Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm

actone này đã được sử dụng để tạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của các loại thực phẩm…Tuy nhiên tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khó khăn và không mang lại hiệu quả kinh tế cao. Thực tế các g-lactone được tổng hợp từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Dầu thầu dầu là loại nguyên liệu rất lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của nó là acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng hợp các lactone. Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta rất sẵn có và rẻ tiền nhưng việc sử dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn rất mới mẻ. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm ” với các mục tiêu sau: - Phân lập từ tự nhiên các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm g-decalactone. - Tuyển chọn các chủng nấm men từ bộ sưu tập giống của Viện CNTP - Tách chiết g-decalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ định tính, định lượng bằng sắc ký khí. phần i: Tổng quan tài liệu 1.1. Đại Cương về nấm men Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm chung sau[3]: nói chung có tồn tại trạng thái đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trường có chứa đường cao, có tính acid cao. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả rau, dưa, mật mía, rỉ đường, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ. Là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh gồm có: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân, ty thể, 1-2 không bào…Kích thước tế bào nấm men lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào khoảng 8-15 mm do đó có thể thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Hình thái tế bào nấm men rất đa dạng và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van, hình elip, hình cong, hình thoi, hình tam giác, hình thận, hình lưỡi liềm, hình mũ…Nấm men có cả hai hình thức sinh sản hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, và nhiều chi nấm men thuộc bộ Endomycetales. Nấm men thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khí các hợp chất hữu cơ ngoại bào [4]. Trong quá trình sinh sống và phát triển nấm men cần những nguồn dinh dưỡng như: nguồn cacbon, nguồn nitrơ, các nguyên tố khoáng và các chất sinh trưởng. Đồng thời trong quá trình sinh sống nấm men cũng tổng hợp nên các chất hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con người đã và đang sử dụng chúng để phục vụ cho đời sống của mình. Rất nhiều loại nấm men được ứng dụng trong sản xuất như: công nghiệp sản xuất rượu, bia, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipit nấm men, các enzym như amilaza, invertaza, lactaza, uricaza, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic, riboflavin, các acid amin như lizin, cystein, methionin...Cũng có rất nhiều loài nấm men đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành g-decalacton và đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất g-decalactone như: Candida guilliermondii, Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13], Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinus [11]… 1.2. Dầu thầu dầu 1.2.1. Cây thầu dầu [1] Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét. Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-12m. Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng, phiến lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưa không đều. Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai mềm. Hạt hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng. Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt Nam, ấn Độ, Brazin…Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với mục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu dầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới. 1.2.2. Dầu thầu dầu Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầu dầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly. Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi vị nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định rõ ràng, theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerit chung như stearin, palmitin còn có một một glycerit đặc biệt là ricinolein là thành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic). Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau: Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic ) Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,10] Acid Dầu Brazin (%) Dầu ấn độ (%) Ricinoleic acid 83-90,00 87,4-90,4 Linoleic 3,19-5,98 2,9-4,0 Oleic 2,96-5,64 2,5-4,0 Stearic 0,68-1,84 0,9-1,3 Palmitic 0,87-2,35 0,8-1,3 Dihydrostearic - 0,5-0,8 Encozenic - 0,6-1,6 Linoleic 0,34-0,91 0,1-1,1 Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có thay đổi theo nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic. 1.3. [R]- g-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng Các g-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó g-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. g-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong quả đào và một số loại hoa quả khác. g-Decalactone là một ester nội phân tử của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ 70-100 0 C sẽ đóng vòng để tạo g-decalactone [8]. ở điều kiện thường g-decalactone là một chất lỏng trong suốt không màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu. Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl acetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau[7,26]: + Công thức phân tử: C10H18O2 (M=170) + Công thức cấu tạo: + nhiệt độ sôi: 281 0 C + Tỷ trọng : 0,952 + Mùi: Hoa quả và bơ sữa. g-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực phẩm. Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sách những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao nhất từ 5 –20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400 ppm[23]. Trên thế giới g-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng. Nó được dùng làm chất tạo hương thơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa, sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]... Trong tự nhiên, g-decalactone có mặt trong một số loại hoa quả như: mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20 mg/kg...một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử g-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự nhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là [R]-g-decalactone và [S]-g-decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang học R được tìm thấy nhiều hơn. Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượt trội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới. 1.4. Tổng hợp g-decalactone nhờ vi sinh vật [18]. g-Decalactone được tổng hợp qua hai con đường: tổng hợp sinh học (biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đường biến đổi sinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp g-decalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợp sinh học. 1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic) Là con đường tổng hợp g-decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp g-decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là người đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt của g-decalactone trong môi trường nước thịt lên men các chủng Basidomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều các báo cáo khoa học về việc tổng hợp g-decalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng g-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng Sporobolomyces odorus để tổng hợp g-decalactone nhưng hiệu suất thu được rất thấp (1mg/1 liter môi trường)…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản xuất g-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc sinh lý học với tổng hợp g-decalactone. 