Quy trình sản xuất sữa chua đậu nành tảo Spirulla

. Đặc biệt là thầy Trương Thanh Long đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Đồng cảm ơn thầy Nguyễn Minh Khang, trưởng phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm trường Cao Đẳng Kinh Tế Công Nghệ, đã tạo điều kiện thuận lợi, cho tôi những ý kiến bổ ích trong luận văn này. Vô cùng biết ơn người thân, bạn bè đã động viên, giúp đỡ nhiệt tình khi tôi thực hiện đề tài này. Do bước đầu tiến hành làm thử nghiệm chế biến sản phẩm nên không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong quý thầy cô và bạn bè đóng góp ý kiến để luận văn được hoàn chỉnh hơn. ii TÓM TẮT Đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất sữa chua đậu nành tảo spirulina” đã được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh thực phẩm – Trường Cao Đẳng Kinh Tế Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2008. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Qua quá trình thí nghiệm, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau 3 Trong môi trường MRS broth, sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đạt cực đại sau 15 giờ nuôi cấy, sinh khối vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus đạt cực đại sau 18 giờ nuôi cấy. 3 Trong môi trường sữa, sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus đạt cực đại sau 15 giờ nuôi cấy. 3 Thời gian thu men cái vi khuẩn là 6 giờ ủ. 3 Các thông số của quá trình lên men # Tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT là 8:2 # Thời gian lên men 3 giờ, ủ ở 43OC # Cấy 10% men cái với tỷ lệ giống cấy giữa Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus là 6:4 # Hàm lượng đường saccharose bổ sung là 8% # Hàm lượng tảo bổ sung là 6%, gelatin 5% 3 Thời gian bảo quản sản phẩm tối ưu là 10 ngày ở 4OC. iii MỤC LỤC Trang Trang tựa....................................................................................................................... i Lời cảm ơn..................................................................................................................... ii Tóm tắt.......................................................................................................................... iii Mục lục ......................................................................................................................... iv Danh sách các bảng ................................................................................................... viii Danh sách các hình ..................................................................................................... ix Chương 1.MỞ ĐẦU.....................................................Error! Bookmark not defined. 1.1.Đặt vấn đề ..............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................2 1.3.Công việc thực hiện...............................................................................................2 Chương 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................3 2.1.Tổng quan về đậu nành và sữa chua đậu nành ......................................................3 2.1.1.Lịch sử phát triển................................................................................................3 2.1.2.Cây đậu nành ......................................................................................................3 2.1.3.Hạt đậu nành.......................................................................................................4 2.1.3.1.Tính chất cơ lý và cấu trúc của hạt đậu nành .................................................4 2.1.3.2.Thành phần hóa học của hạt đậu nành ............................................................5 2.1.4. Các sản phẩm từ đậu nành và lợi ích của sữa chua đậu nành .........................10 2.2.Tổng quan về tảo spirulina ..................................................................................11 2.2.1.Lịch sử ..............................................................................................................11 2.2.2.Phân loại ...........................................................................................................12 2.2.3.Đặc điểm sinh học của Spirulina .....................................................................12 2.2.3.1.Đặc điểm cấu tạo tế bào của tảo spirulina .....................................................12 2.2.3.2. Sinh sản của tảo Spirulina: ...........................................................................13 2.2.3.3.Thành phần hóa học của tảo spirulina ...........................................................14 2.2.3.4.Tình hình sản xuất, tiêu thụ và ứng dụng của tảo spirulina...........................17 2.3. Tổng quan về vi sinh vật ....................................................................................19 2.3.1. Probiotic ..........................................................................................................19 2.3.2. Vi khuẩn lên men sữa chua .............................................................................19 iv 2.3.2.1. Lactobacillus acidophilus ............................................................................20 2.3.2.2. Lactobacillus bulgaricus .............................................................................20 2.4. Tổng quan về sữa và chất ổn định ......................................................................21 2.4.1. Sữa ..................................................................................................................21 2.4.2. Chất ổn định ...................................................................................................21 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ....................................................21 Chương 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................22 2.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm.......................................................................22 2.2. Nguyên liệu ........................................................................................................22 2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng ................................................................22 2.4.Quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Spirulina...........................................23 2.4.1.Quy trình...........................................................................................................23 2.4.2.Giải thích quy trình...........................................................................................24 2.5. Phương pháp thí nghiệm.....................................................................................26 2.5.1.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS. ......................................................27 2.5.2.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1).........................................................................................................................28 2.5.3.Làm men cái. ....................................................................................................29 2.5.4. Khảo sát quá trình lên men..............................................................................30 2.5.4.1. Khảo sát thời gian lên men. ..........................................................................30 2.5.