Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan

§Æt vÊn ®Ò Glucose 6 phosphatdehydrogenase (G6PD) lµ mét enzym «xy ho¸ khö, lµ mét enzym then chèt trong qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ Glucose theo con ®­êng Hexose monophosphate trong hång cÇu. Con ®­êng nµy chØ t¹o ra n¨ng l­îng kh«ng ®¸ng kÓ (10%glucose tham gia vµo con ®­êng nµy) nh­ng l¹i ®¶m nhiÖm hai chøc n¨ng quan träng lµ cung cÊp ribose cho qu¸ tr×nh sinh tæng hîp c¸c nucleotid, acid nucleic vµ ®Æc biÖt t¹o ra mét chÊt khö v« cïng quan träng lµ NADPH. ChÊt nµy cã kh¶ n¨ng chèng l¹i t¸c nh©n g©y oxy hãa, lo¹i bá H202, gióp b¶o vÖ cho mµng hång cÇu ®ù¬c bÒn v÷ng, b¶o vÖ cÊu tróc cña Hemoglobin, cÊu tróc cña c¸c enzym cã trong hång cÇu ®Ó duy tr× sù sèng cho tÕ bµo hång cÇu. BÖnh thiÕu hôt G6PD lµ mét trong nh÷ng bÖnh lý hay gÆp nhÊt cña hång cÇu. C¬ së di truyÒn häc cña bÖnh nµy lµ ®ét biÕn gen n»m trªn ®Çu mót tËn cïng nhiÔm s¾c thÓ X ë ®o¹n q víi c¸c d¹ng ®ét biÕn kh¸c nhau (nh­ G©oh,Viangchan...) C¸c d¹ng ®ét biÕn kh¸c nhau cã thÓ t¹o nh÷ng møc ®é thiÕu hôt G6PD kh¸c nhau vµ g©y ra nh÷ng biÓu hÞªn l©m sµng kh¸c nhau. §©y lµ bÖnh di truyÒn gen lÆn liªn kÕt nhiÔm s¾c thÓ giíi tÝnh X kh«ng cã alen t­¬ng øng trªn Y nªn gÆp nhiÒu ë nam h¬n ë n÷,bÖnh mang tÝnh di truyÒn do ®ã biÓu hiÖn kh¸c nhau ë nh÷ng d©n téc kh¸c nhau. C¸c nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy nh÷ng biÓu hiÖn l©m sµng cña bÖnh còng ®a sè xuÊt hiÖn do sö dông c¸c biÖn ph¸p ®iÒu trÞ nh­ thuèc hay sö dông thøc ¨n cã tÝnh oxy ho¸, do vËy ë vïng l·nh thæ kh¸c nhau do tËp qu¸n sinh ho¹t, thãi quen vµ ®Æc ®iÓm bÖnh tËt kh¸c nhau nªn tû lÖ thiÕu hôt cña enzym nµy còng thay ®æi. ViÖt Nam lµ mét trong nh÷ng n­íc n»m trong b¶n ®å thiÕu hôt G6PD, víi tû lÖ m¾c bÖnh t­¬ng ®èi cao. ThiÕu G6PD th­êng cã nh÷ng biÓu hiÖn tan m¸u g©y vµng da, ®¸i huyÕt s¾c tè, thiÕu m¸u, suy thËn cÊp vµ tr­êng hîp nÆng lµ tö vong. BÖnh xuÊt hiÖn khi tiÕp xóc víi c¸c t¸c nh©n g©y oxy ho¸ nh­ vi sinh vËt, ho¸ chÊt (thuèc, thùc phÈm). Ng­êi b×nh th­êng víi sè l­îng vµ chÊt l­îng G6PD ®¶m b¶o th× khi tiÕp xóc víi hµm l­îng cao chÊt oxy ho¸ th× vÉn cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt ra ®ñ NADPH ®Ó lo¹i bá t¸c ®éng cña chóng vµ sÏ kh«ng cã nh÷ng biÓu hiÖn l©m sµng trªn. Tr­ßng hîp thiÕu hôt nÆng enzym th× hay g©y ra nh÷ng c¬n tan m¸u cÊp kÓ c¶ khi sö dông rÊt Ýt chÊt ây ho¸, nh­ng còng cã tr­ßng hîp do sö dông mét l­îng chÊt oxy ho¸ tuy Ýt nh­ng kÐo dµi sÏ dÉn ®Õn hiÖn t­äng kh«ng ®ñ enzym ®Ó tham gia qu¸ tr×nh khö, ®©y chÝnh lµ hiÖn t­îng thiÕu enzym thø ph¸t. Bëi vËy viÖc ph¸t hiÖn ra sù thiÕu hôt G6PD lµ rÊt quan träng. Qua sù ph¸t hiÖn b»ng nh÷ng ph­ong ph¸p ®Þnh tÝnh, ®Þnh l­îng chóng ta cã thÓ biÕt ®­îc møc ®é suy gi¶m ®Ó cã ®­îc kÕ ho¹ch ®iÒu trÞ còng nh­ c¸ch thøc sinh ho¹t hîp lý nh»m h¹n chÕ thÊp nhÊt sù biÓu hiÖn cña bÖnh. Sö dông ph­¬ng ph¸p b¸n ®Þnh l­îng t¹o vßng Formazan víi ­u ®iÓm nhanh chãng, ®¬n gi¶n sÏ gióp cho chóng ta ph¸t hiÖn ®­îc sù thiÕu hôt nµy mét c¸ch ®ång lo¹t vµ cã hiÖu qu¶. T«i tiÕn hµnh lµm kho¸ luËn tèt nghiÖp vÒ ®Ò tµi: "Ph¸t hiÖn tÇn suÊt thiÕu hôt G6PD ë d©n téc Tµy vµ d©n téc Nïng b»ng ph­¬ng ph¸p b¸n ®Þnh l­îng Formazan." Víi hai môc tiªu sau ®©y: - §¸nh gi¸ c¸c ®iÒu kiÖn cña ph¶n øng Formazan. - Sö dông kü thuËt b¸n ®Þnh l­îng Formazan ®Ó ph¸t hiÖn tÇn suÊt thiÕu hôt G6PD ë d©n téc Tµy vµ Nïng. Ch­¬ng 1: Tæng quan tµi liÖu 1. Nh÷ng hiÓu biÕt vÒ G6PD: 1.1.