1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation) g-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ vi sinh vật. acid ricinoleic đầu tiên bị biến đổi thành acid 4-hydroxy-decanoic sau đó đóng vòng lacton để tạo ra g-decalactone . Con đường biến đổi ricinoleic acid tạo g-decalactone Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp g-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [9,11,12,13,14, 22, 24, 26]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành g-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất g-decalacton và một số lactone khác[9, 11, 13, 22, 25 ]. Chủng VSV Năm Nguyên liệu Sản phẩm Giống Pityrosporum: P.canis P.achydermatis P.orbiculare P.ovale 1980 Acid oleic g-decalactone g-hexa g-hepta g-octa… Aspergillus oryzae Geotrichum klebahnii Yarrowia lipolytica Candida guilliermondii Candida albicans Candida krusei Candida parakrusei Candida pseudotropicals Candida stellatoidea Candida tropicalis Candida rugosa Hansenula saturnus 1982 Dầu thầu dầu Dầu thầu dầu thuỷ phân Acid ricinoleic g -decalactone Aspergillus niger Cladosporium suaveolens Phanerochaetechrysosporium Pichia etchellsii 1989 Dầu thầu dầu Dầu hướngdương Dầu dừa g-decalactone g-octanolied g-decanolied Sporobolomyces odorus Rhodotorula glutinus 1990 Dầu thầu dầu g-decalactone g-hydroxy-decanoic acid Yarrowia lipolytica HR 145 (DSM 12397) 2001 Dầu thầu dầu g-decalactone Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành g-decalactone ở vi sinh vật. Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là qúa trình b-oxi hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase (Aox). Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của VSV [2]. Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, như đã biết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra g-decalactone. Yves Wache [27,28] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5) được mã hoá bởi các gen Pox1->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá enzym Aox3 ( chuỗi ngắn-short chain ) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổng hợp g-decalactone. ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng g-decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã ( Từ 50mg/l lên đến 220mg/l sau 24 h ). ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy-g-decalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng ở chủng hoang dã quá trình b-oxi hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-Acyl-Coenzym A Hydrogenase. Con đường b-oxi hoá biến đổi methyl ricinoleate tạo g-decalactone ở nấm men Yarrowia lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [28]: + Sản phẩm tạo thành: 1: Dec-3-en-4-Olide 2: g-Decalactone 3: Dec-2-en-4-Olide 4: 3-hydroxy-g-Decalactone 5: 3-keto-g-Decalactone + Hệ enzymes: Aox: Acyl Coezym A oxidase Ahy: Acyl Co A Hydratase Hdh: 3-hydroxy g-Decalactone Thi : 3keto acyl Co A thiolase. Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị Dầu thầu dầu: Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công nghiệp. Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng ở Bắc Ninh. Acid ricinoleic: Do viện Công nghiêp Thực Phẩm cung cấp Chủng giống: 64 chủng nấm men trong bộ sưu tập của viện CNTP được tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu. Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viên Pasteur, Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây… Hoá chất: + Etyl acetat (Trung Quốc) + Agar + Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco) + Dịch chiết Malt-glu 20 0 Bx + (NH4)2SO4 + n-Hecxan ( Trung Quốc) + g-Decalactone chuẩn + HCL 37% Thiết bị và dụng cụ: + Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp ) + Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật ) + Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật ) + Máy lắc bình tam giác Lab-line ( Mỹ ) + Máy ly tâm Universal 16 Hettich + Lò vi sóng LG ( Hàn Quốc ) + Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật ) + Máy sắc ký khí Aligent 6890 A/ USA + Đĩa petri, ống eppendoff, ống nghiệm có nắp vặn, ống fancol, pipet, bình tam giác… 2.1.2. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu Môi trường 1: + Chất khoáng : (*) + Nguyên tố vi lượng : (**) + Dịch chiết nấm men 5 % : 2ml + (NH4)2SO4 : 5 g + Thêm nước vừa đủ : 1lit (*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit) KH2PO4 : 850 mg K2HPO4 : 150 mg MgSO4.7.H2O : 500 mg NaCl : 100 mg CaCl.6.H2O : 100 mg (**) Thành phần nguyên tố vi lượng (trong 1 lit) H3BO3 : 500 mg CuSO4.5.H2O : 400 mg KI : 100 mg FeCl3. 6 H2O : 200 mg MnSO4.4H2O : 400 mg Na2MoO4.2H2O : 200 mg ZnSO4.7H2O : 400 mg Môi trường 2: môi trường yeast-nitrogen 10% + Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g) + Nước cất vừa đủ 100 ml Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difco gồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự phát triển của nấm men. Môi trường 3: + Pepton 2g + Dầu thầu dầu 10g + Tween 80 20 ml + Nước cất vừa đủ 100 ml Môi trường 4:môi trường làm sạch lần một: + Dịch Malt –gluco 20Bx : 100 ml + Agar : 20g + Nước cất vừa đủ : 1lit Hấp ở 120 0C/ 1atm / 20 phút, sau khi để nguội tới 80 0C bổ xung 0,1 % acid lactic và đổ thạch đĩa. Môi trường 5: môi trường làm sạch lần 2 Thành phần như môi trường làm sạch lần 1nhưng không bổ xung acid lactic Môi trường 6: môi trường phân lập và giữ giống Thành phần như môi trường làm sạch lần 2 2.1.3 Phương pháp thực nghiệm Phương pháp phân lập nấm men sử dụng Ricinoleic acid : + Nguyên tắc: Để phân lập nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic chúng tôi sử dụng môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất là acid ricinoleic. Nếu nấm men mọc có nghĩa chúng phải oxy hoá được acid ricinoleic. Những chủng có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic được kiểm tra khả năng tạo mùi thông qua đánh giá cảm quan. + Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường 1 đong vào các ống nghiệm loại 10 ml có nắp vặn , mỗi ống 3ml. Bổ xung 30 ml acid ricinoleic / ống. Hấp thanh trùng ở 120 0C / 20 phút. + Lấy mẫu: - Mẫu đất: Dùng que vô trùng lấy đất trên bề mặt vào bình thuỷ tinh vô trùng. - Lá và hoa: Được lấy vào túi ni long sạch. + Xử lý mẫu: - Dùng kéo đã thanh trùng cắt nhỏ khoảng 2 g lá cây (1cm) và cho vào ống fancol chứa 20 ml nước cất vô trùng (Với mẫu đất cho khoảng 4 gam). - Lắc nhẹ và ngâm khoảng 10 phút. - Lắc mạnh trong 1-2 phút. - Để lắng trong vài chục giây, sau đó hút 1 ml dung dịch vào ống eppendorf. - Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. - Hút bỏ 900 ml phần dịch trong, trộn đều phần còn lại và nhỏ toàn bộ vào ống chứa môi trường chọn lọc. + Nuôi cấy: Nuôi cấy lắc trên giá ống nghiệm, chỉnh tốc độ lắc sao cho toàn bộ phần dịch bị khuấy trộn. Sau 1-2 tuần, tuỳ theo mức độ phát triển có thể tiến hành phân lập nấm men. + Phân lập : Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường 5 - Lắc đều dịch nuôi cấy - Nhúng que cấy vào canh trường và cấy lên mặt thạch vài lần - Di que cấy theo hướng từ vị trí ban đầu ra các phía để tách từng khuẩn lạc riêng rẽ. Sau 3- 5 ngày ta chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy lên đĩa thạch chứa môi trường làm sạch lần 1. Khi VSV đã mọc ta chọn một khuẩn lạc riêng rẽ cấy lên môi trường làm sạch lần 2. Qua 2 lần làm sạch ta có thể chọn được các giống thuần chủng, các chủng mới được giữ giống trong ống eppendrof ở 5 0 C. + Thử hoạt lực của các chủng phân lập được: Chuẩn bị môi trường 1 và đong vào các ống nghiệm 10 ml có nắp khoảng 3 ml/ống. Bổ xung 30ml acid ricinoleic/ống. Hấp thanh trùng ở 1 atm/20 phút. Các chủng đã phân lập được cấy vào các ống nghiệm có chứa môi trường trên. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí (mở 1/4 nắp ống nghiệm) nhiệt độ 25 0C, lắc 320 vòng /phút. Theo dõi mùi tạo ra hàng ngày trong thời gian 2 tuần để chọn chủng có khả năng tạo hương thơm. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu từ bộ sưu tập giống của Viện CNTP: Các chủng giống được giữ trong ống eppendorf trong tủ lạnh được cấy truyền sang môi trường 6 trên thạch nghiêng để hoạt hoá chủng. Pha môi trường 2 đong vào các ống nghiệm 2ml/ống. Bổ xung 20ml acid ricinoleic /ống nuôi cấy ở điều kiện: rung lắc 320 vòng/phút, 25 0C và theo dõi mùi tạo ra trong 14 ngày. Quan sát hình dạng tế bào của một số chủng nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành chất thơm: Các chủng nấm men được cấy truyền từ ống giữ giống lên môi trường Malt-Glu 2 0 Bx 2 % Agar và quan sát trên kính hiển vi quang học để sơ bộ xác định hình thái và sơ bộ định tên. Lên men và tách chiết chất thơm tạo thành từ môi trường nuôi cấy các chủng tạo hương + Chuẩn bị chủng giống: chủng giống được cấy tryuền từ ống eppendorf sang thạch nghiêng, sau 2-3 ngày có thể sử dụng cho lên men. + Chuẩn bị môi trường: chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml môi trường 2% pepton, 0.02 % Tween 80, 10 gam dầu thầu dầu. Tween 80 được cho vào ở đây nhằm làm tăng khả năng nhũ hoá của dầu thầu dầu giúp cho vi sinh vật có thể sử dụng tốt hơn. Môi trường được hấp thanh trùng ở 120 0C /1 atm /20 phút. Cấy khoảng một vòng que cấy chủng vào môi trường nuôi cấy, lắc đều. Đặt các bình nuôi cấy chủng trong điều kiện rung lắc ở 200 rpm, nhiệt độ 25 0C, pH môi trường được giữ ở 6,5-7 trong thời gian 8 ngày. Sau 8 ngày kết thúc quá trình lên men pH được chỉnh về 1,5 bằng dung dịch acid HCl 2 %. Đun nóng ở 100 0C trong 10 phút để thực hiện phản ứng đóng vòng lacton. Sau khi làm lạnh chiết bằng dung môi n- hecxan. Ly tâm dịch chiết để loại bỏ cặn. Hút lấy dịch trong vào ống Fancol giữ trong tủ lạnh để sử dụng cho việc định tính và định lượng chất thơm tạo ra bằng sắc ký khí. Định tính và định lượng chất thơm tạo thành trong các dịch chiết n-hecxan bằng sắc ký khí Định tính chất thơm trong dịch chiết bằng cách so sánh đối chiếu vị trí của pic tương ứng trên sắc đồ trùng với pic của chất chuẩn đối chiếu. Định lượng chất thơm tạo thành bằng cách tính diện tích pic của chất chuẩn đã biết chính xác hàm lượng từ đó suy ra lượng chất chuẩn có trong mẫu thử . So sánh lượng g-decalacton tạo thành của chủng KFP 346 khi nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau: Nuôi cấy chủng KFP 346 theo các cách sau: + Cách 1: Pha 100ml môi trường 1 trong bình tam giác. Hấp thanh trùng ở 1atm/20 phút. Cấy khoảng 1 vòng que cấy chủng. Sau thời gian nuôi cấy 10 ngày ở điều kiện lắc 150 vòng/phút, 250C. Sau cùng chiết bằng 50 ml dung môi etylacetat. Ly tâm loại chất bẩn. + Cách 2: khác cách 1 ở điểm: sau 10 ngày nuôi cấy thực hiện phản ứng đóng vòng lacton bằng cách acid hoá môi trường bằng d d HCl 2% đến pH 1,5. Đun nóng ở 100 0 C trong 10 phút. Làm lạnh và chiết bằng 25 ml dung môi n-hecxan. Sau cùng ly tâm loại chất bẩn + Cách 3: chuẩn bị 100 ml môi trường 3 vào bình tam giác. Hấp thanh trùng ở 1atm/20 phút. Cấy khoảng một vòng que cấy chủng. Nuôi cấy trong điều kiện rung lắc 200 vòng /phút, nhiệt độ 25 0C, pH môi trường được giữ ở 6,5-7 trong thời gian 8 ngày. Sau 8 ngày kết thúc quá trình lên men pH được chỉnh về 1,5 bằng dung dịch acid HCl 2 %. Đun nóng ở 100 0C trong 10 phút. Sau khi làm lạnh chiết bằng dung môi n-hecxan. Ly tâm loại cặn. Các dịch chiết trên được ký hiệu theo thứ tự KFP 346.1; KFP 346.2; KFP 346.3 và được giữ trong tủ lạnh để chạy sắc ký khí. 2.2 Kết quả thực nghiệm 2.2.1 Phân lập các chủng nấm men chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm Từ 28 mẫu lá cây, hoa và đất chúng tôi phân lập được 70 chủng nấm men (HRA1-HRA70), trong đó có 41 chủng được phân lập từ lá, 18 chủng được phân lập từ hoa và 11 chủng được phân lập từ đất. Sau khi thử hoạt lực chúng tôi tìm được 5 chủng (HRA 1; HRA 2; HRA 51; HRA 55; HRA 61 ) có khả năng tạo mùi thơm. Bảng 3: ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo mùi thơm của 5 chủng HRA 1, HRA 2, HRA 51, HRA 55, HRA 61 Chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày S M S M S M S M HRA 1 - - - - + Thơm ++ Hắc HRA 2 - - - - + Thơm ++ Hắc HRA 51 - - + Thơm + Thơm ++ Hắc HRA 55 - - + Thơm + Hắc ++ Hắc HRA 61 - - + Thơm + Hắc ++ Hắc Nhận xét: Trong số các chủng phân lập từ tự nhiên chỉ có chủng HRA 51 tạo mùi thơm mạnh và tồn tại lâu hơn trong môi trường. Qua quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi thì chủng HRA 51 được sơ bộ xếp vào chi Candida. Trong số các chủng tạo hương thì có tới 3 chủng: HRA 51; HRA 55; HRA 61 thuộc chi Candida. Điều đó có thể đi tới kết luận nấm men thuộc chi Candida có nhiều đại diện có thể chuyển hoá acid ricinoleic. 