Phân tích đa dạng trình tự NUCLEOTIT các vùng tương đồng gen kháng ở Một số giống lúa Việt Nam

ệnh là một trong những yếu tố cơ bản làm giảm năng suất cây lúa, do đó muốn tăng năng suất thì phải làm giảm sự thiệt hại do sâu bệnh gây ra. Theo ước tính, bệnh đạo ôn làm thiệt hại trên 55 triệu USD mỗi năm tại Nam á và Đông Nam á (Hert,1991), cao hơn tại vùng Đông á và các vùng ôn đới khác. Bệnh bạc lá cũng là một trong nhưng bệnh chính hại lúa ở các nước vùng nhiệt đới châu á trong 3 thập kỉ trở lại đây, ở một số nơi bệnh này làm giảm trên 50% năng suất, mức độ ảnh hưởng của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, điều kiện thổ nhưỡng và mùa vụ (Kameswara, 2002). Việt Nam nằm ở một vùng được ưu đãi về địa lý và có một nền nông nghiệp trồng lúa nước truyền thống được phát triển từ lâu đời. Nước ta đang là nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan với hơn 80% dân số làm nghề nông. Để ngành nông nghiệp đặc biệt là trồng lúa phát triển hơn nữa, Nhà nước ta đã có nhiều sự đầu tư cho nghiên cứu và áp dụng công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp. Đối với lúa ở nước ta bệnh bạc lá và đạo ôn cũng là những bệnh chính gây nhiều thiệt hại. Thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa tại Việt Nam là 15-30% (Vien, 1992). Cho tới nay đã có biện pháp phòng trừ khá hiệu quả là dùng thuốc trừ sâu hoá học nhưng biện pháp này có nhiều tác động xấu đến con người, hệ vi sinh vật và môi trường. Do đó, việc tìm ra và phát triển những giống lúa có khả năng kháng những bệnh này là mục tiêu của các nhà chọn giống, biện pháp này tỏ ra có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hưởng xấu đến con ngừơi, vi sinh vật có lợi và môi trường. Người ta đã sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn tạo các giống lúa có khả năng kháng một số bệnh trên. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong công tác chọn tạo ra các giống kháng bệnh đã và đang phất triển ngày càng có hiệu quả lớn. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân tích đa dạng trình tự nucleotit các vùng tương đồng gen kháng ở một số giống lúa Việt Nam” nhằm góp một phần vào công tác chọn tao giống lúa ở nước ta hiện nay. Chương I : tổng quan tài liệu 1. Sự đa dạng ADN Trên trái đất của chúng ta có rất nhiều sinh vật, chúng tạo nên sự đa dạng và phong phú rất cao. Chính vì sự đa dạng đó mà người ta đã xếp sinh vật vào các bậc phân loại khác nhau. ở mức vĩ mô người ta chia làm 3 nhánh chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong mỗi nhánh người ta lại phân loại theo thang bậc gồm 6 lớp: ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài. Thang phân loại này dựa theo tiêu chẩn hình thái, vì vậy nó vẫn chưa mô tả được hết sự phong phú của thế giới sinh vật nên người ta lại phải sử dụng đến các tiêu chuẩn bổ sung để phân loại sinh vật chi tiết hơn nữa như dưới chi, loài...Vì hệ thống phân loại nói trên dựa vào kết quả quan sát đặc điểm hình thái, chính vì vậy mà đã gặp rất nhiều khó khăn khi tiến hành phân loại sâu hơn, trong khi đó sự phân loại dưới loài lại đóng vai trò rất quan trọng. Để khắc phục tình trạng này người ta phải sử dụng chỉ thị “phi hình thái” ở dạng phân tử mà một trong số đó là chỉ thị ADN. Khi nói đến sự đa dạng ADN , nghĩa là sự khác nhau ở mức độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở trong một vùng địa lý nhất định. Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nhưng ở mức độ ADN để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa hai cá thể cùng loài, chẳng hạn như sự giống hay khác nhau giữa các giống lúa trong cùng một loài phụ mà không thể phân biệt được qua chỉ thị hình thái (Lã Tuấn Nghĩa, 2004). Nghiên cứu đa dạng ADN đóng vai trò rất quan trọng, thông qua phân tích tính đa dạng ta có thể chọn được những cặp bố mẹ lai thích hợp trong chọn tạo giống cây trồng. Chẳng hạn, khi tiến hành chọn cặp lai hoặc chọn dòng ở cây trồng, quan sát đặc điểm hình thái cho thấy chúng rất giống nhau, vì vậy rất khó chọn lọc. Tuy nhiên nếu dùng chỉ thị ADN sẽ giúp chúng ta dễ dàng chọn lọc được những cặp lai thích ứng hoặc những dòng mong muốn. Chỉ thị ADN đặc biệt có lợi khi sử dụng để chọn lọc cây trồng có đặc tính khó hoặc không thể quan sát bằng mắt thường như khả năng chịu bệnh, chịu rét, chịu mặn, năng suất... 2. Các chỉ thị sinh học và ứng dụng của nó trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống 2.1. Chỉ thị hình thái. Một tính trạng được coi là một chỉ thị di truyền nếu nó được kiểm soát bởi một locus xác định và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài của môi trường, mặc dù chỉ thị hình thái thường được sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồng trội, song trong nhiều trường hợp chúng vẫn bị ảnh hưởng của các yếu tố khác như tương tác gen, nhân tố gen nhẩy và các nhân tố môi trường . Trong các giai đoạn khác nhau của sự phát triển của cây các đặc điểm hình thái cũng khác nhau nên chúng không được xem là đặc trưng. Hơn nữa các đặc điểm hình thái cũng không nhiều ở mỗi sinh vật, do đó khả năng ứng dụng của chúng còn nhiều hạn chế. 2.2. Chỉ thị sinh hoá Chỉ thị sinh hoá thường là loại chỉ thị có bản chất là Protein. Do các gen trong cơ thể qui định cấu trúc của Protein nên nếu ta biết được cấu trúc của phân tử Protein thì sẽ suy ra được cấu trúc của gen. Các phân tử izozym có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong gel khi điện di. Sau khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc trưng và quan sát kết quả điện di trên bản gel ta có thể đánh giá được sự đa dạng di truyền của sinh vật. Tuy nhiên số lượng kiểu hình isozyme trong thực tế là không nhiều, không phân bố trên toàn bộ gen mà thường xuyên bị ảnh hưởng của yếu tố môi trường Hơn nữa, isozyme chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cơ thể (P. Samee, 1996). 2.3.Chỉ thị phân tử ADN. Hạn chế của việc sử dụng chỉ thị hình thái , chị thị protein là chúng chỉ dùng để nghiên cứu gián tiếp hệ gen của vi sinh vật, do đó người ta đã phát triển nhưng kĩ thuật dùng ngay ADN làm chỉ thị phân tử . Chỉ thị phân tử bao gồm RFLP, PCR... dùng để phát hiện, phân tích và tổng hợp ra những đoạn ADN (hoặc ARN) được sử dụng để lai với ADN của hệ gen cần phân tích .Việc sử dụng chỉ thị ADN đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học có thể nghiên cứu trực tiếp hệ gen của sinh vật. Chỉ thị ADN rất phong phú và có tính ổn định cao, hơn nữa chúng ta có thể nghiên cưú ở bất kì giai đoạn nào của cá thể. Chỉ thị ADN rất thích hợp cho việc nghiên cứu đa dạng sinh học, lập bản đồ di truyền và chọn tạo giống cây trồng. 2.3.1. Chỉ thị RFLP (Bostein, 1980) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nghĩa là đa hình độ dài các mảnh giới hạn. RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axitnucleic. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng enzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit nucleic (sợi ADN hoặc mARN). Khi xử lý ADN bằng các enzym giới hạn sẽ thu được những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau, những mảnh này sau đó được điện di trên gel agaroza 0.8%. Tiếp theo người ta chuyển các mảnh ADN lên một màng lai theo nguyên tắc thẩm thấu giữ nguyên vị trí (Southen Bloting), sau đó người ta cho mẫu dò có trình tự nucleotit đã biết trước và được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng chất hoá học lai với ADN cố định trên màng lai, nếu chúng bổ sung với nhau thì sẽ cho phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai sẽ được phát hiện bằng cách nhuộm màu hoặc dùng phóng xạ qua phim X-quang. Dựa vào những băng ADN chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau (Bùi Chí Bửu, 1999). Chỉ thị RFLP được ứng dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền, sự phân hoá trong di truyền huyết thống và lập bản đồ gen: lập bản đồ di truyền trên cây lúa (Mc.Couch và cs, 1988), lập bản đồ gen cho bệnh đạo ôn (Yu và cs, 1991), bệnh bạc lá (Ogawa, 1987; Kinoshita, 1991), bệnh rầy nâu (Lang và cs, 1999), bệnh sâu đục thân (Tan và cs, 1993). 