Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thành chất thơm

Đặt vấn đề Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thơm đã được xác định rõ về cấu tạo cũng như tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất g-lactone là những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu. Các hợp chất này được tìm thấy trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men tự nhiên. Với giá trị tạo hương thơm, các lactone này đã được sử dụng để tạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của thực phẩm…Tuy nhiên việc tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khó khăn và ít có hiệu quả kinh tế, vì vậy nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu điều chế các hợp chất lactone này từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu là loại nguyên liệu lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của nó là acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng hợp các lactone. Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta có rất sẵn và rẻ nhưng sử dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn chưa được nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm” với các mục tiêu sau: - Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm g-decalactone. - Tách chiết g-decalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ định tính, định lượng bằng sắc ký khí. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 1.1. Đại Cương về nấm men Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm chung sau[3]: nói chung chúng thường ở trạng thái đơn bào, đa số sinh sản theo cách nảy chồi, cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trường có nồng độ đường cao và có tính acid. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ. Là vi sinh vật thuộc nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh gồm có: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân… Kích thước tế bào nấm men lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào khoảng 2-15 mm do đó có thể thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Hình thái tế bào nấm men rất đa dạng và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van, hình elip, hình cong, hình thoi, hình tam giác, hình thận, hình lưỡi liềm, hình mũ…Nấm men có cả hai hình thức sinh sản hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, và nhiều chi nấm men thuộc bộ Endomycetales. Nấm men thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khí các hợp chất hữu cơ ngoại bào [4]. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cần những nguồn dinh dưỡng như: nguồn cacbon thường là các loại đường, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng và các chất sinh trưởng. Đồng thời trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cũng tổng hợp nên các chất hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con người đã và đang sử dụng chúng để phục vụ cho đời sống của mình. Rất nhiều loại nấm men được ứng dụng trong sản xuất như: công nghiệp sản xuất rượu, bia, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm men, các enzym như amilase, invertase, lactase, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic, riboflavin, các acid amin như lyzin, cystein, methionin...Cũng có rất nhiều loài nấm men đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành g-decalactone và đã được sử dụng để sản xuất g-decalactone như: Candida guilliermondii, Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13], Sporobolomyces odorus, Rhodotorula glutinus [10]… 1.2. Dầu thầu dầu 1.2.1. Cây thầu dầu [1] Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét. Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-12m. Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng, phiến lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưa không đều. Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai mềm. Hạt hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng. Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt Nam, Ấn Độ, Brazin…Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với mục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu dầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới. 1.2.2. Dầu thầu dầu Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầu dầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly. Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi vị nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định rõ ràng. Theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerid chung như stearin, palmitin còn có một một glycerid đặc biệt là ricinolein là thành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic). Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau: Acid ricinoleic (12-hydroxy-9-octadecenoic ) Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hoá học của dầu thầu dầu và đã được công bố. Theo các tác giả C.Borch-Jensen và G.Lakshininarayana dầu thầu dầu có thành phần hoá học như bảng1. Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,14] Acid Dầu Brazin (%) Dầu ấn độ (%) Ricinoleic acid 83-90,00 87,4-90,4 Linoleic 3,19-5,98 2,9-4,0 Oleic 2,96-5,64 2,5-4,0 Stearic 0,68-1,84 0,9-1,3 Palmitic 0,87-2,35 0,8-1,3 Dihydrostearic - 0,5-0,8 Encozenic - 0,6-1,6 Linoleic 0,34-0,91 0,1-1,1 Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có sự khác biệt theo nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic (chiếm 83-90,4 %). 1.3. [R]- g-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng Các g-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó g-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. g-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong quả đào và một số loại hoa quả khác. g-Decalactone là một ester nội phân tử của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ 70-100 0 C sẽ đóng vòng để tạo g-decalactone [7]. Ở điều kiện thường g-decalactone là một chất lỏng trong suốt không màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu. Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl acetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]: + Công thức phân tử: C10H18O2 (M=170) + Công thức cấu tạo: + nhiệt độ sôi: 281 0 C + Tỷ trọng : 0,952 + Mùi: Hoa quả và bơ sữa. g-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực phẩm. Năm 1974, Uỷ ban hợp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sách những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao nhất từ 5 –20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400 ppm[17]. Trên thế giới g-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng. Nó được dùng làm chất tạo hương thơm cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa, sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]... Trong tự nhiên, g-decalactone có mặt trong một số loại hoa quả như: mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20 mg/kg...một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử g-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự nhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là [R]-g-decalactone và [S]-g-decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang học R được tìm thấy nhiều hơn. Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượt trội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới[5]. 1.4. Tổng hợp g-decalactone nhờ vi sinh vật [15]. g-Decalactone được tạo thành bằng hai con đường: tổng hợp sinh học (biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đường biến đổi sinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp g-decalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợp sinh học. 1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic). Là con đường tổng hợp g-decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp g-decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là người đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt của g-decalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi các chủng Basidomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều báo cáo khoa học về việc tổng hợp g-decalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng g-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng Sporobolomyces odorus để tổng hợp g-decalactone nhưng chỉ thu được 1mg/1 liter môi trường…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản xuất g-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc sinh lý học với tổng hợp g-decalactone. 