Phân lập vi khuẩn LACTIC có ngườn góc từ thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính PROBIOTIC

sử dụng probiotics như một thưc phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào những năm gần đây probiotics mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn. Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là  “for life”  nghĩa là “dành cho cuộc sống”. Probiotics là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật số lượng đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ” (FAO 2001). Các nhà khoa học mỗi ngày hiểu biết nhiều hơn về vai trò của vi khuẩn trong việc giữ cho sức khỏe con người và nhiều lợi ích về sức khỏe liên quan đến sử dụng đúng loại hình và mức độ của vi sinh sống. Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà nó thể hiện. Probiotics với phương cách là bổ sung những chủng vi sinh vật hữu dụng vào thành phần thức ăn (của động vật, loài thuỷ sản, gia cầm…) nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng và đảm bảo tính an toàn về sức khoẻ. Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotics đang chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác. Vì rằng tính hiệu quả của probiotics (tính trị bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh, tồn dư tác hại trong sinh vật chủ. Mà với sự khắt khe của con người thì điều này là số một. Hiệu quả tác dụng của probiotics không chỉ đơn thuần là làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cải thiện chức năng miễn dịch; ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảm cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại; tăng trọng nhanh… Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Với ý nghĩa đó tôi mong muốn làm phong phú thêm nguồn vi khuẩn probiotic để đóng góp thêm vào ngành công nghiệp probiotics những chủng vi khuẩn lactic mới từ những nguồn chứa vi khuẩn lactic an toàn như thưc phẩm và dược phẩm, có tính kháng khuẩn cao và những hoạt tính probiotic tốt nhất qua đồ án tốt nghiệp của tôi “Phân lập các vi khuẩn lactic có nguồn gốc thưc phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”. Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề. Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng cao của con nguời. Trên phương trình thăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về chất lượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ của chính bản thân họ. Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học học phát triển. “ Probiotics” là một phần của sự phát triển ấy. Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là  “for life”  nghĩa là “dành cho cuộc sống”.Probiotics là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật độ đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ (FAO 2001).” Cơ chế tác động của probiotics gần như giống với kháng sinh nhưng so với các nhược điểm tính hóa học và xâm hại ruột của thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotics là an toàn, tự nhiên, và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào. Các nhà khoa học mỗi ngày hiểu biết nhiều hơn về vai trò của vi khuẩn trong việc giữ cho sức khỏe con người và nhiều lợi ích về sức khỏe liên quan đến sử dụng đúng loại hình và mức độ của vi sinh sống. là những vi khuẩn sống trong đường tiêu hoá. Chúng được mệnh danh là “vi khuẩn tốt bụng” bởi vì giúp cơ thể bảo vệ chống lại một số các vi khuẩn có hại, nấm và siêu vi [72], [73]. Vi khuẩn dùng rộng rải trong sản xuất probiotics và được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất, là các loại Lactobacillus (như L. acidophilus, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. reuteri và L. casei); nhiều chủng Bifidobacterium và Saccharomyces boulardii là những vi nấm không gây bệnh. Như vậy vi khuẩn lactic là một trong những nguồn vi khuẩn probiotic quan trọng nhất, chiếm ưu thế cao. Vì có nhiều cơ chế tác dụng, nhiều probiotics khác nhau có những ứng dụng cho nhiều bệnh khác nhau. Vì vậy nguồn vi khuẩn probiotic càng phong phú sẽ góp thêm khả năng phòng và trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người. 1.2 Mục tiêu đề tài - Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm và dược phẩm . - Định danh các chủng vi khuẩn lactic đến cấp giống và hướng đến định danh cấp loài. - Kiểm tra tính kháng khuẩn của những chủng vi khuẩn lactic phân lập được nhằm xác định những chủng có tiềm năng probiotic.      1.3 Ứng dụng của đề tài Sử dụng những chủng vi khuẩn lactic đã phân lập có hoạt tính kháng khuẩn cao đưa vào sản xuất probiotics ở quy mô công nghiệp. Nhóm vi khuẩn lactic có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực chế biến thực phẩm. Các  chủng vi khuẩn lactic đã phân lập, ngoài mục đích phục vụ cho đề tài này. Chúng tôi có thể sử dụng chúng làm vi khuẩn khởi động cho các thưc phẩm lên men ở quy mô công nghiệp hoặc nuôi cấy để tách chiết bacteriocin đối với những chủng có khả năng sinh bacteriocin cao. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng Quan Về Probiotics 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không phải là mới. Trên hàng nghìn năm về trước, rất lâu trước khi có sự tìm ra thuốc kháng sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men. Các bằng chứng cho thấy quá trình sản xuất sữa lên men được ghi trong “Book of Genesis”. Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là vào khoảng 2500 năm trước công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt [16]. Các nhà khoa học đầu tiên, như Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng và thuốc của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày [26]. Khoa học giải thích cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic có trong sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi người đoạt giải Nobel, nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff. Trong bài thảo luận xuất sắc của ông " Việc kéo dài cuộc sống " (‘The prolongation of life’), Metchnikoff đã tuyên bố "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật hữu ích [38]. Người ta đề xuất rằng sự tiêu hóa một vài vi khuẩn được chọn lựa có thể có ích lợi ảnh hưởng đến vùng dạ dày ruột người. Metchnikoff tin vào lý do chính gây ra quá trình lão hóa của con người là do chất độc tạo thành bởi sự thối rữa và sự lên men trong ruột [42]. Và khi nhận thấy quá trình lên men acid lactic của sản phẩm sữa ngăn chặn sự thối rữa, ông ta đã tin rằng sự tiêu thụ sản phẩm sữa lên men như thế sẽ tương tự với việc ngăn chặn lại quá trình thối rữa ruột. Metchnikoff đưa ra giả thuyết rằng cuộc sống khoẻ mạnh và lâu dài của nông dân Bungari là do sự tiêu thụ các sản phẩm sữa lên men. Ông tin khi được tiêu thụ, các vi khuẩn lên men trong sản phẩm ảnh hưởng tốt đến hệ vi sinh vật của ruột kết, giảm hoạt động của vi khuẩn độc, bằng cách ấy dẫn đến cuộc sống thọ. Điều này khiến cho Metchnikoff đã khuyên trong sách của ông rằng uống đồ uống chẳng hạn như sữa chua chứa vi khuẩn lactic sẽ ngăn cản lão hóa. Một điều thú vị là một vài năm trước bài thảo luận cuả Metchnikoff [45], trong khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã nhận thấy sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, cùng một thời gian, Henry Tissier đã phân lập Bifidobacteria, trước ki được xếp vào thành viên của nhóm vi khuẩn lactic, từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ và nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột [29]. Tissier tin rằng sự thống trị của Bifidobacteria trong cơ thể trẻ sẽ chiếm chỗ của các vi khuẩn thối rữa liên quan đến sự xáo trộn dạ dày và sự tự thành lập của chúng để chiếm chỗ của các vi khuẩn có ích trong ruột [60]. Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào giả thuyết ảnh hưởng lớn của Bifidobacteria tới số trẻ em này [42]. Lý thuyết của ông được khẳng định bởi quan sát lâm sàng trẻ nuôi bằng sữa mẹ so với trẻ được nuôi bằng sữa hộp [47]. Mặc cho sự diễn ra Thế chiến I và cái chết của Metchnikoff làm giảm sự quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn của ông ấy, nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotics rõ ràng đã được thành lập. Nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ vừa qua. Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này cũng như về bảo đảm sự sống sót của các vi khuẩn này khi ở trong vùng dạ dày ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người[36]. Các kiến thức có được về probiotics thông qua những nghiên cứu này đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa. Từ các quan sát từ sớm của Eli Metchnikoff và các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotics với sản phẩm sữa lên men đã tiếp tục cho đến tận hiện đại. Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại. 2.1.2. Định nghĩa về Probiotics Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian. Lilly và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật [23]. Sau đó, Parker (1974) [44] đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó. Vì vậy, khái niệm “probiotics” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989) [21], ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” [24]. