Phân lập và xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella tại một số trang trại lợn nuôi theo quy mô công nghiệp ở miền bắc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRĐỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------
--------- NGUYỄN MẠNH PHƯƠNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA TẠI MỘT SỐ TRANG TRẠI LỢN NUÔI THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Ở MIỀN BẮC LUẬN VĐN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Bá Tiếp Hµ néi - 2011 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất cứ công trình nào khác. Các tài liệu tham khảo, trích dẫn ñều có nguồn gốc rõ ràng. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Tác giả Nguyễn Mạnh Phương Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn sợ giúp ñỡ của các thầy cô giáo Viện ðào tạo Sau ñại học và Khoa Thú y – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giành nhiều thời gian, công sức giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS. Nguyễn Bá Tiếp Bộ môn Giải phẫu – Tổ chức Khoa Thú y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, PGS.TS Cù Hữu Phú trưởng Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia, Th.S Văn Thị Hường Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia, B.S Natipong Lampa giám ñốc Phòng thí nghiệm Công ty C.P. Việt Nam ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cám ơn các cán bộ công nhân viên chức Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y Quốc gia, các cán bộ công nhân viên chức Phòng thí nghiệm Công ty C.P. Việt Nam ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện ñề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Tác giả Nguyễn Mạnh Phương Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC............................................................................................................iii DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................... vi DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH ..............................................................................vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................viii Phần I ðẶT VẤN ðỀ ........................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài ............................................................................... 1 1.2. Mục ñích nghiên cứu...................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài............................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa khoa học của ñề tài ........................................................................... 2 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3 2.1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ...... 3 2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.............................................................. 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước............................................................ 5 2.2. Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella .................................................... 7 2.2.1. ðặc ñiểm hình thái ..................................................................................... 7 2.2.2. Tính chất nuôi cấy ....................................................................................... 8 2.2.3. ðặc tính sinh hoá........................................................................................ 9 2.2.4. Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella ..................................................... 9 2.2.5. ðặc ñiểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella ....................................... 10 2.2.6. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella .................................... 11 2.2.7. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella ........................................ 13 2.3. Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn ................................................. 17 2.3.1. Thể nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis chủng kunzendorf ................... 17 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iv 2.3.2. Thể viêm ruột do S. typhimurium.............................................................. 19 2.4. Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn................................. 21 2.4.1. Phòng bệnh................................................................................................ 21 2.4.2. ðiều trị bệnh.............................................................................................. 21 Phần III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................................................... 23 3.1. ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu................................................................... 23 3.1.1. ðối tượng................................................................................................... 23 3.1.2. ðịa ñiểm .................................................................................................... 23 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 23 3.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu............................................................. 23 3.3.1. Mẫu thí nghiệm ......................................................................................... 23 3.3.2. Các loại môi trường thông thường và ñặc hiệu dùng ñể nuôi cấy, phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella ...................................................................... 24 3.3.3. Các loại hóa chất ....................................................................................... 24 3.3.4. Các loại kháng huyết thanh chuẩn ñể ñịnh typ vi khuẩn Salmonella ....... 24 3.3.5. Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR ... 24 3.3.6. Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm ................................ 25 3.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 25 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu................................................................................ 25 3.4.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella ............................ 25 3.4.3. Phương pháp giám ñịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ñược .................. 27 3.4.4. Phương pháp xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella ......................... 29 3.4.5. Phương pháp xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh....................... 31 3.4.6. Xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh (ñộc tố ñường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR....................... 32 3.4.7. Kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược bằng phương pháp tiêm truyền qua ñộng vật thí nghiệm................................................................... 34 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… v 3.4.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị ......... 