : Có trong rỉ đường chủ yếu là pectin, chất sáp và chất nhày. Các chất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài môi trường. Ngoài ra các chất keo là nguyên nhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. Các chất phi đường vô cơ chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ đường. Độ tro của rỉ đường mía thấp hơn độ tro của rỉ đường củ cải đường. Muối Kali có khá nhiều trong rỉ đường, tiếp đến là Canxi và SO2. Điều này dễ hiểu vì muối Kali được dùng để bón cho mía còn muối canxi và gốc sulfat được thêm vào ở giai đoạn xử lý nước mía khi tinh luyện đường. Ngoài các yếu tố kim loại hay á kim kể trên, rỉ đường mía chứa nhiều nguyên tố khác với lượng cực kì nhỏ chỉ có thể tính bằng mg/kg rỉ đường như Fe 115; Zn 34; Mn 18; Cu 4,9; B 3,0; Co 0,59 ... Rỉ đường mía rất giàu các chất sinh trưởng như axit nicotinic, folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin. II.2.2.vi sinh vật trong rỉ đường mía Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía. Đa số chúng từ nguyên liệu, một số nhỏ từ không khí, nước và đất vào trong dịch đường. Loại nào chịu được tác dụng của nhiệt hay tác dụng hoá chất trong quá trình chế biến, sản xuất đường thì tồn tại. Có thể phân chúng thành 3 loại : Vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Trong đó vi khuẩn là nguy hiểm hơn cả vì nó gồm nhiều giống có khả năng sinh bào tử. Người ta chia rỉ đường làm 3 loại tuỳ theo lượng vi sinh vật tạp nhiễm. Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm Loại rỉ đường Số lượng vi sinh vật trong 1 g rỉ đường Đánh giá và xử lí I 100.000 Rất tốt, không cần xử lí II 100.000-1.000.000 Trung bình, cần thanh trùng III 1.000.000-5.000.000 Nhiễm nặng, cần xử lí nghiêm ngặt bằng hoá chất và tác dụng nhiệt II.2.4. Lực đệm của rỉ đường mía Lực đệm là loại lực có sức tự ngăn cản sự biến đổi phản ứng của rỉ đường khi bổ sung kiềm hoặc axit. Rỉ đường mía có tính đệm đặc trưng. Bình thường pH của rỉ đường mía nằm trong khoảng 5,3-6,0. Trong quá trình bảo quản pH có thể bị giảm do hoạt động của vi sinh vật tạp nhiễm tạo ra các axit hữu cơ. Khi thêm HCl hay H2SO4 vào rỉ đường, axit sẽ tác dụng với các muối kiềm của các axit hữu cơ làm xuất hiện các muối vô cơ (KCl, NaCl hay K2SO4, Na2SO4) và các axit hữu cơ tự do; qua đó pH của rỉ đườngbị thay đổi rất ít khi tiếp tục thêm axit HCl hay H2SO4. Lực đệm của rỉ đường biểu hiện mạnh nhất ở pH 3,0-5,0, trung bình ở pH 5,0-6,0 và rất ít ở pH 6,0-7,0. II.2.5 Các phương pháp xử lí rỉ đường Trong mật rỉ thường chứa 100.000 đến 500.000/g các tạp khuẩn không nha bào. Trong điều kiện nồng độ chất khô trong mật rỉ lớn hơn 75% chúng không sinh trưởng và phát triển nhưng vẫn bảo vệ được sự sống của mình. Khi pha loãng đến nồng độ thấp, chúng sẽ bắt đầu phát triển và tiêu hao đường trong mật rỉ. Vì vậy cần xử lí nhằm diệt hết hoặc giảm bớt các tạp khuẩn, đồng thời phá huỷ hoặc loại bớt các hợp chất có hại cho quá trình lên men như các chất keo, SO2, chất lơ lửng (huyền phù), chất màu, axit hữu cơ dễ bay hơi ... Khi rỉ đường được xử lí tốt, quá trình lên men diễn ra nhanh chóng, hạn chế được khả năng nhiễm tạp, nâng cao hiệu suất lên men. Hiện nay thường có hai phương pháp xử lí chính: Phương pháp hoá học: Người ta sử dụng H2SO4 có khả năng làm đông tụ, kết tủa các chất keo. Lượng H2SO4 cho vào phụ thuộc vào tính chất kiềm hay axit của rỉ đường. Axit hoá kết hợp tác dụng của nhiệt độ nhằm loại bớt các tạp chất tro, keo và tạp trùng, thuỷ phân một phần sacharoza thành glucoza và fructoza, tạo pH thích hợp cho nấm men phát triển. Một số muối của axit hữu xơ như oxalat, nitrat, lactat... dưới tác dụng của H2SO4 và nhiệt độ sẽ tạo thành axit hữu cơ tự do. Có thể kết hợp sử dụng nhiệt hoặc không khi xử kí rỉ đường theo phương pháp hoá học. Phương pháp cơ học: Dùng phương pháp li tâm để loại bớt chất bẩn và chất keo. Làm trong bằng phương pháp này rút ngắn thời gian xử lí rỉ đường, không tốn axit, không ăn mòn thiết bị, đảm bảo quá trình pha chế môi trường nhanh, liên tục nhưng độ trong không bền và tạo thành cặn trong thiết bị lên men. Li tâm với tốc độ từ nhỏ đến lớn để đảm bảo tách hết cặn lớn nhỏ. Phương pháp này có thể hoặc không kết hợp với tác dụng nhiệt tuỳ theo mục đích sử dụng và chất lượng rỉ đường. II.3. Nấm men trong sản xuất rượu êtylic [2,3,5] Trong sản xuất rượu etylic, người ta thường dùng chủng nấm men Saccharomyces Cerevisea thuộc họ Endomycetaceae. Yêu cầu của nấm men dùng trong sản xuất rượu là phải có năng lực lên men cao, tức là phải có khả năng biến đường thành rượu nhanh, càng triệt để cành tốt đồng thời phải ổn định, tạo ít các sản phẩm trung gian, chịu được những thay đổi của môi trường trong điều kiện sản xuất như nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ cồn ... và chất sát trùng. Lên men nổi mà đặc điểm của nó là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho tới khi lên men gần kết thúc. Sau đó, nấm men sẽ lắng dần nhưng chậm và không tạo thành lớp men bám xít, bám chắc ở đáy thùng. Theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành chuỗi, dạng bóng như nấm men chìm. II.3.1. Hình thái và kích thước tế bào nấm men Nấm men thường có cấu tạo đơn bào, nó có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình oval, hình trứng, hình bầu dục... Hình dáng và kích thước của nấm men thay đổi tuỳ thuộc vào loài, điều kiện nuôi cấy và tuổi của nấm men. Trong sản xuất rượu, các loại nấm men thường có kích thước khoảng 2,5-10 x 4,5-21mm do đó có thể thấy rõ được dưới kính hiển vi quang học. II.3.2. Cấu tạo của tế bào nấm men Tế bào nấm men có cấu tạo rất phức tạp, chia thành 2 phần chính : vỏ tế bào và phần trong nội tế bào. ( vỏ và protoplasma) Vỏ tế bào là một thành mỏng, trong suốt và có tính đàn hồi, có nhiệm vụ bảo vệ tế bào khỏi tác động bên ngoài; đồng thời điều chỉnh mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng và thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Vỏ này được cấu tạo chủ yếu từ polisaccarit kiểu hemixenluloza gồm glucan và manan. Ngoài ra thành vỏ tế bào còn chứa một lượng rất nhỏ chất béo, prôtit, chất khoáng và xitin. Thực ra thành tế bào gồm ba lớp : Lớp ngoài là màng nhãn dày 10 đến 30nm gồm chủ yếu lypoproteit. Lớp tiếp theo chứa phức hợp manan protein dày 100nm. Lớp trong cùng có thể là chất keo hoặc sợi li ti dày từ 10 đến 50nm, cấu tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucoza và khoảng 6% hexoamin. ở vỏ ngoài người ta phát hiện có hai vùng mang tính thẩm thấu có chọn lọc đối với các chất khác nhau. Vỏ này chứa các lỗ có đường kính đến 3,6nm qua đó nước và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào được đi vào bên trong. Các enzim được tách ra từ tế bào tập trung ở các lớp này, chúng phân ly