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một hệ sinh thái vi sinh vật ở người trưởng thành [59]; mặc dù phương pháp trị liệu kháng sinh, bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này, nhưng trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự hiệu chỉnh ( Tannock, 2005) [59]. Vi khuẩn probiotic được tiêu thụ với số lượng lớn cũng không đủ để trở thành chủng chiếm ưu thế trong ruột và có thể hiếm khi được phát hiện trong mẫu ruột hoặc phân sau một hay hai tuần sau sự tiêu hóa. Do đó, quan trọng là chúng ta phải hiểu trên thực tế ảnh hưởng của probiotic có thể được đem lại bởi các sự kết hợp và cơ cấu hoạt động ít gắn bó hơn và tạm thời hơn so với hệ vi sinh vật đường ruôt ở người. Vì vậy, định nghĩa về probiotics hiện tại là “vi sinh vật sống mà đi ngang qua vùng ruột và làm lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng”. ( Tannock et al., 2005 ) [59]. Và hiện nay theo định nghĩa của FAO/WHO [20]: “Probiotics là những vi thể sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi bổ sức khoẻ cho người tiếp nhận”. 2.1.3. Thành phần vi sinh của chế phẩm probiotics Vi khuẩn dùng rộng rải nhất và được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất, là các loài thuộc giống Lactobacillus như: L. acidophilus, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. reuteri và L. casei; tuy nhiên cũng có cả các loài không thuộc vi khuẩn lactic như: Bacillus cereus, B. clausii, B. pumilis, Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P. acidopropionici, P. thoenii, và một số nấm men không gây bệnh Saccharomyces boulardii , Saccharomyces cerevisiae. Đối tượng cạnh tranh của vi khuẩn probiotic Những vi khuẩn probiotic này có hoạt động chống lại những vi khuẩn có hại. Đó là sự ngăn chặn hoạt động của một số vi khuẩn sau: Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa ,Staphylococus auerus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio comma. 2.1.4. Cơ chế hoạt động của probiotics. 2.1.4.1. Tác động kháng khuẩn của probiotics. Probiotics làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh đồng thời tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt những vi khuẩn cạnh tranh. Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide và đăc biệt là bacteriocin. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic. Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase. Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong. Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng của tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết. Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng. Một vài bacteriocin của lớp I như nisin, nó có hai kiểu hoạt động, chúng có thể kết hợp với lipid II, như xe chuyên chở các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến thành tế bào, vì thế ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào, dẫn đến tế bào chết. Ngoài ra, chúng có thể sử dụng lipid II như cắt phân tử để bắt đầu quá trình gắn vào màng và hình thành kênh dẫn đến tế bào chết nhanh chống. Lantibiotic có hai chuỗi peptid như lacticin 3147, chúng có thể có hai hoạt động này do cả hai peptid tham gia. Nhưng ngược lại, mersacidin có duy nhất một hoạt động gắn vào lipid II nhưng không hình thành kênh. Thông thường những peptid lớp II có cấu trúc như một xoắn anpha lưỡng tính và được cài vào tế bào gốc của màng dẫn đến bị khử cực và chết. Bacteriocin của nhóm III như là lysostaphin có thể tác động trực tiếp vào thành tế bào của vi khuẩn gram dương dẫn đến chết và làm tan tế bào gốc [37]. 2.1.4.2.Tác động của probiotics trên biểu mô ruột - Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô. - Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn. - Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy. 2.1.4.3.Tác động miễn dịch của probiotics [48]. - Probiotics như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. - Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm. - Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng. [32], bệnh chàm [10]. 2.1.4.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột Probiotics điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Ở những phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn probiotic khác nhau. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này đúng cho tất cả các loại probiotics. Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột. Probiotics có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột. 2.1.5. Chức năng của probiotics Vì có nhiều cơ chế tác dụng, nhiều probiotics khác nhau có những ứng dụng cho nhiều bệnh khác nhau. - Tiêu hóa thức ăn và làm giảm bớt sự rối loạn tiêu hóa: Trong tất cả trường hợp tiêu chảy do nhiễm trùng, điều trị bằng probiotics có thể giảm thời gian bệnh cũng như mức độ trầm trọng của bệnh, dựa trên hồi cứu lớn của Cochrane và phân tích meta gồm cả nghiên cứu tiêu chảy do siêu vi và tiêu chảy ở người. - Đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B - Bảo vệ chống lại E. coli, Salmonella và sự lây nhiễm những vi khuẩn khác: Probiotics được xem vừa an toàn vừa công hiệu để phòng ngừa và điều trị tiêu chảy do nhiễm trùng. Cơ chế tác dụng khả dĩ có thể là kết hợp tranh chỗ trực tiếp với vi trùng gây bệnh trong ruột và điều hòa và tăng cường hệ miễn nhiễm. - Cải thiện dung nạp lactose và hoạt động của các enzyme khác: Hiện tượng không có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới do cơ thể không có enzyme lactase thủy phân lactose. Enzyme này được giải phóng khi vi khuẩn bị dung giải do tác dụng của acid mật [64]. Triệu chứng của bệnh thường gây phìn bụng, đầy hơi, tiêu chảy. Theo kết quả nghiên cứu của Rasstal et al 2000 vi khuẩn Latobacillus và Bifidobacteria làm tăng enzyme lactase trong ruột non tạo khả năng phân giải lactose. - Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh [25]: khoảng 20% người dùng thuốc kháng sinh, đặc biệt là Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bị mắc bệnh tiêu chảy. Nguyên nhân là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đường ruột làm mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột. Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca là những tác nhân gây bệnh chính, khi hệ vi sinh đường ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số lượng ít trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh. kết quả cho thấy chủng S. bolardii, S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả. - Tác dụng trong trị tiêu chảy cấp : nguyên nhân do rotavirus, chủ yếu ở trẻ em ở các nước đang phát triển. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Lb.rhamnosus GG, Bifidobacterium bifidum và Streptococcus thermophilus làm giảm lượng rotavirus trong hệ tiêu hóa [43]. Một nghiên cứu điều trị tiêu chảy cấp tính trẻ em ở châu Á, cho thấy rằng khi sử dụng Lb. rhamnosus GG có thể rút ngắn một nữa thời gian chữa trị. Tuy nhiên, ở châu Âu, kết quả nghiên cứu sử dụng L. rhamnosus đã bị bất hoạt bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L. rhamnosus sống điều này chứng tỏ L. rhamnosus sinh ra những hợp chất có khả năng ngăn ngừa sự hoạt động của các rotavirus - Ngăn ngừa chứng viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, kí sinh trùng nhưng nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và Helicobacter pylori gây viêm loét và ung thư dạ dày. Chúng xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng. Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn động trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nước nghiêm trọng gây nguy hiểm cho trẻ sơ sinh và trẻ dưới ba tuổi và trẻ suy dinh dưỡng [43], [31]. - Kích thích hệ miễn dịch: mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, tuy nhiên việc sử dụng probiotics có tác dụng làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự nhiên. Nhiều vi khuẩn Lactobacillus có khả năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bào tua (dendrit) làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma. [43] - Ngừa ung thư: Một số thành viên của vi khuẩn đường ruột có khả năng tiết ra các enzyme như glycosidase, azoreductase, nitroreductase and b-glucoronidase, chúng sẽ hoạt hóa các chất tiền ung thư thành các chất ung thư hoạt hóa. Những nghiên cứu trên người sử dụng L. acidophilus hoặc L. casei làm giảm đáng kể hoạt động của các enzyme trên [64], [11]. - Giảm cholesterol: Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật. khi lượng cholesterol trong máu cao sẽ gây ra một số bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, huyết áp tăng, bệnh lý ở hệ thống mạch vành như nhồi máu cơ tim, đột quỵ. Trong cơ thể, cholesterol có 2 dạng mà y học gọi là LDL-C có trọng lượng phân tử thấp (hay còn gọi là cholesterol có hại) và HDL-C  có trọng lượng phân tử cao (hay còn gọi là cholesterol có lợi). HDL vận chuyển  cholesterol đến các cơ quan, vì vậy nếu hàm lượng của HDL trong máu càng cao thì càng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành. Ngược lại LDL-C vận chuyển cholesterol từ cơ quan đến mạch máu cho nên nếu nồng độ LDL-C trong máu cao là có nguy cơ mắc bệnh cao. LDL-C luôn tạo ra các mảng xơ vữa trên thành các động mạch nói chung và động mạch vành tim nói riêng. Các mảng xơ vữa này làm cho lòng các động mạch vành bị chít hẹp hoặc có thể bít tắc, từ đó gây nên tình trạng thiếu máu đến nuôi dưỡng tế bào cơ tim, gây ra các cơn đau thắt ngực và nhồi máu cơ tim. Nghiên cứu của Gilliland SE, Walker DK(1990) [22] trong điều kiện thí nghiệm vi khuẩn có thể làm giảm lượng cholesterol trong môi trường nuôi cấy. Một nghiên cứu của Lin et al về khả năng làm giảm cholesterol trong máu của L. bulgaricus và L. acidophilus [22], [49]. 