35 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 36 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các trang trại nuôi lợn công nghiệp ở miền Bắc........................................................................................................... 36 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu nước: .................................. 40 4.3. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu cơ quan của lợn nghi mắc bệnh ..................................................................................................................... 43 4.4. Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hóa của các chủng Salmonella phân lập ñược .................................................................................. 46 4.5. Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ............................................................................................................................. 50 4.6. Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm của các chủng Salmonella phân lập ñược với một số loại kháng sinh .................................................................................. 52 4.7. Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược ..................54 4.8. Kết quả xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ................................................................................... 56 4.9. Kết quả một số phác ñồ ñiều trị tiêu chảy do Salmonella............................ 59 Phần V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ.................................................................... 62 5.1. Kết luận: ....................................................................................................... 62 5.2. ðề nghị: ....................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 63 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Bảng ñánh giá mức ñộ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh ...................................................................................................................... 32 Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi và kích thước sản phẩm xác ñịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược............................................ 33 Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các trang trại..................... 36 Bảng 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong mẫu phân..................... 37 Bảng 4.3. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu nước.......................... 41 Bảng 4.4. Kết quả phân lập Salmonella từ mẫu nước có xử lý chlorine và mẫu nước không xử lý chlorine .................................................................................. 42 Bảng 4.5. Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng............................ 45 của lợn nghi mắc bệnh......................................................................................... 45 Bảng 4.6. Kết quả xác ñịnh hình thái, tính chất bắt màu, ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược………………………………...48 Bảng 4.7. Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ................................................................................... 50 Bảng 4.8. Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược..................................................................................................................... 51 Bảng 4.9. Kết quả kiểm tra mức ñộ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược ......................................................... 53 Bảng 4.10. Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược bằng phương pháp tiêm truyền qua chuột nhắt trắng .................................................. 54 Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng ................. 57 vi khuẩn Salmonella phân lập ñược .................................................................... 57 Bảng 4.12. Các phác ñồ thử nghiệm ñiều trị tiêu chảy do Salmonella ............... 60 Bảng 4.13. Kết quả thử nghiệm một số phác ñồ ................................................. 61 ñiều trị tiêu chảy do Salmonella.......................................................................... 61 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vii DANH MỤC SƠ ðỒ, HÌNH Hình 4.1 So sánh tỷ lệ phân lập ñược Salmonella từ các trang trại lợn có triệu chứng tiêu chảy ở các tỉnh................................................................................... 37 Hình 4.2. So sánh kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong mẫu phân......... 38 Hình 4.3: Lợn bị nhiễm Salmonella biểu hiện tím tai, tím vùng bụng dưới....... 39 Hình 4.4: Lợn bị tiêu chảy do Salmonella phân vàng, như nước ....................... 39 Hình 4.5 So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nguồn nước uống .................... 41 Hình 4.6. So sánh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nước của các........................... 42 trang trại không xử lý nước bằng chlorine ở các tỉnh ......................................... 42 Hình 4.7: Mổ khám lợn tiêu chảy nghi do Salmonella ....................................... 44 Hình 4.8: Ruột xuất huyết, có màng giả.............................................................. 44 Hình 4.9. So sánh tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ phủ tạng của lợn nghi mắc bệnh.............................................................................................................. 45 Hình 4.10: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM ............................ 47 Hình 4.11: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL................................... 47 Hình 4.12. Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI và môi trường LIM ....... 49 Hình 4.13. So sánh tỷ lệ các chủng Salmonella phân lập ñược ........................ 51 Hình 4.14 & 4.15: Mổ khám chuột chết sau khi tiêm canh trùng Salmonella .... 55 Hình 4.16. So sánh tỷ lệ dương tính với một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella kiểm tra bằng phương pháp PCR..................................................... 57 Hình 4.17. Sản phẩm PCR xác ñịnh gen sản sinh ñộc tố ñường ruột và yếu tố xâm nhập với ñối chứng tương ứng ở giếng 5 (259 bp và 521 bp); các ñối chứng âm (giếng 6&7); các mẫu dương tính với Stn (giếng 1,3,4) và với InvA (1,2,3,4); giếng 8, thang chuẩn 1000 bp ............................................................................. 