§¹i c­¬ng: G6PD ®­îc Warburg vµ Christan ph¸t hiÖn n¨m 1931 ë hång cÇu ng­¹, ®éng vËt, vi sinh vËt, men bia vµ hång cÇu ng­êi. N¨m 1936 G6PD ®· ®­îc nghiªn cøu vµ tiÕn hµnh chiÕt suÊt lµm s¹ch nh­ng ph¶i 25 n¨m sau míi thµnh c«ng. B­íc ®Çu nghiªn cøu enzym ®· ®ù¬c t×m hiÓu vÒ cÊu tróc ph©n tö, d¹ng cã ho¹t tÝnh sinh häc, c¸c d¹ng biÕn thÓ cña enzym. Qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt enzym ra khái hång cÇu còng ngµy cµng ®¹t ®­îc ®é tinh s¹ch cao h¬n, tr¶i qua c¸c b­íc nh­ ®iÖn di, ph­¬ng ph¸p s¾c ký trao ®æi ion, s¾c ký ¸i lùc ®é tinh s¹ch cña enzym ®· ®¹t ®ù¬c tíi 1448,2 lÇn [2]. Cïng víi sù ph¸t triÓn cña sinh häc ph©n tö c¸c d¹ng ®ét biÕn cña G6PD ngµy cµng ®­îc ph¸t hiÖn nhiÒu, c¸c ph­¬ng ph¸p ph¸t hiÖn thiÕu hôt tõ ®Þnh l­îng, ®Þnh tÝnh, b¸n ®Þnh l­îng, test nhanh ngµy cµng ®­îc ph¸t triÓn chÝnh x¸c h¬n vµ ¸p dông réng r·i h¬n trong céng ®ång. 1.2.CÊu tróc: CÊu tróc bËc mét (monomer): lµ chuçi polypeptid gåm 515 acid amin liªn kÕt víi nhau b»ng nh÷ng liªn kÕt peptid (nhãm cacboxyl(-C00H) cña acid amin tr­íc sÏ liªn kÕt víi nhãm amin (-NH2) cña acidamin sau b»ng c¸ch chung nhau mÊt ®i mét ph©n tö n­íc). Träng l­îng ph©n tö cña enzym nÆng 59265 Daltons. Tr×nh tù acid amin ®· ®­îc gi¶i m·, tÝnh ®ång nhÊt cña tr×nh tù nµy thay ®æi tuú theo tõng vïng. Vïng cã tÝnh ®ång nhÊt cao ®­îc cho lµ vïng cã chøc n¨ng quan träng (hay cßn gäi lµ trung t©m ho¹t ®éng) cña enzym, ë ng­êi vïng nµy thuéc acidamin 188-291. CÊu tróc bËc cao h¬n: G6PD cã cÊu tróc kh«ng gian lµ p«lymer, ®ã lµ c¸c d¹ng dimer, tetramer, hexamer. D¹ng cÊu tróc kh«ng gian míi ®¶m b¶o cho enzym ho¹t ®éng ®­îc. Trong hång cÇu ng­êi th× d¹ng dimer chiÕm ­u thÕ h¬n. C¸c cÊu tróc bËc 1, bËc cao h¬n cã sù chuyÓn d¹ng lÉn nhau tuú vµo ®iÒu kiÖn cña m«i tr­êng, nh­ ë pH thÊp th× chñ yÕu lµ d¹ng tetramer, pH gÇn trung tÝnh th× lµ d¹ng dimmer, ë pH trung tÝnh th× hai d¹ng ®ã gÇn b»ng nhau. G6PD lµ mét enzym kh«ng ®ång nhÊt vµ ®a d¹ng ph©n tö, b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ sinh WHO ®· m« t¶ cã 442 d¹ng kh¸c nhau [1,3]. H×nh 1: cÊu tróc bËc bèn cña G6PD 1.3.Chøc n¨ng: G6PD lµ mét enzym oxy ho¸ khö xóc t¸c ph¶n øng chuyÓn ho¸ ®Çu tiªn cña chu tr×nh Pentose( chu tr×nh Hexomonophosphate), cã ký hiÖu quèc tÕ lµ: 1.1.49. Chøc n¨ng quan träng cña nã lµ t¹o ra NADPH ®Ó chèng l¹i c¸c t¸c nh©n oxy ho¸ vµ v× vËy trong hång cÇu nã ý nghÜa lín trong viÖc b¶o vÖ mµng hång cÇu ®­¬c bÒn v÷ng, ®¶m b¶o thêi gian tån t¹i trong m¸u ngo¹i vi cña hång cÇu lµ kho¶ng 120 ngµy nh»m ®¸p øng nhu cÇu «xy cña c¬ thÓ. Chu tr×nh Hexomonophosphate ( pentosephosphat) Sù oxy hãa glucose theo con ®­êng Hexomonophosphate x¶y ra ë c¸c m« song song víi con ®­êng ®­¬ng ph©n song chiÕm tØ lÖ thÊp h¬n nhiÒu (7%-10%). Tuy nhiªn ë mét sè tÕ bµo nh­: hång cÇu, gan, tuyÕn mì, tuyÕn s÷a thêi k× ho¹t ®éng ... Sù tho¸i hãa glucose theo con ®­êng nµy chiÕm ­u thÕ x¶y ra trong phÇn dÞch bµo cña tÕ bµo. + G6P ®­îc t¹o ra qua sù phosphorin hãa Glutathion d­íi t¸c dông cña enzym Hexokinase + G6P b­íc vµo con ®­êng Pentose qua 2 giai ®o¹n: Giai ®äan 1: khö cacboxyl oxy hãa G6P thµnh pentose phosphat, qu¸ tr×nh nµy t¹o ra NADPH ë mét sè tæ chøc con ®­êng pentose dõng t¹i ®©y vµ ph­¬ng tr×nh tæng qu¸t lµ: G6P + 2NADP+ + HO --> R5P + CO + 2NADPH + 2H NADPH dïng cho c¸c ph¶n øng sinh tæng hîp, cßn R5P lµ tiÒn chÊt tæng hîp Nucleotid. Giai ®o¹n 2: biÕn hãa tiÕp tôc cña pentose phosphat cã sù vËn chuyÓn c¸c ®¬n vÞ 2C hoÆc 3C d­íi t¸c dông cña c¸c enzym t­¬ng øng lµ fructose 6 phosphat vµ 1 ph©n tö phospho glyconat: 6 G6P + 12NADP+ + 6 HO --> 5G6P +12 NADPHH+ + 6CO + Pi §©y lµ giai ®o¹n oxy hãa ë nh÷ng tæ chøc cÇn nhiÒu NADPH h¬n R5P th× c¸c pentose phosphat ®­îc ®i vµo chu tr×nh biÕn hãa thµnh G6P ®Ó tiÕp tôc oxy hãa nhê s¾p xÕp l¹i khung C mµ 6 ph©n tö pentosephosphat trë thµnh 5 Hexo phosphat. Glucose-6-phosphate dehydrogenase Glucose-6-phosphat 6-phosphogluconolacton Mg2+ NADP+ NAPDH +H+ Lactonase 6-phosphogluconat NADP+ Mg2+ 6-phosphogluconate dehydrogenase NADPH+ H+ Ribulose-5-phosphat Phosphopentose isomerase D-Ribose-5-phosphat ( 5C) H×nh 2: giai ®o¹n 1 cña chu tr×nh Hexomonophosphate 5C 7C 6C 5C 3C 4C 6C 5C 3C 6C 5C 3C 5C 3C 4C 6C 5C 7C 6C H×nh 3: giai ®o¹n 2 cña