2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic [35], [70] Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). 2.2.1 Khái niệm. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo acid lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau: có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoạt xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoạt xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có dạnh hình que. Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Sơ đồ 2.1:[27] Cây phân loại vi khuẩn lactic, gồm một số vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, gram dương. Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau. - Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an toàn với con người. 2.2.2. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và acid. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua. Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae, thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que. Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic. Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không tạo bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2÷3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8÷4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5÷6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25÷350C, ưa nhiệt là 40÷450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 60÷800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt,…). 2.2.3. Đặc điểm hình thái Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. 2.2.3.1 Giống Lactobacillus: * Phân loại khoa học Bảng 2.1:Phân loại khoa học giống Lactobacillus [8]. Giới Vi khuẩn Nghành Firmicutes Lớp: Bacilli Bacilli Loại: Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Hình 2.1: Lactobacillus (L. acidophilus) [61] * Đặc tính: Tế bào có dạng hình que. Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài. Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ. là giống được sử dụng rộng rãi, là loài có khả năng chịu đựng pH acid thấp. Kích thước tế bào 0,5-1,2 x 1,0-10,0μm. Ở phase tăng trưởng, tế bào thường tạo chuỗi. Không di động, không tạo bào tử, tế bào non gram dương và gram âm khi tế bào già. • Trên môi trường agar, khuẩn lạc lồi, mép trơn, đục có đường kính 2-5mm. Hiếm khi tạo sắc tố nhưng khi tạo sắc tố thì thường là màu vàng, màu cam hay màu gỉ sắt và màu đỏ gạch. • Kỵ khí tùy ý, một vài chủng vi hiếu khí hay kỵ khí nghiêm ngặt. Phát triển mạnh trong môi trường agar, kỵ khí có 5-10% O2. Các thử nghiệm catalase, cytochrome và benzidine âm tính. • Hơn 50% sản phẩm cuổi cùng của chuyển hóa carbohydrate là lactate, phần còn lại là acetate, formate, succinate, CO2 hoặc ethanol. Không tạo acid dễ bay hơi có số nguyên tử carbon hơn hai. Khả năng khử nitrate kém và tạo pH dưới 6,0. Không hóa lỏng gelatin. Không phân hủy casein nhưng vài chủng có thể tạo một lượng nhỏ đạm hòa tan. Không tạo indole và H2S. • Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp: amino acid, peptide, các dẫn xuất acid nucleic, vitamin, muối, acid béo, ester và một số nguồn carbohydrate và đặc trưng từng loài. Nhiệt độ phát triển 5-53oC, nhiệt độ tối ưu 30-40oC, có thể phát triển tốt ở pH khoảng 5 và pH tối ưu là 5,5-5,8. Tìm thấy trong các sản phẩm sữa, hạt kefir, sản phẩm thịt, nước, nước thải, bia, rượu vang, nước ép trái cây, hoa quả, dưa chua, miệng, đường tiêu hóa người và nhiều loài động vật. Ít khi gây bệnh. Hàm lượng G+C của DNA là 34,7 ± 1,4 đến 53,4 ± 0,5 mol%. * Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic đồng hình: - Lactobacillus acidophilus: trực khuẩn dài. Đây là loại ưa nhiệt, nhiệt độ tối thiểu cho sinh trưởng là 200C và tối thích là 37÷400C. Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ. - Lactobacillus bulgaricus: trực khuẩn tròn (đôi khi dạng hạt), thường kết thành chuỗi rất dài được tìm ra do Metchnikoff ở sữa chua Bungari. Có khả năng lên men được đường glucose, không lên men được đường saccharose. Đây là loại ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển là 45÷500C, nhiệt độ tối thiểu là 15÷200C, có khả năng tạo acid rất cao (từ 2,5÷3,7% acid lactic). - Lactobacillus plantarum: trực khuẩn nhỏ, thường kết thành đôi hoặc chuỗi. Là loại ưu ấm, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 300C, tích tụ được khoảng 1,3% acid. Loại này tìm thấy chủ yếu trong rau muối chua và ủ chua thức ăn xanh dùng cho chăn nuôi. Flening (1969) đa kết luận rằng sự đóng góp quan trọng nhất của vi khuẩn này là việc tạo mùi vị cho sản phẩm lên men và sinh ra hàm lượng acid để bảo quản, ngăn cản những vi sinh vật không mong muốn có thể sinh ra mùi xấu cho sản phẩm. * Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình: - Lactobacillus brevis: tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột, nên nó còn được gọi là "trực khuẩn bắp cải". Trong lên men, ngoài tạo thành acid lactic (1,2%) nó còn tạo thành acid acetic, rượu ethylic (2,4%) và CO2. Đồng thời tạo hương làm sản phẩm có hương vị dễ chịu. - Lactobacillus pentoaceticus: là trực khuẩn, không sinh bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển ._.là 30÷350C. Vi khuẩn này lên men một số đường như: glucose, fructose, galactose, mannose... Lactobacterium lycopersici: Là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi tạo thành từng đôi một. khi lên men tạo thành rượu, acid latic, acid acetic và CO2, chúng có khả năng tạo bào tử. Tế bào sinh dưỡng thường chết ở 77÷800C. Lactobacterium – coli – aerogenes: là giống đại diện của lên men lactic dị hình. Có dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp cho phát trển là 35÷380C. Thường gặp loại này trong nước, trên bề mặt rau quả, trong ruột người và động vật, trong sữa chua,… Sản phẩm của vi khuẩn này là acid lactic, acid acetic, acid succinic, rượu ethylic, CO2, H2O và indol. 2.2.3.2. Giống Streptococcus * Phân loại: Bảng 2.2: Phân loại khoa học Giống Streptococcus [51] Giới: Vi khuẩn Nghành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Streptococcaceae Giống: StreptococcusRosenbach, 1884 Hình 2.2: Streptococcus [71] Gồm các loài: S. agalactiae, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. equi, S. iniae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S. peroris, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. salivarius ssp. thermophilus, S. sanguinis… * Đặc tính: có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0.5-1µm. Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn. Là loại vi khuẩn không nha bào, có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, lactose, maltose,… * Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: + Steptococcus cremoris: thường tạo thành một chuỗi dài. Tế bào có kích thước 0,6÷0,7µm, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn. + Streptococcus lactis. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 25÷350C, nhiệt độ tối đa là 35÷380C. Lên men glucose và galactose. + Steptococcus lactis: cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết song đôi thành chuỗi ngắn. Đây là loại ưu ấm, nhiệt độ tối ưu 30÷350C, Nhiệt độ tối thiểu cho sự phát triển là 100C và tối đa là 40÷500C. Trong môi trường chúng có khả năng tích tụ được khoảng 0,8÷1% acid. Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin, là một hợp chất có tính kháng sinh được dùng trong bảo quản thực phẩm. + Streptococcus thermophillus: hình cầu kết thành chuỗi dài, phát triển tốt nhất ở 40÷450C, trong quá trình lên men chúng có khả năng tích tụ được khoảng 1% acid. * Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình: Streptobacterium brassicae fermentati: thường thấy chúng có trong dịch lên men chua rau cải. Thường tồn tại tế bào đơn hoặc ghép thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn và thường tạo thành chuỗi dài hình sợi. Đuôi tế bào thường uốn cong lại. Khi lên men rau cải chua tạo thành acid lactic, acid acetic và rượu (đến 2,4%) và CO2. Chúng lên men saccharose tốt hơn lactose. 2.2.3.3. Giống Leuconostoc * Phân loại: Bảng 2.3: Phân loại khoa học giống Leuconostoc [62] Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Leuconostocaceae Giống: Leuconostocvan Tieghem 1878 Hình 2.3: Leuconostoc [68] Gồm các loài như: L. carnosum, L. citreum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. fructosum, L. garlicum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae, L. kimchii, L. lactis… * Đặc tính: có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm. trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3 µm. Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung. Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi khuẩn lactic đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến rau muối chua. 2.2.3.4. Giống Pediococcus * Phân loại: Bảng 2.4: Phân loại khoa học giống Pediococcus [17]. Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: PediococcusClaussen 1903 Hình 2.4: Pediococcus sp [67] Gồm các loài như: P. acidilactici, P. cellicola, P. claussenii, P. damnosus, P. ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. stilesii * Đặc tính: là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn. Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu. Gram dương, thường dính lại với nhau thành cặp đôi hoặc bốn. Quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình.Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí. Chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường. Vì chúng không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể. Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu acid và chịu NaCl. 2.2.4. Đặc điểm sinh lý- sinh hóa 2.2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ… 2.2.4.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ. 2.2.4.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. 2.2.4.1.3. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… 2.2.4.1.4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid xitric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. 2.2.4.1.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. 2.2.4.1.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy. + Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP, + Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 2.2.4.2. Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. 2.2.4.2.1 Lên men lactic đồng hình Lên mem lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl, …………. Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men: C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá theo chu trình Embden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất cả các loai enzym aldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat dược chuyển đến pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pynivic không phân huỷ nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic theo sơ đồ chuyển hoá dưới đây: Sơ đồ 2.2: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành acid lactic Glucose - 6 – photphat Glucose Fructose – 6 – photphat Fructose –1, 6 – diphotphat Photpho dioxyaceton Photphoglyceraldehyde Acid – 1,3 – diphotphoglyceric Acid pyruvic Acid lactic Cũng có một số tác giả cho rằng lên men lactic đồng hình tiến hành theo hai giai đoạn : Giai đoạn 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ sự oxi hoá photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide (PN) để tạo acid photphoglyceriaic. PCH2-CHOH + H2O + PN P.CH2CHOG-COOH + PNH2 Giai đoạn 2: do chất nhận hydro là PN-H2 tăng mà thế oxy hoá khử của môi trường giảm xuống dẫn đến sự nhường hydro từ PN-H2 cho acid photphoglycerinic để khử nó thành acid lactic. CH2OP-CHOH-COOH + H2O ( PN-H2 ) CH3CHOHCOOH + H3PO4 + PN +H2O Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate- dehydrogenase và sự có mặt của lactataxemase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D(-), L(+) hoặc DL. 2.2.4.2.2 Lên men lactic dị hình Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, etanol, acid succinic, CO2,……… Phương trình chung biển diễn quá trình lên men: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 … Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các laọi khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình. 2.2.5. Sản phẩm của quá trình lên men ở vi khuẩn lactic 2.2.5.1 Các enzyme tiêu hóa Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một sốt lượng lớn các enzyme ngoại bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lactic dehydrogenase. • Proteolysis (khả năng phân giải protein): Vi sinh vật tổng hợp protease giúp phân hủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa được.Hoạt tính này của Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ có thể tiêu thụ dễ dàng. • Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp thành những hợp chất đơn giản. Điều này có thể hữu ích trong việc tạo ra các khẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng bệnh. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng Lactobacilli có thể phân hủy cholesterol. • Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme b-galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase có thể sản sinh acid lactic từ lactose. Acid lactic có những lợi ích như sau: - Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến dưỡng enzyme. - Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đông tụ sữa. - Tăng cường việc sử dụng canxi, phospho, sắt. - Kích thích sự bài tiết. - Kích thích sự tiêu hóa trong dạ dày. - Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hô hấp. 2.2.5.2 Các vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng • Vitamin: Vi sinh vật dùng làm probiotics đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K. • Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn • Bacteriocin: Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm hoặc gram dương. Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau: - Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome. - Tế bào chủ miễn dịch với chúng. - Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất. . Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB (lactic acid bacteria) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm và vì tính an toàn của chúng. - Bacteriocin được sản xuất bởi LAB được chia thành 4 lớp: Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những amino acid hiếm và một số amino acid khử nước. Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa. Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa Lanthionine và bền nhiệt, phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của bacteriocin. Bacteriocin lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus. Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid và carbohydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch. 2.2.5.3 Các chất khác có khả năng kháng bệnh Vi khuẩn sinh acid lactic cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác như: hydrogen peroxide, cacbon dioxide và diacetyl. Quá trình biến dưỡng của vi khuẩn sinh acid lactic có ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các vi sinh vật có hại và các dạng hoạt động khác của chúng được tổng kết ở bảng 2.5. Bảng 2.5: Sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động đối kháng Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng CO2 Ức chế quá trình decarboxilation, giảm tính thấm của màng Diacetyl Tác động lên protein gắn arginine Hydrogen peroxide Lactoperoxide Oxy hóa các protein cơ bản Acid lactic Acid lactic không bị phân hủy mà thấm vào màng làm giảm pH nội bào. Nó cũng liên quan đến quá trình biến dưỡng như: oxidative phosphorylation Bacteriocin Tác động lên màng, tổng hợp enzyme và tổng hợp protein. 2.2.6 Đối tượng cạnh tranh của vi khuẩn probiotics Những vi khuẩn probiotic này có hoạt động ức chế tăng trưởng những vi khuẩn gây bệnh nguồn gốc thực phẩm như: 2.2.6.1 Escherichia coli Escherichia coli (E. coli 0157:H7) là vi khuẩn gram âm, hình que, kỵ khí không bắt buộc, không sinh bào tử, sống trông hệ đường ruột con người và động vật. Dưới một điều kiện nào đó nó có thể trở thành tác nhân gây bệnh và gây nhiễm độc thức ăn, tiêu chảy xuất huyết và suy thận. E coli O157:H7 sinh ra độc tố làm hại đến mạng ruột. Những loại này bắt đầu từ đường ruột của gia súc và lan nhiễm sản phẩm thịt bò và sữa. Hình 2.5: Escherichia coli E. coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên và đặt biệt trong đường tiêu hóa của người và động vật. Chúng lên men đường lactose và glucose, cho phản ứng dương tính với indol và methyl red song có phản ứng âm tính với Voges Proskauer và citrate. Cách hữu hiệu nhất để định danh loài là xác định kiểu huyết thanh, dùng kháng thể tương hợp với kháng nguyên O, H và K của các chủng E. coli khác nhau. Phần lớn E. coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh. Nhóm E. coli gây bệnh đường ruột EPEC (enteropathogenic E. coli diarrheagenic E. coli) thuộc nhóm huyết thanh đã được xác định về mặt dịch tễ là những tác nhân gây bệnh tuy vẫn chưa chứng minh được cơ chế gây bệnh của chúng thuộc dạng nội độc tố không chịu nhiệt hay nội độc tố chịu nhiệt hay thuộc nhóm xâm nhiễm dạng Shigella. Một nhóm E. coli gây bệnh khác là EIEC (enteroinvasive E. coli) rất giống với Shigella bởi khả năng gây bệnh lỵ do xâm nhiễm và chứng tiêu chảy ở người. Nhóm E. coli gây bệnh cuối cùng là ETEC (enterotoxigenic E. coli) có khả năng sinh một hoặc cả hai loại độc tố ruột từng được biết rõ là loại không chịu nhiệt và loại bền nhiệt không có tính kháng nguyên. 