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường. ........................................................................................................................30 2.5.4.3. Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung. .........................................30 2.5.5. Khảo sát tỉ lệ phối chế giữa dịch sữa ( sữa tươi UHT + sữa đậu nành) với dịch tảo spirulina. ..............................................................................................................31 2.5.6. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm............................................................31 2.6. Phương Pháp Phân Tích Các Chỉ Tiêu...............................................................32 2.6.1. Mật độ tế bào vi sinh vật: ................................................................................32 2.6.2. Xác định pH của sản phẩm:.............................................................................32 v 2.6.3. Phương pháp chuẩn độ acid.............................................................................32 2.6.4. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm ....................................................32 2.6.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý kết quả .............................................32 Chương 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................33 4.1. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth....................................................................33 4.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường MRS agar ..............................................33 4.1.2. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth....................................................................33 4.2. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1) ........36 4.3. Khảo sát quá trình làm men cái. .........................................................................38 4.4. Khảo sát quá trình lên men.................................................................................39 4.4.1. Khảo sát thời gian lên men..............................................................................40 4.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường ...................................................................................................................................41 4.4.3. Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung .............................................42 4.4.4. Khảo sát tỉ lệ giống cấy ...................................................................................43 4.5. Khảo sát hàm lượng tảo bổ sung ........................................................................44 4.6. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm...............................................................45 4.7. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh và hóa học ..............................................49 4.7.1. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh ....................................................................49 4.7.2. Kết quả phân tích chỉ tiêu hóa học ..................................................................49 Chương 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................50 5.1. Kết luận...............................................................................................................50 5.2. Đề nghị ...............................................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................51 PHỤ LỤC .....................................................................................................................53 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần hóa học trung bình của các hợp phần trong hạt đậu nành Bảng 2.2: Thành phần hóa học các chất trong hạt đậu nành Bảng 2.3: Thành phần các acid amin không thay thế trong đậu nành và một số thực phẩm quan trọng Bảng 2.4: Thành phần hóa học của Spirulina Bảng 2.5: Thành phần vitamin trong Spirulina Bảng 2.6: Thành phần khoáng trong Spirulina Bảng 2.7: Thành phần acid amin trong Spirulina Bảng 2.8: Các chất màu trong Spirulina Bảng 2.9: Tình hình sản xuất Spirulina trên thế giới Bảng 4.1: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. acidophilus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường MRS Bảng 4.2: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. acidophilus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường dịch sữa Bảng 4.3: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. bulgaricus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường dịch sữa Bảng 4.4. Kết quả pH men vi khuẩn L. acidophilus và L. bulgaricus qua thời gian khảo sát Bảng 4.5: Mô tả cảm quan men vi khuẩn qua thời gian khảo sát Bảng 4.6: Kết quả pH của dịch sữa theo thời gian lên men Hình 4.8: Kết quả pH của dịch sữa theo thời gian lên men Bảng 4.6: Mô tả cảm quan dịch sữa theo thời gian lên men Bảng 4.7: Điểm trung bình kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm khi thay đổi tỷ lệ phối chế giữa đậu nành và sữa tươi Bảng 4.8: Điểm trung bình kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm khi thay đổi hàm lượng đường bổ sung Bảng 4.9: Điểm trung bình kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm khi thay đổi tỷ lệ giống cấy Bảng 4.10: Điểm trung bình kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm khi thay đổi hàm lượng tảo bổ sung vii Bảng 4.11: Kết quả khảo pH, độ acid và số lượng vi sinh vật theo thời gian bảo quản Bảng 4.12: Điểm đánh giá thị hiếu trung bình của người thử cho các đặc tính của sản phẩm Bảng 4.13: Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vi sinh sản phẩm Bảng 4.14: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hóa học viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1. 1: Ảnh hưởng của pH đến khả năng hòa tan của protein đậu nành Hình 2.2: Sơ đồ vòng đời của Spirulina Hình 4.1: L. acidophilus Hình 4.2: L. bulgaricus Hình 4.3: Đường cong sinh trưởng của L. acidophilus trong môi trường MRS broth. Hình 4.4: Đường cong sinh trưởng của L. bulgaricus trong môi trường MRS broth Hình 4.5: Đường cong sinh trưởng của L. acidophilus trong môi trường dịch sữa Hình 4.6: Đường cong sinh trưởng của L. bulgaricus trong môi trường dịch sữa Hình 4.7: pH men vi khuẩn L. acidophilus và L. bulgaricus qua thời gian khảo sát Hình 4.9: bổ sung 6% tảo Hình 4.10: bổ sung 8% tảo Hình 4.11: bổ sung 10% tảo Hình 4.12: Kết quả PH và số lượng vi khuẩn lactic theo thời gian bảo quản sản phẩm Hình 4.13: Kết quả độ acid của sản phẩm theo thời gian bảo quản Hình 4.14: Điểm đánh giá thị hiếu của người thử cho hai sản phẩm ix Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Ngày xưa, khi đất nước còn nghèo và lạc hậu chúng ta thường nghe câu nói “ăn no mặc đủ”. Nhưng ngày nay, đất nước đang trên đà phát triển thì câu nói “ăn no mặc đủ” được thay thế bằng câu “ ăn ngon mặc đẹp”. Tuy nhiên,nhu cầu con người không chỉ dừng ở “ ăn ngon” mà họ còn đòi hỏi cao hơn đó là ăn ngon bổ dưỡng và đa dạng thực