chu tr×nh Hexomonophosphate Hb MetHb Glutathion peroxydase Hexokinase Glucose Glucose 6 phosphate NADP+ ADP ATP G6PD NADPH++hHHHHH Glutathion d¹ng OXH(G-S-S-G) 6phosphogluconat Glutathion reductase Glutathion d¹ng khö (2G-SH) H×nh 4: S¬ ®å ho¹t ®éng cña G6PD Th«ng qua qu¸ tr×nh photphoryl hãa t¹o thµnh G6P qua xóc t¸c cña G6PD ®Ó t¹o ra s¶n phÈm 6PG ®ång thêi t¹o thµnh NADPH tõ NADP+ lµ chÊt cung cÊp H+ ®Ó khö Glutathion d¹ng oxy hãa thµnh d¹ng khö th«ng qua enzym Glutathion reductase ®Ó tõ ®ã trùc tiÕp b¶o vÖ hång cÇu chèng l¹i c¸c t¸c nh©n g©y oxy hãa ngoµi ra cßn khö MetHb thµnh Hb do ®ã tr¸nh ®­îc sù biÕn tÝnh Hb.NÕu kh«ng ®ñ G6PD th× l­îng NADPH kh«ng ®ñ dÉn ®Õn mµng hång cÇu diÔn ra qu¸ tr×nh peroxy hãa lipit dÉn ®Õn hiÖn t­îng vì hång cÇu g©y ra tan m¸u vµ Hemoglobin sÏ bÞ kÕt tña thµnh thÓ Heinz 1.4.C¸c yÕu tè ¶nh h­ëng ®Õn cÊu tróc vµ ho¹t ®éng sinh lý cña G6PD: Mét sè tÝnh chÊt chung cña enzym: Enzym lµ nh÷ng chÊt xóc t¸c sinh häc b¶n chÊt lµ pr«tªin do c¬ thÓ sèng sinh ra nhê ®ã mµ c¸c ph¶n øng hãa häc trong c¬ thÓ sèng x¶y ra víi tèc ®é rÊt nhanh trong ®iÒu kiÖn sinh lý b×nh th­êng: nhiÖt ®é, ¸p suÊt kh«ng cao, pH m«i tr­êng gÇn nh­ trung tÝnh. Cã nh÷ng enzym chØ lµ nh÷ng pr«tªin ®¬n thuÇn nh­ng còng cã nh÷ng enzym cã thµnh phÇn cÊu t¹o gåm cã 1 thµnh phÇn lµ pr«tªin ®¬n thuÇn (Apoenzym) vµ mét thµnh phÇn lµ chÊt h÷u c¬ ®Æc biÖt (chÊt céng t¸c cofactor hay coenzym). Ngoµi ra cßn cÇn ®Õn sù cã mÆt cña c¸c ion kim lo¹i trong cÊu tróc cña enzyme, lµ thµnh phÇn ®Ó liªn kÕt enzym vµ c¬ chÊt, liªn kÕt apoenzym vµ coenzym. VÞ trÝ diÔn ra ph¶n øng cña enzym lµ trung t©m ho¹t ®éng cã tÝnh chÊt ®Æc hiÖu ®èi víi tõng c¬ chÊt cÊu trøc vµ ho¹t tÝnh cña enzym chÞu t¸c ®éng cña rÊt nhiÒu yÕu tè kh¸c nh­: nhiÖt ®é, pH muèi kim lo¹i nÆng, chÊt ho¹t hãa vµ øc chÕ hay c¸c dung m«i h÷u c¬ nh­ r­îu, axeton... Mçi mét c¬ chÊt enzym cã mét Km x¸c ®Þnh, ®©y chÝnh lµ h»ng sè Michailis-Menten: lµ nång ®é cña c¬ chÊt (mol/lit) ®ñ lµm cho tèc ®é ph¶n øng enzym ®¹t tíi mét nöa tèc ®é cùc ®¹i (Vmax). Km thÓ hiÖn ¸i lùc cña enzym tíi c¬ chÊt Km cµng nhá th× ¸i lùc cµng lín vµ ng­îc l¹i. Cã 6 lo¹i enzym: enzym oxy ho¸ -khö (oxidoreductase), enzym vËn chuyÓn nhãm (Transferase), enzym thuû ph©n (Hydrolase), enzym ph©n c¾t (lyase), enzym chuyÓn ®ång ph©n (Isomerase), enzym tæng hîp (Ligase). G6PD lµ enzym oxy ho¸ khö. Nh÷ng ®iÒu kiÖn ¶nh h­ëng ®Õn ho¹t ®éng cña G6PD: + NhiÖt ®é: enzym b¾t ®Çu biÕn tÝnh nhÑ tõ 40C, ®Õn 60C th× ho¹t tÝnh cña enzym cßn l¹i kh«ng ®¸ng kÓ. + §é pH: pH kiÒm nhÑ sÏ lµm cho nång ®é d¹ng dimer nhiªï vµ enzym sÏ ho¹t ®éng tèt nhÊt, bëi vËy cã mÆt mét l­îng nhá NaHCO3 sÏ gióp enzym ph¶n øng tèt h¬n. pH tèi ­u cña G6PD lµ 8,0 [2] + Nång ®é cña cña c¸c chÊt néi bµo nh­ c¬ chÊt, cofactor, chÊt t¹o thµnh: tu©n theo quy luËt cña c¸c ph¶n øng ho¸ häc kh¸c. Sù trïng hîp cña enzym tõ d¹ng monomer sang d¹ng dimer vµ c¸c cÊu tróc bËc cao h¬n cÇn cã sù cã mÆt cña NAPD+, chÊt võa lµ c¬ chÊt võa lµ cofator. Mçi dimer cã 2 vÞ trÝ g¾n NADP+, ®ã lµ NADP+ xóc t¸c, g¾n láng lÎo vµ dÔ dµng bÞ khö thµnh NADPH, cßn l¹i lµ NAPD+ chøc n¨ng g¾n chÆt chÏ h¬n cÇn thiÕt ®Ó duy tr× cÊu tróc ho¹t ®éng cña enzym. +Khi ë ngoµi c¬ thÓ th× ®Ó ®¶m b¶o cho enzym ho¹t ®éng ®­îc tèt th× vÊn ®Ò b¶o qu¶n lµ hÕt søc quan träng G6PD lµ mét enzym mÊt nh¹y c¶m, kh«ng bÒn v÷ng, nh­ng nÕu hång cÇu ®­îc röa vµ b¶o qu¶n nguyªn vÑn trong dung dÞch NaCl 0,9% ë nhiÖt dé l¹nh (40C) ngay sau 24h th× ho¹t ®é enzym ch­a bÞ thay ®æi. Tr¸i l¹i chØ b¶o qu¶n theo tiªu chuÈn m¸u th× sau 24h sÏ gi¶m 17% ho¹t tÝnh. +Ion Mg2+ lµ ion ®Æc hiÖu cho hång cÇu ng­êi, víi nång ®é 0,01 mol/l th× ho¹t ®é enzym lµ 100%[2], theo nghiªn cøu th× ion kim lo¹i nµy ®ãng vai trß t¹o phøc hîp gi÷a enzym vµ c¬ chÊt. 1.5 C¬ së di truyÒn häc cña G6PD Gen quy ®Þnh cÊu tróc cña G6PD n»m trªn nh¸nh dµi, locus q28 