Phân lập, xác định đăc tính sinh học của E. coli, Salmonella gây tiêu chảy cho lợn sau cai sữa nuôi tại tỉnh Lào Cai và đề xuất biện pháp phòng trị

đàn bò thịt 7,1 triệu con, sản lượng thịt bò 210 ngàn tấn; đàn bò sữa 200 ngàn con, sản lượng sữa 350 ngàn tấn; đàn gia cầm 283 triệu con, sản lượng thịt 1.427 ngàn tấn và 7,95 tỷ quả trứng gà, vịt (Cục chăn nuôi, 2006 ). Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, đương nhiên phải đầu tư cho công tác giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý; đồng thời cũng phải chú trọng hơn nữa công tác thú y, tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật trong chẩn đoán làm cơ sở cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả. Hội chứng tiêu chảy với đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp đang gây nên những thiệt hại to lớn, làm giảm năng suất, chất lượng đàn vật nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng. Bệnh tiêu chảy xảy ra ở các giống lợn và mọi lứa tuổi: lợn nái sinh sản, lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa. Bệnh thường xuất hiện khi thời tiết thay đổi đột ngột, thức ăn kém phẩm chất, vệ sinh chăm sóc không đảm bảo… Hội chứng tiêu chảy ở lợn thường xảy ra quanh năm, nhưng nhiều nhất vào những tháng có khí hậu ẩm ướt, thay đổi đột ngột sau những đợt mưa bão. Trên thế giới và cả Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn, vi khuẩn E.coli, Salmonella và một số bệnh của chúng gây ra cho vật nuôi; nhưng cho đến nay, ở Lào Cai chưa có nghiên cứu nào về hội chứng tiêu chảy ở lợn và về vi khuẩn E.coli và Salmonella trên lợn sau cai sữa bị tiêu chảy. Nhiều kết quả của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã kết luận E.coli và Salmonella là căn bệnh chung của nhiều loại vật nuôi và gây bệnh cho cả con người. Nhất là hiện nay, khi nước ta gia nhập Tổ chức Thương mại Thế giới (WTO) thì vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh là một yêu cầu cấp thiết. Việc nghiên cứu vi khuẩn E.coli và Salmonella, tỷ lệ nhiễm, vai trò gây bệnh của chúng,… đối với lợn từ sau cai sữa ở Lào Cai là việc làm cần thiết, để từ đó có cơ sở xây dựng biện pháp phòng, chống bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi gia súc, gia cầm nói chung, chăn nuôi lợn nói riêng phát triển bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao trên thị trường. Sau nhiều năm công tác ở Chi cục Kiểm dịch động vật vùng Lào Cai và qua thực tế theo dõi tình hình dịch bệnh ở đàn lợn cùng với Chi cục Thú y Lào Cai, chúng tôi nhận thấy hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa xảy ra khá phổ biến, gây nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi. Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn sản xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Phân lập, xác định đăc tính sinh học của E. coli, Salmonella gây tiêu chảy cho lợn sau cai sữa nuôi tại tỉnh Lào Cai và đề xuất biện pháp phòng trị". 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và giám định vi khuẩn E. coli và Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm và phân của lợn con tiêu chảy - xác định đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được - Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy của lợn. - Xây dựng và đề xuất phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa đạt hiệu quả. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Công trình đã chứng minh vai trò của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi tại tỉnh Lào Cai. Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, đồng thời đóng góp tư liệu tham khảo, nghiên cứu cho cán bộ thú y và người chăn nuôi. - Kết quả nghiên cứu đưa ra phác đồ điều trị có hiệu quả, giúp cho thú y cơ sở, các hộ chăn nuôi trong phòng trị tiêu chảy cho lợn, góp phần giảm thiệt hại và tăng thu nhập trong chăn nuôi lợn. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái niệm về hội chứng tiêu chảy Tiêu chảy là tình trạng bệnh lý đường tiêu hoá, là hiện tượng con vật ỉa nhanh, nhiều lần trong ngày, trong phân có nhiều nước do rối loạn chức năng tiêu hoá (ruột tăng cường co bóp và tiết dịch) (Phạm Ngọc Thạch, 1996 [51]), hoặc chỉ phản ánh đơn thuần sự thay đổi tạm thời của phân gia súc bình thường khi gia súc đang thích ứng với những thay đổi trong khẩu phần ăn. Tiêu chảy xảy ra ở nhiều bệnh và bản thân nó không phải là bệnh đặc thù (Archie.H, 2000 [1]). Tuỳ theo đặc điểm, tính chất, diễn biến bệnh, hoặc loài gia súc, hoặc nguyên nhân chính gây bệnh mà hội chứng tiêu chảy được gọi bằng tên khác nhau như: bệnh xảy ra đối với gia súc non theo mẹ, gọi là bệnh lợn con ỉa phân trắng, hay bê nghé phân trắng…; còn ở gia súc sau cai sữa là chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hoá, hoặc hội chứng rối loạn tiêu hoá…. Nếu xét về nguyên nhân chính gây bệnh thì có các tên gọi như: bệnh Colibacillosis do vi khuẩn E. coli gây ra, bệnh phó thương hàn lợn do vi khuẩn Samonella spp gây ra, bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) do Coronavirus gây ra,… Song, với bất kỳ cách gọi nào thì tiêu chảy luôn được đánh giá là hội chứng phổ biến trong các bệnh của đường tiêu hoá, xảy ra ở mọi nơi, mọi lúc (Archie. H, 2000 [1]) với các triệu chứng chung là: ỉa chảy, mất nước và chất điện giải, suy kiệt, dẫn đến có thể chết. 2.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn Tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý có liên quan đến nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Vì vậy việc phân biệt rạch ròi giữa các nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn ( Lê Minh Chí, 1995 [3]). Có thể liệt kê một số nguyên nhân quan trọng như sau 2.2.1. Do môi trường ngoại cảnh Môi trường ngoại cảnh là một trong 3 yếu tố cơ bản gây ra bệnh dịch, mối quan hệ giữa Cơ thể – Mầm bệnh – Môi trường là nguyên nhân của sự không ổn định sức khoẻ, đưa đến phát sinh bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001 [50]). Môi trường ngoại cảnh bao gồm các yếu tố: nhiệt độ, ẩm độ, các điều kiện về chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh chuồng trại, sự di chuyển, thức ăn, nước uống…. Khi gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào, làm cho gia súc dễ bị nhiễm khuẩn gây bệnh (Hồ Văn Nam và cs, 1997 [22]). Khẩu phần ăn cho vật nuôi không thích hợp, trạng thái thức ăn không tốt, thức ăn kém chất lượng như mốc, thối và nhiễm các tạp chất, các vi sinh vật có hại dễ dẫn đến rối loạn tiêu hoá kèm theo viêm ruột, ỉa chảy ở gia súc (Trịnh Văn Thịnh, 1985a [55], Hồ Văn Nam, 1997 [22]). Khi gặp điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi, thay đổi đột ngột về thức