các đường có phân tử lớn ( maltoza, saccharoza) không có khả năng thẩm thấu vào trong được. Nhờ đó các đường maltoza, saccharoza được đồng hoá. Vỏ trong của tế bào là màng plasma rất mỏng, dày khoảng 8nm và cũng gồm 3 lớp, được cấu tạo từ phức hợp lypoproteit, canxi và ribonucleoprotit. Chức năng chủ yếu của màng là điều chỉnh vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào. Xitoplasma là hệ thống keo, độ nhớt của nó phụ thuộc vào thời kì sinh trưởng và các yếu tố sinh lí. ở các tế bào non trẻ, độ nhớt của xitoplasma nhỏ hơn ở tế bào già, bảo đảm cho việc vận chuyển sản phẩm trao đổi chất được tốt hơn. Xitoplasma còn có tên chung là protoplasma. protoplasma của nhân tế bào còn có tên riêng là nucleoplasma, còn nếu ở ngoài nhân thì gọi là xitoplasma. Valutin gồm các chất chứa nitơ, dẫn xuất của axit nucleic. Nó có quan hệ tới sinh trưởng của nấm men và xuất hiện trong thời kì sinh trưởng, nảy chồi hay tạo nang bào. Valutin nằm bên trong không bào, ở dạng hạt to (valutin nằm yên) hoặc nhiều hạt nhỏ phân bố xung quanh mặt bên trong của không bào ( valutin hoạt động). Khi tiếp xúc với metylen xanh, valutin ở tế bào sống sẽ biến thành màu đỏ, còn tế bào chết sẽ biến thành màu xanh nhưng bản thân nấm men không đổi màu. Nhân tế bào được bao bọc bởi màng. Bên trong chứa đầy nucleoplasma trong suốt và những sợi chỉ nhỏ dài gọi là cromoxom. Cromoxom cấu tạo từ protit và axit dezoxyribonucleic. Ngoài hai chất kể trên, cromoxom còn chứa axit ribonucleic và các enzim. Cromoxom đóng vai trò quan trọng trong tế bào, thực hiện chức năng di truyền và trao đổi chất, kiểm soát sự phân hoá tế bào và tổng hợp protit, lypoproteit và các quá trình khác, kể cả sự sinh sản. Quá trình nảy chồi xảy ra cùng với việc tách nhân làm hai, khi tạo nang bào nhân sẽ tách thành nhiều phần, tuỳ theo số nang bào tạo thành. Nhân tế bào có hình tròn, đường kính từ 1 đến 2mm. Nó bị ngăn cách với các xitoplasma bởi hai lớp màng. Các màng này thông với nhau qua các lỗ có đường kính từ 30 đến 100nm. Qua đó sự liên hệ giữa nucleoplasma và xitoplasma được thực hiện. Người ta cho rằng sự liên hệ này mang tính chịn lọc cao. Mitokhondrin là những phần rất bé nhỏ ở xitoplasma, tựa các sợi có chiều rộng như nhau 0,2-0,5mm nhưng khác nhau về chiều dài và có thể từ 4,0-1mm. Mitokhondrin được cấu thành từ protit, axit ribonucleic và các hợp chất photpho. Chúng còn chứa các enzim thuỷ phân protit, chất béo và gluxit. Chức năng chủ yếu của mitokhondrin là ghép nối sự tổng hợp ATP và ADP với axit photphoric để tạo ra nguồn năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Với ý nghĩa đó, mitokhondrin được gọi là “nhà máy điện” của tế bào. Riboxom là xitoplasma có dạng túi nhỏ, cấu tạo từ lipoit, protit, và axit ribonucleic. Đây là cấu tử nhỏ nhất ở tế bào, trong đó chứa phần chủ yếu của dịch axit ribonucleic và phức hệ của enzim. Phức hệ của enzim này bảo đảm sinh tổng hợp các hợp chất quan trọng nhất của tế bào-trước hết là protit. Vì thế riboxom còn được gọi là “phân xưởng sản xuất protein”. Không bào là một túi chứa đầy dịch tế bào. Tuỳ theo giai đoạn sinh trưởng trong đó có thể có một hoặc hai túi bé hơn. ở các tế bào trẻ không bào ít xuất hiện, ở các tế bào già không bào trở nên lớn, có khi chiếm gần hết tế bào. Điều này là do trong quá trình trao đổi chất, không bào là chỗ tạm chứa các sản phẩm trung gian và sau đó