2.2.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu từ bộ sưu tập giống của Viện CNTP: Từ 81 chủng giống trong bộ sưu tập của viện Công Nghiệp Thực Phẩm sau khi thử khả năng chuyển hoá acid ricinoleic, chúng tôi tuyển chọn được 7 chủng (KFP 346; KFP 145; KFP 116; KFP 304; KFP 248; KFP 254; KFP 265) có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành chất thơm trong đó có 3 chủng tạo mùi rất tốt (KFP 346, KFP145, KFP 248), rất giống mùi của g-decalacton được đem phân tích bằng sắc ký khí. Trong số các chủng có khả năng tạo hương chủng KFP 346 được đánh giá theo cảm quan là tốt nhất. Mùi thơm được nhận thấy chỉ sau 1 ngày và tăng dần theo thời gian cho đến khi acid ricinoleic được chuyển hoá hết là lúc môi trường nuôi cấy không còn các hạt dầu. Thông thường ở các chủng còn lại tại một thời điểm nhất định mùi tạo ra là tốt nhất sau đó mùi chuyển sang hắc, nhưng riêng chủng KFP 346 mùi thơm tồn tại rất lâu trong môi trường và cho đến khi acid ricinoleic được chuyển hoá hết mùi thơm không bị mất đi hay chuyển sang hắc. Điều đó có thể giải thích rằng quá trình chuyển hoá acid ricinoleic nhờ chủng KFP 346 chỉ dừng lại ở việc tạo ra chất thơm đó mà không tiếp tục chuyển hoá nó thành các chất đơn giản hơn. 2.2.3. Quan sát hình thái tế bào của một số chủng tạo hương: Qua quan sát hình ảnh tế bào trên kính hiển vi chúng tối sơ bộ xác định tên chi của các chủng phân lập được như sau: Bảng4: Sơ bộ xác định tên chi của một số chủng phân lập từ tự nhiên Tên chi Chủng Candida HRA 26, HRA 28, HRA 44, HRA 51, HRA 54, HRA 55, HRA 59, HRA 61, HRA 63, HRA 65, HRA 66, HRA 67, HRA 68, HRA 69. Aureobasidium HRA 33, HRA 34, HRA 35, HRA 38, HRA 40, HRA 46, HRA 47, HRA 49, HRA 50. Rhodoturula HRA 9, HRA 37, HRA 53, HRA 58, HRA 60, HRA 70, HRA Leucosporidium HRA 8, HRA 42, HRA 43, HRA 57. - KFP 346: Hình thái tế bào rất đa dạng vừa có dạng sợi vừa có dạng hình trứng, hình cầu. Sinh sản bằng cách nảy chồi từ 1- 2 chồi và phân cắt. Khuẩn lạc dạng phức tạp, màu xanh xám, bề mặt xù xì, mọc sâu vào thạch. Sinh sắc tố màu xanh đen trên môi trường thạch. - KFP 145: Hình thái tế bào hơi giống KFP 346 nhưng nhỏ hơn. Khuẩn lạc cũng có hình dạng tương tự nhưng có màu trắng. - KFP 248: Tế bào hình xúc xích, hình trứng. Sinh sản bằng cách phân cắt. Khuẩn lạc màu trắng ngà, tròn, bề măt nhẵn. 2.2.4. Lên men và tách chiết chất thơm tạo thành từ môi trường nuôi cấy các chủng tạo hương - Chủng giống được sử dụng để lên men và tách chiết chất thơm gồm: KFP 346, KFP 145, KFP 248, JMC 2320 (Chủng giống trong bộ sưu tập của bộ môn vi sinh viện: đã định tên là Yarrowia lipolytica ), PDT 7 (chủng phân lập từ tự nhiên của bộ môn có khả năng tạo hương ): HRA 51 - Các chủng giống được cấy truyền từ ống giữ giống sang môi trường 6 trên thạch nghiêng, sau đó được cấy vào bình lên men. Sau khi kết thúc quá trình lên men chất thơm tạo thành được chiết bằng dung môi n-Hecxan theo sơ đồ sau: Quy trình tách chiết g-Decalactone Dịch lên men sau 8 ngày Dịch acid hoá Dịch chiết n- hecxan 1 Dịch chiết n- hecxan 2 Thêm d2 HCl 2 % Chỉnh pH về 1,5. Đun 100 0 C / 10 Â Làm lạnh Thêm 25 ml n- Hecxan, lắc mạnh, để lắng Bỏ lớp nước Ly tâm bỏ cặn 2.2.5. Định tính và định lượng chất thơm tạo thành trong các dịch chiết n-hecxan bằng sắc ký khí Cách tiến hành: + Hút chính xác 100 ml dịch chiết n-hecxan của các chủng vào ống eppendorf mới. Bay hơi dung môi. Thêm chính xác 500 ml dung môi n-hecxan ta thu được dịch chiết pha loãng 5 lần (mẫu thử : được ký hiệu theo tên chủng) dùng để chạy sắc ký khí. + Pha dung dịch chuẩn g-decalacton 1% trong n-hecxan (mẫu chuẩn): hút chính xác 5 ml g-decalacton vào ống eppendorf chứa chính xác 500 ml dung môi n-hecxan. Dung dịch g-decalacton 1% trong n-hecxan dùng để chạy sắc ký khí và so sách đối chiếu với các mẫu dịch chiết cần phân tích để xác định chất thơm tạo thành về mặt định tính và định lượng. Tiến hành chạy sắc ký