cña nhiÔm s¾c thÓ X (vïng 2, b¨ng 8) kh«ng cã alen t­¬ng øng trªn Y. Vïng 2 lµ vïng mang th«ng tin di truyÒn m· hãa kh¸ nhiÒu tÝnh tr¹ng kh¸c nh­: nh×n mµu, hemophilia A. Gen G6PD gåm cã 13 exon vµ 12 intron. Dµi kho¶ng 18,5 kilobases. Chøc n¨ng cña tõng exon kh¸c nhau, vµ kÝch th­íc cña c¸c exon m· hãa thay ®æi rÊt nhiÒu tõ 38 - 236 bp. Trong ®ã exon 1 kh«ng m· ho¸ [12], exon 6 m· ho¸ s¶n phÈm lµ n¬i g¾n c¬ chÊt G6P [6]. mARN G6PD gåm 2269 ribonucleotid, m RNA cña G6PD cã mét ®o¹n ®Çu 3' kh«ng m· hãa dµi 655 bp vµ ®o¹n ®Çu 5' kh«ng m· hãa dµi 69 bp. Gen G6PD cã sù ®iÒu hßa vµ kiÓm so¸t chÆt chÏ. Vïng promotor cña G6PD kÐo dµi kho¶ng 300 nucleotid giÇu GC vµ nhiÒu GC kh«ng bÞ methyl hãa. 2. BÖnh lý thiÕu hôt G6PD. 2.1.C¬ chÕ bÖnh sinh vµ c¬ së di truyÒn häc: 2.1.1. C¬ chÕ bÖnh sinh : Gi¶m G6PD sÏ gi¶m l­îng Glutathione d¹ng khö kh«ng ®ñ ®Ó khö HbHOt¹o thµnh Met Hemoglobin vµ Choleglobin do ®ã Hemoglobin bÞ biÕn tÝnh vµ kÕt tña thµnh thÓ Heinz [2][9]. C¬ chÊt t¹o ra lµ NADPH cßn cã t¸c dông b¶o vÖ nhãm -SH (nhãm chøc n¨ng ho¹t ®éng) cña enzym phosphoglyceral-dehydrogenase, ®©y lµ 1 enzym quan träng trong chuçi ph¶n øng xóc t¸c NAD+ thµnh NADH (mét chÊt khö quan träng chèng l¹i sù «xy hãa cña hång cÇu [2]). Ngoµi ra gi¶m NADPH dÉn ®Õn hång cÇu ph¶i sö dông nhiÒu NADHlµm gi¶m l­îng ATP cÇn thiÕt vµ l­îng Na+ trong tÕ bµo bÞ ø ®äng, n­íc vµo trong hång cÇu nhiÒu céng víi sù bÒn v÷ng cña mµng hång cÇu bÞ yÕu dÉn ®Õn hång cÇu bÞ hñy ho¹i. 2.1.2 BÖnh lý gen häc cña thiÕu hôt G6PD: Gi¶m G6PD lµ bÖnh di truyÒn gen hoÆc n»m trªn nhiÔm s¾c thÓ X kh«ng alen t­¬ng øng trªn Y do vËy tû lÖ bÞ bÖnh gÆp ë nam giíi lµ nhiÒu h¬n vµ th­êng nÆng h¬n. Nam giíi XY: gi¶ sö a lµ gen quy ®Þnh tÝnh tr¹ng gi¶m G6PD sÏ cã kiÓu gen lµ XaY: ë nam giíi chØ cÇn ng­êi alen a ë X lµ cã biÓu hiÖn bÞ bÖnh. N÷ giíi XX: cã 3 d¹ng XA XA: b×nh th­êng. XAXa: cã thÓ b×nh th­êng hoÆc thiÕu hôt G6PD tõ nhÑ ®Õn trung b×nh, hiÕm khi thiÕu hôt nÆng (trõ phi ë vïng trung t©m ho¹t ®éng). Nguyªn nh©n lµ do sù bÊt ho¹t nhiÔm s¾c thÓ tõ trong bµo thai, trong qu¸ tr×nh ph¸t triÓn cña ph«i t¹o ra thÓ kh¶m gi÷a dßng tÕ bµo lµnh vµ dßng tÕ bµo bÖnh, tû lÖ gi÷a 2 lo¹i tÕ bµo nµy thay ®æi rÊt lín: tÕ bµo gi¶m G6PD chiÕm tõ 1% -> 90%. XaXa: biÓu hiÖn kiÓu h×nh thiÕu nÆng nh­ng tÇn suÊt gÆp kiÓu gen nµy rÊt nhá. Gen cÊu tróc ®ét biÕn sÏ b©y biÕn ®æi vÒ mÆt chÊt l­îng ng­îc l¹i gen ®iÒu hßa bÞ ®ét biÕn g©y thiÕu G6PD vÒ mÆt sè l­îng, nh­ng biÕn ®æi ë intron kh«ng g©y biÕn ®æi cÊu tróc vµ s¶n l­îng G6PD. Ho¹t tÝnh G6PD phô thuéc vµo c¶ chÊt l­îng vµ sè l­îng. Ngµy nay ®· ph¸t hiÖn ®­îc h¬n 140 d¹ng ®ét biÕn kh¸c nhau ®¹i diÖn cho 442 biÕn thÓ kh¸c nhau cã tÝnh chÊt ®Æc hiÖu vµ ph©n biÖt b»ng c¸c chØ sè sinh hãa. Do 1 axit amin cã thÓ ®­îc quy ®Þnh bëi ng­êi bé ba nªn cã khi 2 biÕn ®æi kh¸c nhau trªn AND chØ g©y nªn mét lo¹i ®ét biÕn. VÝ dô nh­: - D¹ng ®ét biÕn Aaches: ®ét biÕn nucleotid 1089C -> G - D¹ng ®ét biÕn Loma Linda: 1089C -> A hai lo¹i nµy ®Òu lµm thay ®æi acid amin 363 Asn -> Lys. Dùa vµo ho¹t ®é cña enzym trong hång cÇu vµ nh÷ng bÖnh nh©n l©m sµng cña chóng, WHO ®· chia c¸c biÕn thÓ cña thiÕu hôt G6PD ra lµm 4 líp: + Líp 1: thiÕu enzym nÆng víi biÓu hiÖn thiÕu m¸u tan m¸u, hång cÇu h×nh kh«ng trß ng­êi m¹n tÝnh. + Líp 2: ThiÕu G6PD nÆng (ho¹t ®é enzym < 10% so víi b×nh th­êng + Líp 3: ThiÕu G6PD võa ®Õn nhÑ. (Ho¹t ®é tõ 10 - 60% so víi b×nh th­êng). + Líp 4: thiÕu rÊt nhÑ hoÆc kh«ng thiÕu G6PD (60 - 100%). Tuy vËy nh­ng sù ph©n biÖt nµy lµ kh«ng râ rµng gi÷a c¸c ph©n líp. Líp 1, líp 2 lµ g©y nguy hiÓm nhÊt v× th­êng cã tan m¸u cÊp diÔn. HiÖn nay ë ViÖt Nam ®· t×m thÊy ®­îc c¸c d¹ng ®ét biÕn kh¸c nhau, trong ®ã cã mét d¹ng kh«ng lµm ¶nh h­ëng ®Õn sù m· hãa acid amin trong cÊu tróc G6PD ®ã lµ d¹ng Silent tån t¹i d¹ng cßn l¹i ®Òu lµ nh÷ng d¹ng hay gÆp ë c¸c d©n téc ch©u ¸. D¹ng