1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation) g-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ vi sinh vật. Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-hydroxy-decanoic sau đó đóng vòng để tạo ra g-decalactone . Con đường biến đổi acid ricinoleic tạo g-decalactone ở vi sinh vật. Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp g-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11, 12, 13, 16, 18, 19]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành g-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất g-decalactone và một số lactone khác[8, 10, 12, 16, 19]. Năm Chủng vi sinh vật Nguyên liệu Sản phẩm 1980 Pityrosporum canis Pit.achydermatis Pit.orbiculare Pit.ovale Acid oleic g-decalactone g-hexa g-hepta .. 1982 Aspergillus oryzae Geotrichum klebahnii Yarrowia lipolytica Candida guilliermondii Candida albicans Candida krusei Candida parakrusei Candida pseudotropicals Candida stellatoidea Candida tropicalis Candida rugosa Hansenula saturnus Dầu thầu dầu Dầu thầu dầu thuỷ phân Acid ricinoleic g -decalactone 1989 Aspergillus niger Cladosporium suaveolens Phanerochaetechrysosporium Pichia etchellsii Dầu thầu dầu Dầu hướng dương Dầu dừa g-decalactone g-octanolied g-decanolied 1990 Sporobolomyces odorus Rhodotorula glutinus Dầu thầu dầu g-decalactone g-hydroxy-decanoic acid 2001 Yarrowia lipolytica HR 145 (DSM 12397) Dầu thầu dầu g-decalactone Cơ chế chuyển hoá acid ricinoleic thành g-decalactone ở vi sinh vật. Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là qúa trình b-oxy hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase (Aox). Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra Acetyl-CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật [2]. Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, như đã biết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra g-decalactone. Yves Wache [21, 22] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aox1 đến Aox5) được mã hoá bởi các gen Pox1->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá enzym Aox3 (chuỗi ngắn-short chain) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổng hợp g-decalactone. Ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng g-decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã (Từ 50mg/l lên đến 220mg/l sau 24 h). Ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy-g-decalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng ở chủng hoang dã quá trình b-oxy hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-Acyl-Coenzym A Hydrogenase. Con đường b-oxy hoá biến đổi methyl ricinoleate ở nấm men Yarrowia lipolytica theo Yves Wache và cộng sự [22]: Sản phẩm b-oxy hoá khác + Sản phẩm tạo thành: 1: Dec-3-en-4-Olide 2: g-Decalactone 3: Dec-2-en-4-Olide 4: 3-hydroxy-g-Decalactone 5: 3-keto-g-Decalactone +Hệ enzym: Aox: Acyl CoezymA oxidase Ahy: Acyl Co A Hydratase Hdh: 3-hydroxy-g-Decalactone Thi : 3keto acyl Co A thiolase. PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị Dầu thầu dầu: Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công nghiệp. Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng ở Bắc Ninh. Acid ricinoleic: Do viện Công nghiệp Thực Phẩm cung cấp Chủng giống: 81 chủng nấm men KFP trong bộ sưu tập của viện CNTP được sử dụng để tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu, chủng giống JMC2320( Yarrowia lipolytica ), chủng PDT7. Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viên Pasteur, Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây… Hoá chất: + Etyl acetat (Trung Quốc) + Agar + Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco) + Dịch chiết Malt-glu 20 0 Bx + (NH4)2SO4 + n-Hecxan ( Trung Quốc) + g-Decalactone chuẩn + HCL 37% Thiết bị và dụng cụ: + Box cấy vô trùng Bioblock scientific ( Pháp ) + Nồi hấp áp lực Himayamatoko (Nhật ) + Máy lắc ống nghiệm IKA* KS 130 basic ( Nhật ) + Máy lắc bình tam giác Lab-line ( Mỹ ) + Máy ly tâm Universal 16 Hettich + Lò vi sóng LG ( Hàn Quốc ) + Kính hiển vi quang học E clipse E 600 Nikon ( Nhật ) + Máy sắc ký khí Aligent 6890 A(USA) + Đĩa petri, ống eppendorf, ống nghiệm có nắp vặn, ống falcon, pipet, bình tam giác… 2.1.2. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu Môi trường 1: + Chất khoáng (*) : 100 ml + Nguyên tố vi lượng (**) : 200 ml + Dịch chiết nấm men 5 % : 2 ml + (NH4)2SO4 : 5 g + Thêm nước vừa đủ : 1lit (*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit) KH2PO4 : 850 mg K2HPO4 : 150 mg MgSO4.7.H2O : 500 mg NaCl : 100 mg CaCl.6.H2O : 100 mg (**) Thành phần nguyên tố vi lượng (trong 1 lit) H3BO3 : 500 mg CuSO4.5.H2O : 400 mg KI : 100 mg FeCl3. 6 H2O : 200 mg MnSO4.4H2O : 400 mg Na2MoO4.2H2O : 200 mg ZnSO4.7H2O : 400 mg Môi trường 2: môi trường yeast-nitrogen 10% + Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g + Nước cất vừa đủ 100 ml Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difco gồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự phát triển của nấm men. Môi trường 3: + Pepton 2g + Dầu thầu dầu 10g + Tween 80 20 ml + Nước cất vừa đủ 100 ml Môi trường 4:môi trường làm sạch lần một: + Dịch Malt –gluco 200Bx : 100 ml + Agar : 20g + Nước cất vừa đủ : 1lit Hấp ở 120 0C/ 20 phút, sau khi để nguội tới 80 0C bổ xung 0,1 % acid lactic và đổ thạch đĩa. Môi trường 5: môi trường làm sạch lần 2 Thành phần như môi trường làm sạch lần 1 nhưng không bổ xung acid lactic. Môi trường 6: môi trường phân lập và giữ giống Thành phần như môi trường làm sạch lần 2. 2.1.3 Phương pháp thực nghiệm Phương pháp phân lập nấm men sử dụng Ricinoleic acid : + Nguyên tắc: Để phân lập nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic chúng tôi sử dụng môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất là acid ricinoleic. Nếu nấm men mọc có nghĩa chúng phải oxy hoá được acid ricinoleic. Những chủng có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic được kiểm tra khả năng tạo mùi thông qua đánh giá cảm quan. + Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường 1 đong vào các ống nghiệm loại 10 ml có nắp vặn , mỗi ống 3ml. Bổ xung 30 ml acid ricinoleic / ống. Hấp thanh trùng ở 120 0C / 20 phút. + Lấy mẫu: - Mẫu đất: Dùng dụng cụ vô trùng lấy đất trên bề mặt vào bình thuỷ tinh vô trùng. - Lá và hoa: Được lấy vào túi ni long sạch. + Xử lý mẫu: - Dùng kéo đã thanh trùng cắt nhỏ khoảng 2 g lá cây (1cm) và cho vào ống falcon chứa 20 ml nước cất vô trùng (Với mẫu đất cho khoảng 4 gam). - Lắc nhẹ và ngâm khoảng 10 phút. - Lắc mạnh trong 1-2 phút. - Để lắng trong vài chục giây, sau đó hút 1 ml dung dịch vào ống eppendorf. - Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. - Hút bỏ 900 ml phần dịch trong, trộn đều phần còn lại và nhỏ toàn bộ vào ống chứa môi trường chọn lọc. + Nuôi cấy: Nuôi cấy lắc trên giá ống nghiệm, chỉnh tốc độ lắc sao cho toàn bộ phần dịch bị khuấy trộn. Sau 1-2 tuần, tuỳ theo mức độ phát triển có thể tiến hành phân lập nấm men. + Phân lập : Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường 5 - Lắc đều dịch nuôi cấy - Nhúng que cấy vào canh trường và cấy lên mặt thạch vài lần - Di que cấy theo hướng từ vị trí ban đầu ra các phía để tách từng khuẩn lạc riêng rẽ. Sau 3- 5 ngày ta chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy lên đĩa thạch chứa môi trường làm sạch lần 1. Khi VSV đã mọc ta chọn một khuẩn lạc riêng rẽ cấy lên môi trường làm sạch lần 2. Qua 2 lần làm sạch ta có thể chọn được các giống thuần chủng và các chủng này được giữ trong ống eppendrof ở 5 0 C. + Thử hoạt lực của các chủng phân lập được: Chuẩn bị môi trường 1 và đong vào các ống nghiệm 10 ml có nắp khoảng 3 ml/ống. Bổ xung 30ml acid ricinoleic/ống. Hấp thanh trùng ở 1 atm/20 phút. Các chủng đã phân lập được cấy vào các ống nghiệm có chứa môi trường trên. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí nhiệt độ 25 0C, lắc 320 vòng /phút. Theo dõi mùi tạo ra hàng ngày trong thời gian 2 tuần để chọn chủng có khả năng tạo hương thơm. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic từ bộ sưu tập giống của Viện: Các chủng giống được giữ trong ống eppendorf trong tủ lạnh được cấy truyền sang môi trường 6 trên thạch nghiêng để hoạt hoá chủng. Pha môi trường 2 đong vào các ống nghiệm 2ml/ống. Bổ xung 20ml acid ricinoleic /ống nuôi cấy ở điều kiện như trên v à theo dõi mùi tạo ra . Xác định thời gian tối ưu cho việc tạo hương ở một số chủng phân lập và tuyển chọn Từ các chủng tạo hương được phân lập và tuyển chọn chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và khả năng tạo mùi thơm của các chủng. Quan sát hình dạng tế bào của một số chủng nấm men phân lập và tuyển chọn. Các chủng nấm men được cấy truyền từ ống giữ giống sang thạch nghiêng, nuôi cấy ở 25 0C trong 3-5 ngày và quan sát hinh thái. Các hình ảnh qua kính hiển vi quang học Eclipse 600 được truyền bằng camera JVC và lưu giữ trên máy vi tính. Hình ảnh đã số hoá được sử lý bằng phần mềm đồ hoạ Adobe Photoshop 5.0. Kết quả thu được sẽ được tham chiếu với những khoá phân loại nấm men để sơ bộ định tên các chủng giống. Lên men và tách chiết chất thơm tạo thành từ môi trường nuôi cấy các chủng tạo hương + Chuẩn bị chủng giống: chủng giống được cấy truyền từ ống eppendorf sang thạch nghiêng, sau 2-3 ngày có thể sử dụng cho lên men. +Lên men và tách chiết: chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml môi trường 2% pepton, 0.02 % Tween 80, 10 gam dầu thầu dầu. Tween 80 được cho vào ở đây nhằm làm tăng khả năng nhũ hoá của dầu thầu dầu giúp cho vi sinh vật có thể sử dụng tốt hơn. Môi trường được hấp thanh trùng ở 120 0C /20 phút. Cấy khoảng một vòng que cấy chủng vào môi trường nuôi cấy, lắc đều. Đặt các bình nuôi cấy chủng trong điều kiện rung lắc ở 200 vòng/phút, nhiệt độ 25 0C, trong quá trình lên men theo dõi pH môi trường và giữ ở 6,5-7. Sau 7 ngày kết thúc quá trình lên men pH được chỉnh về 1,5 bằng dung dịch acid HCl. Đun nóng ở 100 0C trong 10 phút để thực hiện phản ứng đóng vòng lactone. Sau khi làm lạnh chiết bằng dung môi n- hecxan. Ly tâm dịch chiết để loại bỏ cặn. Hút lấy dịch trong vào ống Falcon, dịch chiết được sử dụng cho việc định tính và định lượng chất thơm tạo ra bằng sắc ký khí. Định tính và định lượng chất thơm tạo thành trong các dịch chiết n-hecxan bằng sắc ký khí Định tính chất thơm trong dịch chiết bằng cách so sánh đối chiếu vị trí của pic tương ứng trên sắc đồ trùng với pic của chất chuẩn đối chiếu. Định lượng chất thơm tạo thành bằng cách tính diện tích pic của chất chuẩn đã biết chính xác hàm lượng từ đó suy ra lượng chất chuẩn có trong mẫu thử . So sánh lượng g-decalactone tạo thành của chủng KFP 346 khi nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau(*): Nuôi cấy chủng KFP 346 theo các cách sau: + Cách 1: Pha 100ml môi trường 1 trong bình tam giác. Hấp thanh trùng ở 1atm/20 phút. Cấy khoảng 1 vòng que cấy chủng. Sau thời gian nuôi cấy 7 ngày ở điều kiện lắc 150 vòng/phút, 250C. Sau cùng chiết bằng 50 ml dung môi etylacetat. Ly tâm loại cặn. + Cách 2: khác cách 1 ở điểm: sau 7 ngày nuôi cấy thực hiện phản ứng đóng vòng lacton bằng cách acid hoá môi trường bằng dung d ịch HCl đến pH 1,5. Đun nóng ở 100 0 C trong 10 phút. Làm lạnh và chiết bằng 25 ml dung môi n-hecxan. Sau cùng ly tâm loại cặn. + Cách 3: chuẩn bị 100 ml môi trường 3 vào bình tam giác. Hấp thanh trùng ở 1atm/20 phút. Cấy khoảng một vòng que cấy chủng. Nuôi cấy trong điều kiện rung lắc 150 vòng /phút, nhiệt độ 25 0C, pH môi trường được giữ ở 6,5-7 trong thời gian 7 ngày. Sau 7 ngày kết thúc quá trình lên men pH được chỉnh về 1,5 bằng dung dịch acid HCl . Đun nóng ở 100 0C trong 10 phút. Sau khi làm lạnh chiết bằng 25 ml dung môi n-hecxan. Ly tâm loại cặn. Các dịch chiết trên được ký hiệu theo thứ tự KFP 346.1; KFP 346.2; KFP 346.3 được chạy sắc ký khí để định lượng g-decalactone. 