2.2.6.2 Salmonella Salmonella enteritidis được phân lập từ năm 1884 và hiện vẫn là một tác nhân gây bệnh do thực phẩm quan trọng. Đây là loại trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử , di động bằng chu mao. Có ba dạng bệnh thực sự do Salmonella. Sốt thương hàn do Salmonella typhy, nhiễm trùng máu do Salmonella cholera-suis, rối loạn tiêu hóa do Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis. Các triệu chứng bệnh do Salmonella như nôn mửa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy, sốt xuất hiện 12-24 giờ sau khi ăn phải thức ăn chứa 1-10 triệu Salmonella trong 1 g. Bệnh kéo dài 2-3 ngày. Phần lớn bệnh nhân hồi phục song cũng có những trường hợp tử vong, đặt biệt ở người già, trẻ sơ sinh, người suy yếu hệ miễn dịch. Hình 2.6: Salmonella enteritidis 2.2.6.3 Listeria monocytogenes. Đây là vi khuẩn gram dương, không bào tử, yếm khí và có thể phát triển trong tế bào (intracellulaire facultatif). Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ có L. monocytogenes mới là tác nhân thật sự của những ca nhiễm khuẩn từ thực phẩm (infection alimentaire). Có tất cả 11 chủng huyết thanh trong đó 90% trường hợp bệnh Listeriosis ở người đều do các serotype 1a, 1b và 4b gây nên. Trong ba nhóm vừa kể, thì 4b là serotype độc hại nhất.Vi khuẩn L. monocytogenes sống rất dai và có thể phát triển ở nhiệt độ từ 3°C đến 45°C. Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được thấy trong đất cát, trong nước, trong phân thú vật và cả trong phân người. Rau cải, salade, có thể bị nhiễm từ nước bẩn và từ phân gia súc. Thú vật có thể chứa vi khuẩn nhưng không bị bệnh. Chúng có thể lây nhiễm vào tất cả thực phẩm như thịt, sữa, thịt nguội và đồ biển. Sữa tươi không được hấp khử trùng (raw milk, unpasteurized milk) có thể chứa vi khuẩn L. monocytogenes. Khác với đa số vi khuẩn khác..., L. monocytogenes có thể tăng trưởng chậm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C. Vi khuẩn có thể nhiễm vào chúng ta qua các vật dụng nhà bếp như dao, thớt bẩn hoặc từ tay đã bị nhiễm trùng. Hình 2.7: Listeria monocytogenes 2.2.6.4 Staphylococcus aureus Là các cầu khuẩn gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Có thể nói tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn nổi tiếng nhất: được các nhà vi khuẩn học nổi tiếng quan tâm nghiên cứu, tỉ lệ gây bệnh rất cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng kháng sinh rất mạnh. Các nhà vi khuẩn học lừng danh như Robert Koch (1878) và Louis Pasteur (1880) đều rất quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học. Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phẫu Thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng. Hình 2.8: Staphylococcus aureus Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có men coagulase và tụ cầu không có men coagulase. Vi khuẩn này có trên cơ thể người (như: da, vết thương nhiễm trùng, niêm mạc họng, mũi), vi khuẩn từ đây nhiễm vào thực phẩm. Vi khuẩn này thường phát triển nhanh và tiết ra độc tố trên thực phẩm, nên gây ngộ độc. Những loại thức ăn dễ bị nhiễm Staphylococcus aureus thường là thực phẩm giàu protein, có độ ẩm cao như: thịt chế biến sẵn, cá, gia cầm, sản phẩm từ sữa, các thức ăn ngọt. Kết quả điều tra mới đây của Bộ NN-PTNT cho thấy, có rất nhiều mẫu thịt bị nhiễm khuẩn vượt quá mức cho phép: Các loại vi khuẩn tìm thấy trong các mẫu thịt được đưa đi xét nghiệm là Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Clostridium perfringens (vi khuẩn yếm khí), và Salmonella (vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn).[15] 2.2.6.5 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập đầu tiên trên cá nheo(Hawke,1979). Loài vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh trên cá nheo và hiện nay là cá tra ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam. Khi cá bị nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao từ 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi, đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên người dân thường gọi là bệnh trắng gan [1]. Ngoài ra probiotics con có tính đối kháng với một số loài khác như: Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae , Vibrio comma. 2.3. Tổng Quan Về Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi khuẩn Lactic 2.3.1 Nhu cầu tìm kíếm các nguồn probiotics mới. Trong những năm gần đây, khả năng kháng cự lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong sự điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế sự tiếp tục tìm ra những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc. Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh. Trong số đó, sự sản xuất probiotics từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự chú ý do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm. 2.3.2. Các tiêu chuẩn để chọn các chủng probiotics Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau: không gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch mât) Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hoá vật chủ Sản xuất các chất chống lại các mầm bệnh: bacteriocin, H2O2…. Duy trì tốt khả năng sống trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá vật chủ Dễ nuôi cấy Kích thích hoạt động của gen kháng và sinh ra chất chống ung thư. Tăng cường khả năng hấp thụ lactose Giảm huyết áp của những người bị chứng cao huyết áp. Ngăn ngừa và giảm mức độ gây bệnh tiêu chảy . 2.3.3 Các phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotics mới. Hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm probiotics dùng trong dược phẩm, chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm đều giống nhau về thành phần vi sinh, chỉ khác nhau về nhà sản xuất mà các chủng vi sinh mang đặc tính probiotic lại rất đa dạng, mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau vì vậy việc phân lập để tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn probiotics, làm tăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật. Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất probiotics là một quy trình lựa chon cẩn thận. Phân lập các chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên biệt đặc trưng, tìm kíếm và lựa chọn các khuẩn lạc mang đặc điểm hình thái như những giống mà mình đang tìm kiếm. Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng vi khuẩn lactic thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vì chúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi. Vì vậy vi khuẩn lactic thường được chọn để trở thành probiotics. Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) [18] từ nhiều nguồn khác nhau: - Từ các sản phẩn thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi…. - Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo… - Từ sữa mẹ Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì viêc quan trọng kế tiếp là phải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào. Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng. Công việc tuyển chon ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt của probiotics, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhất theo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp. Khảo sát tính an toàn của chủng trước khi mang đi sử dụng. Sự an toàn cho con người, cho động vật và cho môi trường. 2.3.4. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 2.3.4.1 Các phương pháp định danh cổ điển đối với vi sinh vật [2]. Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v.. và dựa theo khoá phân loại của Bergey để xác định chủng vi khuẩn vừa phân lập có phải thuộc họ mình cần tìm hay không. * Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái: - Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến). - Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm. - Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm Carbolic Fuchsin. - Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo, Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet) - Nhuộm thành tế bào - Nhuộm hạt dị nhiễm - Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid) - Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis) - Nhuộm vi khuẩn kháng acid * Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý: - Hình thái khuẩn lạc - Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt - Nhu cầu oxygen. * Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng  V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza. ... Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như: - API20E KIT Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. - Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. - Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. - Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. 2.3.4.2. Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân tử [3].          Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống ._.y vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. * Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động 3.2.2.3.6 Thử nghiệm khả năng sinh acid. * Mục đích: kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. * Tiến hành: dùng phương pháp sử dụng thuốc thử Uffelmann : Nhỏ vài giọt dung dịch thuốc thử Uffelmann có màu tím lên khuẩn lạc trên đĩa thạch. - Nếu có acid chloryhric, sẽ  làm mất màu dung dịch. - Nếu có acid lactic, dung dịch sẽ chuyển ra màu vàng. 3.2.2.3.7 Thử nghiệm oxidase. * Mục tiêu: phát hiện nhóm vi khuẩn có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C) * Cơ sở sinh hoá: Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C oxy hoá + H2O Cytochrom C oxy hoá + TMPD khử TMPD oxy hoá (màu xanh) * Tiến hành:  - Đặt một miếng giấy lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt. - Dùng que cấy có đầu que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh (không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt, niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24 giờ) bôi lên miếng giấy lọc. * kết quả: Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm tính. Chú ý: nếu dung dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên âm tính giả. 3.2.2.3.8 Thử nghiệm khả năng lên men đường * Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: mantose, glocose, mannitol, lactose. * Tiến hành: - Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lựơc thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. - Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml. - Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 0C. Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường. - Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày * Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục. 3.2.2.3.9 Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục [4]. Mục đích: Những vi sinh vật mang đặc tính probiotic phải là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này, chúng tôi kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính probiotic. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn vi khuẩn E. coli là vi sinh vật chỉ thị. Nguyên tắc: khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trưởng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sóng 600nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát Ống đối chứng là sự phát triển bình thường của VK chỉ chị E. coli. Ống kiểm tra là dịch nuôi cấy vi khuẩn đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng. * Tiến hành: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ tiến hành thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục Ống đối chứng Ống kiểm tra Ly tâm dịch LAB (nuôi cấy kỵ khí 24h, 370C) Lấy 30 µl Dịch nuôi cấy VK chỉ thị nuôi cấy tăng sinh qua 24h Lấy 30 µl Cho vào 240 µl MT BHI Ủ hiếu khí 24h, 370C Ủ hiếu khí 24h, 370C Đo độ đục Đo độ đục So sánh độ đục, kết luận Cho vào 240 µl MT BHI+30 µl MRS Broth % OD = OD đối chứng * 100%)/ OD kiểm tra Như vậy với %OD càng nhỏ thì khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó càng cao. D = 100% - %OD thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D càng lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao. Chú ý: kết quảthu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê 95%. Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kết quả phân lập: Tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau. Hầu hết các nguồn phân lập đều là thực phẩm lên men. Ví dụ, Sharpe et al (1981) cho thấy L. casei, L. plantarum, L. brevis, L. coryniformis, L. curvatus, L. buchneri, L. lactis, và L. fermentum được tìm thấy trong sữa chua nên tôi đã tiến hành lên men tự nhiên một số mẫu sữa, và một số chủng vi khuẩn lactic tồn tại trong các sản phẩm lên men truyền thống như nem chua và rau củ muối chua nhằm thu thập các chủng lactic có nguồn gốc hoang dại với mong muốn chúng có hoạt lực cao hơn so với các chủng đã trãi qua các quá trình công nghệ. Tuy nhiên tôi cũng tiến hành trên các sản phẩm thuần túy với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của các nhà sản xuất có uy tín như các sản phẩm sữa chua và dược phẩm chứa vi khuẩn sống có bán trên thị trường. Môi trường sử dụng để phân lập là MRS (DeMan et al, 1960)[50] agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960). [50] Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí sẽ loại bỏ được những vi khuẩn kỵ khí và ngược lại khi nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ bớt được vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí nên để chọn lọc chúng tôi đã nuôi ủ trong điều kiện kỵ khí bằng cách dáng kín các đĩa pettri bằng parapin. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) [57] ( hình 4.1). sẽ được chọn. Từ đó tôi đã chọn lựa được 40 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic. Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 4.1. Hình thái khuẩn lạc quan sát dưới kính hiển vi được thể hiện ở bảng 4.2. Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân phập Sữa chua Sữa để chua tự nhiên 1 S1a, S1b Sữa để chua tự nhiên 2 S2 Sữa để chua tự nhiên 3 S3 Sữa để chua tự nhiên 4 S4 Kefir lên men từ PTN 1 S5 Kefir lên men từ PTN 2 S6 Sữa chua Vinamilk S7 Sữa chua Yoyo S8 Sữa chua Well S9 Sữa chua Susu S10 Sữa chua uống Probi S11 Nem Nem Thủ Đức N1 Nem Sài Gòn N2 Nem Ninh Hòa N3 Nem Gia Lai N4 Nem chua Văn Thánh N5 Dưa muối chua Dưa muối 1 D1 Dưa muối 2 D2 Dưa muối 3 D3 Cà muối chua Cà muối 1 C1 Cà muối 2 C2 Chế phẩm dược Biolactyl T1a, T1b, T1c Biosubtyl DL T2a, T2b, T2c L-Bio-M T3a, T3b, T3c Lactomin plus T4a, T4b, T4c Antibio Granules T5 L-Bio T6 Probio T7a, T7b Ybio T8a, T8b Thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2. Kết quả dương tính ở 5 chủng được nhận biết bằng sự tạo bong bóng (O2) cho biết 5 chủng này có hệ thống enzyme catalase, theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính vì vậy loại bỏ khả năng chúng là vi khuẩn lactic. Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập có catalase dương như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và Micrococcus, Corynebacterium spp…các vi khuẩn gây nhiễm trùng. * Kết quả: - 35 chủng âm tính. - 5 chủng dương tính. Các chủng cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính được thể hiện ở bảng 4.3. Hình 4.2: thử nghiệm catalase âm tính . Hình 4.3: thử nghiện catalase dương tính. 4.3. Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufelmann Điều kiện tiên quyết của một vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh acid lactic vì vậy trước khi tiến hành các kiểm tra sinh lý, sinh hóa phức tạp ta thử nghiệm định tính xem vi khuẩn đó có sinh acid lactic hay không bằng thuốc thử ufelmann. Từ 35 chủng đã qua chọn lọc bằng thử nghiệm catalase, cho thuốc thử trực tiếp lên khuẩn lạc thấy có 33 chủng đổi màu thuốc thử từ màu tím chuyển thành màu vàng nhạt, đây là những chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic. Còn lại là những chủng không có khả năng sinh acid lactic. - Kết quả: 33 chủng có khả năng sinh acid lactic và 2 chủng không sinh acid lactic. Hình 4.4:Vi khuẩn sinh acid Hình 4.5: Vi khuẩn không sinh acid 4.4. Kết quả nhuộm Gram. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh chúng ta tiến hành nhuộm gram. Khi tiến hành nhuộm gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương (hình 4.6) và vi khuẩn E. coli gram âm (hình 4.7) có ở phòng thí nghiệm làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm gram các chủng đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận. Từ đó tôi xác định được 31 chủng vi khuẩn gram dương, 2 chủng vi khuẩn gram âm. Ở bước nhuộm gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh gram âm ví dụ như vi khuẩn E. coli tác hại gây bệnh như đã nêu ở mục 2.2.6.1 Từ việc nhuộm gram, ngoài việc xác định vi khuẩn là gram âm hay gram dương ta còn có thể quan sát hình thái của vi khuẩn và mô tả hình dạng của 31 chủng gram dương thì có : 24 chủng hình que. 6 chủng hình cầu. 1 chủng hình ovan Kết quả mô tả hình thái vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.2. Hình 4.6: Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu gram dương. Hình 4.7: Vi khuẩn E. coli bắt màu gram âm Hình 4.8: vi khuẩn Gram dương hình que. Hình 4.9: Vi khuẩn Gram dương hình cầu. Hình 4.10: Vi khuẩn Gram dương hình ovan Bảng 4.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x100 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x1000 Kí hiệu chủng phân lập Quan sát khuẩn lạc Mô tả khuẩn lạc Quan sát nhuộm gram Mô tả hình thái vi khuẩn S1a Khuẩn lạc tròn nhỏ, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, rất ngắn, nhỏ. S1b Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình cầu. S2 Khuẩn lạc tròn, to, mép gợn sóng, hơi lồi, trắng đục. Vi khuẩn hình que, ngắn, có thắc ở giữa. S3 Khuẩn lạc tròn, mép gợn sóng, có rảnh, mặt bằng phẳng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que ngắn, có thắc ở giữa. S4 Khuẩn lạc mép răng cưa, to, lồi lên ở giữa, có những nếp cuộn lên trên bề mặt, màu tắng đục. Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn, có thắt ở giữa. S5 Khuẩn lạc tròn, nhỏ, mép trơn, lồi, nhẵng bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que ngắn. S6 Khuẩn lạc tròn, vứa, mép trơn, lồi, nhẵng bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que nhỏ, rất ngắn, có thắc ở giữa. N1 Khuẩn lạc vừa, không tròn đều, mép hơi gợn sóng, mặt gồ gề, trắng đục. Vi khuẩn hình que, ngắn. N3 Khuẩn lạc to, mép răng cưa không đều, mặt bằng, gợn sóng, có chia rảnh, màu nâu. Vi khuẩn hình que, có thắc. N4 Khuẩn lạc nhỏ, lồi, mép gợn sóng không đều, bề mặt có những nếp cuộn, màu nâu. Vi khuẩn hình que dài, thon nhỏ. N5 Khuẩn lạc tròn đều, to, mép nhẵng, lồi, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, có thắc, ngắn. D2 Khuẩn lạc tròn, to, lồi ở giữa, mặt gợn sóng, mép không trơn, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que ngắn. D3 Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵng bóng, mép trơn, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, có thắc. C1 Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, phẳng, mặt gồ gề, có rãnh. Màu hơi xẩm ở giữa Vi khuẩn hình que nhỏ. T1a Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, to, lồi lên ở giữa, có những nếp cuộn lên trên bề mặt, màu xẩm. Vi khuẩn hình que dài. T1b Khuẩn lạc mép gợn sóng không đều, lồi lên ở giữa, mặt gồ gề, màu nâu. Vi khuẩn hình ovan. T1c Khuẩn lạc tròn nhỏ, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, mảnh, dài. T2c Khuẩn lạc tròn nhỏ, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que, không thắc. T3c Khuẩn lạc mép gợn sóng, , có những nếp xoáy, ở giữa nhọn lên, màu hơi xẩm Vi khuẩn hình que, có thắc. T4c Khuẩn lạc to, không có quy tắc, mặt gồ gề gợn sóng, hơi lồi ở giữa, màu nâu Vi khuẩn hình cầu. T7b Khuẩn lạc to, không đều, bề mặt gồ gề, chia rảnh, màu nâu. Vi khuẩn hình que dài, có thắc. T8b Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn, lồi, bóng, màu trắng đục. Vi khuẩn hình que nhỏ, có thắc. 4.5. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lang sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy. Khi ta ủ vi khuẩn qua 2 ngày thấy phần thạch bị đẩy trồi lên vì vậy trong thử nghiệm này, ngoài việc xác định vi khuẩn có khả năng di động hay không ta còn có thể xác định được một số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh. Thử nghiệm di động cong giúp tôi loại bỏ được một số vi khuẩn gây bệnh ví dụ như Edwardsiella ictaluri gây bệnh trắng gan ở cá tra như đã nêu ở mục 2.2.6.5 Kết quả thử nghiệm tính di động 26 chủng đã qua thử nghiệm catalase âm tính thu được kết quả. * Kết quả: 22 chủng không có khả năng di động. 4 chủng có khả năng di động. Các chủng không có khả năng di động được thể hiện ở bảng 4.3. 1 2 3 Hinh 4.11: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn (Ống 1: Vi khuẩn có khả năng di động; Ống 2: Vi khuẩn không có khả năng di động; Ống 3: Vi khuẩn không di động và có sinh khí) 4.6. Kết quả nhuộm bào tử Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi không phù hợp cho việc sinh trưởng , phát triển bình thường của chúng. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đay cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng. Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng, quan sát dưới kính hiển vi x 100 thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục rất mờ nằm rãi rác. Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, gram dương và có khả năng sinh bào tử. Từ 22 chủng đã qua kiểm tra không có khả năng di động, tôi tiến hành nhuộm bào tử thu được kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 Kết quả: 22 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử. Hình 4.13: vi khuẩn không sinh bào tử Hình 4.12: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử [65] 4.7. Nhuộm kháng acid Vi khuẩn lactic tuy là những vi khuẩn sinh acid nhưng chúng không có khả năng kháng acid mà chúng chi sinh trưởng tốt ở pH 4-6.5 vì vậy trong quá trình sinh trưởng phát triển, đến một giai đoạn nào đó, lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ ức chế ngược lại sự phát triển của chúng. Dựa vào đặc tính này mà khóa phân loại của Bergey đã sử dụng làm một trong các yếu tố đặc trưng giúp định danh vi khuẩn lactic. Ngoài ra ở giai đocnj này ta loại bỏ một số vi khuẩn có tính kháng acif gây bệnh như Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae là những vi khuẩn gây bệnh lao. Chúng là những vi khuẩn gram dương, hình que và không sinh bào tử. Vì vậy nếu chúng có lẫn vào thì các phản ứng trước đó sẽ không nhận ra được. - Từ 22 chủng cho kết quả không sinh bào tử, tiến hành nhuộm kháng acid, thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3. - Kết quả: tất cả điều bắt màu xanh. - Kết luận 22 chủng vi khuẩn đều không có tính kháng acid. Hình 4.15: Vi khuẩn bắt màu không có tính kháng acid. Hình 4.14: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid [66] Qua các thử nghiệm trên và dựa vào khóa phân loại của Bergey ta đã xác định được 22 chủng thuộc giống Lactobacillus,. Ở vi khuẩn Lactobacillus mỗi loài sẽ có khả năng sử dụng các loại đường khác nhau nhằm tiến hành đi xâu hơn trong việc phân loại, ta tiến hành thử nghiệm khả năng lên men đường của các chủng. Sau thử nghiệm catalase, tôi tiến hành thử khả năng sinh acid, nhuộm gram để chọn các vi khuẩn gram dương, thử nghiện di động, nhuộm bào tử, xét nghiệm oxidase và nhuộm kháng acid. Đến đây tôi đã loại bỏ dần để kết quả thu nhận cuối cùng là chọn được 20 chủng vi khuẩn Lactobacillus và 2 chủng lactococcus. * Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 Từ việc xuất hiện 11 chủng không được lựa chọn qua các kiểm tra nhưng vẫn hiện diện trên môi trường phân lập là do nhiều yếu tố chẳng hạn như sự xuất hiện của vi khuẩn hiếu khí như đã thảo luận ở trên, thứ hai là có thể các chủng này không hiện diện trong các mẫu phân lập mà do các yếu tố ngoại cảnh như điều kiện nghiên cứu, phương pháp lựa chọn và khả năng kinh nghiệm. Thứ ba, với cùng một giao thức được áp dụng cho tất cả các mẫu vì tôi không thể đáp ứng được điều kiện cụ thể của từng chủng vi khuẩn lactic mà tôi mong muốn chọn ra từ mẫu của mình. Trong khi mỗi mẫu sản phẩm lên men tự nhiên chắc chắn chứa ít nhất 50 loài vi khuẩn khác nhau thì việc giống nhau ở một vài đặc điểm là chuyện không tránh khỏi. ví dụ, ở pH thấp 4.3 ức chế một số loài Lactobacillus [6], nhưng cũng làm giãm sự phát triển của một số loài khác (Boskey et al, 2000), các nghiên cứu khác cũng tìm thấy được không chỉ vi khuẩn lactic hiện diện trong các nguồn. Ví dụ, Chapman và Sharpe (1981) [15] được tìm thấy Streptococcus trong phô mai, trong khi đó lại Savadago et al (2004) cũng phân lập Streptococcus Lactococcus từ sữa. Shaw & Harding (1984) nói đến sự hiện diện của Carnobacterium trong các sản phẩm thịt, cá lên men. Rất nhiều giống không chỉ vi khuẩn lactic có thể được tìm thấy ở môi trường sống của vi khuẩn lactic. Vì vậy chúng có chung một số đặc điểm sinh hóa và trao đổi chất. Khi lập ra sơ đồ phân lập tôi đã xác định nếu phân lập thành công vi khuẩn lactic thì bằng những phương pháp kiểm tra đã đề ra tôi chỉ có thể thu hẹp khả năng xác định đến cấp giống bằng cách so sánh các kết quả thu được với khóa phân loại của Bergey và những tiêu chuẩn của Sharpe. Tuy nhiên tôi vẫn muốn đi sâu hơn trong kết quả nghiên cứu vưới mong muốn thu hẹp đến việt xác định đến cấp loài. Tôi tiến hành các kiểm tra khả năng lên men đường với nhiều loại đường khác nhau. Tuy hiên với khả năng cho phép của phòng thí nghiệm. tôi chỉ dừng lại ở việc kiểm tra trên 5 loại đường nên tôi có thể khoanh vùng một số loài cho những chủng mà tôi phân lập được. 4.8. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí. Nếu các ống nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy làm đục môi trường, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng sử dụng loại đường đó. Khi cho thuốc thử xanh bromophenol vào nếu thuốc thử đổi màu đỏ, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng lên men đường tạo acid. Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường. Nếu vi khuẩn đó có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo ra thì đó là lên men dị hình và bọt khí tạo ra đó chính là khí CO2. Nếu không có bọt khí tạo ra thì đó là lên men đồng hình. Kết hợp với phản ứng sử dụng thuốc thử Ufermann đã trình bày ở mục 4.3 tôi có thể kết luận đây là những chủng có khả năng lên men loại đường đó tạo acid lactic. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 gồm: - 15 chủng có khả năng lên men đường glucose, trong đó có 6 chủng sinh khí. - 15 chủng có khả năng lên men đường mantol, trong đó có 6 chủng sinh khí. - 19 chủng có khả năng lên men đường sacharose, trong đó có 7 chủng sinh khí. - 11 chủng có khả năng lên men đường lactose, trong đó có 6 chủng sinh khí. - 6 chủng có khả năng lên men đường manitol, trong đó có 2 chủng sinh khí. 2 3 1 . Hình 4.16: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường (Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường; Ống 2: Vi khuẩn lên men đồng hình; Ống 3: Vi khuẩn lên men dị hình) Bảng 4.