Silent xuÊt hiÖn lµ do ®ét biÕn thay nucleotid C thµnh nucleotid T dÉn ®Õn bé ba m· ho¸ TAC chuyÓn thµnh TAT vÉn m· ho¸ acid amin Tyrosin, ®©y còng chÝnh lµ mét vÝ dô cô thÓ biÓu thÞ tÝnh b¶o thñ cña th«ng tin di truyÒn. B¶ng 1: Mét sè d¹ng ®ét biÕn G6PD gÆp ë Ch©u ¸ STT D¹ng ®ét biÕn VÞ trÝ biÕn ®æi Acid amin t­¬ng øng Exon Nucleocid 1 Gaoha 2 95A - G 32 His -> Arg 2 Viangchan 9 871G -> A 291 Val -> Met 3 Chatham 9 1003G -> A 335 Sla -> Thr 4 Chinese - 5 9 1024 C -> T 342 leu - > Phe 5 Union 11 1360 -> T 454 Arg -> Cys 6 Canton 12 1376 G -> C 459 Arg -> Leu 7 Kaiping 12 1388 G -> A 463 Arg -> His 8 Silent 11 1311 C -> T TAC -> ATA -> Tyrosil 2.2. DÞch tÕ häc. N¨m 1996 Blood Ernest Beutler ®· ph¸t hiÖn cã 400 triÖu ng­êi thiÕu m¸u G6PG gÆp ë tÊt c¶ c¸c d©n téc. ViÖt Nam n»m trong vïng cã tØ lÖ thiÕu hôt G6PD kh¸c nhau tïy tõng vïng vµ tïy tõng d©n téc. Theo nghiªn cøu cña t¸c gi¶ §oµn H¹nh Nh©n thiÕu G6PD hång cÇu, cã tØ lÖ cao t¹i mét sè vïng Sèt RÐt Kim B«i (34,1%), Mai Ch©u (20,4%), Nh­ Xu©n (19,7%), tû lÖ thiÕu l¹i th­êng thÊp ë n¬i kh«ng cã l­u hµnh bÖnh sèt rÐt. ë d©n téc M­êng (tØ lÖ cao nhÊt 31%) tiÕp ®Õn lµ d©n téc Thæ (19,3% d©n téc Thæ, d©n téc Th¸i 19,3%) rÊt thÊp ë d©n téc kinh 0,5%. H×nh 5: ph©n bè thiÕu hôt G6PD trªn thÕ giíi 2.3. BiÓu hiÖn l©m sµng Th­êng biÓu hiÖn khi tiÕp xóc víi chÊt oxi hãa ®ã lµ nh÷ng c¬n tan m¸u. Primaquine lµ mét lo¹i thuèc cã tÝnh o xi ho¸ cao nh­ng rÊt hay ®­îc sö dông trong ®iÒu trÞ sèt rÐt v× ®©y lµ thuèc duy nhÊt ®­îc sö dông ®Ó diÖt thÓ Èn trong gan víi bÖnh nh©n nhiÔm P.vivax vµ thÓ giao bµo víi bÖnh nh©n nhiÔm P.falciparum [6]. Tïy thuéc vµo d¹ng thiÕu hôt G6PD tïy vµo tÝnh chÊt hay nång ®é cña tÝnh chÊt hay nång ®é cña c¸c chÊt oxi hãa sÏ dÇn dÇn tan m¸u nhiÒu hay Ýt tõ ®ã dÇn ®Õn bÖnh thiÕu hôt nÆng hay nhÑ. 2.3.1. Vµng da s¬ sinh. Vµng da s¬ sinh lµ mét triÖu chøng cña nhiÒu nguyªn nh©n kh¸c nhau, lµ do trong m¸u cã sù gia t¨ng chÊt bilirubin, mét s¸n phÈm dÞ ho¸ cña hemoglobin.Vµng da xuÊt hiÖn khi ®Þnh l­îng bilirubin trong m¸u ë ng­êi lín lµ >2mg%, trÎ em lµ >7mg%[8]. DÞ ho¸ Hb ë hÖ liªn vâng néi m« (75%) vµ tõ nguån kh¸c(25%) Hemoxygen HÖ liªn vâng néi m« Biliverdin Bilirubin+albumin (m¸u) Bilirubin+ligandin (gan) Glucuronyl transferase Bilirubin glucuronid (trùc tiÕp) Bµi tiÕt xuèng ruét Stercobiline, urobilinogen H×nh 6: S¬ ®å chuyÓn ho¸ cña bilirubin. Vµng da s¬ sinh cã hai lo¹i lµ sinh lý vµ bÖnh lý. Vµng da sinh lý th­êng diÔn ra trong ba ngµy ®Çu vµ kÕt thóc tèi ®a lµ 10 ngµy, møc ®é vµng da nhÑ, hiÖn t­äng nµy lµ do sù suy gi¶m nhÊt thêi chøc n¨ng chuyÓn ho¸ bilirubin cña gan do t¨ng qu¸ tr×nh t¸I hÊp thu bilirubin t¹i ruét, t¨ng thÊm vµo tæ chøc. Trong khi ®ã chÊt nµy ®­îc s¶n sinh hµng ngµy ë giai ®o¹n s¬ sinh nÕu tÝnh trªn c©n nÆng lín gÊp ®«i ng­êi lín.Vµng da bÖnh lý thÊy xuÊt hiÖn khi nång ®é bilirubin trong m¸u cao h¬n 20mg/dl. HËu qu¶ nghiªm träng cña bÖnh lý nµy lµ vµng nh©n n·o. TrÎ s¬ sinh sÏ cã biÓu hiÖn lµ nh÷ng c¬n t¨ng tr­¬ng lùc c¬, xo¾n v¨n, mÊt c¸c ph¶n x¹ s¬ sinh, ngõng thë tÝm t¸i vµ rÊt dÔ tö vong. NÕu trÎ qua khái th× sÏ ®Ó l¹i nh÷ng di chøng nÆng nÒ nh­ rèi lo¹n ngo¹i th¸p (móa vên, móa giËt, rèi lo¹n ng«n ng÷…) hoÆc bÊt th­êng thÝnh lùc, thÞ gi¸c vµ thiÓu s¶n ph¸t triÓn r¨ng. Vµng da nh©n n·o ¶nh h­ëng ®Õn kh¶ n¨ng ph¸t triÓn tinh thÇn vµ vËn ®éng cña trÎ. ViÖc ph¸t hiÖn ra bÖnh lý nµy kh«ng khã vµ viÖc ®IÖu trÞ cã kÕt qu¶ rÊt nhanh chãng vµ dÔ dµng b»ng ph­¬ng ph¸p chiÕu ®Ìn, thuèc lµm gi¶m nång ®é bilirubin trong m¸u vµ hiÖu qu¶ nhÊt lµ ph­¬ng ph¸p chiÕu ®Ìn. Nh­ng nÕu ®Ó l©u, Bilirubin ®· ngÊm vµ c¸c nh©n x¸m cña n·o th× sÏ ®Ó l¹i hËu qu¶ nÆng nÒ kh«ng thÓ håi phôc l¹i ®­îc do tæn th­¬ng c¸c tÕ bµo thÇn kinh nh­ ®· nªu trªn. ThiÕu G6PD nh­ mét yÕu tè nguy c¬ dÉn ®Õn vµng da bÖnh lý. Do ®ã viÖc ph¸t hiÖn thiÕu hôt G6PD sÏ gióp cho qu¸ tr×nh ph¸t