2.2 Kết quả thực nghiệm 2.2.1 Phân lập các chủng nấm men chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm Từ 28 mẫu lá cây, hoa và đất chúng tôi phân lập được 70 chủng nấm men (HRA1-HRA70), trong đó có 41 chủng được phân lập từ lá, 18 chủng được phân lập từ hoa và 11 chủng được phân lập từ đất. Sau khi thử hoạt lực chúng tôi tìm được 5 chủng (HRA 1; HRA 2; HRA 51; HRA 55; HRA 61 ) có khả năng tạo mùi thơm. 2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo mùi thơm của 5 chủng phân lập. Từ 5 chủng trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và mùi thơm tạo ra khi nuôi cấy chủng trong môi trường 1 ở điều kiện như nhau lượng tế bào được cấy như nhau, nhiệt độ 25 0C, lắc 150 vòng / phút, thông khí bằng cách mở ¼ vòng nắp ống nghiệm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3 Bảng 3: ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo mùi thơm của 5 chủng HRA 1, HRA 2, HRA 51, HRA 55, HRA 61 Chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày S M S M S M S M HRA 1 - - + ± + + ++ - HRA 2 - - + ± + + ++ - HRA 51 - - + + + + ++ - HRA 55 - - + + + - ++ - HRA 61 - - + + + - ++ - Ghi chú: (S): sinh trưởng; (M): mùi Cột S: (- ): Chưa mọc; (+): có mọc; (++): mọc nhiều Cột M: (-): mùi hắc; (±): không mùi; (+): mùi thơm. Nhận xét: Trong 5 chủng được nghiên cứu chỉ có chủng HRA 51 tạo mùi thơm tốt và tồn tại lâu trong môi trường, sau 5 ngày đã xuất hiện mùi thơm và tồn tại cho đến ngày thứ 7, còn hai chủng HRA 55, HRA 61 bị mất mùi nhanh hơn. 2.2.3. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic từ bộ sưu tập giống của Viện. Từ 81 chủng giống trong bộ sưu tập của viện Công Nghiệp Thực Phẩm sau khi thử khả năng chuyển hoá acid ricinoleic, chúng tôi tuyển chọn được 7 chủng (KFP 346; KFP 145; KFP 116; KFP 304; KFP 248; KFP 254; KFP 265) có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành chất thơm trong đó có 3 chủng tạo mùi rất tốt (KFP 346, KFP145, KFP 248), đặc biệt chủng KFP 346. Mùi thơm tạo ra trong môi trường nuôi cấy chủng này được nhận thấy chỉ sau 1 ngày và tăng dần theo thời gian cho đến khi acid ricinoleic được chuyển hoá hết là lúc môi trường nuôi cấy không còn các hạt dầu. Thông thường ở các chủng còn lại tại một thời điểm nhất định mùi tạo ra là tốt nhất sau đó mùi chuyển sang hắc, nhưng riêng chủng KFP 346 mùi thơm tồn tại rất lâu trong môi trường và cho đến khi acid ricinoleic được chuyển hoá hết mùi thơm không bị mất đi hay chuyển sang hắc. Điều đó có thể giải thích rằng quá trình chuyển hoá acid ricinoleic nhờ chủng KFP 346 chỉ dừng lại ở việc tạo ra chất thơm mà không tiếp tục chuyển hoá chất thơm đó thành các chất khác. 2.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo mùi thơm của 7 chủng tuyển chọn. Từ bảy chủng tuyển chọn trong bộ sưu tập giống của Viện chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và mùi thơm tạo ra. Kết quả thể hiện ở bảng sau. Bảng 4: ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo mùi thơm của7 chủng tuyển chọn. Chủng 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 13 ngày S M S M S M S M S M S M KFP 346 + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ KFP 145 + ± + + + + + + ++ + ++ _ KFP 248 - ± + ± + + + + ++ + ++ _ KFP 116 - ± - ± + + + + ++ _ ++ _ KFP 265 - ± - ± + ± + + ++ _ ++ _ KFP 304 - ± + + + + + + ++ _ ++ _ KFP 254 - ± - ± + ± + + ++ _ ++ _ Ghi chú: (S): sinh trưởng; (M): mùi Cột S: (- ): Chưa mọc; (+): có mọc; (++): mọc nhiều Cột M: (-): mùi hắc; (±): không mùi; (+): mùi thơm; (++): rất thơm Nhận xét: Theo kết quả ở bảng 4 với hầu hết các chủng thời gian nuôi cấy để cho mùi tốt nhất là 1tuần tuy thời điểm xuất hiện mùi có khác nhau.Trong đó chủng KFP 346 cho mùi sớm nhất và cũng kéo dài nhất, từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 13. 