thải vào protoplasma để chịu những biến đổi tiếp theo. Nhưng khi trao đổi chất kết thúc các chất không bị biến đổi sẽ tích tụ trong không bào- đẩy protoplasma về phía thành tế bào. ở không bào là chỗ xảy ra các quá trình enzim sôi động để tạo ra các sản phẩm trung gian. Không bào cách biệt với xitoplasma bởi những màng lypoproteit. Tất cả các cơ quan chức năng của xitoplasma đều được đặt ở vị trí xác định. Vì thế bên trong tế bào có rất nhiều vách ngăn và kênh dẫn. Nhờ đó các phản ứng sinh học trong tế bào đều xảy ra theo trật tự nghiêm ngặt. II.3.3. Thành phần hoá học và dinh dưỡng của nấm men Thành phần hoá học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lí cũng như điều kiện nuôi cấy. Men ép chứa trung bình 75% nước và 25% chất khô. Các chất khô của nấm men bao gồm thành phần sau: Protit 30-50% Gluxit 24-40% Chất béo 2-5% Chất khoáng 5-11% Gluxit của nấm men chủ yếu là glucogen (C6H10O5)n, đây là chất dự trữ của tế bào. Theo thành phần cấu tạo thì glucogen giống như amylopectin nhưng khác là khối lượng phân tử lớn hơn. Hàm lượng của nó trong tế bào men có thể từ 20-40% và tuỳ thuộc trước hết vào môi trường dinh dưỡng. Trong môi trường dư đường, lượng glucogen tăng đáng kể. Trong giai đoạn đầu của lên men nồng độ đường còn cao nên nấm men chứa nhiều glucogen. Khi lượng đường giảm, nấm men sẽ sử dụng glucogen để duy trì sự sống. Dưới tác dụng của a-amylaza, glucogen sẽ biến thành maltoza và dextrin. Protit chứa trong nấm men rượu thường vào khoảng 35-40% và có đủ các axit amin không thay thế được. Về giá trị dinh dưỡng thì protit nấm men tương đương protit động vật nhưng giá trị hơn protit thực vật. ở nhiệt độ cao và bình thường, dưới tác dụng của proteazacó sẵn trong nấm men, protit sẽ biến thành pepton, peptit và axit amin. Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất, hàm lượng khoảng 2-5% khối lượng chất khô. Trong nấm men còn chứa các chất tương tự chất béo như lơxitin và sterin. Trong số đó quan trọng hơn cả là ecgosterin, chất này dễ biến thành vitamin D dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời và còn gọi là tiền vitamin D. Hàm lượng vào khoảng từ 0,3-1,4% chất khô của nấm men. Chất khoáng chiếm từ 5-11%. Tuy với số lượng ít nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của tế bào nấm men, đặc biệt là photpho. Photpho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của photphatit, nucleoproteit cũng như axit nucleic. Trong tế bào nấm men có chứa các ion Kali, canxi, magie, sắt, lưu huỳnh và axit silic. Lưu huỳnh có trong thành phần protit ở dạng –SH hoặc –S-S-. Lưu huỳnh và sắt đều tham gia phản ứng oxy hoá khử. Sắt cùng với các hợp chất vô cơ khác như kẽm, mangan, đồng, magie... là những chất không thể thiếu đối với nhiều enzim oxy hoá (oxydaza, katalaza, peroxydaza). Magie cũng như lưu huỳnh và photpho còn có tác dụng làm hoạt hoá photphataza trong quá trình lên men. Caxni giúp và loại bỏ các chất độc thải ra khi lên men, đồng thời giúp cho tổng hợp protit, làm tăng quá trình oxy hóa và có tác dụng tạo thành một số vitamin. Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin B1 có trong thành phần của coenzim cacboxylaza. vitamin B2 có ở dạng este photphoric, axit nicotin có trong cozymaza... Biotin và axit paraaminobenzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của nấm men. trong tế bào nấm men chứa nhiều loại vitamin và với hàm lượng khá lớn nên hiện nay nấm men được coi là nguồn nguyên liệu quí trong sản xuất một số vitamin. Trong điều kiện sản xuất rượu, nguồn thức ăn của nấm men như gluxit và chất khoáng thường có sẵn và đủ trong môi trường. Vitamin với số lượng rất ít thường được cung cấp từ chế phẩm amylaza đưa vào khi đường hoá. Riêng nguồn nitơ thường không đủ, phải được bổ sung từ ure hoặc amon sulphat. Theo nghiên cứu của Cônôvalôp, lượng nitơ hoà tan cần có trong môi trường lên men rượu phải vào khoảng 0,35-0,4g/l. Nếu thiếu nitơ nấm men sẽ phát triển chậm, thời gian lên men kéo dài, hiệu suất lên men giảm. II.3.4 Đặc điểm sinh lí sinh hoá của tế bào nấm men Nấm men giống như các vi sinh vật khác cần nguồn năng lượng để phát triển và sinh sản. Chúng phân huỷ các chất dinh dưỡng bằng các phản ứng oxy hoá khử để giải phóng năng lượng và tạo nên các chất chuyển hoá để tổng hợp nên các thành phần cấu trúc tế bào. Nấm men là vi sinh vật hô hấp tuỳ tiện. Trong điều kiện đủ oxy chúng sẽ chuyển các chất có trong môi trường để cung cấp năng lượng và bộ xương cacbon cho việc xây dựng cơ thể theo phương trình sau: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 34ATP aC6H12O6 + bO2 + cNH4OH dCxHyOzNt + eCO2 + fH2O Trường hợp này nấm men sử dụng các hợp chất nitơ, photpho và các muối khoáng… để tạo sinh khối. Các axit amin tạo ra được hoạt hoá và liên kết với ARN hoà tan rồi chuyển vào Riboxom. ở đây diễn ra sự tổng hợp các mạch peptit và protit. Ngược lại trong điều kiện yếm khí nấm men phân giải đường thành rượu và các sản phẩm khác: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Saccharomices Cerevisiae có thể lên men các loại đường như: glucoza, fructoza, saccharoza, tiếp theo là đường maltoza và cuối cùng là đường maltotrioza. Nấm men này chỉ có thể sử dụng 1/3 phân tử Rafinoza. Các loại hợp chất nitơ thích hợp nhất đối với nấm men là các axit amin, rồi đến các nitơ vô cơ như (NH4)2HPO4, ure, amonsunfat… II.3.5. Sinh sản và phát triển của nấm men Trong môi trường dinh dưỡng đầy đủ, nấm men sinh sản và phát triển rất nhanh. Nấm men có thể sinh sản theo phương pháp nẩy chồi, phân chia, vừa nảy chồi vừa phân chia, và trong điều kiện không thuận lợi nấm men có tạo bào tử để duy trì sự sống. Có thể khẳng định nẩy chồi là phương pháp sinh sản chủ yếu của nấm men. Bản chất của phương thức nảy chồi: Khi tế bào nấm men phát triển đến một giới hạn nhất định thì bắt đầu xảy ra hiện tượng nẩy chồi. Đầu tiên nhân dài ra và bắt đầu thắt lại thành mấu nhỏ. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Nhân một phần chuyển vào tế bào con và một phần ở lại tế bào mẹ. Đồng thời một phần nguyên sinh chất cũng được chuyển sang tế bào con. Chồi con lớn dần, khi gần bằng tế bào mẹ nó được tách ra và sống độc lập. Một tế bào mẹ có thể tạo một lúc một hay nhiều chồi con. Sau mỗi lần nẩy chồi trên, tế bào mẹ có một vết sẹo. Sự sắp xếp chồi con ở trên tế bào mẹ không nhất thiết phải ở một nơi cố định. ii.3.6. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nấm men Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật tuân theo một quy luật nhất định. Sinh khối (g/L) Biểu thị quy luật sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bằng một đồ thị người ta gọi là đồ thị sinh trưởng hay đường cong sinh trưởng. Thời gian (h) Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn Giai đoạn thứ nhất: Giai đoạn này gọi là pha tiềm phát, giai đoạn này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến lúc bắt đầu thấy sự sinh trưởng và phát triển nhanh. ở giai đoạn này, nấm men chỉ làm quen với môi trường nuôi cấy mà chưa tiến hành sinh sản. Kích thước của tế bào bắt đầu tăng dần do sự trao đổi chất với môi trường mạnh. Thời gian pha này ngắn hay dài phụ thuộc rất nhiều vào sinh lý của giống vi sinh vật đưa vào nuôi cấy và chất lượng của thành phần môi trường. Giai đoạn thứ hai: Còn gọi là pha cấp số hay pha logarit. Pha này biểu hiện rõ nét bởi tốc độ sinh sản của vi sinh vật đạt cực đại. Tế bào vừa sinh sản mạnh, vừa tăng sinh khối. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật tăng theo cấp số nhân theo phương trình sau: N1 = N0 x 2n Trong đó: N0 : số tế bào lúc đầu N1: số tế bào đạt được n : số thế hệ Trong giai đoạn này nồng độ các chất dinh dưỡng giảm nhanh do vi sinh vật sử dụng chúng rất mạnh. ở giai đoạn này vi sinh vật tổng hợp enzim với số lượng và chất lượng cao. Do vậy mục đích của quá trình nuôi cấy là thu nhận các chất có hoạt tính sinh học cao hoặc tế bào có khả năng hoạt động mạnh người ta thường kết thúc ở giai đoạn này. Giai đoạn thứ ba: là giai đoạn cân bằng hay ổn định,tổng số tế bào sinh ra gần bằng số tế bào chết đi nên số tế bào vi sinh vật trong giai đoạn này không thay đổi. Các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy giảm một cách rõ rệt. Các chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất được tích luỹ trong môi trường rất lớn. Giai đoạn thứ tư: Gọi là pha suy vong. ở giai đoạn này số lượng tế bào sinh ra và chết đi không cân bằng nhau. Số tế bào chết tăng nhanh. Sở dĩ như vậy là do: Chất dinh dưỡng trong môi trường giảm và dẫn đến hết nên vi sinh vật không đủ chất dinh dưỡng để duy trì quá trình trao đổi chất, bên cạnh đó tế bào lại già, sản phẩm trao đổi chất trong môi trường quá nhiều gây ức chế cho quá trình trao đổi chất của tế bào. ii.3.7. Cơ chế vận chuyển chất dinh dưỡng của tế bào Trong điều kiện nuôi cấy thuận lợi nấm men sinh sản và phát triển nhanh. Đường và các chất dinh dưỡng từ môi trường lên men, trước tiên được hấp thụ vào trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua màng bề mặt bán thấm đó mà thấm vào trong tế bào. Sự khuyếch tán qua vỏ tế bào và màng nguyên sinh chất này tuân theo những quy luật chung của sự khuyếch tán. Trong khi nước được vào ra tế bào một cách tự do thì đường và các chất dinh dưỡng khác chỉ được cho đi vào mà không cho quay ra. Thông qua các hoạt động sống của tế bào nấm men mà trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men liên tục xảy ra những phản ứng sinh hoá phức tạp để tổng hợp chất này và phân huỷ chất kia. Vì vậy, đường được đưa vào tế bào nấm men rồi bị chuyển hoá qua một chuỗi các phản ứng enzim để tạo thành sản phẩm cuối cùng là rượu etylic và CO2. Rượu etylic và CO2 được tạo thành liền thoát ra khỏi tế bào và khuyếch tán ra môi trường xung quanh. Vì rượu hoà tan vào nước theo tỷ lệ bất kỳ nên nó có thể khuyếch tán vào môi trường một cách nhanh chóng. Khí CO2 cũng có thể hoà tan được trong dịch thể song độ hoà tan của nó trong nước không lớn lắm (ở nhiệt độ 25-30oC và áp suất 760 mmHg, một lít nước hoà tan được 0,865-0,837 lit CO2). Độ hoà tan của khí CO2 trong rượu lớn gấp 3 lần trong nước. Do vậy mà trong môi trườ._.