phẩm. Sữa đậu nành là một loại sữa làm từ đậu nành, theo các nhà nghiên cứu việc kiên trì dùng sữa đậu nành hàng ngày sẽ làm giảm được cholesterol trong máu, hạ dược huyết áp và đề phòng xơ cứng động mạch ở người lớn tuổi. (Tâm Diệu, 1998).Ngoài lượng lớn protein, trong sữa đậu nành còn chứa đến 8 loại acid amin an trọng đối với cơ thể con người ( leucine, isleucine, lysine, methionine, phenyl alanine, threonine, tryptophane, valine). Acid béo không no trong đậu nành còn có tác dụng phòng chống lại các mầm ung thư như: Bowman-Bird Inhibitor (BBI), protease inhibitor, phytate, phytosterol, isoplavones, chất phenolic acid,…(Tâm Diệu, 1998). Sữa là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng, cung cấp gần như đầy đủ các vitamin và khoáng chất cho cơ thể. Nhờ những tác dụng có ích mà sữa và các sản phẩm từ sữa rất được mọi người ưa chuộng. Thị trường sữa và các sản phẩm từ sữa khá phong phú về chủng loại, đáp ứng cho mọi người ở mọi độ tuổi. Sữa chua, sản phẩm lên men từ sữa, người ta đã dựa vào quy luật đấu tranh sinh tồn tự nhiên để tăng cường sức khoẻ cho con người, các vi khuẩn lactic được đưa vào ruột sẽ cạnh tranh với vi khuẩn gây thối và lấn át các vi khuẩn này. Theo các nghiên cứu thì sữa chua rất có lợi cho cơ thể, nó có tác dụng chống lão hóa, giảm cholesterol trong máu, hạn chế rối loạn đường ruột, làm giảm tác dụng phụ do sử dụng thuốc kháng sinh, làm tăng interferon, giảm viêm loét dạ dày, ngăn ngừa loãng xương… Tảo là nhóm các vi sinh vật có khả năng quang tự dưỡng, chúng tham gia tổng hợp nguồn năng lượng sống sơ cấp từ ánh sáng mặt trời. Tảo Spirulina có nhiều ưu 1 điểm vượt trội đặc biệt về giá trị dinh dưỡng và có chứa nhiều hợp chất có giá trị trong phòng và điều trị một số bệnh. Chính vì những lý do trên, mục đích của đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất sữa chua đậu nành tảo spirulina” nhằm tạo tạo ra sản phẩm mới đa dạng về cảm quan và có tác dụng bổ dưỡng. 1.2. Mục tiêu đề tài Tạo ra sản phẩm sữa chua vừa có giá trị dinh dưỡng vừa có giá trị cảm quan. 1.3.Công việc thực hiện 3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS. 3Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường dịch sữa. 3Khảo sát các yếu tố của quá trình lên men: khảo sát thời gian lên men, tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi, khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung, khảo sát tỉ lệ giống cấy. 3Khảo sát hàm lượng tảo bổ sung. 3Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm. 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Tổng quan về đậu nành và sữa chua đậu nành 2.1.1.Lịch sử phát triển Đậu nành được xem là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc. Nó được trồng trên nhiều loại đất khác nhau và có phạm vi khí hậu rộng khắp, trải dài từ vùng nhiệt đới Brazil đến hòn đảo Hokkaido đầy tuyết nằm ở phía bắc Nhật Bản. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã tìm thấy vai trò của đậu nành trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực thực phẩm. Vì vậy, đậu nành được lan rộng ngày càng nhiều trên khắp thế giới.[ 23] Yogurt tiếng Thổ Nhĩ Kỳ có nghĩa là sự lên men, thực phẩm có lượng acid nhẹ được lên men bởi vi khuẩn lactic như Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus. Vào cuối những năm 1970, ở Mỹ, sản phẩm từ sữa đậu nành được gọi theo nhiều cách khác nhau: soymilk yogurt, soy yogurt, soyogurt, soygurt. Năm 1912, tại Pari, Li – Yu – Ying và Grand Voinnet đã chế biến sữa đậu nành lên men. Năm 1974, nghiên cứu của Wang và Konishi đã tách giống L. acidophilus thích hợp để chế biến soy yogurt. Năm 1977, Sterm, Hesseltine, Wang và Konishi đã chọn giống L. acidophilus tận dụng Raffinones, Stachyose, hỗn hợp đường trong sữa đậu và dùng L. acidophilus làm soy yogurt có vị ngon (pH = 4,2), giảm đầy hơi. Năm 1981 tại Nhật Bản lần đầu tiên sản xuất soy yogurt số lượng lớn. [ 24] 2.1.2.Cây đậu nành Cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc họ Leguminosae, chủng Papilionoidae, là cây bụi nhỏ, cao trung bình dưới 1m, có lông toàn thân. Lá có 3 chét hình bầu dục. Chùm lông mọc ở nách lá, bông có màu trắng hoặc tím. Trái có nhiều lông vàng, dài 3 – 4 cm, rộng 0,8 cm, mỗi trái có từ 3 – 5 hạt. Cây đậu nành là cây ngắn ngày, phát triển tốt nhất ở vùng nhiệt đới, ưa sáng, ưa nhiệt, chịu hạn.[ 1], [ 21] Điều kiện để cây đậu nành phát triển tốt : 9 pH của đất trồng: 6,0 – 6,5. 3 9 Nhiệt độ: 25 – 30oC. 9 Lượng mưa: 500 – 700 mm. 9 Đất trồng có nhiều mùn hữu cơ với độ ẩm trung bình. 9 Thời kỳ trồng: cuối mùa xuân, đầu mùa hè. 2.1.3.Hạt đậu nành 2.1.3.1.Tính chất cơ lý và cấu trúc của hạt đậu nành [ 7] Tính chất cơ lý ảnh hưởng rất lớn đến quy trình chế biến cũng như chất lượng sản phẩm. Một số tính chất chủ yếu là: 3 Hình dáng: hạt đậu nành có hình dạng tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt…tùy từng giống. 3 Độ lớn của hạt cũng rất khác nhau tùy đặc điểm của giống và kĩ thuật trồng trọt, thường từ 220 – 300g /1000 hạt. 3 Kích thước hạt: tùy thuộc vào giống và điều kiện canh tác. 3 Vỏ hạt nhẵn phần lớn màu vàng, một số có màu vàng đậm, xanh, nâu hoặc đen. Vỏ chỉ chiếm khoảng 8% khối lượng của hạt Cấu trúc hạt đậu nành gồm có 3 bộ phận chính: vỏ, trụ dưới lá mầm, lá mầm. 3Vỏ: là lớp ngoài cùng của hạt đậu nành. Vỏ hạt đậu nành có nhiều loại màu sắc và là yếu tố cho việc xác định giống đậu nành. Vỏ hạt có tác dụng bảo vệ phôi mầm chống lại nấm và vi khuẩn. 3Trụ dưới lá mầm: là rễ mầm, phần sinh trưởng của hạt khi hạt nảy mầm. 3Lá mầm: gồm hai lá mầm tích trữ dinh dưỡng cho hạt. Nó chiếm phần lớn khối lượng của hạt, chứa hầu hết các protein, lipid của hạt, có màu xanh trước khi hạt chín, và chuyển thành màu vàng khi hạt chín. Bảng 2.1: Thành phần hóa học trung bình của các hợp phần trong hạt đậu nành (% so với khối lượng chất khô của hạt) [ 9] Protein ( Nx 6,25) Lipid Glucid ( Cả xơ) Khoáng Tổng Lá mầm 43 23 29 5 90 Vỏ 8,8 1 86 4,3 8 Trụ dưới lá mầm 41 11 43 4,4 2 Hạt nguyên 40 20 35 4,9 100 4 2.1.3.2.Thành phần hóa học của hạt đậu nành So với các nguồn thực phẩm chính hiện nay, đậu nành thực sự là thành phần giàu dinh dưỡng. Đậu nành vừa có nguồn protein cao nhất trong các loại đậu, hạt; giàu chất béo, carbohydrate, các chất xơ, vitamins, chất khoáng vừa là dược liệu quý cho việc ngăn ngừa và chữa trị các bệnh mãn tính. Bảng 2.2: Thành phần hóa học các chất trong hạt đậu nành (so với khối lượng chất khô) [ 21] Thành phần Đơn vị Hàm lượng Hàm lượng trung bình PROTEIN % 30 – 50 40 AMINOACID g/100g hạt Không cần thiết Alanine Arginine Aspartic acid Glutamic acid Glycine Cysteine Proline Serine 1,49 – 1,87 2,45 – 3,49 3,87 – 4,98 6,10 – 8,72 1,88 – 2,02 0,56 – 0,66 1,88 – 2,61 1,81 – 2,32 1,69 2,90 4,48 7,26 1,69 0,60 2,02 2,07 Cần thiết Histidine Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine 0,89 – 1,08 1,46 – 2,12 2,71 – 3,20 2,35 – 2,86 0,49 – 0,66 1,70 - 2,08 1,33 – 1,79 0,47 – 0,54 1,12 – 1,62 1,52 – 2,24 1,04 1,76 3,03 2,58 0,54 1,95 1,58 0,49 1,43 1,83 LIPID % 12 – 30 20 ACID BÉO %so với lipid tổng Palmitic acid Stearic acid 4 - 23 3 - 30 11 4 5 Oleic acid Linoleic acid Linolenic acid 25 - 86 25 - 60 1 - 15 25 53 7 CARBOHYDRATE % 26 - 38 34 Sucrose Raffinose Stachyose 2,5 - 8,2 0,1 - 0,9 