58 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine DiPhosphate ATP Adenosine TriPhosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA Deoxyribo Nucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC EnteroToxigenic E. coli GDP Guanin DiPhosphate GTP Guanin TriPhosphate InvA Invasion A LIM Lysine Indole Motility LPS LipoPolySaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide PCR Polymerase Chain Reaction RPF Rapid Permebility Factor RV Rappaports Vassiliadis ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 1 Phần I ðẶT VẤN ðỀ 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài Chăn nuôi công nghiệp tác ñộng tích cực ñến quá trình nhiễm trùng và phát bệnh truyền nhiễm. Thực tế cho thấy trong các trang trại vật nuôi chỉ mắc một số ít loại bệnh. ðây là kết quả của quy trình tiêm vacxin, hạn chế sự phát triển và tiếp xúc với vật chủ trung gian truyền bệnh, sử dụng thuốc ñiều trị và các quy trình khác. Tuy vậy, tính kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh là nguyên nhân làm giảm hiệu quả ñiều trị của thuốc, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và gây thiệt hại kinh tế (EMEA, 2006). Vi sinh vật gây bệnh có khả năng biến ñổi trong phạm vi từng loài vật chủ hay do tương tác giữa vật chủ với chính bản thân vi sinh vật ñó. Có nhiều chỉ tiêu ñánh giá mức biến ñổi của vi sinh vật theo các yếu tố không gian và thời gian. Những chỉ tiêu thường ñược quan tâm hơn cả gồm thành phần loài, các typ, subtyp, ñặc tính sinh hóa, ñộc lực, khả năng ñề kháng với các tác nhân hóa học ñặc biệt là thuốc sát trùng và kháng sinh. Nhiều thay ñổi ñược tạo ra do biến ñổi di truyền của bản than vi sinh vật. Các biến ñối của vi khuẩn và virus theo thời gian ñã và ñang thách thức các chiến lược nghiên cứu, sản xuất và sử dụng vacxin cũng như kháng sinh trong chăn nuôi mà hậu quả cuối cùng là dịch bệnh vẫn sảy ra, gây tổn thất kinh tế (Baxendale, 1996). Ảnh hưởng dây chuyền mang tính tuần hoàn sẽ tác ñộng làm thay ñổi ñặc tính sinh học của vật nuôi và sức khỏe con người. Một trong những nhóm ñối tượng vi sinh vật gây bệnh ñược quan tâm là các vi khuẩn gây hội chứng tiêu chảy. Mặc dù chuồng trại ñược thiết kế khoa học hơn (chuồng kín, có hệ thống ñiều hòa không khí…) và biện pháp phòng bệnh cũng ñược chú trọng hơn, nhưng hàng năm hội chứng tiêu chảy mà trong ñó có nguyên nhân là do vi khuẩn Salmonella vẫn thường xuyên xảy ra và gây Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 2 thiệt hại không nhỏ ñến năng xuất chăn nuôi. Xuất phát từ vấn ñề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập và xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella tại một số trang trại lợn nuôi theo quy mô công nghiệp ở Miễn Bắc”. 1.2. Mục ñích nghiên cứu - Phân lập chủng Salmonella tại các trang trại nghiên cứu. - Xác ñịnh các ñặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella và vai trò của Salmonella trong hội chứng tiêu chảy trên ñàn lợn nghiên cứu. - Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị. 1.3. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài - Bước ñầu nghiên cứu về các chủng Salmonella gây bệnh trên ñàn lợn thịt nuôi theo phương thức chăn nuôi công nghiệp. - Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị ñể tìm ra phác ñồ ñiều trị hiệu quả nhất. 1.4. Ý nghĩa khoa học của ñề tài - Kết quả nghiên cứu của ñề tài bổ sung, làm phong phú thêm lý luận cơ sở về căn bệnh Salmonella. - Bổ sung các biện pháp ñiều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn thịt nuôi công nghiệp có nguyên nhân do Salmonella, góp phần giải quyết các vấn ñề mà thực tiễn sản xuất ñặt ra. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1885, vi khuẩn Salmonella lần ñầu tiên ñược phát hiện bởi Salmon phân lập từ lợn mắc bệnh dịch tả; lúc ñó người ta cho rằng vi khuẩn này là nguyên nhân gây bệnh dịch tả với cái tên Bacillus suipestifer. Cho ñến năm 1903, khi Schweinitz và Dorset xác ñịnh ñược nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn là do virus thì Bacillus suipestifer chỉ ñược coi là nguyên nhân gây bệnh thứ phát (Selbitz, 1995). Năm 1888, Gaertner A và Jena ñã xác ñịnh ñược nguyên nhân gây viêm ruột của người do ăn phải thịt bò chết ở Frankenhausen, bang Thuringen (ðức) là vi khuẩn Bacillus enteritidis (hiện nay gọi là S. enteritidis). Năm 1891, Jensen C.O. ñã phân lập ñược S. dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy. Cũng vào năm ñó, S. typhimurium ñược phát hiện ở vùng Greiswald và Breslau. Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc ñầu ñược ñặt tên chung là Phó thương hàn “Para-typhus”, cho ñến năm 1914, có 12 loài vi khuẩn ñược mô tả và xếp vào giống Salmonella. Năm 1926, những công bố của White về cấu trúc kháng nguyên của Salmonella ñã mở ñầu một thời kỳ mới của các nghiên cứu về giống vi khuẩn này. Sau ñó Kauffmann cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella (Selbizt, 1995). Năm 1934, Kauffmann và White ñã thiết lập ñược bảng cấu trúc kháng nguyên ñầu tiên và ñặt tên là bảng phân loại Kauffmann-White. Từ ñó ñến nay, bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella vẫn luôn ñược bổ sung. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 4 Năm 1972, vi khuẩn Salmonella ñã ñược tìm thấy có trong phân lợn với tỷ lệ 9,9% số mẫu; năm 1973, tiếp tục phát hiện Salmonella trong hạch màng treo ruột lợn ốm là 7.3%. Tại Mỹ năm 1984 ñã phát hiện Salmonella trong máu lợn chết là 4,3%. Năm 1989, Hungari công bố tỷ lệ mẫu phân lợn có Salmonella tới 48% (Wilcock và Schwartz, 1992). Năm 1993 ñã có 2375 serovar Salmonella ñược ñịnh danh (Selbizt, 1995). Năm 1997, số serovar ñã lên ñến 3000 (Plonait và Birkhardt, 1997). ðến năm 1998 lại thêm 14 serovar khác ñược công nhận bổ sung vào bảng cấu trúc kháng nguyên. Như vậy, giống Salmonella luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật và y học (ðỗ Trung Cứ, 2004). Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002) cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn con theo mẹ là 4,5%, lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%. Tác giả cũng cho biết S. typhimurium ñược phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%. Kishima và cs (2008) công bố tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi khuẩn Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường tại Nhật Bản giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%. Các nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho các loại vật nuôi khác nhau cũng ñược nhiều tác giả công bố. Selbizt (1995), Laval (2000) ñều cho biết bệnh phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S. choleraesuis chủng kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do S. typhimurium gây ra. Ở trâu bò, bệnh chủ yếu do các loài S. dublin và S. entertidis gây ra. Ở cừu, do S. abortus ovis, S. montevideo, S. dublin, S. anatum gây ra. Ở ngựa do S. abortus equi gây ra, còn ở gia cầm và chim do S. pullorum, S. gallinarum, S. typhimurium và S. enteritidis gây ra. Theo Selbizt (1995), hệ gen (genome) của vi khuẩn ñã ñược công bố. Cho ñến nay ít nhất 750 gen ñã ñược xác ñinh, trong ñó có 680 gen ñã có trong bản ñồ gen vi khuẩn này. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 5 2.1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng ñã ñược bắt ñầu nghiên cứu từ lâu. Ngay từ những năm 1951 – 1953, Viện Pasteur Sài Gòn ñã phân lập ñược 6 chủng ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu). Cũng ở Sài Gòn, trong thời gian này ñã phân lập ñược 35 chủng từ 360 lợn, trong ñó có 23 mẫu là S. cholereasuis (Nguyễn Quang Tuyên, 1996). Năm 1963, Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội kiểm tra tại lò sát sinh Lương Yến thấy trong 172 mẫu phân của công nhân ở ñây thì có 111 trường hợp nhiễm, tỷ lệ dương tính khoảng 64,53% (ðỗ ðức Diên, 1999). Nguồn tàng trữ Salmonella chủ yếu là ñường tiêu hóa của người và ñộng vật mắc bệnh. Ở người có các loài S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C. Hai loài S. choleraesuis, S. enteritidis chủ yếu ở ñộng vật nhưng cũng có khả năng gây bệnh cho người. Kết quả nghiên cứu tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc do Nguyễn Thị Nội và cộng sự thực hiện (1989) cho thấy 37,5% lợn nhiễm Salmonella. Nhóm tác giả này ñã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin ña giá Salsco phòng bệnh ỉa chảy cho lợn con. Vacxin ñã ñược áp dụng ñể phòng bệnh có hiệu quả ở nhiều trại chăn nuôi lợn, tỷ lệ lợn bị tiêu chảy giảm từ 30 – 50%, tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy giảm xuống còn 10 – 20%. Kết quả phân lập và xác ñịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn của Lê Văn Tạo (1993) cho thấy 50% các chủng phân lập ñược thuộc S. choleraesuis; 12,5% S. enteritidis; 6,25% S. typhimurium và số còn lại thuộc các serotyp khác. Trần Xuân Hạnh (1995) ñã phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S. typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S. paratyphi ở lợn 6 – 16 tuần tuổi là Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 6 2,8%. ðặc biệt, vi khuẩn S. choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn bình thường. Kết quả nghiên cứu của Phùng Quốc Chướng (1995) ở Tây Nguyên, mùa khô lợn mắc bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là 20,03%, thấp hơn trong mùa mưa (28,66%). Theo Nguyễn Thị Oanh (2003) nghiên cứu ở ðăk Lăk cho kết quả cũng tương tự : mùa mưa tỷ lệ mắc Salmonella trên lợn là 20,72% cao hơn của mùa khô (13,26%). Tạ Thị Vịnh và cs (1996) ñã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợn bệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây cũ) và Gia Lâm (Hà Nội) cho thấy: Tỷ lệ nhiễm Salmonella là 30 – 56% ở lợn khoẻ trong giai ñoạn 22 – 60 ngày tuổi. Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn lợn bình thường và tăng dần theo lứa tuổi : 1 – 21 ngày tuổi: 70% ; từ 22 – 60 ngày tuổi : 75%, Trên 60 ngày : 86%. Hồ Văn Nam và cs (1997) ñã tiến hành gây viêm ruột cho 12 lợn sau cai sữa bằng cách cho uống nước muối và sau 10 giờ cho uống thêm 5ml canh trùng Salmonella. Sau 4-7 ngày, lợn sốt 40 – 41oC, ỉa chảy phân khắm ; chứng tỏ viêm ruột ở giai ñoạn nhiễm trùng. Xét nghiệm vi khuẩn 12 lợn trên, 100% bệnh phẩm lấy ở ruột ; 85,71 – 100% bệnh phẩm là hạch lâm ba, gan, lách có Salmonella cả thể cấp tính và mãn tính. Cù Hữu Phú và cs (2000), nghiên cứu Salmonella trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 35 ngày ñến 4 tháng tuổi nuôi xung quanh khu vực Hà Nội, cho biết 80% mẫu phân lợn tiêu chảy có nhiễm Salmonella. Xác ñịnh ñặc tính sinh học, khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột của các chủng Salmonella phân lập ñược ; các tác giả ñã chế thử nghiệm autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn, kết quả ñạt 89,22% lợn ñược phòng bệnh sau 4 tháng tiêm phòng. Theo Nguyễn Bá Hiên (2001), tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các ñàn lợn, ngoại thành Hà Nội cao nhất là lợn trên 60 ngày tuổi (88,23%), thấp nhất là lợn từ 1 – 21 ngày tuổi (73,68%). Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 7 Kết quả nghiên cứu của Hoàng Thị Phi Phượng và Trần Thị Hạnh (2005), cho biết thức ăn ô nhiễm Salmonella ảnh hưởng trực tiếp tới lượng vi khuẩn thải ra theo phân, lượng vi khuẩn thải ra có tương quan thuận với lượng vi khuẩn ăn vào và ảnh hưởng ñến khả năng sinh trưởng của lợn, làm giảm mức ñộ tăng trọng và tăng lượng thức ăn tiêu tốn của lợn. 2.2. Một số ñặc ñiểm của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae. Giống Salmonella gồm 2 loài: S. enterica và S. bongori gồm trên 2000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và ñôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Gần ñây, loài S. enterica ñã ñược phân thành 6 phân loài ñó là: S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizinae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica. Trong ñó phân loài S. enterica subsp. enterica gồm phần lớn các chủng Salmonella là những tác nhân gây bệnh cho người và ñộng vật (Quinn và cs, 2002). 2.2.1. ðặc ñiểm hình thái Vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hai ñầu tròn, có kích thước 0,4 – 0,6 x 1,0 – 3,0 µm, bắt màu Gram âm, không hình thành nha bào và giáp mô. ða số loài Salmonella (trừ S. gallinarum và S. pullorum) có từ 7 ñến 12 lông (flagella) xung quanh thân nên chúng có khả năng di ñộng mạnh. Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella ñều có các cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili. Chúng có kích thước chừng 0,01 – 0,03 x 1,0 µm. Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250 – 400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào. Fimbriae làm cho vi khuẩn có khả năng bám dính vào các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc. Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường ; bắt màu Gram âm (bắt màu ñều toàn thân hoặc hơi ñậm ở hai ñầu). Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 8 2.2.2. Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng thông thường. Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển ñược ở nhiệt ñộ từ 6 – 42oC. Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ ñược tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển ñược. pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển ñược ở pH từ 6 – 9. Salmonella gây bệnh ở gia súc sinh trưởng tốt trong ñiều kiện hiếu khí, kém hơn ở ñiều kiện kỵ khí. Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường nước thịt, môi trường BPW và môi trường RV : sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn ñục nhẹ, sau 18 ñến 24 giờ thấy canh trùng ñục ñều, trên mặt môi trường có màng mỏng, ñáy ống nghiệm có cặn. Trên môi trường thạch DHL : sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), có màu vàng nhạt. Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu ñen. Trên môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella : sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng. Trên môi trường thạch TSI : vi khuẩn Salmonella do sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu ñỏ (pH = 7,3), ñáy ống nghiệm màu vàng (pH = 6,8) do vi khuẩn chỉ lên men ñường Glucose. Phần giữa ống nghiệm có màu ñen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S. Nếu ñể lâu (quá 24 giờ), màu ñen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần ñáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng). Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi ñẩy thạch khỏi ñáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002). Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 9 Trên môi trường LIM (Lysine Indole Motility) : vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt. Trên môi trường Malonate : vi khuẩn không phát triển nên không làm ñổi màu môi trường. 2.2.3. ðặc tính sinh hoá Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số loại ñường nhất ñịnh. Phần lớn các loài Salmonella lên men._. có sinh hơi các loại ñường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, arabinoza, sorbitol và levuloza. Một số loài (S. typhi, S. typhiuis, S. choleraesuis, S. enteritidis) cũng lên men các ñường nhưng không sinh hơi. Hầu hết các vi khuẩn Salmonella ñều không lên men lactoza và saccaroza. ða số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy gelatin, một số không phân giải urê, không sản sinh Indol. Phản ứng catalaza dương tính. Phản ứng oxidaza âm tính. Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S. paratyphi A, S. typhisuis, S. choleraesuis). Trong quá trình phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella thì ñặc tính sinh hóa có ý nghĩa rất quan trọng. ðây là bước không thể bỏ qua khi xét nghiệm vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng. 2.2.4. Sức ñề kháng của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt ñộ và các chất sát trùng mạnh. Ở nhiệt ñộ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ ở nước trong và 9 giờ ở nước ñục có thể diệt ñược vi khuẩn (Laval, 2000). Cũng theo Laval (2000), vi khuẩn Salmonella sống ñược lâu trong ñiều kiện lạnh ; chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở ñiều kiện môi trường có ñộ pH ≤ 5 chúng chỉ sống ñược trong thời gian ngắn. Trong nước thường Salmonella khó sinh sản, nhưng có thể tồn tại một tuần, trong nước ñá tồn tại ñược 2 – 3 tháng. Vi khuẩn Salmonella có thể tồn tại trong chất ñộn chuồng tới trên 30 tuần, có thể sống ở trong ñất với ñộ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng. Ở sàn gỗ, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 10 tường gỗ trong ñiều kiện ít ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (ðào Trọng ðạt và cs (1995). Trong nước tù ñọng, ñồng cỏ ẩm thấp S. typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng. Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100 ngày, trong thịt ướp muối từ 6 – 8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970). 2.2.5. ðặc ñiểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi, phân bố ở khắp nơi trên thế giới, vì vậy các nghiên cứu về cách truyền lây của vi khuẩn này ñược nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Một ñặc ñiểm dịch tễ quan trọng của Salmonella là trạng thái mang trùng và thải trùng của gia súc. Một nguồn bệnh ñặc biệt quan trọng là gia súc mang vi khuẩn Salmonella nhưng không biểu hiện lâm sàng. Những con này có thể thải mầm bệnh ra ngoài môi trường trong vài tháng. Gia súc nhiễm bệnh thải vi khuẩn Salmonella vào trong phân và bệnh xảy ra do tiếp xúc trực tiếp hay ô nhiễm phân vào thức ăn, nước uống hay chuồng trại gia súc. Lợn nhiễm S. choleraesuis thường biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng từ 36 – 48 giờ sau khi nhiễm trùng và có 103 – 106 ñơn vị vi khuẩn trong 1 gram phân vào giai ñoạn bệnh cao nhất. Phần lớn những lợn nhiễm tự nhiên sau khi khỏi bệnh, có thể loại thải hoàn toàn vi khuẩn trong khoảng thời gian 9 – 12 tuần sau khi nhiễm trùng. Như vậy trạng thái mang trùng kéo dài là một trong các nguyên nhân dẫn tới sự nhiễm khuẩn môi trường và tạo cơ hội cho vi khuẩn nhiễmsự tái nhiễm tiếp theo của những ñộng vật mới ñưa vào trại. Vi khuẩn Salmonella có thể xâm nhập vào cơ thể vật chủ theo thức ăn, nước uống vào ñường tiêu hóa hay do tiếp xúc. Bình thường, vi khuẩn tồn tại trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh. Chỉ khi nào sức ñề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máum nội tạng và gây bệnh. Bệnh phó thương hàn chỉ gây thành dịch ñịa phương, dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu ñàn, tình hình vệ sinh thú y, chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng và ñặc ñiểm dịch tễ học của cơ sở ñó (Phan Thanh Phượng, 1988; Nguyễn Như Thanh, 2001; Laval , 2000). Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 11 Theo Phan Thanh Phượng (1988), tỷ lệ lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra thường tăng lên vào thời kỳ lợn cai sữa, vì lúc ñó cơ thể lợn con thay ñổi, dễ nhiễm bệnh. Nguyễn Như Thanh (2001) cũng cho biết: vi khuẩn gây ra bệnh phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ lệ chết khoảng 25%, có khi lên ñến 95%; bệnh có thể ở lợn lớn với thể mạn tính và ít gây chết. Lợn con trước cai sữa có tỷ lệ bị bệnh thấp hơn do ñược bảo hộ nhờ kháng thể có trong sữa ñầu của lợn mẹ. Nguy cơ mắc bệnh tăng dần theo lứa tuổi, ñặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ ñộng chưa thể bù ñắp kịp thời ñể thay thế miễn dịch thụ ñộng (Laval, 2000). 2.2.6. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella hết sức phức tạp, bao gồm 3 loại chính: Kháng nguyên O (O – Antigen) còn gọi là kháng nguyên thân. Kháng nguyên H (H – Antigen) hay kháng nguyên lông. Kháng nguyên K (K – Antigen) còn gọi là kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên thân O (O – Antigen) Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysaccharide là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram âm. Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat stable) và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde. Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính: - Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tính ñặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (smooth) sang dạng R (rough) dẫn ñến giảm ñộc lực của vi khuẩn (Selbitz, 1995). - Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết ñịnh tính kháng nguyên và ñặc trưng cho từng serotyp. Kháng nguyên O ñược xem như là một nội ñộc tố (endotoxin) mà nó ñược cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco – polypeptide có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn. Theo CIRAD (2006), kháng nguyên O của vi khuẩn Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 12 Salmonella có 67 loại chính, ñược chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại ñóng vai trò phụ. Kháng nguyên lông H (H – Antigen) - Kháng nguyên lông H là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt ñộ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Như Thanh va cs, 2001). Kháng nguyên H gồm có 2 pha: Pha 1: có tính ñặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên ñược biểu thị bằng chữ mẫu la tinh thường: a,b,c,d,...,z. Pha 2: Không có tính ñặc hiệu, gồm 6 loại ñược biểu thị bằng chữ số ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay chữ cái Latinh viết thường như e,n,x,....Tuy nhiên, trong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt luôn luôn chỉ xuất hiện từng pha, bởi vậy mà trong chẩn ñoán, ñể ñạt ñược một công thức kháng nguyên hoàn chỉnh cho Salmonella phải thay ñổi pha. Có các loài Salmonella như S. typhisuis, hoặc S. enteritidis thì chỉ tạo 1 pha. Kháng nguyên H không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn, cũng như không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác ñịnh giống loài của vi khuẩn. Kháng nguyên vỏ (K – Antigen hay Vi – Antigen) Theo Quinn (1995), kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S. typhi, S. paratyphi. S. dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ, kháng nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O. Cũng theo tác giả, nếu ñun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 – 12 phút sẽ phá hủy ñược kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi phát triển nhiều. Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là: S.typhi và S.paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong công thức ñứng sau kháng nguyên O. Theo sơ ñồ của Kauffmann – White; công thức kháng nguyên của S.paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S.typhi là: 9, 12, Vi: c,d. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 13 Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong công tác chẩn ñoán. 2.2.7. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella Salmonella là vi khuẩn sống hoại sinh trong ñường tiêu hóa của người và gia súc. Bình thường, vi khuẩn không gây bệnh, ñến khi cơ thể yếu hoặc do yếu tố nào ñó bất lợi làm giảm sức ñề kháng của cơ thể thì vi khuẩn Salmonella tăng sinh rất nhanh (bội nhiễm) và gây bệnh. Quá trình tác ñộng gây bệnh của Salmonella có sự tham gia của các yếu tố không phải là ñộc tố và các yếu tố là ñộc tố. 2.2.7.1. Các yếu tố không phải là ñộc tố Kháng nguyên O: Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O ñều ảnh hưởng tới ñộc lực của vi khuẩn Salmonella. Kháng nguyên này là yếu tố ñộc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của ñại thực bào. Kháng nguyên O kích thích các cơ quan ñáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể ñặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng. Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn. Kháng nguyên H: Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, cũng không quyết ñịnh yếu tố ñộc lực, tuy vậy nó có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các tế bào ñại thực bào, cũng như trong tế bào gan và thận (Weinstein và cs, 1984). Kháng nguyên K: Bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O. Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác ñộng ngoại cảnh và hiện tượng thực bào Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 14 (Nguyễn Như Thanh, 2002). Yếu tố bám dính Khả năng bám dính của vi khuẩn Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi ñầu quan trọng trong quá trình gây bệnh. Yếu tố bám dính của Salmonella là Fimbriae typ 1. Khi yếu tố bám dính Fimbriae typ 1 của Salmonella có ñiện tích ion bề mặt trái với ñiện tích ion bề mặt tế bào nhung mao ruột thì ñiểm tiếp xúc có lực hút và vi khuẩm bám dính lên bề mặt của tế bào. Quá trình bám dính xảy ra theo 3 bước: Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này ñòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ñộng. Bước 2: Là quá trình hấp phụ vi khuẩn lên nhung mao ruột, phụ thuộc vào ñặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và ñược thực hiện theo hướng thuận nghịch với sự tương hỗ của những tác ñộng khác nhau. Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào. Khả năng bám dính là yếu tố quan trọng của vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ. Những vi khuẩn có ñộc lực cao có khả năng bám dính tốt hơn các vi khuẩn có ñộc lực thấp. Khả năng xâm nhập: Khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của ñường ruột là ñặc tính của một số chủng Salmonella có ñộc lực. Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không có ñộc lực. Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác ñộng làm tăng hàm lượng Ca2+ nội bào, hoạt hóa actindepolimeriring enzymes, làm thay ñổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến ñổi màng tế bào, dẫn ñến hình chân giả bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn. Sau ñó Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 15 Salmonella ñược xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh ñộc tố ñường ruột (enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ. Khả năng tổng hợp sắt: ðây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống ñỡ của vật chủ do bị thiếu sắt. Vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay ñổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng ñiều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt. Khả năng kháng kháng sinh: Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh ñể phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc, gia cầm, ñã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường. Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên nhiều lần. Khả năng kháng kháng sinh có thể thay ñổi, phụ thuộc vào ñịa phương, thời ñiểm làm kháng sinh ñồ và loại vật nuôi. Theo Tô Liên Thu (2005), trong 20 chủng Salmonella phân lập từ thịt lợn ñược thử 9 loại kháng sinh cho thấy: Salmonella kháng lại các kháng sinh thông thường như Streptomycin, Ampicilin, Chloramphenicol bị kháng lại với tỷ lệ > 30%, nhiều chủng có ñặc tính ña kháng, có chủng kháng lại 8 loại kháng sinh. Trên ñây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố của vi khuẩn Salmonella. Các yếu tố này bằng những cơ chế tác ñộng khác nhau, phương thức tác ñộng khác nhau, ñã tạo ñiều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, ñồng thời chúng lại tạo ñiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh. Chính vì thế các yếu tố không phải là ñộc tố ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella. Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố này là hết sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do vi khuẩn Salmonella gây nên. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 16 2.2.7.2. Các yếu tố là ñộc tố Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố là những tác nhân gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố gây bệnh là ñộc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết ñịnh quá trình sinh bệnh. Các yếu tố gây bệnh là ñộc tố của Salmonella bao gồm: nội ñộc tố (endotoxin), ngoại ñộc tố ñường ruột (enterotoxin) và ñộc tố tế bào (cytotoxin). ðộc tố ñường ruột (Enterotoxin): ðộc tố ñường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: ðộc tố thẩm xuất nhanh và ñộc tố thẩm xuất chậm. ðộc tố thẩm xuất nhanh (Rapid permeability factor: RPF) có cấu trúc, thành phần giống với ñộc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat Stabile Toxin: ST). ST có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt ñộ thấp, có thể bảo quản ở - 20oC. RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1 – 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO. ðộc tố thẩm xuất chậm (Delayed permeability factor: DPF) có cấu trúc, thành phần giống ñộc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat Labile Toxin: LT). Nó thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18 – 24 giờ, có thể kéo dài 36 – 48 giờ. DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ. Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptide và một số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000 – 50.000 dalton. Nội ñộc tố (Endotoxin) Nội ñộc tố ñóng vai trò quan trọng gây nên những biến ñổi bệnh lý do Salmonella gây ra, nhất là trong giai ñoạn nhiễm trùng huyết. Thành phần chủ yếu của nó là Lipopolysaccharide. Nội ñộc tố là Lipopolysaccharide ñược tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Gan, thận, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa,cơ và hệ thống miễn dịch là ñích tấn công của nội ñộc tố. Lipopolysaccharide còn tác ñộng lên quá trình trao Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 17 ñổi chất và các bào quan. Lipopolysaccharide còn góp phần tăng ñộc lực của vi khuẩn, phá hủy thành mạch, hủy hoại tế bào biểu mô ruột, gây sốt, tắc nghẽn mạch máu, rối loạn tuần hoàn và phản ứng shock là hậu quả tác ñộng của Lipopolysaccharide do vi khuẩn sản sinh. ðộc tố tế bào (Cytotoxin): Thành phần của Cytotoxin không phải là Lipopolysaccharide (Non – Lipopolysaccharide). ðặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp protein của tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO. ða phần ñộc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt ñộ.Và ñặc tính quan trọng của Cytotoxin làm tổn thương tế bào biểu mô. Trên ñây là 3 loại ñộc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là các tác nhân trực tiếp, quyết ñịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn. 2.3. Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn Mầm bệnh sau khi nhiễm vào ñường tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ ñó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho lá lách sưng to, lúc ñầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội ñộc tố, gây viêm hoại tử gan và hạch. Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu: Thể nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis chủng kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do S. typhimurium. 2.3.1. Thể nhiễm trùng huyết do S.choleraesuis chủng kunzendorf Bệnh phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn sau cai sữa do S. choleraesuis chủng Kunzendorf gây nên (Laval, 2000) với các triệu chứng lâm sàng ñiển hình như bỏ ăn, ủ rũ, thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chui vào ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 41 – 42oC. Mí mắt sưng mọng có nốt tím bầm, viêm kết mạc. Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan, có dịch ñờm. Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết ñỏ thẫm trên Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 18 da bụng và tai. Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng. Trong các ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao, tỷ lệ những con ốm không cố ñịnh, thường dưới 10% trong tổng ñàn. Hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéo dài cho ñến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh. Phân bài xuất nhiều lần trong ngày, sau ñó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợn con, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu. Lợn gầy sút nhanh (Laval, 2000).Trên da lợn trưởng thành mắc bệnh cũng xuất hiện các mảng da bị ñỏ, hoặc tím bầm ở vùng bụng, tai, bẹn,… sau ñó xuất hiện chứng viêm phổi, lợn ho, thở dốc. Những lợn như vậy thường bị chết do chứng viêm phổi thứ phát 15 ngày sau khi bị bệnh. Tỷ lệ lợn chết ở lợn bị bệnh thể á cấp tính khoảng 40 – 45%. Lợn bị bệnh thường mang trùng và ñều ñặn thải mầm bệnh ra ngoài theo phân, nhưng khó phát hiện một cách chính xác (Laval, 2000). Bệnh tích ñại thể: Khi mổ khám lợn bệnh, những bệnh tích ñại thể quan sát ñược bao gồm: Các vết tím xanh ở rìa tai, trên bề mặt da bụng, bẹn, chân và ñuôi; nhồi huyết ở lớp niêm mạc dạ dày; lách sưng to nhưng nhẹ hơn gan, khi cắt ngang thấy tổ chức lách có màu tím. Gan sưng to,tụ máu,trên bề mặt gan xuất hiện những nốt hoại tử nhỏ màu trắng, tế bào gan cứng lại. Phổi bị cứng và xung huyết tràn lan. Bệnh tích vi thể: Dấu hiệu biến ñổi bệnh tích vi thể là do Salmonella gây ra là ở hạch lympho màng treo ruột: Sưng, xung huyết, xuất huyết và có ñiểm hoại tử màu xám, trên bề mặt gan thấy xuất hiện ñiểm hoại tử mô bào. Những biến ñổi bệnh tích vi thể ở lợn do Salmonella gây ra là không hề trùng lặp với bất cứ bệnh nào khác ở lợn. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 19 Chẩn ñoán: Chẩn ñoán bệnh phó thương hàn thể nhiễm trùng máu do S. choleraesuis chủng Kunzendorf gây nên không thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng ñơn lẻ, vì các triệu chứng lâm sàng của bệnh giống như nhiều triệu chứng nhiễm trùng khác ở lợn như bệnh nhiễm trùng do Streptoccocus, bệnh ñóng dấu lợn. 2.3.2. Thể viêm ruột do S. typhimurium Bệnh phó thương hàn thể viêm ruột thường do các serotyp S. typhimurium gây ra ở lợn con từ sau cai sữa ñến khoảng 4 – 6 tháng tuổi. Các thể bệnh hay gặp là cấp tính hoặc mãn tính (Laval, 2000). Triệu chứng: Triệu chứng lâm sàng xuất hiện từ từ, một trong những triệu chứng ñầu tiên và quan trọng là ỉa chảy. Thời kỳ nung bệnh thường từ 3 – 4 ngày. Phân ban ñầu nhão sau ñó chuyển sang thể nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy. Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước. ðợt sốt ñầu tiên kéo dài chừng một tuần, tiếp theo một thời kỳ không sốt mấy ngày, rồi lại tiếp tục sốt. Ở một số lợn ốm thấy bị viêm khớp, chân bị què, ñứng không vững, ñi xiêu vẹo. Ngoài triệu chứng tiêu chảy, lợn ốm còn bị viêm phổi, lợn ho, thở gấp, nước mũi chảy nhiều. Hầu hết lợn bệnh bình phục nếu ñược ñiều trị kịp thời, nhưng chủ yếu chuyển sang thể mãn tính kéo dài vài tháng. Tỷ lệ lợn chết dao ñộng từ 40% – 50%. Số con còn sống sót chậm lớn, còi cọc. Những lợn khỏi bệnh thường mang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường (Laval, 2000). Bệnh tích ñại thể: Bệnh tích thường thấy ở ruột, nhất là ruột già. Trong thể cấp tính, niêm mạc ruột thấm máu tràn lan, khi cắt ra trông giống như mỡ và có thể có màng giống như sợi huyết phủ ở trên, lách sưng to và dai như cao su. Trong thể mạn tính, bệnh tích ñặc biệt là thối loét ở niêm mạc ruột. Những mụn loét to hay nhỏ, màu vàng xanh hoặc xám, chứa ñầy một thứ bã Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 20 ñậu, xung quanh có bờ ñỏ và nhẵn. Van hồi manh tràng bị loét cúc áo, có phủ một lớp màng (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002). Bệnh tích vi thể: Sự hoại tử nông hay sâu trên bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột là những bệnh lý vi thể ñặc trưng của thể viêm ruột; có trường hợp thấy nổi gồ lên khỏi niêm mạc xung huyết của ruột những hạt tròn như hạt ñậu màu trắng vàng. Phần ñầu lông nhung trong hồi tràng bị teo ngắn lại. ða số trường hợp thấy mảng peyer bị loét dưới ñáy như phủ một lớp tổ chức hoại tử màu vàng trắng, niêm mạc dạ dày có ñiểm chảy máu rải rác, có một số loét nhỏ tập trung ở bờ cong nhỏ. Gan xung huyết, trên bề mặt gan có thể thấy những nốt u nhỏ (áp xe) mang tính ñặc trưng cho thể bệnh không giống với ñiểm hoại tử trong thể nhiễm trùng huyết. Chẩn ñoán: + Chẩn ñoán lâm sàng: Ở thể viêm ruột của bệnh phó thương hàn, căn cứ vào các triệu chứng ñiển hình như viêm ruột và dạ dày ở lợn con từ sau cai sữa ñến 4 tháng tuổi. ðồng thời, dựa vào kết quả nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên môi trường pepton và kiểm tra di ñộng trên môi trường thạch và xét nghiệm huyết thanh học. + Chẩn ñoán phân biệt với bệnh hồng lỵ, chứng viêm ruột do Campylobacter (PHE), bệnh viêm ruột hoại tử, bệnh viêm dạ dày ruột (Transmission Gasto Enteritis – TGE), bệnh tiêu chảy ở lợn do E. coli. Một số tác nhân gây tiêu chảy do vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây viêm ruột, bệnh dịch tả lợn, các loại ký sinh trùng như cầu trùng Coccidia. - Ở bệnh phó thương hàn, thân nhiệt lợn ốm vẫn giữ cao (41 – 42oC) trong suốt thời gian lợn bị ỉa chảy, ñiều ñó hoàn toàn khác với bệnh hồng lỵ. Hiện tượng tím tái nhiều khu vực trên da lợn bị bệnh phó thương hàn cũng khác với lợn bị bệnh hồng lỵ. Ở lợn bị bệnh hồng lỵ, phân có màu xám, xám – ñen, ñen, ñen nâu, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh phó thương hàn. Lách ở lợn bị Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 21 bệnh hồng lỵ không bị sưng và không có những biến ñổi ñặc trưng. Màng niêm mạc ruột ở lợn bị bệnh hồng lỵ thường phủ một lớp biểu bì hoại tử, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh phó thương hàn. 2.4. Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 2.4.1. Phòng bệnh Phòng bệnh phó thương hàn cho lợn, nhất là ở những nơi chăn nuôi lợn tập trung quy mô lớn và chăn nuôi lợn nái có nhiều lợn con là một việc quan trọng, vì ñặc ñiểm dịch tễ của căn bệnh là vi khuẩn Samonella không dễ dàng khống chế. Có 2 bước ñể phòng bệnh hiệu quả: - Thực hiện an toàn sinh học trong chăn nuôi: là thực hiện các biện pháp kiểm soát, hạn chế mầm bệnh xâm nhập vào trang trại như biện pháp quản lý vật nuôi cùng vào – cùng ra, làm hệ thống sát trùng thường xuyên khử trùng khu vực chăn nuôi; kiểm soát chất lượng nguồn thức ăn và nước uống; tiêu diệt chuột, ruồi, gián; làm hệ thống biogas xử lý phân và nước thải... - Tiêm phòng vac-xin: Có nhiều loại vac-xin ñể phòng bệnh do Salmonella gây ra như vacxin nhược ñộc chủng TS-177, vacxin bổ trợ keo phèn hay vacxin nhũ hóa bổ trợ dầu. Vacxin chống một số chủng phổ biến là S.typhimurium, S.choleraesuis... 2.4.2. ðiều trị bệnh Hiệu quả chữa bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các biện pháp phòng bệnh tổng hợp như vệ sinh thú y, chăm sóc, nuôi dưỡng, chẩn ñoán bệnh kịp thời. - Sử dụng kháng huyết thanh: Kháng huyết thanh phó thương hàn ñược chế bằng cách gây tối miễn dịch cho bò ñực thiến bằng canh trùng vi khuẩn S. choleraesuis chứa ñộc tố ñược vô hoạt bằng formol. Tiêm bắp 30 – 60ml cho lợn dưới 45 ngày tuổi; 50 – 80ml cho lợn 45 ngày tuổi trở lên. Phương pháp này trong thực tế ít ñược sử dụng vì giá thành cao. - ðiều trị bằng kháng sinh: Cho ñến nay, việc dùng kháng sinh chữa bệnh phó thương hàn cần chú ý loại trừ các loại kháng sinh ñã bị vi khuẩn kháng Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 22 ñược nhiều tác giả thông báo như Streptomycin, Ampicillin...Cũng phải loại trừ các kháng sinh vi khuẩn mẫn cảm nhưng ñã bị cấm sử dụng như Chloramphenicol, Furazolidon,… Hiện nay có nhiều loại kháng sinh mà các công ty, xí nghiệp thuốc thú y trong và ngoài nước sản xuất dùng cho ñiều trị bệnh phó thương hàn như Ampisure, Nor-100, Zinabrime... Làm kháng sinh ñồ cho từng trại ñể ñánh giá và chọn loại kháng sinh ñiều trị có hiệu quả nhất ñược khuyến cáo. Ngoài ra cần chú ý kết hợp với bổ sung muối và ñiện giải, chống mất nước cho lợn ốm. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 23 Phần III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 3.1.1. ðối tượng - Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược. 3.1.2. ðịa ñiểm - ðịa ñiểm lấy mẫu: Các trang trại chăn nuôi lợn ở một số tỉnh Miền Bắc. - ðịa ñiểm tiến hành các xét nghiệm và thí nghiệm: + Phòng thí nghiệm công ty cổ phần chăn nuôi C.P. Việt Nam + Phòng thí nghiệm bộ môn Vi trùng – Viện Thú y.Quốc Gia 3.2. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mẫu xét nghiệm (mẫu phân, mẫu nước, mẫu cơ quan) từ lợn và các trang trại có lợn bị tiêu chảy ở 6 tỉnh miền Bắc. - Xác ñịnh tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nguồn nước uống ở khu vực chăn nuôi. - ðịnh danh vi khuẩn phân lập ñược. - Xác ñịnh ñộc lực và các yếu tố gây bệnh của Salmonella phân lập ñược. - Thử nghiệm một số phác ñồ ñiều trị. 3.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 3.3.1. Mẫu thí nghiệm Mẫu thí nghiệm là phân và phủ tạng (hạch amidan, gan, lách, hạch màng treo ruột và hồi tràng) của lợn ốm và chết bị tiêu chảy có các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn Salmonella. Mẫu nước uống của lợn ở các trang trại. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 24 3.3.2. Các loại môi trường thông thường và ñặc hiệu dùng ñể nuôi cấy, phân lập và giám ñịnh vi khuẩn Salmonella Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường chế sẵn ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức của các hãng Eiken, Oxoid, Biorad, Merk.... - Môi trường nước thịt: dùng ñể kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn. - Môi trường BPW, RV: dùng ñể tăng sinh vi khuẩn Salmonella. - Môi trường thạch thường: dùng ñể kiểm tra hình thái, màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Salmonella. - Môi trường thạch máu (Blood Agar Base): dùng ñể giữ giống và kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn Salmonella. - Môi trường thạch DHL: là môi trường ñặc biệt dùng ñể nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella . - Môi trường TSI: dùng ñể giám ñịnh khả năng sinh H2S và lên men ñường glucose. - Môi trường LIM: dùng ñể giám ñịnh khả năng sinh Indol và khả năng di ñộng của vi khuẩn Salmonella. - Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng ñể ñịnh typ và giữ giống vi khuẩn. 3.3.3. Các loại hóa chất - Các loại ñường: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroze, Sucroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze ñể thử phản ứng lên men ñường. - Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader. - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất). 3.3.4. Các loại kháng huyết thanh chuẩn ñể ñịnh typ vi khuẩn Salmonella Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng ñể ñịnh typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella. 3.3.5. Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR - Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, ñệm phản ứng, ñệm ñiện di Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 25 TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm ñiện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide). - Các chủng vi khuẩn dùng làm ñối chứng dương gồm: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp. 3.3.6. Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm ðĩa petri, lam kính, ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, ống hút, que cấy, ñèn cồn, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, lò vi sóng, kính hiển vi…… 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu - ðối với mẫu phân: mẫu phân từ lợn bị tiêu chảy ñược lấy bằng cách dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng của những con có triệu chứng tiêu chảy. Thường phân có màu vàng, lẫn chất nhầy, có mùi thối ñặc biệt. Mẫu ñược cho vào các ống vô trùng, bảo quản lạnh 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm. - ðối với những lợn sau cai sữa bị tiêu chảy nặng hoặc chết có các triệu chứng ỉa chảy phân có mùi thối ñặc biệt, vùng da bụng, quanh tai và bẹn có những ñốm ñỏ hoặc tím bầm, tiến hành mổ khám tại chỗ rồi lấy bệnh phẩm từ gồm gan, lách, hạch ruột, chất chứa ruột non. Các mẫu ñược ñựng trong túi nilon vô trùng chuyên dùng (ñể riêng rẽ). Máu tim ñược hút vào xi – lanh, bảo quản ở 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tổng số lợn mổ lấy mẫu là 24 con. - ðối với mẫu nước: chúng tôi tiến hành lấy 200ml nước từ nguồn nước uống dùng trong chăn nuôi của trại (nước._.