hiÖn nh÷ng triÖu chøng nÆng gióp cho qu¸ tr×nh theo dâi tèt h¬n tr¸nh bá sãt ®¸ng tiÕc. Tû lÖ vµng da dÉn ®Õn vµng nh©n n·o ë n­íc ta cßn rÊt cao. N¨m 1996 - 2000: t¹i ViÖn Nhi Trung ­¬ng tû lÖ nµy kho¶ng 25%, t¹i bÖnh viÖn Nhi §ång I thµnh phè Hå ChÝ Minh ph¸t triÓn tõ 147 tr­êng hîp (1995) ®Õn 238 tr­êng hîp (1997). ë nh÷ng trÎ em bÞ thiÕu hôt G6PD th× Bilirubin huyÕt thanh cao h¬n ®¸ng kÓ so víi nhãm chøng, cao h¬n vµo ngµy thø 3 sau sinh. Lo¹i thiÕu hôt G6PD líp 3 th­êng biÓu hiÖn vµng da sau sinh. VÝ dô: G6PD Aures th­êng g©y vµng da víi ®ét biÕn cao. ThiÕu G6PD ®­îc di truyÒn ®ång thêi víi ®ét biÕn gen VGI1A1 (Gilbert) th× nguy c¬ cao dÉn ®Õn vµng da nh©n. 2.3.2. Tan m¸u do dïng thuèc vµ do sö dông mét sè thùc phÈm. Ernet Beutler ph¸t hiÖn ra hiÖn t­îng tan m¸u sau khi nghiªn cøu mét sè bÖnh nh©n sö dông thuèc chèng sèt rÐt lµ Primaquin. Sau ®ã qua nghiªn cøu ng­êi ta ®· kh¸m ph¸ ra r»ng kh«ng chØ pnimaquin mµ sau sö dông mét sè thuèc kh¸c còng g©y nªn hiÖn t­îng tan m¸u: Aspirin (thuèc gi¶m ®au), Procainamide (thuèc ®iÒu trÞ bÖnh tim m¹ch), DDS (diÖt khuÈn)... TriÖu chøng tan m¸u dÉn ®Õn vµng da th­êng x¶y ra vµo ngµy thø 2,3 sau khi dïng thuèc. Ngoµi ra hiÖn t­îng tan m¸u cßn ®­îc biÕt ®Õn sau khi bÖnh nh©n sö dông mét sè lo¹i thøc ¨n cã tÝnh oxi hãa cao nh­ long n·o, r­îu vang ®á, c¸c s¶n phÈm tõ ®Ëu t­¬ng, ®Ëu nµnh vµ ®Æc biÖt lµ c¸c lo¹i ®Ëu Fava dÉn ®Õn héi ch­¬ng Favism. Héi chøng favism: lµ bÖnh lý thiÕu m¸u tan m¸u ®· ®­îc biÕt ®Õn tõ thêi Pythagoras. Ng­êi ta nhËn thÊy r»ng sau khi ¨n ®Ëu Fava, th× mét sè ng­êi 24giê sau cã thÓ xuÊt hiÖn hiÖn t­îng tan m¸u cã khi rÊt d÷ déi. Sau ®ã nhiÒu nghiªn cøu cho thÊy r»ng t×nh tr¹ng nµy liªn quan ®Õn thiÕu hôt G6PD. §a sè c¸c tr­êng hîp x¶y ra ë nh÷ng c¸ thÓ thiÕu G6PD nÆng nh­ng ®«i khi còng thÊy ë thiÕu hôt nhÑ. Ng­îc l¹i còng cã tr­êng hîp thiÕu mµ kh«ng cã bÖnh sinh lý sau khi ¨n ®Ëu Fava. Trong ®Ëu Fava thµnh phÇn liªn quan trùc tiÕp g©y ra hiÖn t­îng tan m¸u lµ glucosidevicine vµ dividine. Aglycone cña chóng ®­îc thay thÕ bëi prymidune ®Õn tæn th­¬ng oxi hãa cho xu h­íng oxi hãa tù ph¸t ë nh÷ng bÖnh nh©n nµy th­êng thÊy Hemoglobin niÖu trong vµi ngµy. VÒ sau ph¸t hiÖn ®­îc ng­êi do cã gi¶m G6PD. Gi¶m G6PD nhÑ th­êng bÖnh sinh lý nhÑ h¬n do chØ ë nh÷ng hång cÇu giµ (do khèi l­îng enzyen G6PD ë hång cÇu non). ë bÖnh nh©n nÆng th× c¶ nh÷ng hång cÇu non còng kh«ng cã ®ñ hµm l­îng G6PD, kh«ng cã kh¶ n¨ng tù b¶o vÖ tr­íc c¸c t¸c nh©n oxi hãa g©y nªn hiÖn th­îng tan m¸u nÆng dÉn ®Õn ®¸i ra huyÕt s¾c tè cã thÓ g©y viªm thËn hay suy thËp cÊp mµ biÓu hiÖn l©m sµng lµ tho¹t ®Çu cã ®¸i ®á, vÒ sau ®au vïng th¾t l­ng hè thËn dÉn ®Õn v« niÖu. C¸c triÖu chøng cËn l©m sµng cña bÖnh nh©n: Hemoglobin gi¶m dÇn ®Õn ngµy 7 - 8 sau ®ã phôc håi dÇn ®Õn ngµy thø 10 xuÊt hiÖn thÓ Heinz g¾n trªn bÒ mÆt hång cÇu ®ã lµ phÇn Protein vµ Hemoglobin bÞ biÕn chÊt g¾n vµo mµng hång cÇu g©y nªn h×nh th¸i bÊt th­êng cña hång cÇu vµ dÉn ®Õn tan m¸u. H×nh7: §Ëu fava 2.3.4.C¸c triÖu chøng kh¸c: Tan m¸u do nhiÔm trïng – ®¸i th¸o ®­êng Qu¸ tr×nh nhiÔm trïng th­êng kÝch ho¹t tan m¸u. §¸i th¸o ®­êng giai ®o¹n toµn ph¸t sÏ khëi ph¸t nh÷ng ®ît tan m¸u ë bÖnh nh©n. Tan m¸u m¹n tÝnh hång cÇu h×nh kh«ng trßn di truyÒn. N¨m 1958 ng­êi ta t×m thÊy r»ng thiÕu G6PD còng cã thÓ dÉn ®Õn tan m¸u m¹n tÝnh. Lo¹i tan m¸u nµy th× th­êng kh«ng x¶y ra ë nh÷ng lo¹i ®ét biÕn hay gÆp nh­ G610A - G6PD med nh­ng l¹i hay gÆp ë nh÷ng ®ét biÕn cã tÇn suÊt xuÊt hiÖn nhá. 2.4. BiÓu hiÖn cËn l©m sµng 2.4.1 ë c¬n tan m¸u cÊp XÐt nghiÖm m¸u: hång cÇu gi¶m, Hematocrit gi¶m, Hemoglobin gi¶m, soi hång cÇu kh«ng cÇn nhuém ph¸t hiÖn ®­îc thÓ Heinz. ChÝnh nh÷ng tÕ bµo nµy chØ nh×n thÊy sau c¬n tan m¸u cÊp sau ®ã nã sÏ rêi tuÇn hoµn nhanh, kh«ng nh×n thÊy sau 3 - 4 ngµy, cã vµi tÕ bµo ®o¹n vµ ®· nhiÔm s¾c (hång cÇu lín xanh nh¹t), cã tÕ bµo l­íi (th­êng kh«ng ®¸ng kÓ), 5 - 15%. §Þnh l­îng bilirubin qua da, trong m¸u t¨ng. XÐt nghiÖm n­íc tiÓu: Hemoglobin niÖu (+), trô hång cÇu (-) 2.4.2 Kü thuËt tÕ bµo: Nghiªn cøu s©u h¬n b»ng xÐt nghiÖm hång cÇu cã thÓ ph¸t hiÖn 2 dßng hång cÇu ë nh÷ng ng­êi n÷ dÞ hîp tö ®Þnh l­îng erzym ë 2 dßng hång cÇu thÊy kh¸c nhau, mét dßng thiÕu hoµn toµn, mét dßng kh«ng thiÕu hoµn toµn ®ã lµ kÕt qu¶ cña hiÖn t­îng bÊt ho¹t nhiÔm s¾c thÓ. VÝ dô: Ditk Roos nghiªn cøu mét bÖnh nh©n thiÕu G6PD Vonledam ®· ph¸t hiÖn 94% hång cÇu ho¹t ®é G6PD b»ng kh«ng vµ 6% hång cÇu cßn l¹i th× ho¹t ®é chØ cßn 5% so víi b×nh th­êng. 2.5. ChÈn ®o¸n. - DÞch tÔ vµ tiÒn sö: trÎ bÞc¸c bbÖnh nhiÔm trïng,®Î non ,thiÕu th¸nggia ®×nh ®· cã trÎ bÞ vµng da,hay trong vïng sèt rÐt,vïng cã tû lÖ thiÕu hôt G6PD,hay sau khi sö dông mét sè thuèc vµ thùc phÈm cã tÝnh oxy ho¸. - L©m sµng - CËn l©m sµng - ChÈn ®o¸n nguyªn nh©n: Cô thÓ nh­ do thiÕu hôt G6PD, ®Þnh l­îng G6PD b»ng ph­ong ph¸p quang phæ hÊp thô, b¸n ®Þnh l­îng nh­ ph­¬ng ph¸p Formazan hay test nhanh. ViÖc ®Þnh l­îng G6PD ngay khi tan m¸u, l­îng hång cÇu non vµ l­íi chiÕm kh¸ cao nh÷ng tÕ bµo nµy cã ho¹t ®éng enzym cao h¬n tÕ bµo giµ. V× vËy xÐt nghiÖm cÇn ph¶i ®­îc tr× ho·n sau ®ît tan m¸u ®Õn khi møc enzym thÊp xuèng råi míi xÐt nghiÖm ®Õn chÈn ®o¸n. Tuy vËy cã nghiªn cøu cho r»ng dï vËy th× G6PD còng kh«ng ®¹t ®­îc tíi møc b×nh th­êng. Ngoµi ra cã thÓ sö dông kü thuËt ph©n tÝch gen (ph­¬ng ph¸p PCR) ®Ó ph¸t hiÖn ®­îc nguyªn nh©n vµ d¹ng ®ét biÕn gen tõ ®ã cã h­íng tiªn l­îng vµ dù phßng. Tuy ®é chÝnh x¸c cña kü thuËt nµy cao nh­ng l¹i tèn kÐm. 2.6. §iÒu trÞ vµ phßng. 2.6.1 Phßng bÖnh: gi÷ mét vai trß quan träng v× gióp tr¸nh x¶y ra triÖu chøng vµ biÕn chøng. + Víi nh÷ng bÖnh nh©n ®· biÕt tr­íc lµ thiÕu hôt G6PD th× cÇn tr¸nh nh÷ng thùc phÈm vµ thuèc cã tÝnh chÊt oxi hãa. + Víi nh÷ng bÖnh nh©n khi cã chØ ®Þnh dïng nh÷ng thuèc cã tÝnh chÊt oxi hãa (primaquiu) aspirin...) cÇn xÐt nghiÖm en zym G6PD tr­íc khi dïng. + Víi bÖnh nh©n ®· xÐt nghiÖm triÖu chøng cÇn phßng biÓu hiÖn biÕn chøng: xÐt nghiÖm m¸u, xÐt nghiÖm n­íc tiÓu, theo dâi triÖu chøng tan m¸u (®¸i m¸u, vµng da, suy thËn vµ vµng da ®a nh©n). 2.6.2 §iÒu trÞ: + Ngõng thuèc + TruyÒn dÞch, truyÒn m¸u, lîi tiÓu. Chó ý kh«ng ®­îc truyÒn cho bÖnh nh©n lo¹i m¸u thiÕu G6PD. 3. Kü thuËt ph¸t hiÖn thiÕu hôt G6PD 3.1.C¸c møc ®é ph¸t hiÖn thiÕu hôt G6PD: Ph­¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh: Ph­¬ng ph¸p ph¸t quang (Beutler vµ Mitchelt-1968), ph­¬ng ph¸p ®­îc tiÕn hµnh b»ng c¸ch lÊy m¸u tõ ®Çu ngãn tay sau ®ã dïng thuèc chèng ®«ng. Trén ®Òu m¸u ®· chèng ®«ng b»ng dung dÞch ®· chuÈn bÞ s½n gåm NADP vµ G6P, sau ®ã nhá vµo giÊy Whatman sè 1 vµo thêi ®iÓm 0 phót, 5 vµ 10 phót. §Ó kh«, ®äc kÕt qu¶ d­íi ¸nh s¸ng ®Ìn cùc tÝm. NÕu hµm l­îng G6PD ®ñ th× c¸c giät dung dÞch vµ m¸u sÏ ph¸t quang vµ kh«ng ph¸t quang khi kh«ng ®ñ l­îng G6PD. §©y lµ mét ph­¬ng ph¸p ®· ®­îc uû ban quèc tÕ vÒ c¸c tiªu chuÈn trong huyÕt häc ®Ò nghÞ sö dông trong ph¸t hiÖn sµng läc c¸c ®èi t­îng thiÕu men G6PD. Tuy vËy ph­¬ng ph¸p nµy cã gi¸ thµnh cao do cÇn ph¶i cã c¸c thiÕt bÞ chuyªn dông nh­ ®Ìn chiÕu tia tö ngo¹i [12], ngoµi ra ph­¬ng ph¸p nµy khã ph¸t hiÖn tr­êng häp thiÕu men G6PD ë n÷ dÞ hîp tö [6]. Ph­¬ng ph¸p nhanh cña AkiraHirono-1998: lµ ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh dùa trªn nguyªn lý G6P ®­îc chuyÓn thµnh 6GP th«ng qua sù xóc t¸c cña enzym G6PD, tõ ®ã t¹o ra NADPH lµ mét chÊt khö tham gia ph¶n øng chuyÓn MTT thµnh Formazan, chuyÓn tõ mµu vµng sang mµu xanh thÉm( h×nh minh ho¹ cho nguyªn lý xin xem ë kü thuËt Formazan). - Tr­êng hîp kh«ng thiÕu G6PD l­îng NAPDH t¹o ra ®ñ th× s¶n phÈm t¹o ra cã mµu xanh thÉm cña Formazan. §äc kÕt qu¶ (-) - Tr­êng hîp thiÕu G6PD th× ph¶n øng x¶y ra kh«ng hoµn toµn, s¶n phÈm t¹o ra cã mµu xanh nh¹t, ®äc kÕt qu¶ (+) : b¸n