1,4 - 4,1 5,5 0,9 3,5 TRO % 4,61 - 5,94 5,0 VITAMIN Thiamine Riboflavin Vitamin E µg/g µg/g µg/g 6,26 - 6,85 0,92 - 1,19 10,9 - 28,4 ISOFLAVONE % 0,2 SAPONINS % 0,1 - 0,3 PHYTATE % 1,0 - 1,5 1,1 TRYPSIN INHIBITORS mg/g 16,7 - 27,2 22,3 PHYTOSTEROLS mg/g 0,3 - 0,6 •Protein Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ lệ rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành, ngoài methionin và tryptophan ra còn các acid amin khác, có số lượng khá cao tương đương lượng acid amin có trong thịt. Bảng 2.3: Thành phần các acid amin không thay thế trong đậu nành và một số thực phẩm quan trọng (g/100g protein) Loại acid amin Đậu nành Trứng Thịt bò Sữa bò Gạo Giá trị được đề nghị bởi FAO - OMS Leusine 7,84 8,32 8,00 10,24 8,26 4,8 Isoleusine 4,48 5,60 5,12 5,60 3,84 6,4 Lysine 6,40 6,24 2,12 8,16 3,68 4,2 Phenylalanine 4,96 5,12 4,48 5,44 4,80 2,8 6 Threonine 3,84 5,12 4,64 4,96 3,36 2,8 Tryptophane 1,28 1,76 1,21 1,44 1,28 1,4 Valine 4,80 7,52 5,28 7,36 5,76 4,2 Methionine 1,28 3,20 2,72 2,88 2,08 2,2 Dựa vào chức năng sinh học ở thực vật, protein trong hạt đậu nành được chia làm 2 loại: protein chuyển hóa (metabolic protein) và protein dự trữ. Protein chuyển hóa gồm enzyme và cấu trúc. Protein dự trữ cùng với dầu dự trữ được tổng hợp trong quá trình phát triển của hạt đậu. Protein đậu nành chủ yếu là protein dự trữ. Hai loại protein dự trữ chính trong đậu nành là glycinin (11S) và beta-conglycinin (7S) chiếm khoảng 65 – 80% protein tổng trong hạt.[ 15], [ 21] Nếu phân loại theo tính tan trong nước, protein đậu nành chứa 85 – 95% globuline, một lượng nhỏ albumine, một lượng không đáng kể prolamine và glutelin. Khả năng hòa tan trong nước của protein đậu nành ảnh hưởng nhiều bởi pH. Khoảng 80% protein trong hạt đậu nành có thể được trích ly ở pH trung tính hoặc kiềm. pH đẳng điện của protein đậu nành là 4,2 – 4,6. [ 21] % Protein hòa tan Hình 1. 1: Ảnh hưởng của pH đến khả năng hòa tan của protein đậu nành Các chất phi dinh dưỡng trong thành phần protein đậu nành: trypsin inhibitors và hemagglutinins (lectins) [ 21] 3 Trypsin inhibitors là hợp chất không bền ở nhiệt độ cao. Chất này có khả năng kết hợp với trypsin làm trypsin không được hấp thu. Thiếu trypsin sẽ làm cơ thể 7 chậm phát triển và ảnh hưởng nhiều đến các chức năng khác của cơ thể. Đậu nành chứa 2 loại trypsin inhibitors: Bowman – Brik inhibitor và Kunitz inhibitor 3 Lectin (hemagglutinins) là protein có khả năng kết dính các tế bào hồng cầu. Nó được xem như là chất có độc tính cao, tuy nhiên nó cũng dễ dàng bị vô hoạt dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Các tính chất chức năng của protein đậu nành: hấp thụ và giữ nước, tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ nhớt, tạo nhũ, tạo bọt. 3Khả năng hấp thụ và giữ nước: Khả năng hấp thụ và giữ nước của protein dựa trên tương tác giữa protein – protein và protein – nước. Nồng độ protein tăng, khả năng hấp thụ nước tăng. pH thay đổi thì sự tích điện của protein cũng thay đổi, ở pH đẳng điện sự hút nước là thấp nhất vì tương tác giữa protein – protein rất chặt chẽ, ở pH cao sự hấp thụ và giữ nước càng tăng. Nhiệt độ tăng, khả năng hấp thụ nước giảm vì làm giảm liên kết hydro. 3Khả năng tạo gel: Khi protein bị biến tính, các cấu trúc bậc cao bị phá hủy, các mạch polypeptide duỗi ra, tiến lại gần nhau, tiếp xúc và tạo nên mạng lưới không gian tương đối chặt và pha phân tán chứa trong nó. Các yếu tố tạo gel + Sử dụng nhiệt: Khi dịch sữa protein đậu nành có nồng độ cao được đun nóng ở pH trung tính, thì sẽ tạo gel. + Sử dụng pH đẳng điện: Ở pH đẳng điện protein có khả năng tạo gel. + Sử dụng các muối của ion kim loại hóa trị hai: Do liên kết giữa Ca2+ và nhóm carboxyl. 3Khả năng tạo kết cấu: Protein đậu nành có khả năng tạo sợi tốt. Khi protein bị phân ly, chuỗi polypeptide duỗi mạch, vì vậy khi cho qua khuôn đúc, sẽ định hướng được các phân tử protein và các sợi hình thành. 3Khả năng tạo độ nhớt: Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch gồm: pH, nhiệt độ, ion Ca2+… và nồng độ protein. 3Khả năng tạo nhũ: Trong phân tử protein đậu nành có hai đầu ưa nước và ưa béo, nên có khả năng nhũ hóa với chất béo. 3Khả năng tạo bọt: Khả năng tạo bọt là do sự khuếch tán protein đến bề mặt tiếp xúc giữa pha khí và nước. 8 •Lipid Chất béo chiếm khoảng 20% trọng lượng chất khô của hạt đậu nành. Nó nằm chủ yếu trong phần tử diệp của hạt. Chất béo chứa khoảng 6,4–15,1% acid béo no (acid stearic, acid archidic) và 80–93,6% acid béo không no (acid linoleic, acid linolenic, acid oleic trong đó acid linolenic chiếm tỷ lệ tương đối cao). Chất béo không no có lợi cho sức khỏe hơn là chất béo no. Tuy nhiên các acid béo không no dễ bị oxy hóa và giảm chất lượng. • Carbohydrate Hydratcarbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành. Phần hydratcarbon có thể chia ra làm 2 loại: loại tan trong nước và không tan trong nước. Loại tan được trong nước chỉ chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcarbon. Trong các nhóm đường của đậu nành ta cần lưu ý hai loại đường raffinose và stachyose. Cơ thể con người thiếu enzyme galactosidase để thủy phân stachyose và rafinose. Hai loại đường này thường di chuyển từ ruột non sang ruột già là nơi có thể lên men đường bởi vi khuẩn đường ruột. Quá trình lên men tạo ra các khí gồm CO2, H2 và CH4 làm cho cơ thể người cảm thấy đầy hơi. Sự loại bỏ hay giảm hiện tượng này đối với các thực phẩm từ đậu nành cần phải được quan tâm. Trong quá trình lên men sữa đậu nành có thể làm giảm hàm lượng raffinose và stachyose. [ 11] •Vitamin và khoáng chất Mặc dù đậu nành không được xem như là nguồn rất giàu một loại vitamin nào đó nhưng nó đem lại một nguồn dinh dưỡng toàn diện. Các vitamin có trong đậu nành như là thiamine, riboflavin, niacin, pantothenic acid, biotin, folic acid, inositol, choline, vitamin A và E, trừ vitamin C và vitamin D. Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành. Các chất khoáng chủ yếu có trong đậu nành là K, Na, Ca, Mg, S, và P. Hàm lượng chất khoáng có thể thay đổi nhiều do loại đậu cũng như điều kiện trồng trọt khác nhau.[ 21] • Enzyme Về mặt công nghệ, enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase, được biết đến là lipoxydase. Enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hoá acid béo không bão hoà bởi O2, gây mùi cho đậu nành. Khử mùi đậu nành dựa trên nguyên tắc vô hoạt enzyme lipoxygenase bằng cách sử dụng riêng rẽ hay kết hợp các phương pháp nhiệt (sấy, chấn), phương pháp hóa học (NaHCO3). Enzyme urease được tìm thấy với hàm lượng lớn ở đậu nành sống. Nó sẽ phân hủy ure thành ammoniac, là một hợp chất độc đối với cơ thể người. Enzyme này sẽ 9 chống lại sự hấp thụ các chất đạm qua màng ruột, do đó không nên ăn đậu nành sống. Hơn nữa, enzyme urease dễ dàng bị vô hoạt bởi nhiệt.