Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

ủa hạt. Không những thế, một số loài nấm mốc khi phát triển chúng sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin. Nguy hiểm hơn, những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây độc cho con người và động vật kinh tế. Việc sử dụng các biện phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo sử dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và sự nhiễm aflatoxin trên ngô lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không thể tránh được. Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc, đặc biệt là aflatoxin bởi độc tính và nguy cơ gây ung thư của nó. Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu để tìm ra những pháp làm giảm lượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói riêng đã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm. Ở nước ta, từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [9] đã nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc... , Đặng Hồng Miên [5] cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm mốc trên ngô gạo và các biện pháp phòng trừ. Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin bằng NH4OH cũng đã được nghiên cứu và công bố [7]. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] cũng đã nghiên cứu khử aflatoxin trên ngô bằng NH3 và Ca(OH)2, kết quả cho thấy tác dụng khử aflatoxin bằng hai hóa chất rất rõ rệt và hiệu quả cao. Tuy nhiên, việc khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất như NH3 có giá thành cao và để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý. Để khắc phục nhược điểm này, trong những năm qua, nhiều công trình nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp sinh học đã được nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu và đã thu được một số kết quả hứa hẹn. Để góp phần vào việc nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp sinh học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao”. 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu Tìm được một số chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar có hoạt tính khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao và khả năng ứng dụng chúng trong khử nhiễm aflatoxin trên ngô và trên lạc. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu - Phân lập một số chủng Flavobacterium aurantiacum từ một số mẫu đất thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. - Phân lập một số chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản, thực phẩm như quýt, xoài, gạo mốc, bánh men thuốc bắc. - Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Flavobacterium aurantiacum phân lập được. - Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Rhizopus delemar phân lập được. PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đại cương về độc tố nấm mốc Độ tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [14]. Ngoài tự nhiên có rất nhiêu loài nấm khác nhau phát triển trên các sản phẩm ngũ cốc, hạt bông, lúa mì và nhiều loại hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, chỉ có một vài loài nấm có thể sinh độc tố và ảnh hưởng đến gia súc, gia cầm và con người. Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại giữa kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của nấm mốc. Độc tố nấm là sản phẩm của sự chuyển hóa thứ cấp trong quá trình phát triển của nấm mốc [6]. Quá trình trao đổi thứ cấp được hiểu là quá trình tạo thành các chất mà vai trò sinh lý của chúng chưa được rõ,chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế bào đó. Sự chuyển hóa thứ cấp thường xảy ra ở cuối giai đoạn phát triển của tế bào nấm mốc. Tính độc của những loài nấm lớn nhất định đã được biết đến từ lâu, nhưng đến năm 1960 Bệnh độc tố nấm mốc mới được nghiên cứu sâu. Khi đó, cả thế giới bàng hoàng bởi hơn 100 000 con gà tây ở nước Anh đã chết vì bệnh X khi ăn lạc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus. Những số liệu có giá trị về các mycotoxin và các bệnh về mycotoxin đã được thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Nghiên cứu về động vật thực nghiệm đã cho thấy tính độc của mycotoxin là rất lớn. Bệnh nấm mốc ở người và động vật đều không có khả năng lây lan vì chúng do tác nhân độc tố (hóa học ) gây ra.Tuy nhiên, hầu như tất các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩm của con người. Khi gia súc ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con người. Độc tố nấm mốc đã thu hút sự quan tâm của toàn cầu bởi chúng đe dọa đến sức khỏe con người và động vật cũng như sự thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế [8]. Điều này đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị, hội thảo quốc tế , tạp chí và các bài nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết này. Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Nhưng chỉ có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và thường liên quan đến an toàn thực phẩm. 2.2. Độc tố aflatoxin Năm 1961, Butler là người đã xác định được loài nấm Aspergillus flavus tiết ra độc tố gây bệnh X ở gà tây và ông đặt tên là aflatoxin là viết tắt của Afla và toxin. Trong các mycotoxin thì aflatoxin được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện. Các aflatoxin gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocaumarin, là sản phẩm trao đổi chất, tạo bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus được đặt tên là B1, B2, G1, G2. Các aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liên quan đến aflatoxin B1, G1 và aflatoxin B2, G2 là dẫn xuất dihydro của các hợp chất mẹ. Các aflatoxin M1 và M2 là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B1 và B2 theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo như sau: OCH3 O O O O O Aflatoxin B1 Aflatoxin M2 OH OCH3 O O O O O Aflatoxin B2 O O O O O OCH3 Aflatoxin M1 OH OCH3 O O O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin G1 O O O O OCH3 O O Aflatoxin G2 Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển), và G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk). Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G1, còn B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn. Các aflatoxin phát quang mạnh khi ở dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp(0,5 ng hay thấp hơn trên một vết sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định lượng. Aflatoxin M1 ở nồng độ 0,22mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng. Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform và metanol, đặc biệt tan nhiều trong dimetylsulfoxit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin và các động vật thực nghiệm). Tính tan của aflatoxin trong nước giao động từ 10 -20 mg/l. Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong không khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để trong không khí dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt hòa tan ở các dung môi có độ phân cực cao. Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy phá hủy điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, lạc rang đã làm giảm đặc biệt lượng các aflatoxin và các aflatoxin có thể bị phá hủy hoàn toàn với việc xử lí mạnh bằng amoniac hay hypochlorit. Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm. Đặc tính này là quan trọng trong quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lí kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin của các sản phẩm. Tuy nhiên, nếu xử lí kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu. Moreau và cộng sự khi nghiên cứu tính chất của aflatoxin đã đưa ra những kết quả sau: Bảng 2.1. Tính chất hóa lý của một số aflatoxin Aflatoxin Công thức phân tử Trọng lượng phân tử Nhiệt độ nóng chảy Huỳnh quang * ** *** B1 C17H12O6 312 268-269 265-270 252-266 Xanh lam B2 C17H14O6 314 286-289 305-309 280-283 Xanh lam G1 C17H12O7 328 244-246 247-250 246-247 Xanh lục G2 C17H14O7 330 229-231 237-240 Xanh lục M1 C17H12O7 328 299 Xanh lam tím M2 C17H14O7 320 293 Tím Ghi chú: * Kết quả của Townsend ** Kết quả của Stubblefield và cộng sự. *** Kết quả của Beljaars. 2.2.1. Sự tạo thành aflatoxin do các nấm mốc Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu được thấy ở hai chủng A.flavus và A.parasiticus. Các chủng tạo aflatoxin của A.flavus là rất phổ biến và thường được phân lập từ các nguồn khác nhau như lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa... Theo số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân lập của A.flavus có khả năng tạo aflatoxin. Ngoài hai loài A.flavus và A.parasiticus còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh aflatoxin nhưng yếu hơn như A.nominus (Samson 2001, Varga etall 2003) và A.bombycis (Varga et all 2003). Sản lượng aflatoxin thường tỉ lệ với trọng lượng với hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu thì sản lượng aflatoxin lớn nhất, nhưng giảm sút nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải. Sự sản sinh aflatoxin trong điều kiện nuôi cấy thông thường bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của A.flavus, nó tăng dần đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin như chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nước, các yếu tố môi trường… Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 12oC, 27oC và 40 – 42oC theo thứ tự. Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường không thích hợp, nhưng khả năng sinh độc tố cũng có thể tăng khi chủng nấm mốc được cấy chuyển trên môi trường thích hợp. Môi trường có bổ sung nấm men hoặc pepton hoặc là các axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 28oC) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin. 2.2.2. Sự nhiễm aflatoxin trên ngô và lạc. Cho tới nay, sự có mặt của aflatoxin được phát hiện trên nhiều loại nông sản, thực phẩm của trên 50 nước ở hầu hết các châu lục. Aflatoxin đã làm thiệt hại kinh tế cho nghành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn [9]. Theo đánh giá của FAO, hiện tại ước lượng có khoảng 25% tất cả các loại ngũ cốc bị ảnh hưởng bởi độc tố nấm mốc [10]. Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trên nhiều loại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung được xác định trên lạc và trên ngô là chủ yếu. * Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc trên thế giới Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự [13] cho thấy sự nhiễm aflatoxin trên ngô do nấm Aspergillus flavus gây nên là vấn đề nghiêm trọng ở các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A.flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0 -100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb). Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ngoài đồng không tương quan với với sự nhiễm A.flavus. Tuy nhiên, 84% A.flavus phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo aflatoxin. Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 400μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 133μg/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% mẫu ở đảo Cebu, Philippin trung bình 213μg/kg [18]. Theo Goto và cộng sự [12], 80 -85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái Lan đã nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb. Còn đối với lạc, trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở nước Mĩ cho thấy 15% của 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg. Stoloff, Krof và Hald đã tìm thấy aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465μg/kg. Các aflatoxin đã tìm thấy ở 41% số mẫu của tất cẩ các mẫu bơ lạc được kiểm tra năm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg và giá trị trung bình 500μg/kg. * Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở Việt Nam Ở nước ta cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu và thấy rằng mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô miền Nam và miền Bắc Việt Nam là tương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25% ppb đối với các tỉnh khác nhau [3]. Đậu Ngọc Hào [6] xác định tỉ lệ nhiễm aflatoxin B1 trong 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỉ lệ nhiễm trên ngô hạt là 33%, ngô bột là 74,2%, khô lạc là 84,7%. Theo kết quả nghiên cứu của Viện y tế cộng đồng TPHCM gần 95% thức ăn gia súc có chứa aflatoxin B1, bên cạnh đó thực phẩm sử dụng cho con người cũng có chứa loại độc tố này (68% mẫu lạc và các sản phẩm từ lạc) [8]. Ngoài ra còn có Đặng Hồng Miên nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc [5]. 2.2.3. Độc tính của aflatoxin Aflatoxin là một độc tố rất độc, nhất là aflatoxin B1. Cơ quan chịu tác động của aflatoxin lớn nhất là gan. Trong cơ thể động vật, aflatoxin gắn với ARN và AND thành dạng liên kết, cản trở việc sinh tổng hợp ADN, ARN và protein, gây đột biến dẫn đến ung thư và làm suy giảm hệ miễn dịch. Sự liên kết của aflatoxin với protein làm vô hoạt các enzym, thay đổi tính chất của ty thể, lạp thể, suy giảm quá trình hô hấp mô bào [11]. Tình trạng nhiễm độc mãn tính aflatoxin đã dẫn đến ung thư gan ở nhiều loài chuột, cá hồi, vịt và khỉ. Ngoài ra còn thấy u ở thận, túi mật, tụy, bọng đái, xương của động vật thí nghiệm [12]. Elis và Dipaolo đã chứng minh rằng việc tiêm aflatoxin B1 vào chuột theo đường bụng với liều 4μg/kg thể trọng đã gây cho thai chuột bị quái thai hoặc chết [báo cáo tổng kết]. Với những con vật bị nhiễm độc aflatoxin mãn tính chúng thường kém ăn, chậm lớn, có thể sút cân, tổn thương ở gan, gan bị tụ máu có vùng chảy máu và hoại tử, tăng sinh biểu mô ống dẫn mật. Ở hàm lượng thấp tuy không gây chết nhưng aflatoxin đã mở đường cho các bệnh truyền nhiễm xâm nhập do nó tác động làm suy giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch tế bào và cả sức đề kháng chung của cơ thể [27]. Aflatoxin có thể tác động tương hỗ với sự thiếu vitamin, thiếu protein, nhiệt độ không thuận lợi và các yếu tố truyền nhiễm để gây hại. 2.2.4. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe con người Hiện nay, vấn đề thực phẩm bị nhiễm aflatoxin đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học vì nó đe dọa đến sức khỏe của con người. Aflatoxin liên quan tới bệnh ung thư gan nguyên phát ở người. Nhiều tài liệu nghiên cứu về ung thư tế bào gan chứng minh đó là bệnh chung của các vùng có lương thực bị nhiễm nấm mốc A.flavus mà chất độc là nhóm aflatoxin. Bảng 2.3 dưới đây cho thấy mối tương giữa tỉ lệ người bị mắc bệnh ung thư gan với hàm lượng aflatoxin có trên thực phẩm. Bảng 2.2. Tỉ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình có trên thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993) Tên nước hoặc vùng Hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm (μg/kg) Tỉ lệ người mắc ung thư gan trên 105 người/năm Vùng cao Kenya Songkha (Thái Lan) Thảo nguyên vùng cao (Thụy Sỹ) Vùng cao trung bình Kenya Thảo nguyên cao trung bình (Thụy Sỹ) Vùng thấp Kenya Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ) MôZămbic 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 1,5 7,8 1,2 2,0 2,2 2,5 3,8 4,0 9,2 13,0 2.2.5. Giới hạn aflatoxin cho phép Trước thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao cũng như tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hưởng của nó đối với sức khỏe con người, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn aflatoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm (bảng 2.4): Bảng 2.3. Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA Nước Giới hạn aflatoxin tối đa cho phép Loại thức ăn Mỹ 20 ppb Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau 20 ppb Hàm lượng tối đa cho phép trong thức ăn cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu bột ngô Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho người Canada 15 ppb Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số tất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 Úc 15 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và lạc Nhật 10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1 100 ppb Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Trung Quốc 5 – 20 ppb Ngũ cốc, đậu tương và dầu thực vật 10 – 50 ppb Trong các loại thực phẩm khác Châu Á 30 ppb Tất cả các loại lương thực, thực phẩm 120 ppb Trong các sản phẩm từ lạc Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định về hàm lượng tối đa aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) được tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm (ppb). Bảng 2.4. Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam Loại vật nuôi Aflatoxin B1 Tổng số các aflatoxin Gà con từ 1 – 28 ngày tuổi < 20 <30 Nhóm gà còn lại <30 <50 Vịt con từ 1 – 28 ngày tuổi Không có <10 Nhóm vịt còn lại <10 <20 Heo con theo mẹ từ 1 – 20 ngày tuổi <10 <30 Nhóm heo còn lại <100 <200 Bò nuôi lấy sữa <20 <50 2.3. Biện pháp ngăn ngừa hạn chế nấm mốc Có nhiều công trình nghiên cứu về hạn chế độc tố nấm mốc trong lương thực cũng như thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều loại thuốc diệt nấm trên ngô, lúa mì, lạc và gạo có tác dụng tốt trong hạn chế sự phát triển của nấm mốc trên các cây này. Một số tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ chất dinh dưỡng trong đất nhằm hạn chế sự tấn công của nấm mốc đối với các loại lương thực. Một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nấm mốc đi theo hướng khác đó là tạo ra giống cây trồng có khả năng ức chế và chống lại sự phát triển của nấm mốc. Đối với các nước đang phát triển, việc áp dụng các biện pháp luân canh cây trồng trên cùng một đơn vị diện tích là một trong những biện pháp khá phổ biến nhằm hạn chế tác hại của nấm mốc. Tuy nhiên, biện pháp này chỉ có tác dụng trong những năm đầu tiên, sau đó bào tử nấm thích ứng và có thể tồn tại rất lâu trong đất, vì vậy việc luân canh không còn tác dụng nữa. Để bảo quản lương thực, thực phẩm được tốt thì việc áp dụng nhiều biện pháp như thu hoạch ngũ cốc đúng thời gian, không làm hỏng hoặc hoặc trầy xước lớp vỏ bảo vệ, phơi khô đúng độ ẩm cho phép và bảo quản trong phòng có hệ thống hút ẩm là cần thiết và chi phí thấp nhất. Trong bảo quản lương thực, có nhiều nghiên cứu và ứng dụng các phương pháp hạn chế sự phát triển của nấm mốc bằng hóa chất. Tuy nhiên, kết quả ứng dụng các loại hóa chất diệt nấm trong thực phẩm rất hạn chế vì chúng có thể gây độc. Vì vậy, việc bảo quản lương thực, thực phẩm cũng như các loại thức ăn chăn nuôi khỏi sự tấn công của nấm mốc còn gặp nhiều khó khăn. 2.4. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm aflatoxin có thể là đưa những biện pháp kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây ra. Song những biện pháp như vậy là rất khó thực hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổi cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Các thực nghiệm với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông nghiệp về sự nhiễm aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là không thể tránh được. Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế, cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩm và thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được. Các phương pháp khử aflatoxin bao gồm phương pháp vật lí, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. 2.4.1. Phương pháp vật lí * Các qui trình phân loại Phương pháp sử dụng rộng rãi nhất là loại trừ chọn lọc các phần bị nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm. Các quy trình phân loại dựa trên các đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng một cách khá thành công đối với lạc ăn. Phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt. Tuy nhiên, do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biện pháp này không thể nói là hiệu quả 100%. * Các quy trình chiết suất bằng dung môi Việc chiết suất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện: - Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách căn bản trong điều kiện thuận lợi. - Ít có khả năng tạo những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng từ aflatoxin. - Trong nhiều trường hợp, việc chiết suất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất mát chất dinh dưỡng. Nhưng việc chiết suất bằng dung môi có một số bất lợi: - Cần phải có thiết bị chiết suất dung môi đặc biệt; - Sẽ chiết suất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin; - Giá thành của việc chiết suất cao; - Có thể mất mùi của sản phẩm xử lý. Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu suất thu hồi chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa, độc tính của dung môi, dư lượng của chúng và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy dễ nổ và điểm sôi của dung môi. Các aflatoxin có thể được chiết suất bằng các dung môi như cloroform/nước, aceton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hỏa/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nước, và hexan –aceton - nước. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg. 2.4.2. Phương pháp khử độc tố bằng hóa chất Nhiều hóa chất có thể khử aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin; - Nó phải không tạo ra hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc tố hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng; - Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúng có thể tái nhiễm lại sản phẩm; - Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêu chuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy aflatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Những hóa chất này bao gồm hydrogen peroxit hay những hóa chất tương tự, hypochlorit, dimetylamin hay metylamin và amoniac. Trong số này, hydrogen peroxit , natri hydrixit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn. Trong khi đó, dimetylamin hay các amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu hay ngô. Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng rộng rãi trong việc xử lý các thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Về cơ chế, ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến aflatoxin B1 bởi amoniac. Ở nước ta, Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tố aflatoxin B1 trên ngô và khô lạc bằng hóa chất. Kết quả cho thấy NH3 nồng độ 6% hoặc Ca(OH)2 có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin [1]. Nhưng giá xử lý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac đã để lại mùi khó chịu cho ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực tế ở Việt Nam. 2.4.3 Khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc. 2.4.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân hủy aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả ở môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B1 của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật, lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai trò quan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B1 bằng chất chiết của Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan Quản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm. 2.4.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng Rhizopus delemar Zhu C.R. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin. Aflatoxin B1 được đưa và nước uống của chuột nhắt cái ở liều 126 μg trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,4 mg trong thời gian 27 tuần. Chất chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn dung dịch aflatoxin B1. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18, 30, 38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B1, tai biến ung thư gan là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B1, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzym đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có con chuột nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan. Kết quả thực nghiệm này cho thấy rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính gây ung thư gan của aflatoxin B1. Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin. Từ kết quả nghiên cứu này, Rhizopus delemar đã được Cộng đồng Châu Âu khuyến cáo sử dụng như một tác nhân sinh học để khử nhiễm aflatoxin trong thức ăn gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng. PHẦN 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu * Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 40 mẫu đất của các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên để phân lập vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum. * Để phân lập các chủng Rhizopus delemar có khả năng khử aflatoxin, chúng tôi đã thu thập: - 8 mẫu bánh men thuốc bắc tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh - 7 mẫu xoài tại các chợ của Hà Nội - 6 mẫu quýt tại các chợ của Hà Nội - 4 mẫu gạo mốc 3.1.2. Môi trường * Môi trường M1: 5 gram pepton 2 gram cao thịt 0,2 gram cao nấm men 3 gram NaCl 20 gram aga 1000 ml nước máy pH = 7,2-7,4 Đun cho tan chảy aga, thử pH = 7,2-7,4 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. * Môi trường PDA: 200g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4500ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây. 1000 ml dịch chiết khoai tây 20 gram glucoza 20 gram aga Đun cho tan chảy aga, thử pH = 6 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. * Môi trường Sabouraud: 40 gram glucoza 20 gram pepton 20 gram aga 1000 ml nước máy pH = 5,5 – 5,8 Đun cho tan chảy aga, thử pH = 5,5 – 5,8 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. 3.1.3. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin * Na2SO4 khan (Trung Quốc) * NaHClO, Nhà máy hóa chất Việt Trì * Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc) * Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma) * Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức cho sắc ký lớp mỏng 3.1.4. Dụng cụ thí nghiệm * Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ * Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức * Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc * Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật * Phễu chiết * Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc * Bơm tiêm vi lượng Hamilton * Máy cô chân không * Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ) * Máy đánh sóng siêu âm * Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh * Máy cất quay chân không (Đức) * Tủ cấy vô trùng (Đức) * Nồi hấp tự động (Đài Loan) * Máy đánh vovtex 3.2. Phương pháp 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu đất Chọn những ruộng lúa hay ruộng rau có đất màu mỡ. Dùng dao gạt bỏ 10cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng ._.