2.2.5. Quan sát hình thái tế bào của một số chủng phân lập và tuyển chọn. Một trong những tiêu chí đầu tiên để tuyển chọn chủng có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm (cụ thể là g-decalactone) là các chủng này phải có khả năng sử dụng acid ricinoleic. Từ 28 mẫu lá cây và đất trên môi trường chọn lọc các chủng có khả năng sử dụng acid ricinoleic như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, có 25 mẫu có biểu hiện phát triển của nấm men. Từ những mẫu này 70 chủng nấm men được phân lập. Các chủng này được phân nhóm theo đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào. Những chủng đại diện được định tên sơ bộ tới chi thông qua hình thái tế bào. Tất cả các chủng phân lập được đều được thử nghiệm khả năng tạo hương khi mọc độc lập trên môi trường chứa acid ricinoleic. Các chủng nấm men đã qua phân loại sơ bộ được liệt kê ở bảng 5. Trong số 36 chủng đã phân loại sơ bộ có 18 chủng được xếp vào chi Candida, 9 chủng thuộc chi Aureobasidium, 6 chủng thuộc Rhodotorula và 4 chủng thuộc Leucosporidium. Đặc tính của nấm men trong các chi này có thể được liệt kê như sau : - Candida : Phần lớn nấm men phân lập được thuộc chi này (18/36 đại diện). Đặc biệt cả 5 chủng phân lập (HRA 1, HRA 2, HRA 51, HRA 55, HRA 61) có khả năng tạo hương đều thuộc vào chi này . Nấm men Candida có đặc trưng là tạo khuẩn lạc mầu kem, tế bào có thể hình oval cho tới hình ống. Đa số các chủng có khả năng tạo khuẩn ti giả. Chi Candida là một trong những chi phức hợp nhất trong hệ thống phân loại nấm men. Hầu hết những nấm men thuộc lớp Ascomycetes nếu không tạo bào tử và không có đặc điểm gì nổi trội đều được xếp vào chi này. Một số đặc điểm của nấm men Candida phân lập được có thể thấy được thông qua hình 2. Rhodotorula: Một đặc điểm dễ nhận biết nhất của chi là chúng tạo khuẩn lạc có sắc tố hồng đỏ. Nấm men này được xếp vào lớp Basidiomycetes. Chúng không có khả năng lên men các loại đường. Sắc tố đỏ giúp cho nấm men này chống chọi được với tác dụng của tia tử ngoại. Chúng thường gặp nhiều trên lá cây, trong đất. Từ 28 mẫu phân tích chúng tôi phân lập được 7 chủng. Các chủng mọc tốt trên môi trường chứa acid ricinoleic nhưng không tạo mùi thơm. Leucosporidium: Đây là một trong những chi thuộc lớp Basidiomycetes. Trong pha sinh sản hữu tính chúng tạo bào tử nghỉ và sau đó nảy chồi kèm theo quá trình giảm phân. Có 4/36 đại diện chúng tôi phân lập được có hình thái gần giống nấm men thuộc chi này. Tuy nhiên do chưa phát hiện được quá trình sinh sản hữu tính việc gắn chủng phân lập được với chi này thực ra chưa thật chính xác và chỉ mang tính chất tạm thời. Cũng như Rhodotorula các chủng mọc tốt trên môi trường chọn lọc nhưng không tạo mùi thơm. Aureobasidium: Những chủng thuộc chi này có điểm đặc biệt là trên môi trường ban đầu chúng có thể không có mầu, nhiều chủng có mầu hồng nhạt, vàng nhạt nhưng sau đó đều chuyển sang mầu đen ở các mức độ khác nhau. Nhiều chủng có khả năng sinh chất nhầy. Đặc điểm sinh sắc tố đen và chất nhầy là yếu tố giúp chúng thích nghi với đời sống trên lá cây (chống tia tử ngoại và chống bị rửa trôi). Nấm men thuộc chi Aureobasidium có thể phát triển rất tốt ở trạng thái đơn bào trên môi trường giàu dinh dưỡng nhưng sau đó lại phát triển một hệ sợi dầy đặc khi môi trường trở nên kém thích nghi. Từ các mẫu phân tích có 9 chủng được xếp vào chi này. Trong số những chủng khảo nghiệm có 2 chủng tạo mùi hương nhưng không đậm nên không được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 5: Sơ bộ x ác định tên chi một số chủng phân lập. Tªn chi Chñng Candida HRA 26, HRA 28, HRA 44, HRA 51, HRA 54, HRA 55, HRA 59, HRA 61, HRA 63, HRA 65, HRA 66, HRA 67, HRA 68, HRA 69, HRA1, HRA2. Aureobasidium HRA 33, HRA 34, HRA 35, HRA 38, HRA 40, HRA 46, HRA 47, HRA 49, HRA 50. Rhodoturula HRA 9, HRA 37, HRA 53, HRA 58, HRA 60, HRA 70, HRA Leucosporidium HRA 8, HRA 42, HRA 43, HRA 57. Qua quan sát hình thái tế bào chúng tôi đã sơ bộ định tên chi của một số chủng tạo hương tốt nhất kết quả ở hình 2 và 3. - KFP 346: Hình thái tế bào rất đa dạng vừa có dạng sợi vừa có dạng hình trứng, hình cầu. Sinh sản bằng cách nảy chồi từ 1- 2 chồi và phân cắt. Khuẩn lạc dạng phức tạp, màu xanh xám, bề mặt xù xì, mọc sâu vào thạch. Sinh sắc tố màu xanh đen trên môi trường thạch. - KFP 145: Hình thái tế bào hơi giống KFP 346 nhưng nhỏ hơn. Khuẩn lạc cũng có hình dạng tương tự nhưng có màu trắng. - KFP 248: Tế bào hình xúc xích, hình trứng. Có hình thành khuẩn ty giả. Sinh sản bằng cách phân cắt, nảy chồi. Khuẩn lạc màu trắng ngà, tròn, bề mặt nhẵn. 2.26. Lên men và tách chiết chất thơm tạo thành từ môi trường nuôi cấy các chủng tạo hương - Chủng giống được ._.