[ 6] • Isoflavone Isoflavones là hợp chất phenolic được xem như là phytoestrogens, hay estrogens thực vật vì chúng có công thức hóa học, chức năng và ảnh hưởng đến cơ thể con người như estrogen. Probiotic vi khuẩn lactic khi phát triển có thể chuyển hóa glycoside isoflavone thành dạng aglycone mà không cần phải bổ sung thêm chất dinh dưỡng nào. Trong sữa đậu nành chưa lên men giàu glycoside, dạng aglycone thấp hơn. Ngược lại, sữa đậu nành sau lên men lại có hàm lượng aglycone cao hơn so với glycoside do các vi khuẩn lactic có khả năng tiết ra._. enzyme β - glucosidase chuyển hóa glycoside thành aglycone. Isoflavone aglycone hấp thu nhanh hơn và nhiều hơn so với dạng glucoside trong cơ thể người, giúp ngăn chặn các bệnh mãn tính như ung thư và các bệnh về tim mạch. [ 12] Lợi ích của isoflavone đậu nành [ 25] 3Ngăn cản và chữa trị ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư ruột. 3Giảm khả năng hoạt động của hormone giới tính – hormone này kích thích khả năng phát triển ung bướu ở cả nam và nữ. 3Giảm nguy cơ bệnh tim mạch, chứng loãng xương và tăng cường khả năng tự miễn dịch. 2.1.4. Các sản phẩm từ đậu nành và lợi ích của sữa chua đậu nành Các sản phẩm từ đậu nành [ 23] 3Sữa đậu nành: đậu nành tươi được ngâm với nước, sau đó lấy dịch lọc đun 20 phút ở nhiệt độ 900C sẽ được sữa đậu nành đơn giản. Sữa đậu nành rất giàu protein, isoflavones và vitamin B, có thể là thức uống thay thế cho những người dị ứng với sữa bò. 3Tofu: được tạo thành bởi sự đông tụ sữa đậu nành bằng chất làm đông. Tofu có ba dạng: dạng rắn rất giàu protein, chất béo và calcium, dùng để nấu, nướng, chiên; dạng mềm và dạng mịn dùng để trộn làm thức ăn, như ở Nhật, người ta dùng dạng mềm và mịn để làm nước xốt đậu nành. 3Yoghurt: là sản phẩm của sự lên men sữa đậu nành bằng vi khuẩn. 10 3Tempeh: là dạng bánh được tạo thành bởi sự nấu đậu và trộn với vi khuẩn, lão hóa (ageing) một hay hai ngày. Tempeh rất giàu protein và khoáng chất, isoflavones (100 g tempeh có 53 mg isoflavones). 3Miso: là sản phẩm của sự kết hợp đậu nành với muối, mốc và sau đó ủ trong thùng gỗ 1 – 3 năm. 3Shoyu: là chất lỏng màu nâu sậm, được làm từ đậu nành qua quá trình lên men. Lợi ích của sữa chua đậu nành [ 18] 3 Vi khuẩn lên men sữa đậu nành có thể sử dụng được các đường raffinose, stachyose có trong sữa đậu nành làm giảm các triệu chứng đầy hơi do các đường này gây ra. 3vi khuẩn trong sữa lên men còn sống giúp tăng cường hệ miễn dịch và tạo ra các enzyme thủy phân protein thành các polypeptid, thủy phân tinh bột thành các maltodextrin làm sản phẩm trở nên dễ tiêu hóa hơn. 3 Probiotic trong sữa lên men còn làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, tăng cường các vi khuẩn có lợi, giảm các vi khuẩn có hại gây bệnh cho người. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng một số vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hóa isoflavone glucoside (có nhiều trong đậu nành) thành các isoflavone aglycone là chất có hoạt tính sinh học, có tác dụng làm giảm nguy cơ gây bệnh ung thư, tim mạch, giảm các triệu chứng ở phụ nữ mãn kinh như bốc hỏa, loãng xương,… 2.2.Tổng quan về tảo spirulina 2.2.1.Lịch sử Spirulina là tên gọi do nhà tảo học người Đức – Deurben đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái đặc trưng nhất là dạng sợi xoắn ốc với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh. Và cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được Spirulina từ nguồn nước tự nhiên. Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã chính thức công nhận Spirulina là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa. 11 Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 tại xí nghiệp nước suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận). 2.2.2.Phân loại[ 2], [ 5], [7] Tảo (algae) là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp được các chất hữu cơ từ các chất vô cơ dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Tảo chia làm 9 ngành: tảo lam (Cyanophyta); tảo lục (Chorophyta); tảo silic (Diatomea); tảo vàng ánh (Chysophyta); tảo giáp (Pynophyta); tảo mắt (Euglenophyta); tảo roi lệch (Hererocontac); tảo đỏ (Rhodophyta); tảo nâu. Tảo Spirulina thuộc: Ngành: Cyanophyta Lớp: Cyanophyceae Bộ: Oscillatoriales Họ: Oscillatoniaceae ( Nostocales) Giống: Spirulina 2.2.3.Đặc điểm sinh học của Spirulina [ 2], [ 5] Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5 - 7 vòng đều nhau không phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35 - 50 µm, bước xoắn 60 µm, chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25 mm. Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân thực. Người ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam. Tảo có khả năng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của chúng. Vận tốc vận chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/ giây. 2.2.3.1.Đặc điểm cấu tạo tế bào của tảo spirulina Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh. mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 µm, dài 2 mm. Không có lục lạp mà chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào. Không có không bào. Không có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA (Hedeskog và Hifsten A.1980). Thành tế bào có cấu trúc nhiều lớp chứa mucopolymer, pectin và các loại polysaccharide khác.Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm. 12 Bộ máy quang hợp của Spirulina: 3Phycobilisome: chứa phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid. Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách nguyên vẹn để nghiên cứu. Đối với phycobilisome có cà phycoerythin và phycocianin thì lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocianin và phần trong cùng là allophycocyanin. 3Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng lượng mặt trời để chuyển vào PS II. Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ phycoerythin sang phycocyanin và cuối cùng đến allophycocyanin trước khi đạt tới PS II. 3Có khoảng 50% năng lượng ánh sáng mặt trời, Spirulina nhận được nhờ phycobilisome. 3Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocianin và thường có carotenoid-glycoside như myxoxanthophyll, oscillaxanthin. Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: 3Chlorophyll hấp phụ ánh sáng lam và đỏ. 3Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục. 3Phycobilin hấp thụ ánh sáng lục, vàng và da cam. 2.2.3.2. Sinh sản của tảo Spirulina: [ 3], [ 5], [ 13] Spirulina có phương thức sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng thành (gọi là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng xoắn (2-4 tế bào, gọi là hormogonia). Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina sẽ hình thành các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn Necridia). Các necridia hình thành các đĩa lõm ở 2 mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa. Khi phát triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kỳ sinh sản lặp lại để đảm bảo vòng đời của Spirulina Thông thường Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc. Trong trường hợp gặp điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào tử giống như ở vi khuẩn. Chu kỳ phát triển của Spirulina rất ngắn. Chu kỳ này thường diễn ra trong 24 giờ như của tảo Chlorella 13 Hình 2.2: Sơ đồ vòng đời của Spirulina [Ciferri, 1985] Spirulina là sinh vật phiêu sinh sống tự do trong nước, phát triển tốt trong khí hậu ấm, môi trường kiềm và đặc biệt là những nơi có nhiều nắng như Kona, Hawai 2.2.3.3.Thành phần hóa học của tảo spirulina Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin. Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất có hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao hơn so với nhiều loại thực phẩm. Ví dụ, hàm lượng protein của cá và thịt là 15-20%, nước tương là 35%, sữa cô đặc là 35%, trứng là 12% và của ngũ cốc là 8-14% (R. Herehson, Earth Food Spirulina, Konore Press,1977). Bảng 2.4: Thành phần hóa học của Spirulina [ 5] STT Thành phần Số lượng (% chất khô) 1 Protein tổng số 60 ÷ 70 2 Glucid 13 ÷ 16 3 Lipid 7 ÷ 8 4 Acid nucleic 4,29 5 Diệp lục 0,76 6 Carotene 0,23 7 Tro 4 ÷ 5 Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất. Nếu hàng ngày chúng ta sử dụng 1g Spirulina thì sẽ đáp ứng đủ nhu cầu vitamin B12 hàng ngày. Ngoài ra, Spirulina còn chứa các vitamin khác như A, B1, B2, B6, E và H (Fox, 1986). Spirulina cung cấp 21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng ngày. Provitamin A (β-caroten) (chiếm 14 0,1% chất khô) cao hơn 20 lần so với trong carrot. Thành phần các vitamin của Spirulina được liệt kê trong Bảng 2.2. Bảng 2.5: Thành phần vitamin trong Spirulina [ 17] Vitamin Trên 10g Nhu cầu hàng ngày cho phép % so với nhu cầu hàng ngày cho phép Vitamin A ( β-carotene) 23000 IU 5000 460 Vitamin B1 (Thiamine) 0,31 µg 1,5 21 Vitamine B2 (Riboflavin) 0,35 µg 1,7 21 Vitamin B3 (Niacin) 1,46 µg 20 7 Vitamin B6 (Pyridoxine) 80 µg 2,0 4 Vitamin B12 (Cyanocobalamine) 32 µg 6,0 533 Citamine E (α-tocoferol) 1 IU 30 3 Folacin 1 µg 400 0,04 Panthothenic acid 10 µg 10 1 Biotin 0,50 µg - - Inositol 6,40 µg - - Spirulina giàu sắt và calcium, hỗ trợ tốt cho máu, cho xương và răng. Lượng calcium của Spirulina cao hơn trong sữa (Fox, 1986). Lượng sắt trong Spirulina cao hơn 12 lần so với trong các loại thực phẩm khác. Ngoài ra, Spirulina giàu magnesium, potassium. Những khoáng đa lượng bao gồm sodium, calcium, magnesium, potassium, chlorine, sulfur và phosphorous. Các khoáng vi lượng gồm iodine, zinc, copper, selenium, molybdenum, fluoride, manganese, boron, nickel và cobalt. Lượng Ka và Ca chiếm lượng lớn nhất trong các khoáng đa lượng (160 µg và 100 µg/10g Spirulina), trong các khoáng vi lượng thì Mn chiếm hàm lượng cao nhất (500 µg/10g Spirulina). Bảng 2.6: Thành phần khoáng trong Spirulina [ 17] Khoáng Trên 10g Nhu cầu hàng ngày % so với nhu cầu hàng ngày Calcium 100 µg 1000 µg 10 Iron 15 µg 18 µg 83 Zinc 300 µg 15 µg 2 15 Phosphorous 90 µg 1000 µg 9 Magnesium 40 µg 400 µg 10 Copper 120 µg 2 µg 6 Sodium 60 µg 2 - 5 µg 1 Potassium 160 µg 6 µg 3 Manganese 500 µg 3 µg 17 Selenium 2 µg 100 µg 2 Spirulina chứa 18 trong số 20 loại amino acid được biết (Fox, 1986). Một số amino acid có hàm lượng cao trong Spirulina như glutamic acid (14,6%); aspartic acid (9,8%); leucine (8,7%); aniline (7,6%)… Bảng 2.7: Thành phần acid amin trong Spirulina [ 5] Acid amin thiết yếu Hàm lượng trong 10g %/tổng Các Acid amin khác Hàm lượng trong 10g %/tổng Phenylalanine 280 µg 4,5 % Glycine 320 µg 5,2 % Threonine 320 µg 5,2 % Histidine 100 µg 1,6 % Tryptophan 90 µg 1,5 % Proline 270 µg 4,3 % Valine 400 µg 6,5 % Serine 320 µg 5,2 % Isoleucine 350 µg 5,6 % Tyrosine 300 µg 4,8 % Leucine 540 µg 8,7 % Alanine 470 µg 7,6 % Lysine 290 µg 4,7 % Arginine 430 µg 6,9 % Methionine 140 µg 2,3 % Aspartic Acid 610 µg 9,8 % Cystine 60 µg 1,0 % Glutamic Acid 910 µg 14,6 % Spirulina có màu xanh lam-lục là do Spirulina chứa nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll, phycocyanin, beta-caroten, xanthophyll (Estrada và cộng sự, 2001) 16 Bảng 2.8: Các chất màu trong Spirulina [ 5 Chất màu Màu sắc Hàm lượng trong 10g % Spirulina Phycocyanin Xanh da trời 1400 µg 14 % Chlorophyll Xanh lá cây 100 µg 1,0 % Carotenoids Màu vàng cam 47 µg 0,47% 2.2.3.4.Tình hình sản xuất, tiêu thụ và ứng dụng của tảo spirulina Spirulina được coi là nguồn thức ăn của con người trong nhiều thế kỷ. Spirulina sp. là giống được biết đến nhiều nhất vì giá trị dinh dưỡng của nó. Sinh khối tảo được sử dụng chủ yếu như nguồn cung cấp protein cho người và gia súc. Ở Nhật Bản, người ta sản xuất sinh khối tảo có nhãn hiệu Linablue A, ở Mỹ có Phycobiliprotein. Bảng 2.9: Tình hình sản xuất Spirulina trên thế giới [ 2] Công ty Địa điểm Diện tích (ha) Sản lượng (tấn khô) Giá thành (USD/kg) Sosa-Texcoco Mehico 12 300 Earthrise Hoa Kì 5,5 340 Cyanotech Hoa Kì 2 170 Siam Algae Thái Lan 3,8 480 Blue Continent Đài Loan - 480 Nippon Spirulina Nhật Bản 1,5 40 Bình Thuận Việt Nam 0,5 8 Nhiều công ty Trung Quốc 200 2798 Nhiều công ty Ấn Độ 12,2 260 Nhiều công ty Cu Ba - 40 5 - 18 17 Ứng dụng của tảo spirulina: 3Spirulina được sử dụng như một nguồn thực phẩm từ hàng ngàn năm nay để cung cấp dinh dưỡng và cải thiện sức khỏe cho con người vì Spirulina chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, acid amin, acid béo cần thiết, vitamin, chất khoáng [ 20] 3 Năm 1970-1980, nhiều nghiên cứu sử dụng Spirulina để phòng và trị bệnh suy dinh dưỡng trẻ em đã được tiến hành ở Mehico, Pháp, Roumani, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Peru… [ 3] 3Bột khô Spirulina được dùng như một thức ăn cao cấp giàu protein, acid amin và nhiều vi lượng bổ dưỡng khác. Nếu xét về chất lượng protein, chỉ cần lượng 30 - 40g Spirulina/ngày/người là đủ nhu cầu acid amin. Spirulina dạng tươi tốt hơn Spirulina khô do còn nguyên vẹn các dưỡng chất, các enzyme đang hoạt động giúp ích cho cơ thể như superoxydedismutase, protease, lipase,…và việc sử dụng Spirulina dạng tươi còn mang lợi ích kinh tế vì không phải sấy khô, bảo quản, thích hợp với mô hình nuôi Spirulina hộ gia đình hoặc liên kết với xí nghiệp, sản xuất với trường học, nhà trẻ, khoa dinh dưỡng của bệnh viện [ 3] 3Theo Gloria và cộng sự (2004), khi bổ sung thêm sinh khối tảo S. platensis dạng khô với hàm lượng (6 mg/ml) vào sữa sẽ kích thích sự phát triển của Lactococcus lactis lên 27%, do đó bổ sung Spirulina để thúc đẩy quá trình lên men lactic [ 16] 3Chế phẩm Enalac (bột dinh dưỡng bổ sung 5% Spirulina) là một chế phẩm do Trung tâm Dinh dưỡng trẻ em Tp.HCM sản xuất. Enalac chứa 16,5% protein; 7% lipid; 74% glucide, vitamin…với sự phối chế của 5% bột Spirulina. Khi sử dụng, chế phẩm được pha loãng trong nước ấm (50-60oC) được sử dụng để ăn trực tiếp hoặc nuôi qua sonde. Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm có tác dụng tốt cho bệnh nhân suy dinh dưỡng ở mọi lứa tuổi [ 3] 3 Một số nghiên cứu cho thấy Spirulina có tác dụng tốt trong điều trị bệnh béo phì, bệnh tiểu đường, bệnh thiếu máu, bệnh loét dạ dày tá tràng, viêm tụy, bệnh đục thủy tinh thể và suy giảm thị lực, bệnh rụng tóc. Trong điều trị bệnh béo phì, chế phẩm Spirulina được chỉ định uống vào trước các bữa ăn khoảng 1 giờ vì Spirulina có chứa những chất vi lượng tác dụng điều hòa nội tiết tố (hormon), giúp duy trì lượng glucose trong máu ở mức cần thiết, giúp cơ thể vẫn khỏe mạnh và không có cảm giác thèm ăn [ 3] 18 2.3. Tổng quan về vi sinh vật 2.3.1. Probiotic [ 14] “Probiotics” là thuật ngữ này đã xuất hiện trong nhiều thập kỉ qua và đang trở nên quen thuộc với con người. Probiotic là các vi khuẩn sống khi được cung cấp với liều lượng thích hợp sẽ đem lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ (theo định nghĩa của FAO và WHO 2001). Vai trò của probiotic 3Tăng “ thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu. 3Ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong đường ruột như: Staphylococcus, Salmonella, Yersinia, Clostridia. 3Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột. 3Có khả năng chịu được acid dạ dày, chịu được muối mật. 3Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày… 3Hạn chế sự hình thành các khối u. Enzym được tiết ra bởi các vi khuẩn có hại sẽ góp phần tạo ra các chất gây ung thư. Probiotic có khả năng làm giảm tới mức tối thiểu hoạt động của các enzym này và giảm nguy cơ ung thư ruột. 3Một số cơ thể không sử dụng được lactose do không có enzym lactase hoặc lactase hoạt động không tốt, điều này dẫn tới sự khó tiêu khi dùng các sản phẩm sữa. Probiotic có khả năng sản xuất ra enzym lactase giúp tiêu hoá lactose dễ dàng. 3Việc sử dụng nhiều thuốc kháng sinh là nguyên nhân gây ra các bệnh tiêu chảy, nhiễm Candida do hệ vi sinh vật có ích trong đường ruột bị tiêu diệt. Probiotic giúp tái thiết lập hệ vi sinh vật có ích nhanh chóng sau khi dùng kháng sinh. 2.3.2. Vi khuẩn lên men sữa chua Vi khuẩn lên men sữa chua là vi khuẩn lactic điển hình, thường là các loài Lactobacillus bulgaricus , Lac. Acidophilus, Streptococcus lactis, streptococcus cremosus …Những vi sinh vật này khi lên men sữa tạo ra sản phẩm sữa chua có lợi cho sức khỏe của con người, đó là những Probiotics. 19 2.3.2.1. Lactobacillus acidophilus [ 22] L. acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, dài, mảnh có kích thước từ 0,6-0,9 x 1,5-6 µm, thường xếp theo cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Khuẩn lạc trên môi trường thạch có kích thước 2-5 mm, lồi, đục, đều và không sinh chất tạo màu. Đặc điểm chung của họ vi khuẩn lactic là không sinh bào tử. L. acidophilus là loài ít có khả năng di động, không phân giải protein, phản ứng catalase và chuyển hóa nitrat thành nitrit âm tính. L. acidophilus lên men đường lactose, và các loại đường glucose, saccharose, maltose, mannose. L. acidophilus là loài vi khuẩn vi hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu là 370C. pH tối ưu cho sự tăng trưởng dao động trong khoảng 5,5 – 6. Nhu cầu dinh dưỡng của L. acidophilus phản ánh bản chất rất khó nuôi cấy của vi khuẩn này. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường phải rất giàu acit amin và vitamin như peptone, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleate (tween 80), sodium acetate và muối magne kích thích sự tăng trưởng. Môi trường nuôi cấy hay được sử dụng là MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) lỏng hay agar. 2.3.2.2. Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus là trực khuẩn gram dương, hình que, dài, mảnh, thường xếp thành đôi hay chuỗi dài từ 5- 20 µm, không có khả năng di động, có thể tạo ra 2,7% acid lactic. Khuẩn lạc của Lactobacillus bulgaricus phẳng, hơi vàng, đường kính 2- 3mm. Khuẩn lạc càng già thì ở giữa càng trở nên sậm màu. Trên môi trường thạch- huyết thanh sữa cho khuẩn lạc hình tròn dạng sợi bông rối. Lactobacillus bulgaricus không dịch hóa gelatin, làm đông tụ sữa ở 37OC. Chúng lên men được đường glucose, lactose và galactose. Hàm lượng acid do vi khuẩn này tạo ra trong môi trường sữa rất cao (3-3,5%, tương ứng 30-45OT). Nó thuộc loại kị khí không bắt buộc. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 40-48OC , pH thích hợp ở 5,4. Khi lên men chúng không có khả năng sử dụng đường maltose và tạo một lượng nhỏ acid bay hơi và aldehyde, tạo cho sản phẩm có mùi vị đặc trưng, thường dùng để sản xuất sữa chua đông mịn. 20 2.4. Tổng quan về sữa và chất ổn định 2.4.1. Sữa [ 8] Sữa là một loại thực phẩm rất giàu chất dinh dưỡng. Vì vậy nó là loại thực phẩm quý, đặc biệt đối với người già và trẻ em. Trong sữa có khoảng 90% là nước và có đủ các chất dinh dưỡng như protein, chất béo, đường lactoza, các vitamin như A, D, E, B1, B6, B12, và các chất khoáng. Trong sữa chưa đun còn có một số enzym giúp cho việc tiêu hóa được dễ dàng. Hiện nay sản phẩm sữa chủ yếu là sữa bò với các loại đa dạng như sữa tươi, sữa hấp, sữa hấp pastuer, sữa đặc, kem, bơ, phomat, sữa chua, sữa bột. 2.4.2. Chất ổn định [ 4] Các chất ổn định thường dùng: gelatin, pectin, tinh bột, agar-agar. Chúng liên kết với nước, tăng độ nhớt, ngăn sự tách nhũ thanh. Yoghurt bình thường không cần thêm chất ổn định. Yoghurt trái cây có thể thêm chất ổn định ở mức 0,1-0,5%. 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [ 11] Trong công nghiệp sản xuất sữa chua, các giai đoạn xử lí sản phẩm sau quá trình lên men thường đơn giản. Sản phẩm cuối cùng bao gồm cả sinh khối vi sinh vật, các sản phẩm trao đổi ngoại bào do vi sinh vật tiết ra và cơ chất sót. Thành phần và hàm lượng từng chất sẽ góp phần hình thành nên hương vị cho sản phẩm. Do đó, để sản xuất được sữa chua với chất lượng mong muốn, chúng ta cần phải: - Chọn giống vi khuẩn thích hợp. - Sử dụng môi trường lên men với thành phần cơ chất đầy đủ theo tỉ lệ tối ưu. - Lên men trong điều kiện thích hợp như: lượng giống cấy, nhiệt độ và thời gian lên men. Ngoài ra, ta còn phải quan tâm đến những vấn đề khác như việc cung cấp oxy, sự khuấy trộn… 21 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học trường Cao Đẳng Kinh Tế Công Nghệ số 547/M8 Nguyễn Tri Phương, Phường 14, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03 đến tháng 07 năm 2009. 2.2. Nguyên liệu Hạt đậu nành được chọn từ đậu nành Phương Lâm. Nguyên liệu được chọn mua siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM. Sữa được chọn mua là sữa tiệt trùng không đường của Vinamilk, mua ở siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM Tảo spirulina được chọn là bột tảo thương mại có nguồn gốc Nhật Bản, được đóng gói tại công ty Châu Đại Dương ( 79/3X Phan Tây Hồ, Phường 7, Quận Phú Nhuận, Tp.HCM), loại hộp 50g. Đường được chọn mua là đương cát trắng tinh luyện, mua ở siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM. Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus của viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng Dụng cụ Thiết bị Hóa chất 3Nhiệt kế 3Nồi nấu 3Bếp đun 3Vải lọc 3Ray 3Que cấy trải 3Khúc xạ kế ATAGO 0 – 32oBx 3Tủ sấy 3Cân điện tử 3Cân đồng hồ 3Máy xay sinh tố 3Môi trường MRS agar ( phụ lục) 3Môi trường MRS broth (Phụ lục) 3Cồn 3Paraffin của công ty AR 22 3Đĩa Petri 3Bình tam giác có chia vạch 3Đũa thủy tinh 3Micropipette, đầu tip 3Buret 3Ống nghiệm 3Máy đồng hóa 3Tủ giữ lạnh của công ty Toshiba – Nhật Bản 3Tủ ấm( có thể chỉnh nhiệt độ thành tủ sấy) của công ty Membert- Đức. 3Nồi autoclave SA – 252F của công ty Sturdy – Đài Loan 3Tủ cấy của công ty Huy Hoàng – Việt Nam 3Máy đo pH pH211 của công ty Hanna – Italia – Trung Quốc 3Phenoltalein 1% 3Dung dịch NaOH 0,1N 2.4.Quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Spirulina 2.4.1.Quy trình Đồng hóa Xử lý Dịch tảo Phối trộn Dịch sữa Xử lý Sữa UHT không đường Đường Lựa chọn Đậu nành Bột tảo 23 Cấy giống Nhân giống Thanh trùng Vi khuẩn lactic Rót hủ Bảo quản Sản phẩm Ủ 2.4.2.Giải thích quy trình Lựa chọn đâụ nành: đậu được chọn thường là đậu già, ruột vàng, vỏ mỏng, da láng. Loại bỏ những hạt hư hỏng ( sâu, mọt, mối...), hạt kém phẩm chất ( hạt non, hạt không bình thường về màu sắc và hình dạng...) do những hạt này sẽ làm cho sản phẩm có mùi vị rất kém. Xử lý: Xử lý đậu nành để tạo ra dịch sữa bao gồm các công đoạn sau 3Ngâm: trong giai đoại ngâm, hạt sẽ hút nước và trương lên, khi đó các phân tử nước có tính lưỡng cực sẽ tác động lên các cấu phần ưa nước trong hạt. Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đạt 55 -60% là tốt nhất(Nguyễn Đức Lượng ,1996). Thời gian ngâm đậu được chọn là 4 giờ. Giai đoạn ngâm còn giúp cho công đoạn loại bỏ vỏ trong điều kiện không có máy tách vỏ một cách dễ dàng hơn. 3Bóc vỏ: bóc vỏ bằng cách đãi thủ công trong nước. Bóc vỏ nhằm mục đích làm cho quá trình chần hiệu quả hơn và sữa đậu nành thu dược trắng hơn. 3Chần: chần nóng hạt đậu trong dung dịch Natribicarbonat nhằm loại bỏ yếu tố LOX ( lipoxigenase, là nguyên nhân gây ra mùi khó chịu), hổ trợ quá trình trương nở, ly trích protein, ức chế chất kháng dinh dưỡng. Chần dung dịch đậu trong dung 24 dịch NaHCO3 0,2% ở nhiệt độ 80OC trong vòng 5 phút. Tỉ lệ dung dịch/ đậu là 5/1. Sau khi chần, đậu được rửa lại bằng nước nóng 80OC. 3Xay và lọc: xay ướt đậu là quá trình phá vỡ tế bào giải phóng protein, lipit, gluxit v.v...đồng thời dùng nước hòa tan các chất và chuyển chúng sang dạng huyêng phù. Sau đó lọc huyền phù gồm dung dịch keo và chất rắn không tan thu dịch sữa. Xay đậu trong nước lạnh trong thời gian 1 phút 30 giây với tỉ lệ nước/đậu khi xay là 6/1. Sau khi xay đậu được lọc qua vải lọc. 3Xử lý nhiệt: được tiến hành ngay sau khi lọc hạn chế ảnh hưởng của sự tiếp xúc oxi không khí, ẩm, vi sinh vật.Gia nhiệt sữa đậu nành có các yêu cầu sau cần đạt: tiêu diệt vi sinh vật, diệt enzyme, diệt chất kháng dinh dưỡng, độc tố, khử mùi tanh đậu nành sống. Xử lý nhiệt ở 95OC trong vòng 15 phút. Xử lý bột tảo: Bột tảo được cân và pha vào nước theo tỉ lệ 3g tảo / 50 ml nước cất ấm ( khoảng 40- 50OC), lọc lấy dung dịch tảo bổ sung vào dịch sữa. Phối trộn: Phối trộn sữa đậu nành, sữa tươi, dịch tảo, đường saccharose theo những tỉ lệ nhất định. Trong quá trình thí nghiệm, tỷ lệ phối trộn giữa các thành phần như sau: dịch sữa là sự phối trộn giữa sữa đậu nành và sữa tươi với tỉ lệ 1:1, lượng dịch tảo bổ sung là 6% (v/v), lượng đường saccharose bổ sung là 6% (w/v), ngoài ra bổ sung thêm 5% gelatin dạng bột ( w/v). Đồng hóa: nhằm tạo nên một hỗn hợp đồng nhất, đồng hóa ở tốc độ 4 trong vòng 5 phút. Thanh trùng:thanh trùng ở 80OC trong vòng 15 phút. Nhân giống vi khuẩn: Trước khi nhân giống ta phải làm thuần và giữ giống vi khuẩn. 3Làm thuần giống là công việc tách rời một loại tế bào từ quần thể sinh vật đã được phân lập, cấy chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc (hoặc trộn thạch vào trước khi đông rồi đỗ ra đĩa Petri). Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp, các tế bào sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy vào ống môi trường giữ giống và ủ ở các điều kiện như trên để chúng phát triển thành một quần thể mới.Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng hoặc ống giống. 25 Làm thuần và giữ giống được tiến hành như sau: Vi khuẩn trong ống giống mua từ viện Pastuer được cấy ria trên môi trường MRS agar,ủ ở 37oC trong tủ ấm 2 ngày cho đến khi thuần chủng, tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng hoặc thạch sâu. 3Nhân giống: Cấy giống: Cho vào dịch sữa men cái với tỉ lệ 10% ( Tỷ lệ giữa men L. acidophilus và L. Bugaricus là 1:1) Ủ: Sữa được ủ ở 43OC trong thời gian khoảng 4- 8 giờ. Bảo quản: Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4OC. 2.5. Phương pháp thí nghiệm Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Sprirulina với tóm lược phương pháp nghiên cứu theo sơ đồ sau: Nhân giống cấp 2 ( 1 sữa đậu nành + 1 sữa UHT không đường) 10% giống, ủ 43oC, 6 giờ Men cái Nhân giống cấp 1 (MRS lỏng) ở 37oC, 15 giờ Giống vi khuẩn đã được làm thuần Cho giống vi khuẩn làm quen môi trường sữa 26 Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường MRS Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong dịch sữa ( sữa tươi UHT và sữa đậu nành). Làm men cái Khảo sát quá trình lên men Khảo sát hàm lượng tảo bổ sung Xác định các chỉ tiêu vi sinh và hóa học Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm Khảo sát thời gian lên men Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung Khảo sát tỉ lệ giống cấy Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa tươi UHT và sữa đậu nành 2.5.1.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS. a/ Mục đích Xác định thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu được số lượng vi khuẩn nhiều nhất. b/ Bố trí thí nghiệm 27 0 5 10 15 20 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Vi khuẩn Thời gian (giờ) c/Chỉ tiêu theo dõi Số lượng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi trong môi trường MRS lỏng. d/ Phương pháp thực hiện - Giống vi khuẩn trong môi trường MRS agar cấy chuyền qua môi trường MRS lỏng, ủ ở 37OC trong các khoảng thời gian bố trí như trên. -Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đổ đĩa.( Phụ lục 1.1) 2.5.2.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1) a/ Mục đích Khảo sát số lượng vi khuẩn còn sống trong môi trường sữa sau các khoảng thời gian nuôi cấy, từ đó chọn ra khoảng thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu được số lượng vi khuẩn cao nhất. b/ Bố trí thí nghiệm 0 5 10 15 20 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Vi khuẩn Thời gian (giờ) c/Chỉ tiêu theo dõi Số lượng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi trong môi trường sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1. 28 d/ Phương pháp thực hiện - Giống vi khuẩn trong môi trường MRS agar cấy chuyền qua môi trường MRS lỏng, ủ ở 37OC trong thời gian tối ưu.( ứng dụng kết quả thí nghiệm 2.5.1). -Lấy vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng cho vào môi trường sữa tươi không đường, ủ ở 37OC trong 4h. -Vi khuẩn từ môi trường sữa tươi được cấy vào môi trường sữa tươi và sữa tiệt trùng phối trộn với tỷ lệ 1:1, ủ ở 37OC qua các khoảng thời gian và xác định số lượng vi khuẩn. -Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đổ đĩa. 2.5.3.Làm men cái. a/ Mục đích Tạo ra hủ men đạt yêu cầu về số lượng vi khuẩn và giá trị cảm quan. b/ Bố trí thí nghiệm Xác định giá trị pH và đánh giá cảm quan sản phẩm qua bảng sau: 0 2 4 6 8 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Men cái vi khuẩn Thời gian (giờ) c/ Chỉ tiêu theo dõi -giá trị pH -Đánh giá cảm quan sản phẩm về màu sắc, mùi vị, cấu trúc. d/ Phương pháp thực hiện -Vi khuẩn từ trong môi trường MRS lỏng được cấy chuyền qua môi trường sữa tươi UHT và ủ ở 43OC trong 4 giờ. -Tiếp tục cấy chuyền vi khuẩn từ môi trường sữa tươi sang dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi UHT với tỉ lệ 1:1), ủ ở 43OC trong các khoảng thời gian bố trí như trên. -Khảo sát cảm quan sản phẩm theo thời gian. 29 2.5.4. Khảo sát quá trình lên men. 2.5.4.1. Khảo sát thời gian lên men. Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên Theo dõi pH, đặc điểm sản phẩm theo thời gian và kết hợp với đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong sữa đậu nành, từ đó chọn thời gian lên men thích hợp sao cho sản phẩm đảm bảo lượng vi khuẩn cần thiết để nó đóng vai trò như là probiotic 2.5.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường. a/ Mục đích Phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươ._.