ăn, vitamin, protein, thời tiết, vận chuyển…làm giảm sức đề kháng của con vật thì vi khuẩn thường trực sẽ tăng độc tố và gây bệnh (Bùi Quý Huy, 2003 [15]). Như vậy, nguyên nhân môi trường ngoại cảnh gây tiêu chảy không mang tính đặc hiệu mà mang tính tổng hợp. Lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống điều hoà trao đổi nhiệt của cơ thể lợn, dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất, làm giảm sức đề kháng của cơ thể, từ đó các mầm bệnh trong đường tiêu hoá có thời cơ tăng cường độc lực và gây bệnh. 2.2.2. Nguyên nhân do vi sinh vật Vi sinh vật bao gồm các loại virus, vi khuẩn và nấm mốc. Chúng vừa là nguyên nhân nguyên phát, cũng vừa là nguyên nhân thứ phát gây tiêu chảy. * Tiêu chảy do vi khuẩn Trong đường tiêu hoá của gia súc có hệ vi khuẩn gọi là hệ vi khuẩn đường ruột, được chia thành 2 loại, trong đó vi khuẩn có lợi, có tác dụng lên men phân giải các chất dinh dưỡng, giúp cho quá trình tiêu hoá được thuận lợi và vi khuẩn có hại, khi có điều kiện thì gây bệnh. Họ vi khuẩn đường ruột là họ vi khuẩn cộng sinh thường trực trong đường ruột. Họ vi khuẩn này, muốn từ vi khuẩn cộng sinh trở thành gây bệnh phải có 3 điều kiện (Jones, 1980, dẫn theo Lê Văn Tạo, 1997a [46]): - Trên cơ thể vật chủ có cấu trúc giúp cho vi khuẩn thực hiện được chức năng bám dính. - Vi khuẩn phải có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh, đặc biệt là sản sinh độc tố, trong đó quan trọng nhất là độc tố đường ruột Enterotoxin. - Có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của niêm mạc ruột, từ đó phát triển nhân lên. Một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột là E. coli, Salmonella sp. Shigella, Klebsiella, C. perfringens… Đó là những vi khuẩn quan trọng, gây rối loạn tiêu hoá, viêm ruột tiêu chảy ở người và nhiều loài động vật Đào Trọng Đạt và cộng sự (1996) [10] cho biết: chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E. coli (45,6%). Cũng theo tác giả, vi khuẩn yếm khí C. perfringens gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi và khi nó trở thành vai trò chính. Hồ Văn Nam và cs (1997) [22], Archie.H (2001) [1] nhấn mạnh: vi khuẩn đường ruột có vai trò không thể thiếu được trong hội chứng tiêu chảy. Nguyễn Như Pho (2003) [34] cho rằng, khả năng gây bệnh của các loại vi khuẩn đối với lứa tuổi lợn khác nhau. Đối với lợn sau cai sữa hoặc giai đoạn đầu nuôi thịt thì tỷ lệ mắc tiêu chảy do Salmonella cao hơn; giai đoạn từ lúc sơ sinh đến sau khi cai sữa thường do E. coli; lứa tuổi 6 - 12 tuần thì thường do xoắn khuẩn Treponema hyodysenterriae; còn vi khuẩn yếm khí C.perfringens thường gây bệnh nặng cho lợn con theo mẹ trong khoảng 1 tuần tuổi đến cai sữa. * Tiêu chảy do virus Virus cũng là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn. Sự xuất hiện của virus đã làm tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức đề kháng của cơ thể và thường gây ỉa chảy ở dạng cấp tính với tỷ lệ chết cao (Phạm Ngọc Thạch, 1996 [51]). Khooteng Huat (1995) [76] đã thống kê có hơn 10 loại virus có tác động làm tổn thương đường tiêu hoá, gây viêm ruột ỉa chảy như: Enterovirus, Rotavius, Coronavirus, Adenovirus type IV, virus dịch tả lợn… Rotavirus và Coronavirus là những virus gây tiêu chảy quan trọng ở gia súc non mới sinh như nghé, dê cừu con, lợn con, ngựa con và đặc biệt là bê do những virus này có khả năng phá huỷ màng ruột và gây tiêu chảy nặng (Archie.H, 2000 [1]). Các nghiên cứu trong nước của Lê Minh Chí (1995) [3] và Nguyễn Như Pho (2003) [33] cũng đã cho rằng: Rotavirus và Coronavirus gây bệnh tiêu chảy chủ yếu cho lợn con trong giai đoạn theo mẹ, với các triệu chứng tiêu chảy cấp tính, nôn mửa, mất nước với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao. * Tiêu chảy do nấm mốc Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản không đúng kỹ thuật dễ bị nấm mốc. Một số loài như: Aspergillus, Penicillium, Fusarium…có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố, nhưng quan trọng nhất là nhóm độc tố Aflatoxin (Aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 ). Độc tố Aflatoxin gây độc cho người và gia súc, gây bệnh nguy hiểm nhất cho con người là ung thư gan, huỷ hoại gan, độc cho thận, sinh dục và thần kinh. Aflatoxin gây độc cho nhiều loài gia súc, gia cầm, mẫn cảm nhất là vịt, gà, lợn và các gia súc khác. Lợn khi nhiễm độc thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, ỉa chảy, ỉa chảy ra máu. Nếu trong khẩu phần có 500 - 700mg Aflatoxin/kg thức ăn sẽ làm cho lợn con chậm lớn, còi cọc, giảm sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài, 1997 [43]). 2.2.3. Tiêu chảy do ký sinh trùng Có nhiều loại ký sinh trùng gây bệnh tiêu chảy ở lợn như: cầu trùng Eimeria, Isospora suis, Crytosporidium, Ascaris suum, Trichuris suis… hoặc một số loài giun tròn lớp Nematoda (Ascaris suum, Trichuris suis, Strongloides, Haemonchus, Mecistocirrus…). Bệnh do Isospora suis, Crytosporidium thường tập trung vào giai đoạn lợn con từ 5- 25 ngày tuổi, còn ở lợn trên 2 tháng tuổi do cơ thể đã tạo được miễn dịch đối với bệnh cầu trùng, nên lợn chỉ mang mầm bệnh mà ít khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy (Nguyễn Như Pho, 2003 [33]). Cầu trùng và một số loại giun tròn (giun đũa, giun tóc, giun lươn) là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Thái Nguyên (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006a [19]). Đặc điểm chủ yếu của tiêu chảy do ký sinh trùng là con vật mắc bệnh bị tiêu chảy nhưng không liên tục, có sự xen kẽ giữa tiêu chảy và bình thường, cơ thể thiếu máu, da nhợt nhạt, gia súc kém ăn, thể trạng sa sút. Như vậy có thể thấy, có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy, nhưng theo một số chuyên gia chuyên nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn như Nguyễn Thị Nội (1985) [29], Lê Văn Tạo (1993) [44], Hồ Văn Nam (1997) [22] thì dù nguyên nhân nào gây tiêu chảy cho lợn đi nữa, cuối cùng cũng là quá trình nhiễm khuẩn, vi khuẩn kế phát làm viêm ruột, tiêu chảy nặng thêm, có thể dẫn đến chết hoặc viêm ruột tiêu chảy mãn tính. 2.3. Một số nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây bệnh đường tiêu hoá Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) trước đây được gọi là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis, lần đầu tiên phân lập được từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và được đặt theo tên của người bác sĩ nhi khoa Đức Theodor Escherich (1857 –1911) (Nguyễn Vĩnh Phước, 1974 [37], Nguyễn Lân Dũng, 1976 [8], Nguyễn Như Thanh và cs, 1997 [49], Lê Văn Tạo, 1997a [46]). Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là họ vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí (Hoàng Thuỷ Nguyên và cs, 1974 [23]), vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997a [46]). Trong điều kiện bình thường, E. coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hoá và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 [38]). 2.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn - Đặc điểm hình thái Vi khuẩn E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, có kích thước 2 - 3mm x 0,3 - 0,6mm; ở môi trường nuôi cấy, trong canh khuẩn già, xuất hiện những trực khuẩn dài 4 - 8 mm. Trong cơ thể người và động vật, vi khuẩn thường có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhưng khi soi tươi thì thường không nhìn thấy được. - Đặc điểm cấu trúc Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên thân O, giáp mô K, lông H và kháng nguyên bám dính F. Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã tìm ra được 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F (Fairbrother.J.M, 1992 [70]). Khi xác định serotype đầy đủ của 1 chủng vi khuẩn E. coli thì phải xác định đủ cả 3 loại kháng nguyên nói trên. - Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân – Ohne Hauch) được coi như là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết. Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khó tan. - Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn (Orskov.F, 1978 [84]). - Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc - Capsular), còn được gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular). Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất. Có rất nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực của vi khuẩn, vì thấy rằng độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống độc lực của chủng không có kháng nguyên K (Orskov.F, 1978 [84]). Tuy nhiên, có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: + Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky như E. coli O139: K88, O149: K88... + Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ. Tóm lại, dựa vào kháng nguyên O, E. coli được chia làm nhiều nhóm; căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H, E. coli lại chia làm nhiều type; mỗi type đều được ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, K, H. - Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính) Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 và F41 (Cater.G.R và cs, 1995) [65]. 2.3.2. Đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hoá học - Đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (từ 5- 400C), nhiệt độ thích hợp là 370C và phổ pH rộng (pH từ 5,5 – 8,0), pH thích hợp nhất là từ 7,2-7,4. Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Khi nuôi cấy trên các môi trường, để trong tủ ấm ở 37oC và sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển như sau: + Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2-3mm. Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucous). + Môi trường nước thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối. + Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. + Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng và gây ra hiện tượng tan máu. + Môi trường Simmon citrat: Khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. + Môi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ. + Trong môi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím đen. + Trong môi trường SS: Khuẩn lạc có màu đỏ. - Đặc tính sinh hoá + Phản ứng lên men đường: Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại đường Duncitol, Saccarose và Salixin. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đường Lactose nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E. coli và Samonella. + Một số phản ứng sinh hoá khác: Phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính. 2.3.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli - Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính như kháng nguyên F. Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột. ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá huỷ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruột Enterotoxin. Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nước, làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng cơ học, làm nhu động ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu. Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các tổ chức cơ quan. Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết. - Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố. Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh. Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E. coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Adherence Enteropathogenic E. coli (AEEC) và Verotoxingenic E.coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997a [46]). Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thường gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother.J.M, 1992 [70]). * Yếu tố kháng khuẩn Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là 1 trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh (Smith.H.W và cs, 1967) [88]. * Yếu tố bám dính Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non. Hầu hết các chủng ETEC đều có mang 1 hoặc nhiều các yếu tố bám dính như: F4(K88), F5 (K99), F6(987P), F17, F18, F41, F42 và F165. ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh tiêu chảy thường mang các yếu tố bám dính sau đây: - F4 (K88): F4 hay còn gọi là K88 và là một kháng nguyên không chịu nhiệt. Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1964) [83] đã phân biệt được hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Loại thứ 3 được phát hiện bởi Guinee và Jansen được đặt tên là F4ad (Guinee và cs, 1979 [74]). Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển được ở thành ruột non. Yếu tố bám dính F4 được mang trong vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC, gây bệnh tiêu chảy ở lợn trước và sau cai sữa (Nagy và cs, 1999 [81]). - F5 (K99): F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của E.coli chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs, 1985) [78]. Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1977) [72]. - F6 (987p): Các nhà khoa học cho rằng, fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm trải của các tế bào biểu mô ruột (Dean và cs, 1989, 1994 [67] [68]). F6 bám dính ở màng nhầy để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ. - F18: F18 là tên đặt cho nhân tố bám dính 8813. Bởi vậy, một loại fimbriae mới đã được đề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs, 1995 [86]). Một nghiên cứu của Nagy và cs (1996) [80] thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các chủng ETEC. Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs, 1992 [79]), cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs, 1992 [66]). Điều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn sơ sinh. Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor đặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa (Nagy và cs, 1999 [81]). * Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli: là một khái niệm dùng để chỉ quá trình chưa được xác định một cách rõ ràng mà nhờ đó vi khuẩn E. coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua được hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs, 1976 [73]). * Độc tố của vi khuẩn E. coli: Vi khuẩn E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. * Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù các vi khuẩn E. coli có nhiều loại kháng nguyên, trong đó, có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên F. * Yếu tố dung huyết (Hly) Để phát triển trong cơ thể, vi khuẩn E. coli cần được cung cấp sắt. Hầu hết những chủng E. coli gây bệnh thường có khả năng gây dung huyết. Để chiếm dụng sắt của vật chủ, vi khuẩn E. coli tiết men Heamolyzin phá vỡ hồng cầu, giải phóng sắt trong nhân HEM. Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E. coli là: a-haemolysin, b-haemolysin, g-haemolysin, e-haemolysin, nhưng quan trọng nhất là kiểu a-haemolysin và b-haemolysin (Ketyle và cs, 1975 [75]). 2.3.4. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E. coli Để trị bệnh đường ruột, người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh. Kháng sinh còn được trộn vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng. Vì vậy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nói chung và vi khuẩn E. coli nói riêng đang ngày một tăng, làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Sở dĩ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975) [71]. Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ, Lê Văn Tạo (1993) [44] đã xác định được khả năng kháng kháng sinh của các chủng E. coli phân lập từ bệnh phân trắng lợn con và kết luận vi khuẩn E. coli có được khả năng này là do nhận được bằng di truyền dọc và di truyền ngang qua plasmid. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa chọn kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E. coli gây ra mà là nghiên cứu một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này. Phạm Khắc Hiếu và cs (1999) [14] đã tìm thấy chủng E. coli kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa E. coli và Salmonella qua plasmid. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (2000) [27] cho thấy, hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được từ gia súc tiêu chảy có khả năng kháng lại với nhiều loại kháng sinh như: Chloramphenicol, Sulfadimethoxine hoặc Tetracycline,.. Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng E. coli phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Đỗ Ngọc Thuý và cs (2002) [57] đã thu được kết quả: Các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường vẫn dùng để điều trị bệnh: Amoxicillin (76,42%), Chloramphenicol (79,25%), Trimethroprim/Sulfamethoxazol (80,19%), Streptomycin (88,68%), Tetracyclin (97,17%). Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là phổ biến (chiếm 90,57%) và kiểu kháng thuốc kháng với các loại kháng sinh: Tetracyclin, Trimethroprim/Sulfamethoxazol, Streptomycin và Chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất (76,24%). Có thể dùng Amikacin, Apramycin hay Ceftiofur để điều trị cho lợn con bị tiêu chảy, thay thế cho các loại kháng sinh trước đây vẫn dùng. Bùi Xuân Đồng (2002) [11] đã tiến hành thử kháng sinh đồ với các chủng E. coli phân lập được từ Hải Phòng và cho kết quả mẫn cảm với các loại kháng sinh Chloramphenicol, Norfloxacin, Ampicilin; còn với các chủng tại Tiền Giang thì Bùi Trung Trực (2004) [58] cho rằng chúng vẫn mẫn cảm mạnh với Norfloxacin và Colistin. Khi thử nghiệm phòng và trị bệnh E. coli dung huyết cho lợn con ở Thái Nguyên và Bắc Giang, Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [18] đã kết luận: Vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn bệnh rất mẫn cảm với kháng sinh Amikacin, kém hơn với Doxycycline, không mẫn cảm với Ampicilin và Cefuroxime. Trương Quang và cs (2006) [40] kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy cho bê, nghé đã cho thấy các loại Neomycin, Norfloxacin và Colistin có tác dụng tốt. Như vậy, có thể thấy, qua thời gian và ở các địa điểm khác nhau, tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây bệnh cũng khác nhau. 2.3.5. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy Bệnh tiêu chảy có ở hầu hết các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi. Trong chăn nuôi lợn, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi và đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh. Các tác giả trong và ngoài nước đều nhấn mạnh vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy. Theo nhiều nhà nghiên cứu khoảng 20 – 50% lợn con chết trong những ngày sơ sinh do E. coli gây nên, đôi khi tỷ lệ chết tới 10% (Niconxki.V.V, 1986) [28]. Để xác định vai trò của một E. coli gây ra một bệnh nào đó, cần kiểm tra độc lực và các yếu tố gây bệnh mà chủng E. coli đó có được. Do vậy, kết quả những nghiên cứu về độc lực, yếu tố gây bệnh của E. coli chính là đánh giá khả năng gây bệnh của nó (Lê Văn Tạo và cs, 2003 [48]). Cù Hữu Phú và cs (2004) [36] đã kết luận: vi khuẩn E. coli là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy ở lợn con theo mẹ; các chủng E. coli có thể mang tổ hợp các._. yếu tố gây bệnh như: LT + STa + STb + K88 + Hly+ (29.29%); LT + STa + STb + Hly- (8.33%). Khi nghiên cứu về vai trò gây bệnh của E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1 – 60 ngày tuổi, tác giả Trương Quang (2005) [39] đã có kết luận: 100% mẫu phân của lợn bị tiêu chảy phân lập được E. coli với số lượng gấp 2,46 – 2,73 lần (ở lợn 1 – 21 ngày tuổi) và 1,88 – 2,1 lần (ở lợn 22 – 60 ngày tuổi) so với lợn không tiêu chảy. Tỷ lệ các chủng E. coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy có độc lực mạnh và các yếu tố gây bệnh cao hơn rất nhiều so với ở lợn không bị tiêu chảy. Cụ thể: yếu tố bám dính: 93,33% so với 33,33%; khả năng dung huyết: 53,33% so với 25,92%; độc tố chịu nhiệt (LT): 90% - 11,11%, cả 2 loại ST + LT: 73,33% so với 1,4%, độc lực mạnh (giết chết 100% chuột): 90% so với 0%. Tìm hiểu nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tiêu chảy lợn con, Hồ Soái và cs (2005) [41] đã nhận xét: 100% mẫu phân lợn tiêu chảy phân lập được E. coli với số lượng nhiều gấp 2,37 lần (1- 45 ngày tuổi) và gấp 2,31 lần (45 - 60 ngày tuổi) so với lợn bình thường không tiêu chảy. Độc lực của vi khuẩn E. coli và Salmonella gây chết chuột từ 50 - 100%, thời gian gây chết 6 -36 giờ. Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli gồm: 60% có độc tố STb, tỷ lệ LT, STa và VT2 là 40%, 20% và 10%, có 4 chủng sinh độc tố EAST1, 2 chủng sản sinh 2 loại độc tố STb và LT, 2 chủng sản sinh 3 loại độc tố STa, STb và LT. 2.4. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella gây bệnh đường tiêu hoá Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột được Salmon và Smith phát hiện vào năm 1886 khi xác định Salmonella choleraesuis là nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn (Hog Cholera), một bệnh mà cho đến 20 năm sau đó, mới khẳng định là do virus gây nên (dẫn theo Lê Văn Tạo, 1997b) [47]. Theo Tổ chức Y tế thế giới (W.H.O), đến nay, các nhà khoa học đã xác định được hơn 2200 serotype Salmonella khác nhau, trong đó chỉ khoảng 5% serotype có khả năng gây bệnh, số còn lại là vi khuẩn tự dưỡng hoặc hoại sinh. Vi khuẩn Salmonella thường được đặt tên theo nơi phân lập được như: S. newsport, S. dublin, hoặc theo triệu chứng, bệnh tích gây nên: S. enteritidis, S. cholerasuis. ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu bước đầu của Lê Văn Tạo và cs (1997b) [47] cho thấy, S. choleraesuis chiếm 50%, S. typhimurium chiếm 6,25%, S. entertidis chiếm 12,5% và 31,25% thuộc các loại serotype khác. 2.4.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc của vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có kích thước khoảng 0,4 – 0,6 x 1 – 3 mm, không hình thành giáp mô và nha bào, có lông và di động được (trừ S. pullorum –gallinarum). Vi khuẩn bắt mầu gram âm. * Kháng nguyên vỏ (K - Antigen) Chỉ có ở một số loài như S. typhi, S. paratyphi. S. dublin có thể chứa Vi - Antigen giống như K - Antigen của E.coli. Kháng nguyên Vi là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi nó phát triển nhiều, kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 loài Salmonella: S. typhi và S. paratyphi C, kí hiệu Vi trong công thức đứng sau kháng nguyên O. Theo sơ đồ của Kauffmann - White, công thức kháng nguyên của S. paratyphi C: 6, 7, Vi: - 1, 5 và S. typhi: 9, 12, Vi: c, d. 2.4.2. Đặc tính nuôi cấy, sinh vật hoá học - Đặc tính nuôi cấy: Salmonella là trực khuẩn vừa hiếu khí, vừa yếm khí, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 37oC, độ pH = 7,2 – 7,6. Vi khuẩn có sức chịu đựng tốt với các điều kiện khắc nghiệt. Chúng có thể phát triển được từ 7 - 45oC; tồn tại được ở trong băng đá và ngay cả khi bị sấy khô qua nhiều tuần, tháng, vài năm ở trạng thái tiềm sinh. Vi khuẩn cũng có thể bị diệt bằng nhiệt độ, ánh sáng mặt trời, các chất sát trùng thông thường như phenol, formol hoặc crezyl… Trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường: + Trên môi trường nước thịt: làm đục, sinh cặn ở đáy ống nghiệm, có màng mỏng và mùi thối. + Trên môi trường SS (Salmonella – Shigella): do không lên men đường lactose, khuẩn lạc ở dạng trong hoặc không màu. + Môi trường Endo: khuẩn lạc có màu vàng. + Môi trường thạch EMB: khuẩn lạc có màu đỏ. - Đặc tính sinh hoá: + Chuyển hoá đường: Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi glucose, mannit, mantose, galactose, levulo, mantol. Tất cả các loài Salmonella không lên men lactose. + Các phản ứng sinh hoá khác: Indol: - H2S: + Enzym khử cacboxyn: 96% Salmonella tiết ra enzym khử cacboxyn đối với Lysine, Ornithine, Arginine. Oxydaza: - Catalaza: + 2.4.3. Cơ chế gây bệnh Quá trình gây bệnh ở trong đường tiêu hoá của Salmonella lần đầu tiên được mô tả bởi một thí nghiệm trên chuột lang vào năm 1967 (Wilcock.B.P& Schwartz.K.J, 1992) [90]. Thí nghiệm cho thấy, qua một quá trình sinh sản trên bề mặt thành ruột, Salmonella sẽ xuyên qua lớp màng và xâm nhập vào bên trong tế bào biểu mô, đặc biệt ở đoạn hồi tràng. Tại đây, nó gây tổn thương các tế bào biểu mô ruột. Trong giai đoạn này, vi khuẩn bị thực bào, song các đại thực bào không phá huỷ được vi khuẩn hoàn toàn. Kết quả là sau 24 giờ xâm nhập, vi khuẩn đã phát triển trong đại thực bào và mô lympho ruột. Đồng thời với sự phát triển nhanh về số lượng vi khuẩn là việc xuất hiện thể bệnh cấp tính, sự tập trung các đại thực bào, phản ứng viêm tạo thành huyết khối, gây rối loạn tuần hoàn cục bộ vi mạch ở lớp dưới niêm mạc. Hậu quả là dẫn tới hoại tử ở niêm mạc ruột tại điểm bị vi khuẩn tấn công. Đặc điểm bệnh tích trên có thể coi là 1 trong những dấu hiệu đặc trưng bệnh do Salmonella gây ra. Posposchil A. và cs (1990) [85] đã tiến hành thí nghiệm cho lợn cai sữa uống vi khuẩn S. typhimurium; vi khuẩn phát triển nhanh chóng trong ruột và lan tràn nhanh đến các hạch lympho; chỉ cần sau 24 giờ đã có thể phân lập được vi khuẩn ở trong hạch amidan và hạch dưới hàm. Tác giả cũng cho rằng: sự xâm nhập của vi khuẩn qua lớp niêm mạc ruột được coi như là một điều kiện tiên quyết cho bệnh phát triển. Với serotype S. choleraesuis, số lượng vi khuẩn dường như không phải là một điều kiện tiên quyết, bởi vì trong thực tế chúng luôn xâm nhập vào lớp niêm mạc ruột nhiều hơn so với serotype khác; vì vậy quá trình sinh bệnh của chúng luôn bắt đầu bằng chứng nhiễm trùng huyết và sau 24 – 72 giờ con vật mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy dữ dội. Như vậy, khả năng gây bệnh của Salmonella cũng giống như với vi khuẩn E. coli đó là khi gặp điều kiện bất lợi, làm giảm sức đề kháng của con vật thì vi khuẩn thường trực sẽ tăng độc tố và gây bệnh. 2.4.4. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh Cũng như vi khuẩn E. coli, Salmonella cũng kháng với nhiều loại kháng sinh, mà nguyên nhân là do trong quá trình chăn nuôi, trong điều trị bệnh còn có nhiều thiếu sót về kỹ thuật như: dùng không đúng liều lượng, không đủ thời gian… và khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn với nhau. Các tác giả Nguyễn Quang Tuyên (1996) [60], Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1999) [14] cho thấy, Salmonella mẫn cảm mạnh với Chloramphenicol, mẫn cảm trung bình với Neomycin và kháng mạnh với Chlotetracyclin, Penicillin, Ampicillin và Sulphonamide với 100% số chủng nghiên cứu. Nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cs (1999) [34] cho rằng: Salmonella mẫn cảm mạnh với Neomycin và Nitrofurazolidon với 80 – 90% số chủng phân lập được và kháng mạnh với Penicillin và Ampicillin. Nguyễn Thị Oanh, Phùng Quốc Chướng (2003) [32] cho biết: vi khuẩn Salmonella mẫn cảm cao với Ciprofloxacin, Ceftrixazone, Trimethoprim/ Sulfamid và Nalidixide acid, rất ít hoặc không mẫn cảm với Ampicilin, Erythromycin, Penicillin. Các chủng Salmonella có độ mẫn cảm cao với Furazolidon (100%), Chloramphenicol (87,5%), và ít mẫn cảm với Penicillin (25%) và hoàn toàn kháng với Tetracyclin (Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên, 2001) [5]. Như vậy, các loại thuốc như: Furazolidon, Chloramphenicol, Nitrofurazolidon là thuốc có tính mẫn cảm cao với Salmonella. Tuy nhiên, hiện nay theo quy định của Nhà nước, các loại thuốc này là loại thuốc cấm sử dụng trong phòng và trị bệnh cho vật nuôi. Vì vậy, cần có những nghiên cứu tính mẫn cảm của Salmonella với các loại kháng sinh khác. 2.4.5. Vai trò của vi khuẩn Salmonella trong hội chứng tiêu chảy Bệnh do Salmonella gây ra ở lợn con theo mẹ là rất ít gặp. Bởi vì, trong máu của lợn con còn hàm lượng kháng thể cao do sữa đầu của lợn mẹ cung cấp và có hoạt động bảo hộ cho đến khi những lợn con cai sữa. Lợn sau cai sữa do không còn nguồn cung cấp globulin miễn dịch, nguồn thức ăn và pH đường ruột thay đổi, vì thế con con rất dễ bị nhiễm bệnh (Wilcock.B.P, 1978) [89]. Bergeland (1980) (dẫn theo Đào Trọng Đạt và cs, 1996) [10] đã nêu cụ thể: đối với lợn con trong giai đoạn theo mẹ, bệnh rất hiếm khi xảy ra, tỷ lệ mắc bệnh chỉ khoảng 0,1% so với tổng số ca bệnh tiêu chảy do các nguyên nhân khác. Wilcock.B.P, Schwartz.K.J (1992) [90] cho rằng: bệnh truyền nhiễm do Salmonella gây ra chủ yếu cho lợn con sau cai sữa với các triệu chứng điển hình là nhiễm trùng huyết, nhiễm độc huyết và viêm ruột ỉa chảy. Tác giả còn cho biết: vi khuẩn có thể gây bệnh cho lợn nuôi bởi nhiều serotype có trong tự nhiên, nhưng với bệnh tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa thì chỉ phát hiện có 2 serotype là: S. choleraesuis và S. typhimurium. Trong 2 chủng vi khuẩn Salmonella thường xuyên gây bệnh tiêu chảy cho lợn, S. choleraesuis được phát hiện trên 95%, S. typhimurium khoảng 4% và dưới 1% thuộc về những serotype khác (Schwartz.K.J, 1992) [87]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và cs (1989a) [30], có tới 82,8% đến 100% số lợn tiêu chảy phân lập được vi khuẩn Salmonella gây bệnh. Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Tạo và cs (1993) [44] đã chỉ ra rằng trong số, 50 mẫu bệnh phẩm từ lợn tiêu chảy, đã phân lập được 16 chủng Salmonella sp, trong đó có 8 chủng thuộc S. choleraesuis, 2 chủng S. enteritidis và 1 chủng S.typhimurium. Nghiên cứu lợn tiêu chảy ở các cơ sở chăn nuôi tập trung của các tỉnh miền Bắc, Cù Hữu Phú và cs (2000) [35], đã cho thấy tỷ lệ phân lập được vi khuẩn Salmonella gây bệnh tới 80% số mẫu xét nghiệm. Cũng như họ vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn Salmonella muốn trở thành gây bệnh phải hội tụ đủ 3 điều kiện là phải thực hiện được chức năng bám dính vào cơ thể vật chủ, sản sinh độc tố và có khă năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của nhung mao ruột để nhân lên. Yếu tố bám dính của Salmonella là fimbriae thuộc serotyp I (Cholerae Factor Adherence – CFA/I). Độc tố đường ruột của Salmonella gồm 2 thành phần cơ bản là: độc tố thẩm xuất nhanh (RPF- Rapid Permeability Factor - Độc tố chịu nhiệt) và độc tố thẩm xuất chậm (DPF – Delayed Permeability Factor - Độc tố không chịu nhiệt). Khi nghiên cứu một số đặc tính sinh hoá và yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được từ bê, nghé bị tiêu chảy, Nguyễn Văn Sửu, Nguyễn Quang Tuyên, Trần Thị Hạnh (2005) [42] đã có kết luận: 14/17 (82,35%) chủng Salmonella phân lập được có khả năng sinh độc tố thẩm xuất chậm (DPF – Delayed Permeability Factor - Độc tố không chịu nhiệt); 8/17 (47,06%) chủng sản sinh độc tố thẩm xuất nhanh (RPF- Rapid Permeability Factor - Độc tố chịu nhiệt); 5/17 (29,41%) chủng sản sinh cả 2 loại độc tố DPF và RPF. Cơ chế gây bệnh của các độc tố là làm rối loạn quá trình trao đổi nước, chất điện giải, gây ra hiện tượng bệnh lý nước từ các cơ quan, tổ chức thẩm xuất vào đường ruột dẫn đến tiêu chảy. Wilcock.B.P, Schwartz.K.J (1992) [90] cũng cho biết: trong giai đoạn sớm của bệnh, chứng tiêu chảy là kết quả của sự giảm hấp thu Na+ và tăng tiết dịch có Cl-. Vi khuẩn Salmonella cũng sản sinh độc tố đường ruột Enterotoxin, ngoài việc phá huỷ lớp niêm mặc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy. 2.5. Tình hình dịch bệnh ở đàn lợn nuôi trên địa bàn của tỉnh Lào Cai 2.5.1. Một số đặc điểm tự nhiên ảnh hưởng đến bệnh tiêu chảy Lào Cai là tỉnh miền núi, cách Thủ đô Hà Nội khoảng 340 km về phía Bắc, tiếp giáp với các tỉnh: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang. Tỉnh có địa hình biên giới nằm giáp với nước bạn Trung Quốc và có một số đặc điểm khí hậu: - Nhiệt độ: theo số liệu thống kê cho thấy nhiệt độ trung bình năm dao động từ 23,4 – 23,80C; cao nhất vào tháng 6 dao động từ 28,8 – 29,80C; thấp nhất vào tháng 1 dao động từ 15,7 – 15,90C; khoảng dao động giữa tháng cao nhất và thấp nhất là 13,90C; sự chênh lệch nhiệt độ giữa các vùng trong tỉnh không đáng kể. - Số giờ nắng trung bình/năm là: 1.340,7 giờ. Các tháng 1, 2, 3 có số giờ nắng thấp nhất trong năm. - Lượng mưa trung bình/năm vào khoảng 1.563,7 mm; tháng 6, 7, 8, 9 là những tháng có lượng mưa cao, vào khoảng từ 214 – 328 mm, chủ yếu mưa rào có thời gian ngắn, nhưng lượng nước lớn; các tháng 1, 2, 12, 3 có lượng mưa thấp nhất từ 14,9 – 44,8 mm, chủ yếu là mưa phùn, mưa nhỏ, lượng nước ít nhưng thời gian thường kéo dài. Ẩm độ trung bình/năm là: 86%, dao động từ 81 – 90%; sự chênh lệch ẩm độ giữa các tháng trong năm là không lớn. Đặc điểm địa hình và khí hậu ở tỉnh Lào Cai có nền khí hậu thuận lợi cho sinh trưởng, phát triển vi sinh vật, trong đó có tác động đáng kể đến tình hình dịch bệnh trên đàn lợn, đặc biệt là bệnh tiêu chảy. 2.5.2. Tình hình dịch bệnh ở đàn lợn nuôi trên địa bàn của tỉnh Lào Cai Tình hình dịch bệnh trên đàn lợn tỉnh Lào Cai những năm qua diễn biến phức tạp và đã gây tổn thất khá lớn cho sự phát triển của ngành chăn nuôi. Tổng hợp các báo cáo của Chi cục Thú y Lào Cai trong 3 năm (từ 2006 đến 2008) cho thấy: - Có trên 11 loại bệnh thường xảy ra, với 61.230 con mắc và 6.980 con chết, tính trung bình trên 20.410 con ốm/năm và 2.326,6 con chết/năm - Tỷ lệ mắc tiêu chảy chiếm 54,73% (33.517/61.230), cao nhất so với các bệnh khác; cao hơn bệnh LMLM 342 lần, bệnh suyễn 140 lần, bệnh nội khoa 147 lần, tụ huyết trùng: 3,4 lần, bệnh phù đầu: 4,4 lần, nhưng tỷ lệ chết do mắc tiêu chảy là thấp nhất (3,65%). Có thể thấy, mặc dù tỷ lệ lợn chết do mắc tiêu chảy là không cao, song tần suất xuất hiện bệnh rất lớn: trung bình cứ 100 ca lợn mắc bệnh thì có ít nhất 55 ca lợn mắc tiêu chảy. Như vậy, ngoài việc phải chi phí cho điều trị, số lợn khỏi bệnh cũng chậm lớn, tiêu tốn thức ăn tăng, làm tăng chi phí trong chăn nuôi, dẫn đến hiệu quả chăn nuôi giảm. Qua số liệu thống kê hàng tháng, chúng tôi thấy: Bệnh tiêu chảy ở lợn xảy ra nhiều vào 2 giai đoạn: từ tháng 1 – 2 và từ tháng 6 – 8, đó là vào mùa đông và mùa hè. Giai đoạn từ tháng 9 đến cuối tháng 11 có số ca mắc tiêu chảy thấp hơn. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả khác như Hoàng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo, (1998) [59], Nguyễn Thị Kim Lan và cs, (2006b) [20]. 3. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Lợn từ sau cai sữa nuôi tại các huyện của tỉnh Lào Cai. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa bàn nghiên cứu: Các trang trại, hộ gia đình tại các huyện: Bảo Yên, Bảo Thắng, Bát Xát, Sa Pa, Bắc Hà, thuộc tỉnh Lào Cai. - Địa điểm xét nghiệm mẫu: Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. 3.1.3. Thời gian nghiên cứu: Từ 10/2008 - 8/2009. 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.2.1. Nghiên cứu xác định vai trò của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa - Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm và phân lợn tiêu chảy - Xác định số lượng vi khuẩn E. coli và Salmonella trong phân lợn tiêu chảy và lợn bình thường - Giám định đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập được - Xác định serotyp của các chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập được - Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được - Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. Coli và Salmonella phân lập được trên chuột bạch - Xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. Coli và Salmonella phân lập được 3.2.2. Thử nghiệm phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn con sau cai sữa 3.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 3.3.1. Mẫu bệnh phẩm - Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng gồm: máu, tim, gan, lách, ruột, hạch ruột, ..vv… của lợn từ sau cai sữa mắc bệnh tiêu chảy vừa chết hoặc sắp chết. - Mẫu phân của lợn bị tiêu chảy 3.3.2. Các loại môi trường, hoá chất - Các loại môi trường dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn đường ruột, bao gồm: thạch máu, thạch MacConkey, thạch TSI, thạch DHL, thạch Brilliant Green, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt pepton, thạch Simmons citrate và các loại môi trường đường Glucoze, Lactoze, Mannitol... do hãng Oxoid của Anh sản xuất. - Các loại giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh). - Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập được của Nhật và úc. - Các hoá chất và dụng cụ phòng thí nghiệm khác dùng trong nghiên cứu vi khuẩn. 3.3.3. Động vật thí nghiệm - Chuột bạch khoẻ mạnh, có trọng lượng trung bình 18 - 20 g/con. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn 3.4.1.1. Thu thập mẫu - Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng lợn mắc tiêu chảy chưa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi toàn bộ tăm bông thấm ướt phân lợn, lấy ra, cho ngay vào týp, vặn chặt, và ghi ký hiệu mẫu. Sau đó, cho vào bảo quản lạnh 2 – 4oC trong thùng bảo ôn. - Mẫu chất chứa đếm số lượng vi khuẩn: mỗi con lợn lấy 3 – 6 mẫu ở các vị trí khác nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gram chất chứa ở trong ruột lợn ngay khi vừa mổ khám. - Mẫu bệnh phẩm gồm: máu tim, lách, gan, hạch ruột, chất chứa ruột non, ruột già của lợn tiêu chảy. - Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh 4oC, theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng, Viện thú Y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo. 3.4.1.2. Phân lập và giám định vi khuẩn Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y. Mẫu là phủ tạng, phân hoặc chất chứa trong ruột của lợn có triệu chứng tiêu chảy được ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey và thạch DHL, bồi dưỡng ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Trên các đĩa thạch sau 18 - 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, có thể quan sát thấy các dạng khuẩn lạc Căn cứ vào màu sắc, hình dạng khuẩn lạc trên các môi trường mà có thể xác định và phân loại vi khuẩn đường ruột. Những khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E. coli hoặc Salmonella được phiết kính kiểm tra hình thái và tiến hành giám định bằng các đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn. Nếu được xác định là thuần khiết thì dùng trong việc xác định serotype và giữ giống để tiến hành các thí nghiệm khác. Oxidase âm tính Thạch máu Thạch MacConkey Thạch máu yếm khí E. coli K. pneumoniae Enterobacter aerogenes Salmonella Edwardsiella Proteus Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW Thạch DHL Thạch BG 37oC/24-48h/hiếu khí 37oC/24-48h/hiếu khí Salmonella R/Y/H2S+ Mọc trên thạch MacConkey Trực khuẩn Gram âm KL đen trên DHL KL đỏ trên BG Enterobacteriaceae TSI Dung huyết Trực khuẩn Gram dương 37oC/24-48h/yếm khí C. perfringens Lên men đường Lên men đường Lên men đường Lên men đường Mẫu (phủ tạng, phân, chất chứa) Sơ đồ 3.1: Quy trình phân lập vi khuẩn đường ruột ( Bộ môn vi trùng-Viện Thú Y) 3.4.2. Xác định số lượng vi khuẩn E. coli và Salmonella trong 1 g phân của lợn tiêu chảy và lợn bình thường Mẫu là 1 g phân của lợn bị tiêu chảy và lợn bình thường, được pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1, 10-2, …, 10-8. Lấy 0,1 ml dung dịch ở các nồng độ đã pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn đều trên bề mặt thạch MacConkey, thạch DHL, bồi dưỡng ở 37 0C trong 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loãng dùng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc E. coli và Salmonella mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ. Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức: X = 10 x a x b Trong đó: X là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1 g phân hoặc chất chứa. a là số lượng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha loãng. b là hệ số pha loãng mẫu Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml 3.4.3. Xác định serotyp kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập được 3.4.3.1. Vi khuẩn E. coli Được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Vi khuẩn E. coli có nhiều serotyp O khác nhau, do vậy bước quan trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotyp O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm cần xác định. Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotyp gồm: + Các chủng E. coli cần định typ được giữ trên thạch máu. + Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá). * Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau: Nhỏ lên 2 đầu lam kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định trên môi trường thạch máu trộn đều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (Đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 1 phút. + Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tuỳ theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++. + Phản ứng là âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng. * Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng serotyp. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất. 3.4.3.2. Vi khuẩn Salmonella sp Được tiến hành định typ theo phương pháp Kauffmann (1972). * Xác định nhóm kháng nguyên O bằng huyết thanh đa giá: Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh với kháng nguyên sống trên phiến kính (Slide agglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. Phương pháp tiến hành như sau: Phiến kính sạch được chia làm 2 phần. Dùng ống hút Pasteur hoặc que cấy vô trùng, nhỏ mỗi bên phiến kính 1 giọt nước sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy một ít khuẩn lạc điển hình của chủng vi khuẩn Salmonella cần định typ đã mọc trên môi trường thạch máu, trộn đều với nước sinh lý đã nhỏ sẵn ở 2 bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên. Sau đó, tiến hành nhỏ 1 giọt huyết thanh đa giá nhóm O vào huyễn dịch kháng nguyên đã chuẩn bị ở bên thí nghiệm, còn bên đối chứng thì nhỏ 1 giọt nước sinh lý (đối chứng âm) và trộn đều. Sau 1 - 2 phút đọc kết quả. + Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết xuất hiện, nước xung quanh trong. + Đối chứng âm: hỗn dịch vẫn đục đều. + Nếu hỗn hợp cả 2 đầu phiến kính đều xuất hiện hiện tượng ngưng kết là ngưng kết giả do vi khuẩn tự ngưng kết, phải tiến hành làm lại. * Xác định serotyp kháng nguyên O bằng huyết thanh đơn giá Chọn những chủng Salmonella đã ngưng kết với huyết thanh đa giá nhóm O, tiến hành làm phản ứng ngưng kết như trên với tất cả các huyết thanh nhóm O đơn giá thuộc nhóm đã ngưng kết. Nếu chủng vi khuẩn ngưng kết với huyết thanh O đơn giá nào thì thuộc serotyp O đó. * Xác định kháng nguyên H với kháng huyết thanh H đa giá Cho vào ống tuyp chứa 2,5 ml canh trùng một lượng tương đương dung dịch Salin và formol. Để ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Sau đó, lấy 1 tuyp vô trùng mới, cho vào đó 0,25 ml hỗn dịch nói trên, cho thêm vào đó 0,25 ml kháng huyết thanh đã pha sẵn hoặc 1 giọt kháng huyết thanh H đa giá, đun cách thuỷ 50°C trong 1 giờ. + Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính khi kháng nguyên và kháng huyết thanh kết hợp với nhau, tạo nên kết tủa bông rõ ở đáy ống nghiệm. - Phản ứng âm tính khi không thấy kết tủa ở đáy ống nghiệm. * Xác định kháng huyết thanh H đơn giá Tương tự như xác định kháng nguyên O đơn giá nhưng phải tiến hành làm phản ứng với 2 pha: phase 1 (đặc hiệu) và phase 2 (không đặc hiệu). Sau đây là cấu trúc kháng nguyên của 3 chủng Salmonella thường gặp: S. typhimurium O 1,4, [4], 12 Hi; 1,2 S. enteritidis O 1, 9, 12 H [f], g,m,[p]; [1,7] S. choleraesuis O 6, 7 Hc, 1,5 3.4.4. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction). * Cách tiến hành - DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37oC/24h. - Hỗn hợp phản ứng PCR: gồm Primers: 1 ml mỗi loại Dung dịch đệm (5X): 5.0 ml Enzyme (Taq polymerase): 0.05 ml Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25 ml cho 1 phản ứng. - Chu trình của phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo sơ đồ sau: Loại yếu tố gây bệnh cần xác định Chu trình thứ nhất 30 chu trình tiếp theo Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) STa, STb, LT, F4 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 VT2e, F18 94/5 94/1 50/1 72/1 72/7 - Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh hơn. - Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1ml/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do. - Đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR. 3.4.5. Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được trên chuột bạch Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh, có thể thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau: - Bước 1: Các vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy chuyển vào môi trường BHI. Canh trùng được bồi dưỡng ở 370C/24 giờ. - Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khoẻ mạnh (trọng lượng từ 18 - 20 g/con), với liều tiêm là 0,2 ml/chuột vào phúc xoang. Lô đối chứng gồm 2 chuột được tiêm dung dịch BHI với liều tiêm và đường tiêm tương tự. - Bước 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết, số lượng chuột chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Mổ khám, phân lập vi khuẩn từ máu tim của chuột bị chết. 3.4.6. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập được Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS) (1999) [82]. * Phương pháp tiến hành như sau - Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton. - Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc, hoà vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton. - Bước 3: Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) lên mặt đĩa thạch. - Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370C/18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra. Bảng 3.2. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đường kính mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimethoprim-Sulphamethoxazole < 10 11 - 15 ≥16 Streptomycin < 11 12 - 14 ³ 15 Gentamicin < 12 13 - 17 ³ 18 Neomycin < 12 13 - 14 ³ 15 Cephalothin (KF 30) < 14 15 - 17 ³18 Amikacin (AK30) < 14 15 - 16 ³17 Apramycin (APR 15) < 10 11 - 14 ³15 Ceftiofur (EFT 30) < 17 18 - 20 ³21 Lincospectinomycin < 10 11 - 13 ³14 Enrofloxacin (Batril) < 16 17 - 19 ³20 Ampicillin < 11 12 - 14 ³ 15 Tetracyclin < 14 15 - 18 ³ 19 3.4.7. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn Từ kết quả xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn một số phác đồ để điều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau: - Số lợn tiêu chảy ở cùng một địa phương được phân ra làm 3 lô tương ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh. - Số lần và ngày điều trị bệnh được dùng đồng đều trong các phác đồ. - Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống... sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dùng thuốc. - Các phác đồ điều trị gồm: Phác đồ 1; phác đồ 2 và phác đồ 3. 3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp nghiên cứu tro._.