2.3.2. Chỉ thị PCR 1. Khái niệm: PCR (Polimerase Chain Reaction) hay phản ứng chuỗi polimeraza là một quá trình cho phép nhân nhanh các đoạn ADN trong một khoảng thời gian ngắn .Kỹ thuật này do Kary Mullis phát minh năm 1985. Nguyên tắc: Nhờ enzym ADN polymeraza xúc tác, trên các mạch khuôn ADN tổng hợp nên các mạch đơn mới, các mạch đơn vừa được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mach mới của chu kì tiếp theo. Sự tổng hợp mạch ADN mới cần có sự tham gia của các đoạn ADN mồi làm xuất hiên những nhóm 3’OH tự do,các nucleotit được gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới, chiều tông hợp là chiều 5’-3’. 2. Các bước tiến hành. Kỹ thuật PCR gồm 3 bước: a) Giai đoạn biến tính: Giữ nhiệt độ khoảng 94-950C trong 30’ đến 1 phút để phá vỡ các liên kết hydro giữa 2 mạch ADN để tạo thành sợi đơn. Nếu đoạn khuôn có tỉ lệ G-C cao, chuỗi G, C liền nhau càng dài thì nhiệt độ biến tính sẽ cao hơn do đó cần tính toán để có nhiệt độ và thời gian phù hợp. b) Giai đoạn gắn mồi: Hạ nhiệt độ xuống khoảng 30- 600C trong 30’ đến 1 phút , các mồi sẽ bắt cặp với khuôn . c) Giai đoạn tổng hợp: Giữ nhiệt độ ở 720C là nhiệt độ thích hợp nhất với sự hoạt động của enzym polymeraza, ADN mới sẽ được tổng hợp theo chiều 5’-3’ bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Sau mỗi chu kì, một đoạn ADN được nhân lên thành 2, các ADN được nhân lên lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình sau, sau n chu kỳ ta có 2n đoạn ADN. 3. Thành phần phản ứng. a) Khuôn: Khuôn có thể là ADN mạch đơn hoặc mạch kép thậm chí cả ARN. Khuôn đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao, nồng độ thích hợp khoảng 50- 100 ng, nếu ít quá thì phản ứng sẽ không thể xảy ra, nếu cao quá thì sẽ hình thành sản phẩm phụ không mong muốn và làm giảm độ nét của các băng ADN. b) Mồi: Là những đoạn oligonucleotit dài khoảng 6-10 nucleotit (mồi ngẫu nhiên) hoặc từ 18-24 nucleoitit (mồi đặc trưng). Nồng độ thích hợp là từ 100-500 nM. Nồng độ thấp sẽ không đủ cho phản ứng do đó sẽ không tạo băng ADN hoặc nếu có băng thì nồng độ ADN sẽ rất thấp, ngoài ra cần phải chọn các mồi sao cho không có sự bắt cặp giữa chúng làm giảm hiệu quả phản ứng. c) Enzym Taq: Được tách chiết từ vi khuẩn Themus aquticus hay sống ở suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt cao được dùng thay cho enzym Klenow tách chiết từ VK E.Coli không chịu được nhiệt. Enzym Taq có trọng lượng phân tử (TLPT) 94 kD và nhiệt độ hoạt động tối ưu là 720C, nếu tăng nhiệt độ lên 950C trong 20’ để biến tính ADN sợi kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng. Nồng độ thích hợp là 0,5-2,5 đơn vị. c) MgCl2: Ion Mg2+ có ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng vì nó ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzym polymeraza, tạo phức chất tan với dNTP, nồng độ Mg2+ phụ thuộc vào nồng độ dNTP, pyrophosphat tự do (PPi) và EDTA là những hợp chất liên kết với những ion có trong dung dịch. Nồng độ thích hợp cho phản ứng là từ 0.5-5mM. d) dNTP (deoxynito triphosphat) Gồm 4 loại là: dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Nó chính là nguyên liệu để tổng hợp nên các đoạn ADN mới, nồng độ dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200àM. Khi tăng nồng độ dNTP lên cao thì nó sẽ liên kết với Mg2+ ảnh hưởng tới phản ứng tổng hợp. Ngoài ra nó còn có tính không bền nhiệt và dễ bị chuyển hoá thành dNDP và dNMP. e) Dung dịch đệm PCR (PCR buffer): Thường là hỗn hợp của KCl, Tris-HCl và gelatin. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả phản ứng, Tris-HCl giữ cho pH ổn định, sự thay đổi nhiều nồng độ Tris không ảnh hưởng nhiều đến phản ứng PCR. 4.Sơ đồ kỹ thuật PCR: 5’ 3’ ( 94oC- 95oC ) Biến tính ADN 5’ 3’ 3’ 5’ 30oC- 65oC Gắn mồi vào sợi đơn 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 72oC Tổng hợp ADN 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 2.3.3. Kỹ thuật điện di a) Nguyên tắc: ở pH trung tính, axit nucliec mang điện tích âm nhờ nhóm phophoit nằm trên phosphodieste của các sợi axit nucleic. Do đó chúng sẽ di chuyển về phía điện cực dương khi đặt chúng vào điện trường. b) Quá trình điện di: Các mẫu a.nucleic được đặt vào gel và đặt trong một điện áp nào đó sau khi được nhuộm bằng chất nhuộm. Dựa vào sự di chuyển của chất nhuộm này để dừng quá trình chạy gel. Kết quả được nhìn thấy khi soi bản gel dưới đèn tử ngoại (UV), các băng ADN màu da cam hiện lên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Có hai loại gel cơ bản thường dùng là: Gel agaroza: Là một polysacarit được tách chiết từ tảo biển, thường ở dạng bột, bị nóng chảy khi đun nóng, để nguội sẽ đông lại thành khối. Nó thường được dùng để điện di những mẫu ADN với nồng độ từ 0,5% tới 3%. Gel polyacrylamit: Được làm từ polyme hữu cơ, có các lỗ có kích thước cực nhỏ có khả năng phân giải cao (ở nồng độ 5-6% có thể phân tách được những đoạn ADN chỉ hơn kém nhau 1 nucleotit). Do vậy nó có độ phân giải cao hơn gel agaroza. 2.3.4. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi: Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) Kỹ thuật này được William và cs xây dựng năm 1990. Đây là kỹ thuật dựa trên cơ sở của PCR với việc sử dụng các mồi ngẫu nhiên (Random Primer) dài khoảng 10 bp. Trong phản ứng các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Sản phẩm PCR được điện di trong gel agaroza và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thước sản phẩm có chiều dài 200bp đến 2000 bp (Trần Duy Dương, 1999). Chỉ thị RAPD thuộc loại chỉ thị di truyền trội. Người ta có thể phân biệt hai cá thể thông qua sự có hay vắng mặt của những băng RAPD đặc trưng. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian và ít tốn kém. Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là nó rất nhạy cảm với nhiều yếu tố như thành phần tham gia phản ứng, nhiệt độ gắn mồi... (Lã Tuấn Nghĩa, 2004). ứng dụng : Kỹ thuật này được sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền (Bun, 1999) và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)(Vos, 1995) Kỹ thuật này được tạo ra bằng cách nhân lên những đoạn ADN trong hệ gen đã đựoc cắt bởi enzym giới hạn bằng máy PCR. Các sản phẩm thu được tạo ra phản ánh được sự đa hình đoạn phân cắt giới hạn của phân tử ADN. Sản phẩm đó được nhận biết bằng cách điện gi trên gel polyacrylamit và nhuộm bằng thuốc nhuộm đặc trưng hay dùng chất phóng xạ. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) Nguyên lý: Trên cơ sở hệ gen sinh vật gồm rất nhiều đoạn ADN lặp lại, số lần lặp lại và số bản sao đặc trưng ở mỗi loài cá thể, người ta thiết kế đoạn mồi đặc trưng cho các đoạn lặp, sử dụng phản ứng PCR và kỹ thuật điện di phân tích sự khác nhau giữa các cá thể thông qua số lần lặp lại khác nhau các đoạn nucleotit đặc trưng cho mỗi cá thể (Bùi Chí Bửu, 1999). Đây là nhóm chỉ thị đồng trội, có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, do đó được sử dụng trong lập bản đồ gen và chọn giống. Hạn chế của phương pháp là: đoạn lặp lại ở mỗi loài là khác nhau do đó phải thiết kế mồi đặc trưng cho mỗi loài nhưng mặt khác giá thành lại cao. ứng dụng: Kỹ thuật SSR được dùng trong phân tích gen do tính đa hình phong phú, tiết kiệm thời gian so với các phương pháp khác nên bản đồ di truyền đã được xác định thành công như: phân nhóm di truyền lúa mùa địa phương, xác định bản đồ gen kháng rầy nâu, xác định bản đồ gen kháng mặn trên lá lúa (Lang và cs, 2001). d) Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Sites) Kỹ thuật này do Olson và cs đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN ngắn gồm 60-1000bp có thể phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí đã được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleôtit biết trước ADN trong gen. Hai đoạn mồi được thiết kế trong dựa trên các trình tự nucleotit đã được biết giúp ta xác định được vùng ADN cần tìm kiếm. Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotit nên có tính đặc hiệu cao đối với PCR. Như vậy chỉ thị STS thực chất có nguồn gốc từ chỉ thị RFLP mà phương pháp phát hiện là kĩ thuật PCR thay cho kỹ thuật lai ADN. ứng dụng: Kỹ thuật STS được dùng để phát hiện tính đa hình, lập bản đồ gen và tìm vị trí gen gần nhất trong quá trình fine mapping (Nguyễn Thị Lang, 2002). e) Kỹ thuật RGA (Resistance gene analog) Khi so sánh trình tự ADN giữa những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau (Johal và cs, 1992; Song và cs, 1995; Barker và cs, 1997...), các nhà khoa học đã phát hiện ra điều thú vị rằng, các gen này có một số đặc điểm giống nhau. Các gen này đều có những vùng giàu Leucine (Leucine Rich Repeat = LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site = NBS) và vùng protein kinaza. Trên cơ sở đó họ đã xây dựng một kỹ thuật dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR đặt tên là RGA. Bản chất của kỹ thuật này là dựa vào những vùng giống nhau ở các gen kháng, người ta thiết kế những đoạn mồi tương ứng, sau khi chạy PCR sản phẩm thu được có thể là một phần của gen kháng hoặc toàn bộ gen kháng. Sản phẩm PCR được đem đi điện di và các băng ADN có thể nhìn thấy trên bản gel bằng mắt thường khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc trưng. Trước nghiên cứu của Chen và cs (1998), sản phẩm PCR nhận được từ kỹ thuật RGA chỉ được điện di trong gel agaroza. Bởi vậy mà nó không thể phát hiện hết, với băng ADN rõ nét và số lượng nhiều hơn (Chen và cs, 1998; Wang và cs, 1999). Gần đây, Chen và cs (1998) đã giả định rằng những băng ADN có thể được phân tách tốt hơn và sự đa hình có thể phát hiện cao hơn nhờ sử dụng điện di phân giải cao. Bởi vậy, họ đã xây dựng kỹ thuật RGA cùng với điện di phân giải cao trong gel polyacrylamit. Kỹ thuật RGA là một kỹ thuật mới, nó được sử dụng để phân tích đa hình, phát hiện nguồn gen kháng trong tập đoàn giống, lập bản đồ gen kháng và mô tả dạng di truyền (Chen và cs, 1988;Yu và cs, 1996; Feuillet và cs, 1997). Trong việc lập bản đồ gen người ta dùng những đoạn mồi đặc trưng dài khoảng 20 bp, việc này làm tăng tính đặc trưng của mồi và khả năng liên kết với gen kháng của chúng rất cao. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong phân tích hệ gen lúa, lúa mạch và lúa mì. Kết quả chỉ ra rằng, tuỳ thuộc vào mồi PCR mà số lượng băng của mỗi sản phẩm PCR có thể từ 30 đến 130. Những băng đa hình đã phát hiện trong lúa mì, lúa và lúa mạch là 40%, 47%, 27%. Những mồi RGA đã sử dụng cũng tách biệt những giống lúa có hệ gen di truyền indica từ hệ gen di truyền japonica. Hơn nữa mối liên kết giữa CTPT RGA với gen kháng bệnh rỉ sắt cũng đã được phát hiện (Chen và cs, 1998). Trong nghiên cứu của Wang và cs (1999) đã mô tả 36 giống lúa ở vùng châu thổ sông Dương Tử (Trung Quốc) sử dụng chỉ thị phân tử RGA, nghiên cứu này cho thấy những giống lúa có hệ gen di truyền indica, japonica và lúa lai tạo thành những nhóm riêng biệt. Họ đã phát hiện thấy mối liên kết giữa kiểu gen RGA và kiểu hình kháng/nhiễm bệnh đạo ôn. Họ cũng cho thấychỉ cần sử dụng bất cứ 2 hoặc 3 tổ hợp mồi tương ứng với vùng NBS và LRR cũng đủ để phân nhóm các giống lúa theo các hệ gen di truyền khác nhau. 3. Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu các gen kháng ở lúa. 3.1. Bệnh bạc lá: Bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) gây ra. Bệnh phát sinh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây, nhưng điển hình là thời kỳ lúa bắt đầu trổ bông đến lúc chín sữa. Triệu chứng bệnh là ở mép lá, mút lá có những vệt có độ dài ngắn khác nhau, có màu vàng, nâu bạc, khô xác. Khi bệnh phát triển thì vết bệnh từ mút lá, mép lá lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính theo đường gợn sóng, nhưng cũng có khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra. Kết quả là lá lúa đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanh chóng khô chết hoặc bộ lá xơ xác, ảnh hưởng lớn đến quang hợp làm cho tỉ lệ hạt lép cao, năng suất giảm sút rõ rệt. Bệnh này có khả năng gây dịch bệnh cao và sự huỷ hoại đối với cây lúa, đặc biệt là trong điều kiện trời mưa và ẩm ướt. Nhờ mưa gió, sự va chạm của các lá lúa... vi khuẩn xâm nhập lên bề mặt lá hoặc thân cây. Khi mặt lá có màng nước, vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thương mà vi khuẩn nhân lên về mặt số lượng, theo các bó mạch lan rộng đi. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9àm. Khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, nhuộm Gram âm. Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3 nhưng tạo khí H2S. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn hoạt động là 26- 300C, pH thích hợp là 5,7- 8,5. Tính kháng bệnh của cây chủ được xem như là một phương pháp an toàn để phòng chống bệnh, nhưng tính kháng này thường không ổn định (Mew và cs, 1992) Hơn 20 gen kháng ở lúa đã được xác định trong đó có 2 gen Xa1 và Xa21 đã được lập bản đồ. Xa1 là gen mã hoá một protein kiểu R bao gồm một vùng vị trí liên kết nuclotit và một vùng lặp lại giàu leucin, gen này đã mã hoá một protein kháng bạc lá (X. oryzae pv. Oryzae) dòng Nhật Bản 1 (Yoshimura, 1998). Gen Xa21 mã hoá một phân tử protein, gen này chứa vùng giàu leocin và một vùng Cytoplasmit kinaza, đó là kiểu duy nhất của gen R. Xa21 điều khiển kháng X. oryzae pv oryzae Philipine dòng 6 (PR6) (Song, 1995). Gen Xa21 được nhân dòng bởi Song và cs (1995). Các cây lúa chuyển gen Xa21 đã được kiểm nghiệm có khả năng kháng bệnh bạc lá (Wang và cs, 1996). Zhang và cs đã công bố kết quả chuyển gen Xa21 vào các giống lúa IR64, IR72 và Minghui63 (dòng bố mẹ sản xuất lúa lai). Rất nhiều dòng lúa chuyển gen ở thế hệ R2 đã tỏ ra kháng các bệnh vi khuẩn, một dòng của giống IR72 ở thế hệ R3 đã chứng minh có khả năng kháng bệnh vi khuẩn (Zhang và cs, 1998). Sự kết hợp 4 gen kháng vi khuẩn bạc lá: Xa4, Xa5, Xa13 và Xa21 vào một dòng lúa tạo cây mang cả 4 gen có tính kháng bệnh ưu việt hơn so với cây lúa mang một gen kháng bệnh (Huang và cs, 1997). 3.2. Bệnh đạo ôn: Bệnh đạo ôn hay còn gọi là bệnh cháy lá là một trong những bệnh gây hại quan trọng nhất trên đồng ruộng ở nước ta. ở Việt Nam bệnh xảy ra ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam nhưng nguy hại hơn là ở vùng đồng bằng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ vào vụ Đông-Xuân khi thời tiết ẩm ướt thuận lợi cho bệnh phát triển. Bệnh này do nấm Pyricularia grisea gây nên. Nấm có vòng đời ngắn nhưng khả năng sinh bào tử rất lớn (một vết bệnh có khả năng sinh 2000-6000 bào tử mỗi ngày và kéo dài trong khoảng 14 ngày ở điều kiện phòng thí nghệm), bào tử chính là nguồn phát tán(nhờ gió) của bệnh, khi bào tử rơi lên lá gặp những giọt sương và điều kiện thuận lợi chúng nảy mầm trở lại, do đó bệnh có thể xâm nhiễm và lây lan rất nhanh trên một diện rộng. Bệnh phát triển nhanh khi gặp các yếu tố thích hợp như: trồng giống nhiễm, nhiệt độ từ 20-320C, độ ẩm >93% (đặc biệt khi trời có nhiều mây và sương mù vào sáng sớm), gieo mật độ dày hay sử dụng quá nhiều phân hoá học (Lê Tương Tề, 1998). Bệnh có thể xuất hiện trên lá, đốt thân của cây cổ bông hoặc những phần khác trên bông, đôi khi cả