trong các điều kiện : Máy: Aligent 6890 A/ USA +khí mang: Nitơ +Detector ion hoá ngọn lửa ( FID ) +Columns (Cột): Mode: Const Flow, Inlet : Back, Model No : Aligent 19091 Z-433, HP-1 Methyl Siloxane. Cappillary:30.0 m ´ 250mm ´ 0.25 mm nominal. +Oven : Oven Ramp * C/ min Next * C Hold min Run time Initial 50 0.00 0.00 Ramp 1 20.00 165 0.00 5.75 Ramp 2 8.00 200 0.00 10.13 Ramp 3 15.00 250 5.00 18.46 Ramp 4 0.00 Kết quả định tính: Kết quả định tính chất thơm trong các dịch chiết n-hecxan của các chủng tạo hương KFP 346, KFP 145, KFP 248, JMC 2320, PDT 7, HRA 51: Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn g-decalacton 1 % ngoài pic của dung môi n- hecxan, có 1 pic lớn nhất ở vị trí 8.273 phút có thể kết luận đây là pic của g-decalacton. Dựa trên việc so sách đối chiếu giữa vị trí pic của mẫu chuẩn và mẫu thử chúng tôi kết luận là trong tất cả các mẫu thử đều có g-decalacton trừ mẫu PDT-7. Dựa trên sắc lý đồ chúng tôi nhận thấy g-decalacton trong các mẫu thử là tương đối sạch Bảng 5: Vị trí pic, diện tích pic, % của g-decalacton ở mẫu thử và mẫu chuẩn theo tính toán của máy: Mẫu Vị trí pic (min) Diện tich pic % g-Decalacton g-decalacton 1 % 8.273 1037.21419 0.94576 KFP 346 8.222 211.53931 0.12682 KFP 248 8.211 81.04224 0.07646 KFP 145 8.208 95.14042 0.08959 JMC 2320 8.208 55.11541 0.0474 HRA 51 8.198 22.21419 0.01772 PDT 7 0 0 0 Theo kết quả sắc ký khí chủng có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành g-decalacton tốt nhất là KFP 346 phù hợp với đánh giá theo cảm quan. Vị trí pic của sản phẩm chất thơm trên sắc ký đồ gần nhất so với vị trí pic của g-decalacton trong mẫu chuẩn. Qua vị trí hai pic có thể đánh giá độ tinh sạch của g-decalacton trong mẫu KFP 346 là 99,38 %. a b c d e f Ghi chú: a : g-decalactone 1 %, b: KFP 346, c: HRA 51, d: JMC 2320, e: KFP 145, f: PDT 7, g: KFP 248. g Kết quả định lượng g-decalacton trong các mẫu: + Cách tính kết quả: Dựa trên diện tích pic và tỷ lệ % chất theo tính toán của máy chúng tôi tính được lượng g-decalacton có thể thu được từ môi trừơng lên men các chủng như sau: Lượng g-decalacton thu được trong 100ml môi trường = tỷ lệ % g-decalacton ´ n ´ Thể tích dịch chiết n-hecxan 2 n: là hệ số pha loãng dịch chiết =5 Bảng6 : Lượng g-decalacton thu được từ 100 ml môi trường lên men chủng : Chủng Sản lượng g-decalacton (mg) KFP 346 15.853 KFP 248 9.5575 KFP 145 11.198 JMC 2320 5.925 HRA 51 2.215 PDT 7 0 2.2.6. So sánh lượng g-decalactone tạo thành của chủng KFP-346 khi nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau bằng sắc ký khí. Tiến hành chạy sắc ký khí các mẫu dịch chiết thu được ở mục (2.1.3.f) để so sánh lượng g-decalactone tạo thành Hút chính xác 100 ml dịch chiết các mẫu trên vào ống eppendorf, bốc hơi dung môi. Thêm vào chính xác 500 ml dung môi n- hecxan chuẩn, tiến hành chạy sắc ký như ở trên. Sắc ký đồ sản phẩm chất thơm A: KFP 346.1; B: KFP 346.2; C: KFP 346.3. Kết quả sắc ký đồ sản phẩm chất thơm KFP 346.1; KFP 346.2; KFP 346.3 được thể hiện ở bảng sau: Bảng: Vị trí pic, diện tích pic, tỷ lệ % g-decalactone theo tính toán của máy: Mẫu Vị trí pic Diện tích pic % g-decalacton KFP 346.1 8.205 8.36028 0.00744 KFP 346.2 8.216 129.77435 0.12151 KFP 346.3 8.222 211.53931 0.12682 Bảng : Lượng g-decalactone thu được theo trong 100 ml môi trưòng Mẫu Môi trường Dung môi chiết Lượngg-decalacton KFP 346.1 1 1.86 mg KFP 346.2 1 15.189 mg KFP 346.3 15.852 mg + Nhận xét kết quả: như vậy theo kết quả định lượng bằng sắc ký khí lượng g-decalactone thu được khi nuôi cấy và tách chiết theo cách 2,3 lớn hơn rất nhiều so với cách 1 [ mục 2.1.3.f]. Theo đánh giá cảm quan môi trường sau lên men KFP 346.1 rất thơm nhưng trên sắc ký đồ không nhận thấy có nhiều g-decalactone, và theo tính toán lượng g-decalactone có trong dịch chiết là rất thấp 1.86 mg. Điều này có thể có ba nguyên nhân: thứ nhất sản phẩm chất thơm không phải là g-decalactone, thứ hai có thể do sự biến đổi thuận nghịch giữa g-decalactone và acid 4-hydrroxy decanoic, nguyên nhân thứ ba có thể do dung môi etyl actetat ._.