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn. Nhuộm gram + + + + + + + + + + + Thử nghiệm catalase - - - - - - - - - - - Sinh acid lactic + + + + + + + + + + + Di động - - - - - - - - - - - Sinh bào tử - - - - - - - - - - - Kháng acid - - - - - - - - - - - Lên men glucose - + + + + + - + - - - Lên men mantol + - + + - - + + - + + Lên men sacharose + - + + - + + + + + - Lên men lactose - - + - - + + + - + - Lên men manitol - - + - - + + + - + - Sinh khí - - + - - - + - - - - S1a X S1b X S2 X S3 X S4 X S5 X S6 X N1 X N3 X N4 X N5(*) X D2(*) X D3 X C1 X T1a X T1b X T1c X T2c X T3c X T4c X T7b X T8b X Định danh Lactobacillus Lactoccocus Lactobacillus dị hình Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus dị hình L. acidophilus Lactoccocus Lactobacillus Lactobacillus (*): chủng sinh khí mạnh Qua tất cả các kiểm tra sinh lý, sinh hóa 40 chủng tôi đã sát định được 22 chủng thuộc vi khuẩn lactic, trong đó 20 chủng thuộc giống Lactobacillus và 2 chủng thuộc giống Lactococcus. Trong 20 chủng thuộc giống Lactobacillus thì có 10 chủng thuộc Lactobacillus lên men đồng hình và 10 chủng thuộc giống lên men đồng hình. Ở các chủng T1a, T7b, T8b qua các kiểm tra sinh lý sinh hóa đã thực hiện cho thấy chúng giống với vi khuẩn L. acidophilus. Trong đó chủng T1a được phân lập từ dược phẩm Biolactyl, T7b được phân lập từ Probio và T8b được phân lập từ dược phẩm Ybio cùng với sự khẳn định của các nhà sản xuất thì trong đó có tồn tại loài L. acidophilus cho nên tôi kết luận các chủng T1a, T7b, T8b thuộc loài L.acidophilus . Chủng D3 được phân lập từ dưa chua vốn dĩ thành phần vi sinh rất phức tạp. Trong điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tôi đã thực hiện các kiểm tra sinh lý sinh hóa đã nêu và cho kết quả chủng D3 trùng khớp với 3 chủng T1a, T7b, T8b nên tôi đề xuất chủng D3 thuộc loài L.acidophilus. 4.9. Kết quả kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục. Với mục tiêu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic, tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Vì các vi khuẩn lactic trên được phân lập được từ thực phẩm lên men và dược phẩm nên được xem như là an toàn đối với người và động vật. Đó là điều kiện tiên quyết để chúng tiếp tục sàng lọc chúng nhằm tìm kiếm hoạt tính probiotic. Trong thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của các vi khuẩn lactic, E. coli được chọn làm vi khuẩn chỉ thị, vì nó là một tác nhân gây nhiễm vi sinh thực phẩm và bệnh đường ruột. Để một chủng có khả năng trở thành vi khuẩn probiotic thì trước tiên nó phải có khả năng ức chế tăng trưởng đối với E. coli. Có nhiều phương pháp được sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic như spot on lawn assay, disc diffusion assay, well diffusion assay hoặc phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). Phương pháp cuối cùng đơn giản và mang tính định lượng hơn cả, nên tôi sử dụng phương pháp này để sàng lọc 22 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập nhằm tìm khả năng kháng vi sinh vật của chúng. Hình 4.17 cho thấy mẫu thí nghiệm là huyền phù E. coli được ủ với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm; trong khi ở mẫu đối chứng thay dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm bằng môi trường MRS cùng thể tích. Ở mẫu thí nghiệm, tăng trưởng của E. coli bị ức chế rõ rệt, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường. Để so sánh định lượng mật độ tế bào E. coli sống sót được đo bằng quang phổ kế (Bảng 4.4, 4.5, 4.6. 4.7). 3 2 1 Hình 4.17: Thí nghiệm ủ E. coli với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm (Ống 1: môi trường BHI không cấy vi sinh vật; Ống 2: ống đối chứng; Ống 3: ống thí nghiệm) Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 8 chủng phân lập từ dược phẩm. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) T1a 0.974 0.056 94.3 T1b 0.974 0.84 13.8 T1c 0.974 0.457 53.1 T2c 0.974 0.628 35.5 T3c 0.974 0.412 57.7 T4c 0.974 0.837 14.1 T7b 0.974 0.062 93.6 T8b 0.974 0.067 93.1 Đồ thi 4.1: biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của 8 chủng phân lập từ dược phẩm. Ở chế phẩn Biolactyl, tôi phân lập ra được 3 chủng T1a, T1b, T1c qua kết quả định danh cho thấy chúng thuộc các loài khác nhau. Hai chủng T1a và T2c thuộc giống Lactobacillus trong đó T1a được xác định thuộc loài L. acidophilus, chủng T1b là cầu khuẩn thuộc giống Lactococcus. 3 chủng này có khả năng kháng khuẩn khác nhau với mức độ chên lệch khá cao. Từ đồ thị 4.1 cho ta thấy trong các chủng phân lập từ thuốc thì có 3 chủng T1a là chủng phân lập từ men vi sinh Biolactyl, T7b được phân lập từ Probio và T8b được phân lập từ Ybio có khả năng kháng khuẩn mạnh, chúng có khả năng ức chế hơn 90% tăng trưởng của E. coli. Trong khi đó, Tc1 (Biolactyl) và T3c (L-Bio-M) biểu hiện khả năng kháng E. coli xấp xỉ 50%. Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 7 chủng phân lập từ sữa chua. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) S1a 0.974 0.48 50.7 S1b 0.974 0.821 15.7 S2 0.974 0.036 96.3 S3 0.974 0.473 51.4 S4 0.974 0.359 63.1 S5 0.974 0.52 46.6 S6 0.974 0.341 64.9 Đồ thi 4.2: biểu diễn khả năng kháng vi sinh vật của 7 chủng phân lập từ sữa chua. Trong số các chủng phân lập từ sữa lên men, chủng S2 có hoạt lực cao nhất (> 90%), trong khi S1a (Sữa để chua tự nhiên), S3 (Sữa để chua tự nhiên), S4 (Sữa để chua tự nhiên) và S6 (Kefir lên men từ PTN) biểu hiện hoạt tính trung bình (xấp xỉ 50%). So với 3 chủng T1a, T7b, T8b phân lập từ dược phẩm thì S2 có khả năng ức chế sự phát triển E. coli cao hơn. Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli vật của 4 chủng phân lập từ nem chua. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) N1 0.974 0.169 82.6 N3 0.974 0.035 96.4 N4 0.974 0.31 68.2 N5 0.974 0.462 52.6 Đồ thi 4.3: biểu diễn khả năng kháng E. coli của 4 chủng phân lập từ nem chua. Các chủng vi khuẩn phân lập từ nem chua đều có khả năng ức chế tăng trưởng vi khuẩn chỉ thị trên 50%, trong đó N3 (nem Ninh Hòa) cho kết quả nổi bật (ức chế hơn 96% vi khuẩn chỉ thị, tương tự S2 phân lập từ sữa chua lên men tự nhiên). Nhìn chung, các chủng phân lập từ nem chua có tính kháng vi khuẩn chỉ thị cao hơn và đồng đều hơn so với các chủng phân lập từ dược phẩm. Có lẽ đó chính là lý do vì sao nem chua là thực phẩm lên men cổ truyền chế biến từ thịt sống mà không gây ngộ độc thực phẩm nếu chế biến đúng cách. Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E. coli của 3 chủng phân lập từ dưa cà muối chua. Chủng vi khuẩn OD đối chứng OD Kiểm tra D% = 100 x (1 – ODTN/ODDC) D2 0.974 0.573 41.2 D3 0.974 0.155 84.1 C1 0.974 0.028 97.1 Đồ thi 4.4: biểu diễn khả năng kháng E. coli của 3 chủng phân lập từ dưa cà muối chua. Từ đồ thị ta thấy được chủng C1 phân lập từ cà muối cho hoạt lực cao nhất và cao hơn so với các chủng phân lập từ nguồn khác. Tóm lại, bằng phương pháp đo độ đục tôi đã xác đinh được khả năng ức chế tăng trưởng của vi sinh vật chỉ thị là E. coli: 22 chủng phân lập hầu như đều có khả năng kháng vi khuẩn trong đó có 6 chủng đặc biệc nổi trội đó là - Ba chủng T1a, T7b và T8b (ức chế >93% tăng trưởng E. coli) được phân lập từ chế phẩm dược, - S2 phân lập từ sữa để chua tự nhiên (ức chế 96.3% tăng trưởng E. coli), - N3 phân lập từ nem chua Ninh Hòa (ức chế 96.4% vi khuẩn chỉ thị) - C1 có nguồn gốc từ cà muối khả năng kháng khuẩn lên đến 97.1%. Tất cả các chủng này đều thuộc giống Lactobacillus, riêng T7b và T8b có thể nhận định chúng thuộc loài L. acidophilus. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Bằng quy trình pha loãng và cấy truyền thu khuẩn lạc riêng rẽ và khảo sát hình thái khuẩn lạc, 40 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ thực phẩm lên men như sữa chua, nem chua, rau quả muối chua và từ dược phẩm là men vi sinh có bán trên thị trường. Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa chuyên biệt của vi khuẩn lactic theo khóa phân loại của Bergey và các tiêu chuẩn do Sharpe đưa ra (1961), 22 chủng đã được xác định thuộc vi khuẩn lên men lactic, trong đó 20 chủng thuộc giống Lactobacillus và 2 chủng thuộc giống Lactococcus. Trong số các chủng thuộc giống Lactobacillus, 10 chủng lên men đồng hình và 10 chủng lên men dị hình. Bốn chủng D3, T1a, T7b, T8b được đề nghị thuộc loài Lactobacillus acidophilus. Qua phương pháp đo độ đục (turbidimetric method), hai mươi hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được đều có khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị E. coli, đặc biệt 6 chủng T1a (Biolactyl), T7b (Probio), T8b (Ybio), S2 (sữa để chua tự nhiên), N3 (nem chua Ninh Hòa), C1 (cà muối) có khả năng kháng hơn 93% vi khuẩn chỉ thị E. coli. Từ các kết quả thu nhận được với mục đích là phân lập vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic tôi đề nghị: - Tiếp tục khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của các chủng phân lập được dựa trên các vi sinh vật chỉ thị khác như Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes… - Sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát hình thái cấu trúc tế bào. - Kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được bằng bộ kit API để định danh đến cấp loài. - Sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để khẳng định kết quả định danh bằng phương pháp cổ điển. - Đối với các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng vi sinh vật tổng quát cao, xác định bản chất kháng vi sinh vật của chúng (do acid hữu cơ, H2O2 hay bacteriocin). - Kiểm tra khả năng chịu acid, muối mật, độ bám dính của chúng trong thành ruột. - Đưa chúng vào ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm sản xuất chế phẩm probiotics. - Những chủng có khả năng sinh bacteriocin cao mà không có khả năng bám dính hay khả năng chịu acid, muối mật có thể được sử dụng để nuôi cấy tách chiết bacteriocin hoặc đưa vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm dưới dạng vi sinh vật khởi động (starter) cho quá trình lên men thực phẩm. ._.