trên hạt. Bệnh có thể gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, vết bệnh điển hình có hình thoi, rộng ở giữa và nhọn ở hai đầu, tâm thường có màu xám hoặc hơi trắng, xung quanh thường có màu nâu hoặc nâu đỏ. Một vết bệnh phát triển đầy đủ có thể dài từ 1-1,5cm và rộng từ 0,3-0,5cm, tuy nhiên kích thước và màu sắc vết bệnh thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường, giống nhiễm hay kháng. Khi bệnh nặng các vết bệnh phát triển to lên, lan rộng ra và liên kết với nhau làm cho cả lá bị cháy khô và chết. ở giai đoạn trổ bông, vết bệnh ở cổ bông có màu nâu hay đen, sau đó bông lúa bị gãy và rơi xuống ở nơi vết bệnh. Bệnh tấn công sớm thì gây lép cả bông, trễ hơn thì làm tăng tỉ lệ hạt lép, hoặc làm cây chết, do đó làm giảm năng suất (Ngô Vĩnh Viễn, 1997). Cơ chế gây bệnh: Khi xâm nhập vào lúa sợi nấm hình thành đĩa bám, bám chặt vào mặt cây đồng thời hình thành một sợi xuyên đục thủng lớp biểu bì của tế bào để hút chất dinh dưỡng và do đó, cây sẽ dần bi kiệt quệ và có thể bị chết. Sự hiểu biết về đa dạng nguồn gen của quần thể nấm đạo ôn đóng vai trò quan trọng trong việc hiểm soát bệnh, đặc biệt trong việc phát triển các giống lúa kháng đạo ôn khác nhau (Lã Tuấn Nghĩa, 1997). Những thông tin về đa dạng nguồn gen bệnh có thể được sử dụng trong việc xác định và mô tả gen kháng để cung cấp cơ sở lý luận của gen kháng (Chen, 1995). Năm 1975, Ou và cộng sự đã chia gen kháng làm hai loại : gen kháng chính (Major gene) và gen kháng bổ sung (Minor gene). Cây lúa mang gen kháng chính có thể ngăn chặn sự hoàn thiện vòng đời của các nòi nấm Pyriculiria grisa bất tương hợp. Gen kháng bổ sung có thể làm giảm sự sinh bào tử của nấm đạo ôn tương hợp. Tính kháng hoàn toàn do gen trội qui định (Kiyosawa, 1981; Mackll và cs, 1985; Yu và cs, 1987; Mackill và Bonman, 1992). Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định được hơn 50 gen kháng đạo ôn trong hệ gen lúa (Kinoshita, 1991; Mackill và Bonman, 1992; Zhu, 1993; Wang và cs, 1994; Mendosa, 1996) trong đó có 23 gen kháng chính và 27 gen kháng bổ sung. Trên nhiễm sắc thể số 11 có 8 gen kháng chính là Pi-a, Pi-f, Pi-k, M-Pi-z, Pi-is-1(Rb4), Pi-se-1(Rb1), Pi-1(t), Pi-7 và một gen kháng bổ sung (Wang và cs, 1994; Mendoza, 1996), trên nhiễm sắc thể số 6 có 4 gen kháng bổ sung, trên nhiễm sắc thể số 12 có 4 gen kháng chính (Shen và cs, 1986; Yu và cs, 1994) Các nhân tố gây bệnh khác nhau đã được nghiên cứu kĩ lưỡng trong những thập kỉ gần đây (Yamada, 1976). Năm 1992, Sasaki lần đầu tiên đã có bản báo cáo về sự khác nhau giữa các chủng nấm. Kể từ đó hàng trăm dòng nấm gây bệnh đã được xác định ở nhiều vùng trên thế giới dựa trên phản ứng của những giống cây khác nhau (Lã Tuấn Nghĩa, 1997). 3.3. Bệnh rầy nâu Đến nay các nhà khoa học đã tìm ra 10 gen kháng chính (major gene) và một số gen kháng phụ khác (minor gene hay QTL) dựa vào sự phản ứng của các giống lúa đối với các biotyp rầy nâu cũng như các thí nghiệm phân tích di truyền (Sidu và Khush, 1978; Ikeda, 1985; Ishii, 1994; Bùi Chí Bửu và cs, 1997). Ngoài ra còn tồn tại nguồn gen kháng có bản chất tế bào chất (Rao, 1993). Biến động quan trọng và đáng lo ngại nhất của quá trình kháng rầy nâu là sự hình thành các biotyp mới có khả năng bẻ gãy tính kháng của các giống lúa. Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định được ít nhất 4 biotyp rầy nâu có mặt ở các vùng trồng lúa trên thế giới. Đặc tính kháng nhiễm rầy của các giống lúa tròng phổ biến tại Đồng bằng Bắc Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long đối với quần thể rày nâu thuộc các biotyp 1,2,3 dã được các cán bộ nghiên cứu ở viện Bảo vệ thực vật và viện lúa ĐBSCL khảo nghiệm trong nhiều năm (Nguyễn Công Thuật và cs, 1991 ; Lương Minh Châu và Nguyễn Văn Luật, 1998) Giống lúa CR203 được Nguyễn Công Thuật chọn lọc từ dòng IR8423-132-622 (một dòng lúa thuộc Viện lúa Quốc tế) và được đưa ra sản xuất từ những năm 80. CR203 mang gen kháng lặn bph2. Trong nhiều năm, các giống lúa mang gen bph2 như CR203, IR36, IR42, CN2 vẫn thể hiện tính kháng tốt với quần thể rày nâu ở Đồng bằng Bắc Bộ (Nguyễn Công Thuật và cs, 1996). 