thiÕu. - Tr­êng hîp kh«ng cã G6PD : ph¶n øng kh«ng x¶y ra , s¶n phÈm t¹o ra chØ cã mµu hång ( mµu cña Hb ) ®äc kÕt qu¶ (++) ( +++) thiÕu hoµn toµn. §©y lµ mét ph­¬ng ph¸p ®äc kÕt qu¶ ngay sau 30 phót, ®äc kÕt qu¶ b»ng m¾t th­êng dÔ nhËn biÕt vvµ kh«ng ®ßi hái thiÕt bÞ tèn kÐm. Ph­¬ng ph¸p nµy ®· ®­îc c¸c t¸c gi¶ nh­ Akira Hirono, Kuni Iwai ¸p dông ë mét sè nø¬c §«ng Nam A ®Ó ®iÒu tra hµng lo¹t [6]. Theo nghiªn cøu cña t¸c gi¶ NguyÔn Minh Hïng ®é nh¹y cña ph­¬ng ph¸p nµy ë tr­êng hîp thiÕu hoµn toµn lµ 97,9%, ë tr­êng hîp b¸n thiÕu lµ 61,5%, ®é ®Æc hiÖu lµ 100%.Ta cã thÓ thÊy ®é nh¹y vµ ®é ®Æc hiÖu t­¬ng ®èi cao, cã thÓ ¸p dông cho test sµng läc. Ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Nguyªn t¾c: TiÕn hµnh chèng ®«ng m¸u sau ®ã t¸ch hång cÇu råi t¸ch enzym G6PD. X¸c ®Þnh ho¹t ®é G6PD do sù thay ®æi phæ hÊp thô t¹i b­íc sãng 340 mm do coenzym NAPDH sinh ra trong qu¸ tr×nh ph¶n øng. Ho¹t ®é G6 PD tû lÖ thuËn víi ®é hÊp thô cña NADPH. S¬ ®å minh häa TÝnh kÕt qu¶: A: ®é thay ®æi mËt ®é quang häc. + Ho¹t ®é G6PD (UI/ml = A/phót x 30476. + Ho¹t ®é G6PD (UI/1012HC) = A/phót x 30476 S¶n l­îng hång cÇu trong 1 lÝt + Ho¹t ®é G6PD UI/gHb = A/phót x 30476 Nång ®é Hb. §äc kÕt qu¶ B×nh th­êng 10 UI/1012 HC. ThiÕu G6PD nhÑ vµ trung b×nh: 40 - 100 UI/1012HC. ThiÕu G6PD nÆng: 10 UI/1012 HC. Ph­¬ng ph¸p gen häc Sö dông kü thuËt PCR ®Ó ph©n tÝch ®ét biÕn gen, th«ng th­êng ph¶n øng PCR ®­îc thùc hiÖn qua c¸c giai ®o¹n sau: Giai ®o¹n 1: g©y biÕn tÝnh ®Ó th¸o xo¾n vµ lµm ®øt c¸c liªn kÕt Hi®ro cña chuçi xo¾n kÐp AND Giai ®o¹n 2: lµ giai ®o¹n ñ måi, øng víi mçi exon th× cã mét ®o¹n måi kh¸c nhau. Giai ®o¹n 3: lµ tæng hîp chuçi ®Ých ADN. §o¹n måi ®­îc kÐo dµi nhê enzym nèi, tõ ®ã khuyÕch ®¹i nªn nh÷ng ®o¹n khu«n. Dùa trªn s¶n phÈm khuyÕch ®¹i t­¬ng øng víi cÆp måi b×nh th­êng hay ®ét biÕn sÏ nhËn biÕt ®­îc vÞ trÝ ®ét biÕn §©y lµ mét ph­¬ng ph¸p cã ®é nh¹y vµ ®é ®Æc hiÖu rÊt cao cho biÕt vÞ trÝ ®ét biÕn , d¹ng ®ét biÕn, tõ ®ã biÕt ®­îc ®é thiÕu hôt G6PD. Tuy nhiªn kü thuËt nµy ®ßi hái ph¶i cã trang thiÕt bÞ hiÖn ®¹i do ®ã gi¸ thµnh cao.  3.2. Kü thuËt b¸n ®Þnh l­îng t¹o vßng Formazan. C¬ së khoa häc G6 PD G6P (C¬ chÊt) NAD PH (D¹ng khö) 6 - GP (s¶n phÈm) NADP+ (d¹ng OXH) Formazan (mµu xanh) MTT (mµu vµng) PMS Nguyªn t¾c nhËn ®Þnh kÕt qu¶: s¶n phÈm Formazan cña ph¶n øng t¹o ra cã mµu xanh tÝm. DiÖn tÝch vµ ®é ®Ëm cña vßng mµu s¶n phÈm sau mét thêi gian nhÊt ®Þnh tû lÖ víi ho¹t tÝnh cña enzym trong mÉu thö. §äc kÕt qu¶: ngoµi kÝch th­íc th× mµu s¾c quan träng, mµu ®Ëm chøng tá ho¹t tÝnh enzym trong m¸u cao, nh¹t chøng tá ho¹t tÝnh enzym trong m¸u thÊp. Kü thuËt nµy kh«ng chØ lµ ®Þnh tÝnh mµ cßn lµ b¸n ®Þnh l­¬ng. - §­êng kÝnh vßng xanh > 7 mm: (- ) - §­êng kÝnh vßng xanh 5mm - 7mm. Mµu xanh nh¹t h¬n chøng (- ): (+) - §­êng kÝnh mµu xanh 3mm - 5mm (+ +) rÊt nh¹t mµu. - §­êng kÝnh < 3mm kh«ng cã mµu xanh mµ lµ mµu vµng (+++). Ch­¬ng 2 §èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 1. §èi t­îng Ng­êi Tµy: 130 ng­êi Ng­êi Nïng: 71 ng­êi TÊt c¶ c¸c ®èi t­îng trªn lµ sinh viªn tr­êng trung häc Y tÕ Cao B»ng, ®· ®­îc ®iÒu tra chÝnh x¸c lµ cã 3 ®êi lµ ng­êi d©n téc Tµy (hoÆc Nïng), trong ®ã cã 162 n÷ vµ 39 nam. Së dÜ sè l­îng nam Ýt h¬n n÷ lµ do ®Ò tµi cña t«i ®­îc tiÕn hµnh trªn c¬ së céng t¸c víi ®Ò tµi “ L­u gi÷ DNA ng­êi ” do gi¸o s­ Vò TriÖu An lµm chñ nhiÖm nªn kh«ng cã ®iÒu kiÖn chän mÉu thÝch hîp. - Thêi gian lÊy mÉu: Th¸ng 5 n¨m 2004. - §Þa ®iÓm lÊy mÉu: Tr­êng trung häc Y tÕ Cao B»ng. 2. ThiÕt kÕ nghiªn cøu: m« t¶ c¾t ngang 2.1. C¸c b­íc tiÕn hµnh Thu thËp mÉu: lÊy m¸u tÜnh m¹ch ë ®èi t­îng nghiªn cøu thÊm vµo giÊy Whatman sè 3 lµ lo¹i giÊy dÇy cã thÓ lÊy ®ñ l­îng hång cÇu cÇn thiÕt. §Ó giÊy thÊm kh« tù nhiªn ë nhiÖt ®é phßng l­u tr÷ d­íi 7 ngµy ®Ó lµm xÐt nghiÖm (tèt nhÊt lµ gi÷ l¹nh ë 4oC) B¶o qu¶n m¸u kh«: ë -30oC, ®©y lµ ®iÒu._.