4. Nghiên cứu đa dạng ADN qua giải trình tự các nucleotit 4.1. Các phương pháp xác định trình tự nucleotit Việc giải trình tự các nucleotit đã được xác định từ những năm 70 nhờ sự ra đời của hai phương pháp khác nhau: phương pháp hoá học và phương pháp enzym. a) Phương pháp hoá học (Maxam- Gilrbert, 1977) Nguyên tắc : Dùng nhiệt độ biến tính phân tử ADN thành các mạch đơn không thể tự xoắn lại với nhau đồng thời đánh dấu đầu 5’ của các mạch bằng đồng vị phóng xạ P32. Tiếp theo, xử lý hoá học đặc hiệu phân huỷ đặc trưng một loại nucleotit của các mạch ADN đã đánh dấu phóng xạ tạo thành các đoạn oligonucleotit có chiều dài hơn kém nhau một nucleotit được phát hiện bằng điện di. Kết quả của 4 nhóm phản ứng hoá học xử lý mạch ADN được phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamit, dựa vào đó ta có thể xác định trình tự các mạch đơn. b) Phương pháp dideoxy (Sanger, 1977) Nguyên tắc: Dựa vào sự hoạt động của enzym ADN polymeraza trong quá trình tổng hợp ADN (enzym ADN polymeraza xúc tác gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3’OH, khi gặp nucleotit không có nhóm 3’OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại), người ta sử dụng dideoxynucleotit (là những phân tử đường bị mất hai nguyên tử oxy ở vị trí C2 và C3) để làm ngừng các mạch đơn đang được tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn oligonucleotit dài ngắn hơn nhau một nucleotit, có thể nhận biết được bằng phương pháp điện di. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động : Máy hoạt động dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy, chùm tia laser trên máy đánh dấu vị trí và thời gian đi qua của các nucleotit, từ đó cho biết kết quả trình tự gen. Ngoài ra, máy còn đọc trình tự trên cả hai mạch đơn, do đó có thể phát hiện và làm giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Do giải trình tự gen bằng máy tự động có nhiều ưu điểm như: cho kết quả nhanh, độ chính xác cao, ít công đoạn chuẩn bị nên chúng tôi đã dùng công cụ này trong nghiên cứu đề tài. 4.2. ứng dụng của nghiên cứu đa dạng trình tự nucleotit: Ngày nay, việc áp dụng đọc trình tự nucleotit đã mang lại những thành tựu to lớn trong các lĩnh vực như nông, lâm, ngư nghiệp và đặc biệt là con người. Nhờ sự ra đời của kỹ thuật di truyền, trong điện di trọng trường (pulse fiesld electrophoresis) cho phép tách các đoạn ADN dài cả triệu nucleotit. Cuối năm 1989 ở Mỹ, chương trình xác định trình tự nucleotit của bộ gen người (Human Genome Project) với chi phí 3 tỉ USD đã được bắt đầu và đến năm 2003 đã cơ bản được hoàn thành. Hiện nay, trên thế giới có tổng cộng hơn 80 phòng thí nghiệm lớn tham gia vào chương trình bộ gen người. Tuy đã đạt được những kết quả quan trọng như tạo dòng 2375 gen của bộ não người vào năm 1992, nhưng vẫn còn nhiều khó khăn lớn. Sự can thiệp của tin học đã giúp rút ngắn đáng kể thời gian của một số phân đoạn trong đọc trình tự gen (Phạm Thành Hổ, Nxb Giáo dục, 1998) Một trong những bước tiến dài trong xác định trình tự nucleotit của bộ gen người là việc sử dụng các EST (Expressed Sequence Tags) để chuyển mRNA thành các đoạn cDNA bằng khuếch đại nhờ kỹ thuật PCR. Nhờ kỹ thuật này, sự biểu hiện của các gen ở các mô đặc hiệu được ghi nhận. Ưu thế của xác định trình tự nucleotit bằng EST là chỉ các gen biểu hiện ở một loại mô chuyên biệt được phát hiện (nhờ xác định mRNA trưởng thành và phiên mã ngược thành cDNA), Trình tự cDNA được gắn vào các véctơ plasmit để tách dòng. Sự lựa chọn các dòng để xác định trình tự nucleotit và sự so sánh tiếp theo cho phép đánh giá mức đ._.